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Délivré par l’Université de Montpellier
Préparée au sein de l’école doctorale GAIA
(Biodiversité, Agriculture, Alimentation, Environnement,
Terre, Eau)
Et de l’unité de recherche UMR 204 Nutripass- Institut de
recherche pour le développement, Montpellier
Spécialité : Sciences des aliments et Nutrition
Présentée par Wichien SRIWICHAI
Soutenue le 25 novembre 2016 devant le jury composé de
Waché Y. Professeur AgroSup Rapporteur
Bohn T. Directeur de Recherche Rapporteur
Amiot-Carlin M.J. Directrice de Recherche INRA Examinatrice
Kahane R. Chercheur CIRAD Examinateur
Berger J. Directeur de Recherche IRD Examinateur
Avallone S. Maître de Conférences SupAgro Examinatrice
Déterminants de la bioaccessibilité des
caroténoïdes et tocophérols de légumes
feuilles : comparaison variétale et influence du
procédé
i
ii
Remerciements
En premier lieu, j’aimerais remercier les membres de mon jury de thèse: Monsieur
Jacques Berger, le représentant de l’IRD en Thaïlande, Inde, Népal et Birmanie et
Madame Sylvie Avallone, Maître de conférences, Supagro, d’avoir accepté de participer à
cette soutenance. Je remercie profondément Monsieur Rémi Kahane, Chercheur du
CIRAD1 Montpellier et Madame Marie-Josèphe Amiot-Carlin, Directrice de recherche au
département Alimentation humaine de l’I.N.R.A2 et directrice adjointe de l’unité mixte de
recherche Inra/Inserm « Nutrition, obésité et risque thrombotique » de l’université d’Aix-
Marseille, qui m'ont fait l'honneur d’accepter d’examiner ce travail.
Monsieur Yves Waché, Professeur à l’Université de Bourgogne et Monsieur Torsten Bohn
qui ont accepté d'être les rapporteurs de cette thèse, je les en remercie, de même que
pour leur participation au jury.
Je tiens à remercier Monsieur Jean-Pierre Guyot, Directeur de l’unité mixte de recherche
Nutripass3 pour m’avoir accueilli dans l’unité qu’il dirige et pour les conseils que j'ai eu
l'honneur de recevoir de sa part.
Je voudrais remercier très chaleureusement mon directeur de thèse, Monsieur Jacques
Berger, pour m’avoir donné l’occasion d’intégrer l’UMR Nutripass et d’effectuer mon projet
de recherche au sein de l’équipe Nutrition Aliment. Toute ma gratitude pour ses conseils,
son soutien et ses encouragements pendant ces 3 années de thèse.
Je désire exprimer mes plus sincères remerciements à ma co-directrice de thèse,
Madame Sylvie Avallone, pour m’avoir aidé, conseillé, suivi avec beaucoup de patience et
de rigueur, pour avoir consacré du temps à m’encadrer avec gentillesse, m’avoir transmis
ses connaissances scientifiques et professionnelles et m’avoir fait confiance tout au long
de ces trois années.
Je remercie tous ceux sans qui cette thèse ne serait pas achevée: Monsieur Christian
Picq, Technicien de laboratoire pour m’avoir transmis son savoir-faire et ses
connaissances techniques. Monsieur Tim Tranbarger et Madame Myriam Collin de l’UMR
DIADE4, pour leurs aides et conseils en histologie végétale. Mademoiselle Marie Jeanne
Brillet, Mademoiselle Sann Sotheary avec qui j’ai eu l’occasion de travailler, pour avoir
1 CIRAD : Centre de coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement
2 I.N.R.A : Institut National de la Recherche Agronomique
3 Nutripass : Nutrition et Alimentation des Populations Aux Suds
4 DIADE : DIversité Adaptation et DEveloppement des plantes
iii
réalisé leur stage dans le cadre de master. Je tiens également à remercier les personnes
du laboratoire avec qui j’ai pu échanger et travailler. Mes remerciements vont également à
Monsieur Stéphane Peyron, Monsieur Laurent Pino et Madame Mélanie Broin pour leurs
conseils et leurs aides pour l’obtention des matériels indispensables à l'expérimentation
de thèse.
Je voudrais exprimer ma gratitude aux membres de l’équipe Nutrition Aliment et Nutrition
Publique pour m’avoir accueilli chaleureusement, pour m’avoir aidé, guidé, soutenu et
encouragé tant au niveau scientifique qu’humain, pour les discussions que j'ai eu la
chance d'avoir avec eux quotidiennement, leurs suggestions ou contributions tout au long
de cette thèse.
Mes remerciements vont également à mes collègues doctorants partageant le même
bureau, Monsieur Fabien Saubade, Mademoiselle Maricarmen Ponce de León Rodríguez
et les amis doctorants du centre de l’IRD Montpellier pour leur gentillesse, leur soutien
ainsi que leurs conseils et aussi pour tous les bons moments passés ensembles.
Je remercie du fond de mon cœur ma famille et mes amis thaïlandais et français pour leur
soutien et leur écoute, leurs encouragements qui m’ont motivé aux moments difficiles.
Mes remerciements pour tous mes anciens et inoubliables enseignants qui m'ont formé et
guidé jusqu'au bout de ce bon chemin de l’étude académique et jusqu'à l’obtention du
diplôme doctoral.
iv
Résumé
La carence en vitamine A est un problème de santé publique dans de nombreux pays et
elle touche particulièrement les groupes vulnérables. Un régime alimentaire varié permet
de lutter durablement contre cette carence. Les fruits et légumes ont un rôle important
dans ce contexte. Certains caroténoïdes provitaminiques peuvent participer à la
couverture des besoins en vitamine A. Leur faible absorption intestinale et conversion en
vitamine A est un facteur limitant. Cette thèse avait pour objectif, tout d’abord, d’identifier
les déterminants de la bioaccessibilité des caroténoïdes (β-carotène et lutéine) et de l’α-
tocophérol dans 8 légumes feuilles frais consommés en Asie du Sud Est. Le profil
nutritionnel de ces aliments, ainsi, que leurs capacités à libérer les micronutriments
d’intérêt pendant des digestions in vitro ont été évalués. Des corrélations statistiques ont
été recherchées entre les différentes variables pour identifier quels facteurs favorisent ou
limitent la bioaccessibilité des composés. Dans un deuxième temps, deux études
poussées ont été menées sur les feuilles de moringa et brèdes chouchou afin d’évaluer
l’influence des traitements culinaires et procédés de conservation sur la bioaccessibilité
des micronutriments lipophiles. Une approche microscopique a été mise en œuvre pour
suivre le changement de structure des feuilles à l’échelle cellulaire. Enfin, une méthode de
purification et quantification des pectines et tanins ayant diffusés dans les milieux digestifs
a été développée afin de voir si ces polymères étaient impliqués dans la modulation de la
bioaccessibilité des caroténoïdes et tocophérols selon les variétés. Les légumes feuilles
sont composés de trois tissus distincts (épiderme, mésophylle et tissu vasculaire). Les
teneurs en pectines des légumes feuilles ont été le seul déterminant identifié dans la faible
micellisation des caroténoïdes. L’analyse de la teneur en pectines des milieux digestifs n’a
pas permis de confirmer cette hypothèse. Les tanins condensés, quant à eux, auraient un
effet protecteur probablement liés à leurs propriétés antioxydantes. Parmi les opérations
culinaires, la cuisson à la vapeur est celle qui augmente le plus la bioaccessibilité des
caroténoïdes et de l’α-tocophérol des feuilles en déstructurant légèrement les tissus et en
induisant peu de reactions de dégradations. En revanche, la friture détruit l’épiderme,
ouvre les cellules palissadiques et dégrade les vitamines par réaction à hautes
températures. Le séchage doux (60°C) couplé au broyage permet d’obtenir des poudres
dont les composés sont libérés plus aisément pendant la digestion ; les cellules sont alors
en partie ouvertes par le traitement. En conclusion, les légumes feuilles frais et
v
transformés ont un profil nutritionnel intéressant et les procédés (séchage/broyage,
cuisson à la vapeur, stérilisation) améliorent la capacité des aliments à relarguer les
micronutriments pendant la digestion. L’ouverture des cellules est un élément important
dans la bioaccessibilité des composés mais la composition des légumes elle même
influence le devenir digestif (stabilité, micellisation). La stabilisation par abaissement de la
teneur en eau et broyage, permet de disposer sur l’année de légumes sous forme de
poudre « fonctionnalisée ». Le Moringa a un profil nutritionnel comparable aux autres
légumes feuilles à l’exception des composés phénoliques qu’il contient. Diversifier les
modes de consommation de légumes sous forme fraiche ou transformée pourrait
améliorer le statut nutritionnel des populations.
Abstract
The vitamin A deficiency is a major public health problem in numerous countries and
affects specifically vulnerable groups. A diversified diet allows decreasing the vitamin A
deficiency in a sustainable way. Fruits and vegetables have an important role to play in
this context. Some of provitamin A carotenoids can fulfil human vitamin A requirements.
Their poor intestinal absorption and bioconversion into vitamin A is a limiting factor. This
thesis aim to, firstly, identify the key determinants of carotenoid (β-carotene and lutein)
and α-tocopherol bioaccessibility in 8 fresh leafy vegetables consumed in South-East Asia.
Their nutritional profile and capacity to liberate micronutrient throughout in vitro digestion
were assessed. Statistical correlations were determined among the variables to identify
which factor promotes or impairs the micronutrient bioaccessibility. In a second step, two
studies were leaded on chayote and moringa leaves to evaluate the influence of culinary
treatments and preservation methods on the compound bioaccessibility. A microscopical
approach was used to assess the structural changes of the food at the cellular scale.
Finally, a quantification method of pectins and tannins in the digestive medium was
developed to highlight their role in the carotenoid micellarisation. Leafy vegetables are
constituted of tree distinct tissues (epidermis, mesophylle and vascular bundles). The
pectin contents in leafy vegetable were the only key factor statically involved in the
carotenoid micellarisation. The analysis of the pectin contents of the digestive medium of
leafy vegetable did not confirm this hypothesis. The condensed tannins had rather a
protective role probably related to their antioxidant properties. Among the culinary
vi
treatments, steaming increased greatly the carotenoid and α-tocopherol bioaccessibility
with concomitant tissue disorganization and low degradation reactions. On the contrary,
frying destroys the epidermis layer, opens some palissadic cells with a high level of
destruction of vitamins with the high temperature used. Drying at moderate temperature
(60°C) plus grinding produce powders with high release of compounds during in vitro
digestion. In conclusion, fresh and processed vegetables have an interesting nutritional
profile and processing (drying/grinding, steaming, sterilization) improves the digestive
release of micronutrients. Cell opening is an important factor as well as the biochemical
composition of the leaves which determine the digestive behaviour (stability,
micellarisation). Stabilisation of leaves by drying and grinding allow delivering
functionalised powder during the year. Moringa has a nutritional profile comparable to
others leafy vegetables except for its phenolic contents. The consumption of diversified
products based on leafy vegetables in fresh or processed state should improve the
nutritional status of populations.
Mots clés: vitamine A, stabilité, bioaccessibilité, légumes feuilles, pratiques culinaires,
microstructure
vii
Valorisation de la thèse
Article publié Sriwichai W, Berger J, Picq C, Avallone S 2016. Determining factors of the carotenoid
and α-tocopherol bioaccessibility in several leafy vegetables. Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 64(8):1695-1701.
Sriwichai W, Collin M, Tranbarger TJ, Berger J, Avallone S. Improvement of the
content in bioaccessible lipophilic micronutrients in raw and processed drumstick leaves
(Moringa oleifera Lam.). LWT- Food Science and Technology, 75: 279-285.
Articles soumis Sriwichai W, Collin M, Tranbarger TJ, Berger J, Avallone S. Effect of household
cooking and drying processing on the carotenoid bioaccessibility of Chayote leaves
(Sechium edule.). Food Research International, submitted.
Articles en cours de préparation Sriwichai W, Sann S, Berger J, Avallone S. New method to quantify pectins and
condensed tannins in the in vitro digestive medium of leafy vegetables, in preparation.
Présentation orale Influence of culinary treatment and industrial processing on the bioaccessibility of
lipophilic compounds (carotenoids and α-tocopherol) from Moringa leaves. Présentation
à la journée de l’école doctorale GAIA le 14 juin 2016.
Présentation de poster Influence of cell wall composition on carotenoid bioaccessibility of several leafy
vegetables. Présentation à la journée de l’école doctorale SPSA le 19 juin 2015.
Activités de management Marie Jeanne Brillet. Étudiante du Master Biologie Santé, Université de Montpellier.
Stage réalisé du 20 mai au 18 juin 2015.
Sann Sotheary. Étudiante du Master SPA2E, Université de Montpellier. Stage réalisé
du 1er avril au 30 juin 2016.
viii
Liste des abréviations
ACP Analyse en Composantes Principales (PCA) AG Acides Gras AGCC Acides Gras Chaînes Courtes AGCL Acides Gras Chaînes Longues AGCM Acides Gras à Chaînes Moyennes AIRs Alcohol-Insoluble Residues ANOVA Analyse de la variance ANR Apport Nutritionnel Recommandé ANSES Agence Nationale de Sécurité Sanitaire de l’alimentation, de
l’environnement et du travail) AS Apport Suffisant BCMO1 β-β-carotène 15,15’-mono oxygénase 1 CHOL Cholestérol CIRAD Centre de coopération Internationale en Recherche Agronomique
pour le Développement CLHP Chromatographie Liquide Haute Performance CT Condensed Tannins CV Coefficient of Variation. DAD Diode Array Detector DIADE UMR « DIversité Adaptation et DEveloppement des plantes » DIV Digestion In Vitro DM Dry Matter ER Equivalents Rétinol FAO Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture FW Fresh Wet GalA Galacturonic Acid HC Huile de Colza HFT Hydraulic & Lube Filtration HG Homogalacturonan HPLC High Performance Liquid Chromatography HPMC HydroxyPropyl MethylCellulose HRGP Hydroxyprolin Rich Glyco Protein, Protéines riches en hydroxyproline i.d Inner Diameter IRD Institut de Recherche pour le Développement IVD In vitro Digestion LCFAs Long Chain Fatty Acid, Acides gras à longue chaîne LDL Low Density Lipoprotein, Lipoprotéines de basse densité cholestérol MCFAs Medium-Chain Fatty Acids, Acides gras à chaîne moyenne MF Matière Fraîche MG Monoacylglycérols MHDP Meta-Hydroxydiphényle MIA Matériel Insoluble dans l’Alcool MS Matière Sèche NADH+H+ Nicotinamide Adénine Dinucléotide Hydrogène NCT None contain Condensed Tannins NutriPass UMR « Nutrition et Alimentation des populations Aux Suds » OMS Organisation Mondiale de la Santé OVD-CG OVen Drying and Coarse Grinding
ix
OVD-FG OVen Drying and Fine Grinding OVD-FGE OVen Drying, Fine Grinding and Encapsulation PBS Phosphate Buffered Saline PC Palisade Cells PL Phospholipides PTFE Polytetrafluoroethylene, polytétrafluoroéthylène PVC Polychlorure de vinyle RE Retinol Equivalent RG Rhamnogalactroronane SB Sels Biliaires SC Spongy Cells SupAgro Institut national d'études Supérieures AGronomiques de Montpellier TG Triacylglycérols U/mg Unité par milligramme UI Concentration Urinaire en Iode UMR Unité Mixte de Recherche UVD Ultra-Violet Détecteur VB Vascular bundle WB Wet Besis WHO World Health Organization
x
Liste des tableaux
Tableau 1 : Dénomination des isomères des tocophérols et tocotriénols.......................... 12
Tableau 2 : Gains et pertes en composés après traitements de conservation .................. 15
Tableau 3 : Gains et pertes en composés après cuissons thermiques courantes ............. 17
Tableau 4 : Apports nutritionnels conseillés en vitamine A ............................................... 19
Tableau 5 : Apports nutritionnels recommandés en vitamine E ........................................ 20
Tableau 6 : Thai, English and scientific names of the eight leafy vegetables .................... 65
Tableau 7 : Nutritional profile of the fresh leafy vegetables ............................................... 71
Tableau 8 : Micronutrient content of the fresh leafy vegetables ........................................ 72
Tableau 9 : Micronutrient profile of raw and processed drumstick leaves ......................... 87
Tableau 10 : Micronutrient profile of raw and processed chayote leaves ........................ 102
Tableau 11 : Validation of polymer contents from digestive medium............................... 117
Tableau 12 : Polymer contents of 40 digestive medium and percentage of diffusion ...... 118
xi
Liste des figures
Figure 1 : Structure chimique du rétinol et de ses dérivés ................................................. 10
Figure 2 : Structures chimiques et numérotation des carotènes et xantophylles ............... 11
Figure 3: Structures des tocophérols et tocotriénols ......................................................... 12
Figure 4 : Mécanisme de digestion et micellisation des lipides ........................................ 21
Figure 5 : Différentes représentations de micelles ............................................................ 23
Figure 6 : Conversion du β-carotène en vitamine A .......................................................... 28
Figure 7 : Recommandations nutritionnelles en Thaïlande ............................................... 29
Figure 8 : Légumes feuilles importants dans l’alimentation en Thaïlande ......................... 30
Figure 9 : Plats thaïlandais à base de légumes feuilles et d’herbes aromatique ............... 33
Figure 10: Structure des différents tissus et cellules d’une feuille ..................................... 35
Figure 11 : Coupe transversale des feuilles d’épinard....................................................... 35
Figure 12 : Modèle de structure du plastoglobule ............................................................. 37
Figure 13 : Structure des différentes parois végétales ...................................................... 38
Figure 14 : Modèle de la structure de la paroi primaire ..................................................... 39
Figure 15 : Assemblage des fibres cellulosiques .............................................................. 40
Figure 16 : Schéma de l’organisation des celluloses......................................................... 41
Figure 17 : Structure des pectines et de l’acide galacturonique ........................................ 42
Figure 18 : Structure chimique de deux types de tanins .................................................... 45
Figure 19 : Chromatogramme des composés hydrolysés de tanins .................................. 55
Figure 20 : Chromatogramme des caroténoïdes et tocophérols ....................................... 57
Figure 21 : Contents in bioaccessible micronutrients ........................................................ 73
Figure 22. Contents in bioaccessible α-tocopherol ............................................................ 75
Figure 23 : Principal component analysis of the micronutrient bioaccessibility ................. 76
Figure 24 : Treatments applied to drumstick leaves before in vitro digestion .................... 84
Figure 25 : Contents in bioaccessible β-carotene in raw, processed drumstick leaves ..... 89
Figure 26 : Contents in bioaccessible lutein in raw, processed drumstick leaves ............. 89
Figure 27 : Contents in bioaccessible α-tocopherol in raw, processed drumstick leaves .. 90
Figure 28 : Light micrographs of drumstick leaves. ........................................................... 92
Figure 29 : Light micrographs of drumstick leaves. ........................................................... 93
Figure 30 : Treatments applied to chayote leaves before in vitro digestion ....................... 99
Figure 31 : Bioaccessibility of β-carotene in fresh, processed chayote leaves ................ 104
Figure 32 : Bioaccessibility of lutein in fresh, processed chayote leaves ........................ 105
xii
Figure 33 : Light micrographs of chayote leaves ............................................................ 106
Figure 34 : Light micrographs of chayote leaves ............................................................ 107
Figure 35 : Contents in pectins and condensed tannins .................................................. 119
Figure 36 : Schéma de micellisation des caroténoïdes impactée par les pectines .......... 124
Figure 37 : Milieu digestif des légumes feuilles crus ....................................................... 126
xiii
Sommaire
1 INTRODUCTION ..................................................................................................................... 3
2 INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE ................................................................................... 7
2.1 PROBLÈMES DE SANTÉ PUBLIQUE LIÉS AUX CARENCES EN MICRONUTRIMENTS .............. 7
2.2 CARENCES EN MICRONUTRIMENTS DANS LE MONDE ET EN ASIE DU SUD-EST ................ 7
3 VITAMINES LIPOSOLUBLES DANS LES LÉGUMES FEUILLES ET LEURS
COMPORTEMENTS PENDANT LES TRANSFORMATIONS ET LA DIGESTION HUMAINE ....... 9
3.1 VITAMINES LIPOSOLUBLES : VITAMINE A, E ET CAROTÉNOÏDES DANS L’ALIMENTATION .... 9
3.1.1 Structures biochimiques de la vitamine A, des caroténoïdes et tocophérols . 9
3.1.2 Propriétés biologiques et biochimiques des caroténoïdes et tocophérols .... 13
3.1.3 Sources alimentaires de caroténoïdes et tocophérols ................................. 14
3.1.4 Comportement des caroténoïdes et tocophérols pendant les procédés de
transformation des aliments ....................................................................................... 15
3.1.5 Recommandations nutritionnelles ................................................................ 18
3.2 PHYSIOLOGIE DE LA DIGESTION DE LA VITAMINE A, DES CAROTÉNOÏDES ET
TOCOPHÉROLS ................................................................................................................. 20
3.2.1 Digestion des lipides et vitamines liposolubles ............................................ 21
3.2.2 Mécanismes d’absorption des lipides et des vitamines liposolubles ............ 22
3.2.3 Micellisation et bioaccessibilité des caroténoïdes ........................................ 23
3.2.4 Conversion des caroténoïdes provitaminiques ............................................ 27
3.3 LES LÉGUMES FEUILLES DANS L’ALIMENTATION THAÏLANDAISE ................................... 29
3.3.1 Les légumes feuilles consommés ................................................................ 31
3.3.2 Structure des légumes feuilles ..................................................................... 34
3.3.3 Parois pectocellulosiques: primaire, secondaire, lamelle moyenne ............. 37
3.3.4 Constituants des parois pectocellulosique ................................................... 40
3.4 CONCLUSION ET QUESTIONS DE RECHERCHES ......................................................... 46
4 MATÉRIELS ET MÉTHODES ............................................................................................... 49
4.1 LES MATIÈRES PREMIÈRES ET RÉACTIFS .................................................................. 49
4.2 MÉTHODES MICROSCOPIQUES ................................................................................ 49
4.2.1 Inclusion des feuilles crues et transformées ................................................ 49
4.2.2 Coloration des parois cellulaires et protéines .............................................. 50
xiv
4.2.3 Coloration des tanins condensés ................................................................. 51
4.2.4 Coloration des lipides et vitamines liposolubles ........................................... 52
4.3 MÉTHODES BIOCHIMIQUES...................................................................................... 52
4.3.1 Détermination de la matière sèche .............................................................. 52
4.3.2 Dosage des protéines totales ...................................................................... 52
4.3.3 Dosage des parois cellulaires ...................................................................... 52
4.3.4 Dosage des pectines ................................................................................... 53
4.3.5 Dosage des tanins condensés par CLHP .................................................... 54
4.3.6 Dosage des tanins galloylés par CLHP ........................................................ 56
4.3.7 Dosage des caroténoïdes et tocophérols par CLHP .................................... 56
4.4 DÉTERMINATION DE LA BIOACCESSIBILITÉ DES COMPOSÉS PAR DIGESTION IN VITRO..... 57
4.5 MÉTHODES RHÉOLOGIQUES ................................................................................... 59
4.6 ANALYSES STATISTIQUES ....................................................................................... 59
5 RÉSULTATS OBTENUS ....................................................................................................... 60
5.1 CHAPITRE 1 – DÉTERMINANTS DE LA BIOACCESSIBILITÉ DES CAROTÈNES ET DE L’-
TOCOPHÉROLS DANS LES LÉGUMES FEUILLES FRAIS (ARTICLE 1). ......................................... 62
5.1.1 Introduction .................................................................................................. 63
5.1.2 Materials and methods ................................................................................. 65
5.1.3 Results ......................................................................................................... 70
5.1.4 Discussion ................................................................................................... 76
5.2 CHAPITRE 2A – INFLUENCE DES TRAITEMENTS CULINAIRES ET OPÉRATIONS UNITAIRES
SUR LA BIOACCESSIBILITÉ DES CAROTÉNOÏDES ET Α-TOCOPHÉROL DES FEUILLES DE MORINGA 79
5.2.1 Introduction .................................................................................................. 81
5.2.2 Material and methods .................................................................................. 83
5.2.3 Results and discussion ................................................................................ 87
5.2.4 Conclusion ................................................................................................... 94
5.3 CHAPITRE 2B – INFLUENCE DES TRAITEMENTS CULINAIRES ET OPÉRATIONS UNITAIRES
SUR LA BIOACCESSIBILITÉ DES CAROTÉNOÏDES DES BRÈDES CHOUCHOU (ARTICLE 3) ............. 96
5.3.1 Introduction .................................................................................................. 97
5.3.2 Material and methods .................................................................................. 98
5.3.3 Results and discussion .............................................................................. 101
5.3.4 Conclusion ................................................................................................. 108
xv
5.4 CHAPITRE 3 – MISE AU POINT D’UNE NOUVELLE MÉTHODE D’ISOLEMENT ET DE DOSAGE
DES PECTINES ET TANINS PRÉSENTS DANS LE MILIEU DE DIGESTION IN VITRO DE LÉGUMES
FEUILLES (ARTICLE 4) ..................................................................................................... 110
5.4.1 Introduction ................................................................................................ 112
5.4.2 Materials and methods ............................................................................... 113
5.4.3 Results and discussion .............................................................................. 116
5.4.4 Conclusion ................................................................................................. 120
6 DISCUSSION GÉNÉRALE ................................................................................................. 122
7 CONCLUSION ET PERSPECTIVES ................................................................................... 135
8 RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ............................................................................... 138
ANNEXES ................................................................................................................................... 162
ANNEXE 1 : TENEURS EN CAROTÉNOÏDES CONNUS DES LÉGUMES .................................................................. 163
ANNEXE 2 : TENEURS EN CAROTÉNOÏDES ET -TOCOPHÉROL AVANT ET APRÈS TRAITEMENTS DES LÉGUMES ..... 164
ANNEXE 3 : TENEURS EN CAROTÉNOÏDES ET -TOCOPHÉROL AVANT ET APRÈS PROCÉDÉS DE CONSERVATION .. 166
ANNEXE 4 : BIOACCESSIBILITÉ DES CAROTÉNOÏDES ET TOCOPHÉROLS APRÈS LES TRAITEMENTS THERMIQUES .. 167
ANNEXE 5 : COMPOSITION NUTRITIONNELLE DES LÉGUMES FEUILLES COURAMMENT CONSOMMÉS EN ASE ....... 169
ANNEXE 6 : GRADIENT D’ÉLUTION UTILISÉ POUR SÉPARER LES COMPOSÉS PHÉNOLIQUES................................. 170
ANNEXE 7 : GRADIENT D’ÉLUTION UTILISÉ POUR SÉPARER LES CAROTÉNOÏDES ET TOCOPHÉROLS .................... 170
2
Introduction
3
1 Introduction
Cette thèse a été réalisée au sein de l’Unité Mixte de Recherche Nutripass qui
évalue « la nutrition et l’alimentation des populations au Sud » dans l’équipe
« Nutrition aliment ». L'UMR développe des recherches sur les états de nutrition,
leurs déterminants, leurs conséquences ainsi que sur les stratégies et politiques à
mettre en œuvre pour résoudre les problèmes rencontrés. Aujourd’hui, les membres
fondateurs de l’UMR sont l’Université Montpellier, l’IRD, et Montpellier SupAgro. Les
recherches s’intéressent aux problèmes survenant dans le cadre de la transition
alimentaire et de la double charge (carences et excès) qui caractérisent maintenant
la plupart des pays du Sud. Les groupes de populations les plus vulnérables sont
particulièrement visés, notamment les femmes en âge de procréer et les jeunes
enfants cibles de la fenêtre d’opportunité dite « des 1000 jours » (de la conception à
l’âge de deux ans).
L’équipe « Nutrition aliment » étudie plus particulièrement l’effet des procédés de
transformation sur le profil nutritionnel des aliments et la bioaccessibilité de
composés d’intérêt. L’équipe s’intéresse à l’alimentation des groupes vulnérables (en
particulier des jeunes enfants) des pays les moins avancés en cherchant à
comprendre quels sont les facteurs qui conditionnent la biodisponibilité en macro et
micronutriments des aliments par l’étude des relations existantes entre procédés de
transformation, matrices alimentaires, microbiotes et hôte. Les fortes prévalences
des carences en micronutriments comme le fer, le zinc et la vitamine A mais aussi de
l’insuffisance de la couverture des besoins énergétiques des jeunes enfants sont au
cœur des préocupations. L’essentiel du régime alimentaire des populations locales
est basé sur des produits d’origine végétale notamment des céréales, des
légumineuses et des légumes feuilles. Les apports alimentaires en macro et
micronutriments dépendent non seulement de leur teneur mais aussi de leur
bioaccessibilité et biodisponibilité. Les procédés traditionnels de transformation ont
une influence sur ces paramètres ainsi que sur le microbiote des aliments fermentés
et la santé du consommateur. Le financement de cette thèse a été obtenu auprès du
Ministère des Sciences de Thaïlande. Un financement complémentaire du Ministère
des Affaires Étrangères a assuré la mobilité entre les deux pays.
L’objectif général de cette thèse était d’identifier les légumes feuilles intéressants
dans l’alimentation thaïlandaise du point de vue de leur capacité à contribuer à la
4
couverture des besoins en vitamine A. Pour cela, différentes variétés ont été
comparées dans leur capacité à libérer au niveau intestinal les micronutriments
lipophiles par digestion in-vitro. Les déterminants de la bioaccessibilité des carotènes
et de l’α-tocophérol dans les légumes frais ont été identifiés.
Dans un deuxième temps, l’impact des opérations unitaires et traitements culinaires
utilisés pour transformer les légumes feuilles en Asie a été étudié de manière isolée
ou combinée afin de voir comment ils modulent la bioaccessibilité des composés.
L’influence des traitements sur la bioaccessibilité des vitamines liposolubles a été
évaluée d’une part, sur le brède chouchou et, d’autres parts, sur les feuilles de l’arbre
de moringa. En effet, ces dernières sont consommées de manière endémique en
Thaïlande et font l’objet de controverses quant à leurs bénéfices nutritionnels
notamment pour les populations défavorisées. Ces deux variétés de légumes ont des
propriétés avantageuses en terme de profil nutritionnel mais la bioaccessibilité des
micronutriments dans les produits frais est faible. Les transformations culinaires et
opérations unitaires peuvent améliorer l’efficacité biologique des produits lors de
consommation humaine en déstructurant plus ou moins la matrice alimentaire.
L’impact des traitements sur l’organisation cellulaire des légumes feuilles a donc été
évalué par microscopie électronique et coloration spécifique afin d’apporter un
éclairage supplémentaire sur les modulations de la bioaccessibilité des composés
par le procédé. Dans une troisième partie, le rôle spécifique des pectines et tanins
condensés diffusant dans le milieu digestif a été étudié afin de voir si ces polymères
pouvaient empêcher la micellisation et réduire l’absorption des micronutriments. En
effet, de nombreuses études épidémiologiques ont montré que la consommation
fréquente de produits riches en pectines et tanins pouvaient avoir un effet hypo-
cholestérolémiant et diminuer globalement l’absorption des lipides. L’objectif de la
3ème partie de la thèse a donc été de voir si la teneur en caroténoïdes et tocophérol
bioaccessibles des légumes feuilles testés était négativement corrélée avec la
concentration en pectines et tanins du milieu digestif. Pour cela, une méthode de
récupération des polysaccharides et tanins ayant diffusé de l’aliment vers le milieu
digestif a été mise au point. Une étude statistique a permis de tester cette hypothèse.
L’étude bibliographique rappelle les caractéristiques physico-chimiques des
caroténoïdes et vitamines lipophiles (A, E), la digestion des lipides et l’intérêt des
légumes feuilles dans l’alimentation humaine. Le chapitre «Matériels et Méthodes»
5
décrit les techniques qui nous ont permis d’évaluer la bioaccessibilité des composés
par digestion in vitro ainsi que les méthodes utilisées pour déterminer la composition
des aliments (protéines, caroténoïdes, parois cellulaires, tanins), et également leur
structure. Le chapitre « Résultats » est construit en trois parties présentées sous
forme d’article scientifique en anglais :
Partie 1 - Identification des déterminants de la bioaccessibilité des
caroténoïdes et tocophérols dans les légumes feuilles frais. Article 1 -
Sriwichai W, Berger J, Picq C, Avallone S 2016. Determining factors of the
carotenoid and α-tocopherol bioaccessibility in several leafy vegetables
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 64(8):1695-1701.
Partie 2a – Amélioration des teneurs en micronutriments lipophiliques
bioaccessibles des feuilles de moringa fraiches et transformées (Moringa
oleifera Lam.). Article 2 – Sriwichai W, Collin M, Tranbarger TJ, Berger J,
Avallone S. 2016. Improvement of the content in bioaccessible lipophilic
micronutrients in raw and processed drumstick leaves (Moringa oleifera Lam.).
LWT- Food Science and Technology, 75: 279-285.
Partie 2b - Impacts des traitements culinaires et des méthodes de séchages
sur la bioaccessibilité des caroténoïdes des feuilles de brèdes chouchou
(Sechium edule.). Article 3 – Sriwichai W, Collin M, Tranbarger TJ, Berger J,
Avallone S. 2016. Effect of household cooking and drying processing on the
carotenoid bioaccessibility of Chayote leaves (Sechium edule.). Food
Research International. Article soumis le 10 Septembre 2016.
Partie 3 – Nouvelle méthode pour quanfifier les pectines et tanins condensés
dans le milieu digestif in vitro des légumes feuilles. Article 4 – Sriwichai W,
Sann S, Berger J, Avallone S. New method to quantify pectins and condensed
tannins in the in vitro digestive medium of leafy vegetables, (en cours
d’écriture).
Enfin, une discussion générale permet de mettre en perspective les différents
éléments obtenus au cours des expérimentations et voir dans quelle mesure les
légumes feuilles peuvent effectivement contribuer à la couverture des besoins en
vitamines de certaines populations.
6
Introduction
bibliographique
7
2 Introduction bibliographique
22..11 PPrroobbllèèmmeess ddee ssaannttéé ppuubblliiqquuee lliiééss aauuxx ccaarreenncceess eenn mmiiccrroonnuuttrriimmeennttss
La malnutrition touche près de 795 millions de personnes dans le monde. Entre 2014
et 2016, une personne sur neuf souffrait toujours de la faim cachée (FAO, 2016).
Cette faim invisible est causée par l'insécurité alimentaire, le manque de
diversification des régimes qui engendrent des apports inadéquats en
micronutriments (vitamines et minéraux).
Lorsqu’une population est exposée de manière chronique à la malnutrition et
particulièrement les jeunes enfants, un retard de croissance s’installe (l’enfant est
trop petit comparativement aux normes de croissance OMS). En 2011, 165 millions
d’enfants étaient atteints de retard de croissance ; les prévalences les plus élevées
de cette forme de malnutrition se trouvent en Afrique et en Asie pouvant atteindre 42
% des enfants en Afrique de l’Est5. Les carences en micronutriments concernent
deux à trois milliards de personnes selon les estimations et un tiers des enfants en
âge pré-scolaire est atteint de carence en vitamine A. Le retard de croissance n’est
en réalité que la partie visible de cette forme de malnutrition ; les vitamines et les
minéraux, bien que présents à doses infimes dans les aliments, jouent des fonctions
aussi innombrables qu’essentielles dans le corps humain. Ainsi, les carences dont
l’enfant est l’objet vont également compromettre le développement de son cerveau,
diminuer ses capacités d’apprentissage et de motricité et affaiblir son système
immunitaire6.
22..22 CCaarreenncceess eenn mmiiccrroonnuuttrriimmeennttss ddaannss llee mmoonnddee eett eenn AAssiiee dduu SSuudd--EEsstt
Chez les enfants d’âge préscolaire, la prévalence de l’anémie est de 47,4 %, 293
millions d’enfants étant atteints à l’échelle mondiale (OMS, 2015). Durant les
dernières années, malgré la diminution de la prévalence de la carence en iode, 54
pays sont toujours concernés par ce problème (241 millions d’individus). Dans le
monde, 35,2 % d’individus ont un apport en iode insuffisant (concentration urinaire
en iode (UI < 100 µg/L).
5 10 facts on nutrition, WHO 2013, http://www.who.int/features/factfiles/nutrition/facts/en/index1.html
6 Unicef 2013 http://www.unicef.org/nutrition/index_iodine.html
8
Une carence en vitamine A affecte les yeux et peut conduire à la cécité nocturne et
la xérophtalmie « sécheresse des yeux ». Entre 1995 et 2005, 122 pays ont été
concernés par la carence en vitamine A modérée à grave, qui est un sujet de
préoccupation pour la santé publique compte tenu de la prévalence de la cécité
nocturne et de la carence biochimique en vitamine A (concentration sérique en
rétinol < 0,70 µmol/L), respectivement. A l’échelle mondiale, la cécité nocturne
touche 5,2 millions d’enfants d’âge préscolaire et 9,8 millions de femmes enceintes.
La faible rétinolémie affecte 190 millions d’enfant d'âge préscolaire (33,3 %) et 19
millions de femmes enceintes soit 15,3 %. Chaque année, entre 250 000 à 500 000
d’enfants déficients en vitamine A deviennent aveugles et la moitié d'entre eux
meurent dans les 12 mois suivants (OMS, 2015). Ces carences en micronutriments
sont très fréquentes en Afrique et en Asie.
En Asie du Sud-Est, les principales carences en micronutriments sont les carences
en fer, iode et vitamine A (Seshadri, 2001; Seshadri, 2001; Win, 2016). L'Asie
comptabilise le plus grand nombre d’individus avec un apport en iode insuffisant (624
millions d’individus). La prévalence de l’anémie y est de 65,5 %, elle est l’une des
plus élevées chez les enfants d’âge préscolaire par rapport aux autres continents.
L'Asie comptabilise le plus grand nombre d’individus avec un apport en iode
insuffisant (624 millions d’individus soit 39,8 % (McLean et al., 2009; OMS, 2015).
Une faible concentration sérique en rétinol < 0,70 µmol/L est particulièrement visible
chez les enfants et les femmes enceintes. Dans ces régions, on recense 91,5
millions d’enfants d’âge préscolaire (49,9 %) et 6,69 millions de femmes enceintes
(17,3 %) ayant une carence en vitamine A (OMS, 2015; Singh et West, 2004; Semba
et al., 2004; Anderson et al., 2008). Les carences en autres micronutriments et les
carences multiples comme la carence en vitamine A, D, zinc, iode et fer ont
également été signalées (Thurlow et al., 2006; Anderson et al., 2008;
Rojroongwasinkul et al., 2013; Win, 2016). Dans ces régions, la carence en vitamine
B9 (acide folique) concerne de 30 à 50 % de la population et des carences en zinc
ont été détectées chez les femmes enceintes (Seshadri, 2001).
Les carences en micronutriments sont importantes du point de vue de la santé
publique. Chez les enfants, elles diminuent le développement cognitif, les
performances scolaires et le bon développement. Elles réduisent les défenses
9
immunitaires et augmentent le risque de maladies, morbidité et mortalité infectieuses
des mères et des nouveau-nés. Chez les adultes, elles compromettent la capacité de
travail et leur participation au développement économique (Benton, 2008; Victora et
al., 2008 ; Thompson et Amoroso, 2010). Les groupes vulnérables sont les nouveau-
nés, les jeunes enfants, les femmes en âge de procréer, les femmes enceintes et
allaitantes; de manière plus globale, les personnes exposées à la pauvreté. Dans les
pays les moins avancés, les produits animaux sont coûteux et peu accessibles aux
populations les plus pauvres. Les régimes alimentaires sont assez monotones avec
une prépondérance de produits amylacés. Par conséquent, ces groupes vulnérables
sont plus susceptibles de développer des carences en micronutriments. Avec
l'amélioration de la qualité de l'alimentation, le statut en micronutriments est, en
général, amélioré.
3 Vitamines liposolubles dans les légumes feuilles et leurs
comportements pendant les transformations et la digestion
humaine
33..11 VViittaammiinneess lliippoossoolluubblleess :: vviittaammiinnee AA,, EE eett ccaarroottéénnooïïddeess ddaannss ll’’aalliimmeennttaattiioonn
Dans le régime alimentaire humain, la vitamine A peut être apportée sous forme de
rétinol et ses dérivés, ou de caroténoïdes provitaminiques. La vitamine E, quant à
elle, existe sous huit formes naturelles, correspondant à des isomères de
tocophérols et tocotriénols. Après un rappel de la structure biochimique et des
sources alimentaires de ces composés, leurs propriétés biologiques et
comportements pendant les procédés de transformation seront abordés.
3.1.1 Structures biochimiques de la vitamine A, des caroténoïdes et
tocophérols
La vitamine A (ou rétinol) est composée d’un cycle hydrophobe β-ionone, d’une
chaîne isoprénoïde latérale contenant deux unités isoprènes et quatre doubles
liaisons en configuration trans (Figure 1). Cette chaîne peut porter, une fonction
alcool dans le cas de rétinol, un groupement carboxylique dans le cas de l’acide
rétinoïque ou des composés estérifiés (Mensi et al., 2013; Das et al., 2014). Le tout-
10
trans-rétinol a une activité vitamine A de 100 % (Panfili et al., 2008). Dans
l’organisme, cette vitamine est stockée sous forme de rétinyl ester notamment dans
le foie.
Figure 1 : Structure chimique du rétinol et de ses dérivés (Das et al., 2014)
Les caroténoïdes font partie d’une des plus grandes familles de pigments naturels.
De couleur jaune-orangé à rouge, ils sont très répandus dans le monde vivant
(végétaux, animaux, bactéries, champignons). Le β-carotène a été le premier
composé découvert et, à présent, plus de 700 molécules sont connues (Castenmiller
et West, 1998).
Les caroténoïdes peuvent être classés selon leur effet dans le corps humain. En
effet, certains composés (les provitamines A) sont convertis en vitamine A par une
enzyme β-carotene-15,15′-monooxygenase (BCMO1) lors de la digestion. Une autre
façon est de les classer selon leur polarité. Certains caroténoïdes sont des
hydrocarbures polyinsaturés sans aucun oxygène comme, par exemple, le β-
carotène (Figure 2A). D’autres composés oxygénés sont dénommés xantophylles
(contenant les fonctions hydroxyle, époxyde, carbonyle ou carboxyle), comme la
lutéine (Figure 2B). Ces deux sous-groupes sont tous des dérivés chimiques d’une
structure de base de huit unités isopréniques associées en deux groupes de quatre
unités en miroir. Leur squelette linéaire carboné porte 40 atomes de carbone. La
structure de base, le lycopène (C40H56) porte un cycle oxydé ou déshydraté pour
donner les caroténoïdes dérivés (Figure 2C) (Cazzonelli et Pogson, 2010). La
structure générale des caroténoïdes étant symétrique, le squelette est numéroté de 1
à 15 jusqu'au point de symétrie centrale de la molécule puis de 15' à 1'. Les
groupements méthyles sont numérotés de 16 à 20 et, de même, du côté "prime" et la
structure terminale existe sous plusieurs formes.
11
A: Trans-β-carotène
B: Trans-lutéine
C: Trans-Lycopène
Figure 2 : Structures chimiques et numérotation des carotènes et xantophylles
Le terme de vitamine E désigne huit isoformes différentes dont quatre sont des
analogues saturés du tocophérol et les autres des analogues insaturés de
tocotriénols. La structure de base de vitamine E se compose d’une tête polaire
(noyau chromanol) et d’une longue chaîne latérale isoprénoïde contentant 15 atomes
de carbone. Les formes isomères de cette vitamine diffèrent par le nombre de
substitutions méthyles fixées sur le noyau chromanol ce qui donne la forme de α, β, γ
et δ (Tableau 1). Les tocophérols et les tocotriénols se distinguent par leurs doubles
liaisons dans la chaîne latérale isoprénoïde. Naturellement, les tocotriénols
prossèdent trois doubles liaisons sur la chaîne latérale (Figure 3).
12
Tocophérol
Tocotriénol
Figure 3: Structures des tocophérols et tocotriénols
Les petites différences structurelles entre les formes de vitamine E ont un impact
significatif sur leurs activités biologiques dans le corps. Les α- et β-tocotriénols
possèdent une activité vitaminique alors que les formes γ et δ sont inactives. Le
tocotriénol peut être converti en tocophérol dans les tissus humains (Qureshi et al.,
2001; Qureshi et al., 2002).
Tableau 1 : Dénomination des isomères des tocophérols et tocotriénols
R1 R2 R3 Dénomination
CH3 CH3 CH3 α-tocophérol (5,7,8-
triméthyltocol) α-tocotriénol (5,7,8-triméthyltocotriénol)
CH3 H CH3 β-tocophérol (5,8-
diméthyltocol) β-tocotriénol (5,8-
diméthyltocotriénol)
H CH3 CH3 γ-tocophérol (7,8-
diméthyltocol) γ-tocotriénol (7,8
diméthyltocotriénol)
H H CH3 δ-tocophérol (8-méthyltocol) δ-tocotriénol (8-méthyltocotriénol)
13
3.1.2 Propriétés biologiques et biochimiques des caroténoïdes et tocophérols
Les différentes structures chimiques, les longueurs de la chaîne carbonée et le
nombre de doubles liaisons conjuguées intermoléculaires ainsi que les
conformations (cis ou trans) des caroténoïdes déterminent les propriétés
physicochimiques et biologiques différentes. Par la présence des doubles liaisons
polyènes, les caroténoïdes absorbent la lumière dans le spectre visible et ultra-violet,
autour de 450 nm et de 325 à 380 nm. De ces propriétés résultent des couleurs
variables de pigments dans le monde vivant (plantes, organismes). Les caroténoïdes
sont fortement hydrophobes ce qui oriente leur répartition dans l'environnement
cellulaire. A cause de leurs polyinsaturations, ils se dégradent et s'oxydent en
présence de lumière et d’oxygène (Faure et al., 1999).
Dans le corps humain, les caroténoïdes sont associés aux bicouches lipidiques
membranaires et sont transportés dans l’organisme par les lipoprotéines (Borel,
2012). Les caroténoïdes oxygénés, comme la zéaxanthine et la lutéine, jouent un
rôle important dans la vision humaine. Ces composés possèdent des propriétés
antioxydantes et filtrent la lumière bleue de la macula des yeux (Demmig-Adams et
Adams, 2013; Koushan et al., 2013; Bernstein et al., 2016). Les caroténoïdes
hydrocarbures (α-carotène, β-carotène), apportés par la consommation régulière de
fruits et légumes, pourraient prévenir l’apparition de certaines maladies chroniques
comme les cancers et les maladies cardiovasculaires (Machlin, 1995; Poppel et
Goldbohm, 1995; Gey, 1995; Wright et al., 2003; Li et al., 2011).
La vitamine E est impliquée dans de nombreux processus essentiels chez les
animaux et les plantes. Chez les mammifères, le rôle biologique majeur est d'agir en
tant que piégeur de radicaux libres lipophiles et d’inhiber efficacement l'oxydation des
lipides dans la membrane cellulaire. L’α-tocophérol peut inhiber la croissance des
cellules cancéreuses et l’γ-tocophérol (encore plus efficace que l’α-tocophérol) a
également un effet inhibiteur de croissance sur les cellules de cancer de la prostate
chez l’homme (Gysin et al., 2002; Takahashi et al., 2009). Les trois autres
tocophérols ont des propriétés anti-inflammatoires, anti-néoplasiques, et
natriurétiques (Lu et al., 2010; Li et al., 2011). Les tocotriénols ont un pouvoir
antioxydant élevé, et des propriétés anti-inflammatoire, anti-cancérigène,
14
neuroprotecteur et hypolipidémiant (Gysin et al., 2002; Constantinou et al., 2008;
Niki, 2009; Aggarwal et al., 2010; Zaiden et al., 2010).
3.1.3 Sources alimentaires de caroténoïdes et tocophérols
Chez l’Homme, les caroténoïdes sont apportés par la consommation de produits
végétaux et les provitamines A majoritaires sont le α-carotène, β-carotène et la β-
cryptoxanthine. D’autres caroténoïdes non provitaminiques sont également ingérés
tels que la lutéine et le lycopène. Chez les végétaux, les caroténoïdes sont retrouvés
dans les tissus verts photosynthétiques. Les caroténoïdes sont contenus dans les
chloroplastes ou chromoplastes des cellules végétales sous forme de cristalloïdes ou
globules-tubulaires (Schweiggert et al., 2012).
La teneur en caroténoïdes des produits végétaux varient selon les espèces, la
saison, le lieu et les techniques de culture ainsi que le stade de maturité des produits
(Dhuique-Mayer et al., 2005; Toor et al., 2006; Fratianni et al., 2013; Kevrešan et al.,
2013; Lester et al., 2013). Les teneurs en caroténoïdes des légumes sont
accessibles aisément dans la table Ciqual de l’ANSES7 et certaines sont reportées
en Annexe 1. Les caroténoïdes prédominants dans les légumes feuilles verts sont la
lutéine 45 %, le β-carotène 25-30 %, la violaxanthine 10-15 % et la néoxanthine 10-
15 % (Lakshminarayana et al., 2005; Priyadarshani et Jansz, 2013). L’aliment le plus
riche en caroténoïdes provitaminiques (β-carotène, α-carotène) est l’huile de palme
rouge (Monde et al., 2009). Le rétinol et ses dérivés sont présents dans le foie des
poissons et animaux, dans les produits laitiers (lait, fromage, beurre) et les œufs.
Certains salmonidés et crustacés (crevettes) contiennent des carotènes originaux
non provitaminiques tels que l’astaxanthine, le canthaxantine ou l’astacène.
Les principales sources de vitamine E dans l’alimentation sont les huiles végétales et
les produits dérivés de ces huiles. Parmi eux, l’huile de germe de blé et de tournesol
sont les plus riches en α-tocophérol 1330 et 487 mg/kg respectivement (Bramley et
al., 2000). La vitamine E est également apportée par la consommation de céréales
(orge, germe de blé, seigle) et certains fruits oléagineux (noisettes, amandes,
avocats). Les produits d’origines animales sont également des sources de
tocophérols et tocotriénols tels que le foie, les matières grasses du lait et les œufs.
7 https://pro.anses.fr/tableciqual/
15
En revanche, ces isomères sont retrouvés en faibles quantités dans les légumes
feuilles verts.
3.1.4 Comportement des caroténoïdes et tocophérols pendant les procédés de
transformation des aliments
La vitamine A est sensible à différents facteurs chimiques et physiques tels que
l’oxygène, la température, le pH, la lumière (Loveday et Singh, 2008). L’isomérisation
de la vitamine A a lieu au niveau des insaturations de la chaîne latérale
isoprénoïque. L’influence des procédés de transformation sur la stabilité de la
vitamine A a été beaucoup étudiée. Les causes majeures de la destruction des
caroténoïdes pendant la transformation et stockage des produits sont une oxydation
enzymatique et non enzymatique. Quatre types de réactions chimiques peuvent avoir
lieu: réarrangement (i.e. isomérisation), déshydratation, oxydation et clivage (Mordi,
1993). Par conséquence, la transformation entraîne une perte des colorations et
activités biologiques des caroténoïdes.
Les méthodes de conservation préservent les produits de leur dégradation mais
entrainent une perte ou augmentation de la teneur en composés allant de -57 % à
+187 % selon l’opération appliquée (Tableau 2, Annexe 3).
Tableau 2 : Gains et pertes en composés après traitements de conservation
Aliments Paramètres Gains/ Pertes Référence
Épinard Réfrigération, 5°C, 48 h -1% β-carotène, lutéine Granado et al., 1992; Yadav et Sehgal, 1995
Brocoli Congélation, -20°C, 1 an -16% β-carotène Howard et al., 1999.
Épinard Séchage solaire, 10h -57% β-carotène Gliszczyńska-Swigło et al., 2006
Manioc jaune
Séchage solaire, 48h -43% à -79% caroténoïdes totaux
Vimala et al., 2011.
Feuilles de moringa
Séchage solaire, 72 h +187% β-carotène +119 % lutéine +204% α-tocophérol
Saini et al., 2014a.
Carotte Séchage four, 65°C, 7h -35% β-carotène Pinheiro-Sant’Ana et al., 1998
Tomate Four, 160°C, 20 min +115% β-carotène +55% lutéine +47% α-tocophérol
Hwang et al., 2012.
16
Pendant le séchage solaire, les rayonnements UVs peuvent initier des réactions de
dégradations des vitamines, si le temps d’exposition est long. Pourtant après cette
opération, des augmentations de teneurs sont parfois observées (Saini et al., 2014a;
Mulokozi et Svanberg, 2014). Ces augmentations peuvent être dues i) aux
problèmes de coélution au cours des dosages par CLHP, ii) à des extractions
partielles des composés sur matrice crue, iii) aux expressions de résultats sur base
humide sans tenir compte des transferts d’eau ayant lieu pendant les traitements.
Les caroténoïdes des épinards sont plus stables pendant les cuissons dans l’eau et
à la vapeur par rapport aux carottes (Mazzeo et al., 2011). Une augmentation de la
teneur en caroténoïdes et α-tocophérol après les cuissons peut être expliquée par la
destruction enzymatique des caroténoïdes dans les tissus végétaux ou par la rupture
de structure des celluloses de cellule végétale et de la dénaturation des complexes
protéiques-caroténoïdes (liaison covalente existant dans les chloroplastes), ce qui
permet une extraction plus efficace et plus complète des composés (Khachik et al.,
1992; Baloch et al., 1977).
Dans le cas contraire, une perte des caroténoïdes peut être provoquée au niveau de
leurs insaturations qui les rendent sensibles à l'oxygène, à la lumière et à la chaleur
donc ils se dégradent facilement pendant les cuissons. Les pertes et le niveau de
dégradation dépendent de la méthode de cuisson utilisée (milieu, température, durée
de cuisson, …).
Les trois modes de cuisson courants dans les pays en voie de développement sont
la cuisson dans l’eau, la cuisson à la vapeur et la friture. Les méthodes de
conservations des produits alimentaires les plus utilisées sont la déshydratation par
le séchage au soleil. Les pertes ou les gains en pourcentage de caroténoïdes et α-
tocophérol de différentes variétés des légumes cuits comparés aux légumes ont été
étudiés (Tableau 3, Annexe 2).
Les micronutriments sont plus ou moins préservés selon la variété des légumes et
les paramètres de cuisson. La cuisson des aliments dans l’eau entraîne une perte ou
augmentation de la teneur en composés allant de -79 % à +770 % (Zhang et
Hamauzu, 2004; Ferracane et al., 2008). Une grande variabilité de comportement
des caroténoides et vitamines est observée. De nombreux paramètres interviennent
tels que le volume d'eau utilisé pour la cuisson, la durée et la température du
17
traitement thermique, mais aussi la forme de l’aliment (taille, épaisseur) et son état
de division. Par exemple, la perte en caroténoïdes est moins élevée quand les
légumes sont cuits dans une faible quantité d’eau (Lešková et al., 2006).
Tableau 3 : Gains et pertes en composés après cuissons thermiques courantes
Aliments Paramètres Gains/ Pertes Référence
Brocoli Eau, 5 min à 100°C -79% β-carotène Zhang et Hamauzu, 2004
Artichaut Eau, 5 min à 100°C +770% lutéine Ferracane et al., 2008
Brocoli Eau, 16 min à 100°C +381% α-tocophérol Gliszczyńska-Swigło et al., 2006
Riz Eau, 20 min à 105–110°C -23% α-tocophérol Anil Kumar et al., 2006
Citrouille 10 min à 1 bar -71% β-carotène Gayathri et al., 2004.
Amarante, Épinard
Vapeur 10 min -1% β-carotène Yadav et Sehgal, 1995
Artichaut Vapeur 12 min à 1bar +590% lutéine Bernhardt et Schlich, 2006
Brocoli Vapeur 11 min +394% α-tocophérol Ferracane et al., 2008
Épinards Friture 8 min -77% β-carotène Chang et al., 2013
Aubergine Friture 5 min à 170°C +17 fois β-carotène Kalogeropoulos et al., 2007
Courgette Friture 5 min à 170°C +31 fois α-tocophérol
Ferracane et al., 2008
Artichaut Friture 5 min à 170°C +300% lutéine Chang et al., 2013
L’isomérisation des formes trans en cis-isomères des caroténoïdes et la cinétique de
ces réactions ont été étudiées après la cuisson des fruits et légumes dans l’eau, la
friture à 180°C, le blanchiment, le séchage, la pasteurisation, la stérilisation et
l’homogénéisation haute pression. Globalement, l’isomérisation est plus prononcée
quand la température, la durée de traitement, l’exposition à la lumière et la surface
de contact (ie., découpe /broyage aliment) avec le fluide caloporteur sont importantes
(Chandler et Schwartz, 1987; van den Berg et al., 2000; Marx et al., 2003; Aman et
al., 2005; Dutta et al., 2006; Vásquez-Caicedo et al., 2007; Hiranvarachat et al.,
2008; Achir et al., 2010; Bengtsson et al., 2010; Colle et al., 2010; Lemmens et al.,
2010a; O’Sullivan et al., 2010; Knockaert et al., 2012a).
18
Les teneurs en caroténoïdes et vitamine E après les procédés émergents.
- Les pertes (-22 % de lutéine et zéaxanthine et -67 % de α-carotène) ou gains en
caroténoïdes ont été évaluées durant la cuisson/décongélation des aliments aux
micro-ondes (Bengtsson et al., 2009; Page et al., 2012; Stinco et al., 2013).
- Le blanchiment également provoque une perte en β-carotène plus importante que
celle du lycopène (Svelander et al., 2010).
- La stérilisation entraîne une dégradation significative de la teneur en lycopène
(Knockaert et al., 2012a).
- La pasteurisation (90-105°C,15-30 s) réduit de 10 % à 46 % la teneur en
caroténoïdes de jus d’orange (Stinco et al., 2012; Lee et Coates, 2003; Gama et
de Sylos, 2007).
- Le traitement haute pression (400 MPa) augmente en général de 22 % la teneur
en trois isomères tocophérols de la vitamine E du lait de soja-fruité, mais entraîne
une perte de l’α-tocophérol 13 % et 27 % dans le cas du lait entier (Cilla et al.,
2012).
Le traitement thermique peut casser les parois cellulaires et améliorer l’extractabilité
des caroténoïdes et tocophérols ; cependant, une température élevée accroît
l’isomérisation et les dégradations des composés (Hwang et al., 2012).
3.1.5 Recommandations nutritionnelles
Il est possible de déduire de la teneur en caroténoïdes provitaminiques des aliments
leur capacité à fournir de la vitamine A en calculant les équivalents rétinol (ER).
L’ANSES préconise un facteur de conversion de 6 µg de β-carotène pour 1 µg ER,
tandis qu’un facteur de conversion de 12 µg est appliqué pour les autres
caroténoïdes (-carotène, -cryptoxanthine) pour des raisons de faible conversion de
ces derniers.
19
Tableau 4 : Apports nutritionnels conseillés en vitamine A (FAO, 2004) 8
Tranche d’âge µg ER*/Jour
Enfant 0-6 mois 375
Enfant 7-12 mois 400
Enfant 1-3 ans 400
Enfant 4-6 ans 450
Enfant 7-9 ans 500
Adolescents 10-18 ans 600
Femmes adultes 19-65 ans 500
Femmes adultes 65+ ans 600
Hommes adultes 19-65 ans 600
Hommes adultes 65+ ans 600
Femmes enceintes 800
Femmes allaitantes 850
*RE: Équivalent de rétinol; 6 µg de β-carotène pour 1 µg ER
Un apport en caroténoïdes par l’alimentation ne présente pas de risque d’intoxication
car l’organisme peut réguler la conversion des caroténoïdes quand le corps est en
excès de ces derniers. Il n’existe pas de recommandations spécifiques pour les
caroténoïdes car ils n’appartiennent pas aux molécules essentielles pour l’homme ni
aux substances toxiques. En revanche, les apports nutritionnels conseillés en
vitamine A sont définis (Tableau 4).
Selon la FAO, les données sont insuffisantes pour formuler des recommandations
concernant la vitamine E pour les différentes tranches d’âge de la population excepté
les enfants. Malgré tout, une recommandation a été proposée par le Food and
Nutrition Board (FNB) de l'Institut de médecine des Académies nationales (National
Academy of Sciences) développée par les scientifiques américains et canadiens
(Tableau 5). L’apport nutritionnel recommandé de la vitamine E est souvent indiqué
en ancienne unité internationale (UI). Le facteur de conversion (1,5) en activité
8 Requirements of vitamin A, iron, folate and vitamin B12. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation. Rome, Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2004 (FAO Food and Nutrition Series, No. 23).
20
vitamine E est calculé par rapport à l'α-tocophérol car ce dernier isomère est la forme
la plus active de la vitamine E.
Tableau 5 : Apports nutritionnels recommandés en vitamine E d’α-tocophérol naturel9
Tranche d’âge Quantité (mg/UI*)
Enfant 0-6 mois 4 mg/6 UI**
Enfant 7-12 mois 5 mg/7,5 UI**
Enfant 1-3 ans 6 mg/9 UI
Enfant 4-8 ans 7 mg/10,5 UI
Adolescents 9-13 ans 11 mg/16,5 UI
Adultes +14 ans 15 mg/22,5 UI
Femmes enceintes 15 mg/22,5 UI
Femmes allaitantes 15 mg/22,5 UI
* Un milligramme d'α-tocophérol équivaut à 1,5 UI. **En l'absence de données scientifiques suffisantes, les autorités ont fixé un apport suffisant
33..22 PPhhyyssiioollooggiiee ddee llaa ddiiggeessttiioonn ddee llaa vviittaammiinnee AA,, ddeess ccaarroottéénnooïïddeess eett
ttooccoopphhéérroollss
La digestion des aliments commence par le broyage au niveau buccal, puis passage
par le tube digestif (l’œsophage, l’estomac et l’intestin). Dans l’estomac, certains
micronutriments sont piégés par la matrice alimentaire, ils sont libérés par les
enzymes gastriques et assimilés au niveau l’intestin grêle. D’un point de vue
physiologique, les micronutriments lipophiliques doivent être libérés de la matrice
alimentaire pour être incorporés dans les micelles pendant la digestion avant d’être
absorbés (bioaccessibilité) (Parada et Aguilera, 2007). La biodisponibilité est définie
comme une fraction des nutriments digérés qui devient disponible pour assurer des
fonctions physiologiques normales au niveau d’un tissu cible ou pour le stockage
(Jackson, 1997).
9 Dietary Reference Intakes for Vitamin C, Vitamin E, Selenium, and Carotenoids, 2000. Food and Nutrition Board, Institute of Medicine.
21
3.2.1 Digestion des lipides et vitamines liposolubles
La digestion des vitamines liposolubles est comparable à celle des lipides (Furr et
Clark, 1997). Elles nécessitent un mécanisme d’absorption particulier différent de
celui des molécules hydrosolubles. Les lipides sont un ensemble de substances
organiques caractérisées par la présence d'acides gras (AG) aliphatiques avec un
nombre de carbone supérieur à 4. Ils sont, le plus souvent, présents sous formes
d’esters d'acides gras. Les acides gras (AG) peuvent être classés selon la longueur
de leur chaîne: les AG à chaînes courtes (AGCC) (2 à 4 carbones), à chaînes
moyennes (AGCM) (5 à 12 carbones) et à chaînes longues (AGCL) (plus de 12
carbones). Généralement, les AG libres sont peu présents dans l'alimentation; ils
sont intégrés aux triacylglycérols (TG) (92 à 96 % des lipides alimentaires) et aux
phospholipides (PL).
Figure 4 : Mécanisme de digestion et micellisation des lipides (Wang et al., 2013)
La digestion des lipides (TG) nécessite d’une part, une hydrolyse des triacylglycérols
et d’autre part, une micellisation des acides gras libres par les acides biliaires (Figure
4). L'hydrolyse des TG commence au niveau buccal par l’action d’une lipase salivaire
puis se poursuit au niveau gastrique et duodénal avec d’autres lipases spécifiques
(Mu et Porsgaard, 2005; Favé, 2006). La lipase gastrique hydrolyse de 10 à 30 %
des TG ingérés (Armand et al., 1999). Les AG contenus dans le chyme gastrique
stimulent la libération de cholécystokinine par la muqueuse duodénale, ce qui
22
provoque l'excrétion simultanée d’enzymes pancréatiques et de bile, elle-même,
composée de sels biliaires, acides biliaires, CHOL et PL (Liddle et al., 1985).
La lipase pancréatique (déversée dans le duodénum) est une enzyme principale de
digestion des TG. Celte enzyme libère les AG libres et monoacylglycérols (MG),
forme absorbable au niveau intestinal (caractérisée par la présence de son AG en
position sn-2 forme prédominante des MG) en scindant les AGCL à l’extrémité du
glycérol de squelette en position sn-1 ou sn-3 (Hofmann et Borgström, 1963; Sternby
et al., 1991).
3.2.2 Mécanismes d’absorption des lipides et des vitamines liposolubles
À cause de leur insolubilité dans l'eau, les TG s'agrègent en grosses gouttelettes
lipidiques dans le tube digestif, limitant ainsi la surface d'action des enzymes
lipolytiques. L'émulsification vise à disperser les grosses gouttelettes en structures
de petites tailles (diamètre d'environ 1 mm). Cette étape est initiée dans le
duodénum par l’action des sels biliaires qui agissent en tant que tensioactifs. Les TG
et leurs produits d'hydrolyse (MG et AG) s'associent avec les sels biliaires et forment
de petites gouttelettes émulsifiées, appelées micelles. Les micelles peuvent contenir
jusqu'à 40 molécules de sels biliaires. La bile est un liquide jaune-verdâtre composé
principalement d'acides et sels biliaires, cholestérol, phospholipides et pigments
biliaires (bilirubine, biliverdine) dissouts dans une solution alcaline. Les acides
biliaires sont synthétisés dans les hépatocytes à partir du cholestérol. Les micelles
composées de lipides et sels biliaires sont appelées micelles mixtes et se présentent
sous forme de microsphères ou cylindres riches en lipides et entourés par les acides
biliaires (Figure 5).
23
Figure 5 : Différentes représentations de micelles : sphérique (A), cylindrique (B), sphérique à bicouche planaire (C) (Small et al., 1969; Šegota et Težak, 2006; Madenci et al., 2011)
3.2.3 Micellisation et bioaccessibilité des caroténoïdes
Pendant la digestion, les lipides sont dispersés sous forme d'émulsion grâce aux
enzymes lipolytiques et sels biliaires décrits précédemment. Ils se solubilisent dans
les micelles mixtes qui peuvent être absorbés par les entérocytes. Les vitamines
liposolubles et les caroténoïdes libres seront absorbés par la muqueuse intestinale.
Cependant, la dispersion des caroténoïdes est fortement limitée dans le fluide
digestif en raison de la forte hydrophobicité de leur squelette isoprénoïde composé
de 40 atomes de carbone. Les caroténoïdes subissent une hydrolyse enzymatique
(lipase pancréatique) (Borel et al., 2001; Basu et Donaldson, 2003; Harrison, 2005;
Kotake-Nara et Nagao, 2011). Cette hydrolyse commence dans l'estomac, où la
lipase gastrique hydrolyse environ 17,5 % des triacylglycérols (Carriere et al., 1993).
L'hydrolyse des esters de la vitamine A se fait essentiellement dans le duodénum. Le
suc pancréatique contient deux enzymes principales qui pourraient effectuer cette
hydrolyse: l’hydrolase d'ester de cholestérol et la lipase pancréatique (LP).
24
Déterminants de la biodisponibilité des caroténoïdes
La bioaccessibilité et la bioconversion des caroténoïdes dépendent de nombreux
facteurs décrits par un acronyme SLAMENGHI. Les facteurs les plus importants sont
le type de caroténoïdes, les liaisons au niveau moléculaire, la teneur en
caroténoïdes, les effets de la matrice alimentaire, la présence d’effecteurs, le statut
en micronutriments de l’individu, la variabilité génétique, les facteurs liés à l’individu
et les interactions entre ces variables (Castenmiller et West, 1998). La présence de
parois cellulaires réduit la bioaccessibilité des caroténoïdes et lipides (Waldron et al.,
2003; Ellis et al., 2004; Lemmens et al., 2010b; Tydeman et al., 2010a).
Effet du régime alimentaire
Les repas riches en lipides favorisent la dispersion des caroténoïdes et vitamines
lipophiles; ils influencent la structure de l’émulsion et la micellisation des composés
(Borel et al., 1996; Tyssandier et al., 2001; Harrison, 2005; Bengtsson et al., 2009).
En revanche, la consommation régulière d’aliments riches en composés phénoliques
affecte le métabolisme des lipides et a un effet hypolipidémiant (Crespy et
Williamson, 2004). Des études in vitro et in vivo, montrent qu’une consommation
régulière de thé vert diminue l’absorption des lipides dans l’intestin (Koo et Noh,
2007). Les catéchines interfèrent avec l’émulsification, la digestion, et la micellisation
des lipides; ce dernier phénomène étant un facteur clé du mécanisme de l’absorption
intestinale des lipides. Par ailleurs, sur modèle cellulaire Caco-2, certains
polyphénols (i.e., naringenine) diminuent la biodisponibilité des caroténoïdes
(Tachibana et al., 2004).
Pendant la digestion, les aliments riches en pectines limitent la micellisation des
composés lipophiles par la formation d’une sorte de gel dans le tube digestif (Borel et
al., 1996; Verrijssen et al., 2014). De par leurs propriétés physicochimiques, les
pectines augmentent la viscosité du milieu digestif duodénal et réduisent l’efficacité
des lipases digestives et des acides biliaires (Koseki et al., 1989; Pasquier et al.,
1996; Wang et al., 2001). Chez l’homme, les études cliniques ont mis en évidence
l'effet négatif des régimes alimentaires riches en pectines sur la biodisponibilité des
caroténoïdes (Rock et Swendseid, 1992; Riedl et al., 1999).
25
Effets de la structure des aliments et influences des procédés à l’échelle
cellulaire
La structure des parois cellulaires déterminent la solidité du tissu végétal et
l’adhésion des cellules entre elles (Waldron et al., 1997). Au cours de la maturité des
fruits et légumes et de la transformation, les cellules peuvent se séparer grâce à un
mécanisme de dissolution de la lamelle moyenne riche en polysaccharides
pectiques. La structure des tissus de la plante dépend également des liaisons
chimiques des macromolécules de la paroi cellulaire. Certains composés
phénoliques peuvent établir des interactions avec les polysaccharides de la paroi
cellulaire (Kitamura, 2006).
Les caroténoïdes sont localisés dans les chromoplastes, eux même entourés par la
paroi cellulaire (Vishnevetsky et al., 1999). Les légumes ont des structures
complexes ; la matrice joue un rôle important dans la libération et l'absorption des
nutriments (Parada et Aguilera, 2007; Kong et Singh, 2008). Les bioaccessibilités
des caroténoïdes et tocophérols de différentes variétés de légumes cuits sont
reportées en Annexe 4.
Le broyage ou les traitements thermiques peuvent déstructurer la matrice, libérer des
micronutriments et améliorer la bioaccessibilité. Leur libération et incorporation dans
les micelles dépend du niveau de rupture des tissus végétaux et cellules pendant la
mastication et le processus de digestion (Low et al., 2015).
Les fragmentations de l’aliment (fruits et légumes) en petits morceaux par l’action
mécanique (i.e., coupage, haché, homogénéisation ou broyage) améliorent la
bioaccessibilité des caroténoïdes. Le relargage de ces composés d’intérêt de leurs
matrices est facilité par la rupture des parois cellulaires (Castenmiller et al., 1999;
Hedrén et al., 2002a; Lemmens et al., 2010b; Tydeman et al., 2010b; Netzel et al.,
2011; Svelander et al., 2011; Knockaert et al., 2012b; Moelants et al., 2012 ; Palmero
et al., 2013).
Les procédés mécaniques, décrits précédemment, cassent les parois cellulaires de
l’aliment, tandis que les cuissons thermiques les rendent plus souples donc facilitent
la rupture. La souplesse des parois cellulaires est liée au changement de la propriété
chimique des pectines (i.e., diminution leur degré de méthylation). La pré-cuisson ou
26
la cuisson prolongée à température élevée dans un milieu acide, favorise une
dépolymérisation chimique non enzymatique (β-élimination) des pectines donc
diminue leur degré de méthylation, et par conséquence entraine une dégradation de
la texture des produits (Smout et al., 2005; Sila et al., 2006; Diaz et al., 2007; Fraeye
et al., 2007; Ribas-Agustí et al., 2014). La concentration des pectines et leur degré
de méthylation jouent un rôle important sur la bioaccesibilité des caroténoïdes qui est
généralement modulée après les cuissons thermiques (Lemmens et al., 2009;
Verrijssen et al., 2014).
La rupture des parois cellulaires par les procédés de transformations ou les cuissons
thermiques entraine une dispersion des contenus des parois (cellulose, protéine,
pectines,…) dans un bol alimentaire. Du point de vue physiologique, la digestion des
vitamines liposoluble est influencée par les propriétés rhéologiques du milieu digestif.
Les contenus des parois dispersés, particulièrement les pectines, augmentent la
viscosité du milieu digestif qui empêche la micellation des composés d’intérêt donc
diminuent la bioaccessibilité (McClements et al., 2008 ; Ornelas-Paz et al., 2008;
Verrijssen et al., 2014; Cervantes-Paz et al., 2016).
De nombreuses études ont été menées pour étudier les influences des cuissons
sur les caroténoïdes dans les différentes variétés de légumes mais peu d’études ont
été réalisées sur la bioaccessibilité de la vitamine E (Reboul et al., 2006; Reboul et
al., 2007; Cilla et al., 2012).
La bioaccessibilité des caroténoïdes dans les légumes frais est assez faible (ie., β-
carotène et lutéine < 10 %) (Ryan et al., 2008; Veda et al., 2008; Vimala et al., 2011;
Gomes et al., 2013; Courraud et al., 2013). Cette bioaccessibilité est généralement
améliorée après les cuissons thermiques (cuisson dans l’eau, à la vapeur et friture).
Selon la nature de produits (taille, épaisseur), les méthodes de transformation
(coupage, broyage), milieu de la cuisson (eau, huile) et les paramètres de cuisson
(durée, température), on observe une augmentation plus ou moins élevée. Par
exemple, la bioaccessibilité du β-carotène de différents variétés des légumes est
améliorée allant de 7 % à 95 %, de la lutéine de 51 % à 57 % après la cuisson dans
l’eau, à la vapeur et à la friture (Hornero-Méndez et Mínguez-Mosquera, 2007; Ryan
et al., 2008; Veda et al., 2010; Courraud et al., 2013; Mandalari et al., 2013).
27
Le fait de faciliter la rupture des parois cellulaire des aliments par la chaleur, permet
de libérer plus les micronutriments à l’incorporation avec les micelles par conséquent
augmenter la bioaccessibilité. La friture est un traitement à haute température, où le
transfert de chaleur favorise la vaporisation de l’eau contenue dans les aliments ; au
cours de l’opération unitaire, la vapeur produite explose les cellules de la matrice
alimentaire et crée une structure plus poreuse. Ainsi, la friture de produits amylacés
(manioc, patates douces) serait particulièrement intéressante et augmenterait la
bioaccessibilité du β-carotène de 14 % et 54 % (Tumuhimbise et al., 2009; Veda et
al., 2010).
Au cours de la préparation des mets, l’ajout de lipides augmente la bioaccessibilité
des caroténoïdes (Hedrén et al., 2002b; Hornero-Méndez et Mínguez-Mosquera,
2007; Huo et al., 2007; Bengtsson et al., 2009; Bechoff et al., 2011; Colle et al.,
2012; Moelants et al., 2012; Schweiggert et al., 2012; Victoria-Campos et al., 2013).
Le type de lipides utilisé lors des pratiques culinaires influence la bioaccessibilité des
vitamines liposolubles. Les lipides digestibles contenant des acides gras à longue
chaîne (LCFAs) sont plus efficaces pour améliorer la bioaccessibilité que ceux
contenant des acides gras à chaîne moyenne (MCFAs) (Qian et al., 2012; Rao et al.,
2013; Yang et McClements, 2013; Colle et al., 2012; Salvia-Trujillo et al., 2013;
Ozturk et al., 2015; Salvia-Trujillo et al., 2015; Zhang et al., 2015b).
3.2.4 Conversion des caroténoïdes provitaminiques
Les caroténoïdes provitaminiques contiennent un noyau β avec au moins onze
atomes de carbone sur la chaîne polyène. Ils sont non-substitué par des fonctions
oxygénées et peuvent libérer du rétinol (vitamine A, Figure 6) tels que α- et β-
carotène, et la β-cryptoxanthine. Seulement 10 % des caroténoïdes sont des
provitamines A. Le β-carotène est un dimère de rétinal qui peut être clivé en vitamine
A (rétinol) ; il possède une activité provitaminique élevée (100 %). Le processus
métabolique de conversion des caroténoïdes provitaminiques en rétinol se fait par
une oxydation avec un clivage central de la molécule catalysé par des enzymes.
Plusieurs enzymes spécifiques des caroténoïdes situées principalement dans le
cytosol de l'intestin interviendraient ; les plus connues sont la β-β-carotène 15,15’-
mono oxygénase 1 (BCMO1) et la 15,15’-dioxygénase (Lietz et al., 2012). La
28
scission par oxydation du β-carotène dans le plan de symétrie entre C-15 et C-15’
donne le rétinal (aldéhyde de la vitamine A) qui est ensuite réduit en rétinol par une
enzyme réductase NADH+H+ (Basu et Donaldson, 2003). Le mécanisme de
conversion est représenté dans la figure suivante.
Figure 6 : Conversion du β-carotène en vitamine A par la β-β-carotène 15,15’-dioxygénase (Basu et Donaldson, 2003)
Cette bioconversion est soumise à une régulation car elle est d’autant plus faible que
l’apport en vitamine A est important (Yeum et Russell, 2002), et incomplète car son
rendement n’est pas de 100 % (Murphy, 2002). Le clivage peut être excentré ou
diminué par différents facteurs. Afin de prendre en compte l’activité vitaminique A
globale d’un aliment, un groupe d’experts communs à l’OMS et à l'Organisation des
Nations Unies pour l'Alimentation et l’Agriculture a défini, en 1965, une unité
internationale (UI) basée sur l’équivalence d’activité rétinol. Cette unité a évolué
depuis sa création et, aujourd’hui, les Equivalents d’Activité Rétinol (EAR)
correspondent à 1 µg de rétinol, à 12 µg de β-carotène, à 24 µg de α-carotène, de β-
cryptoxanthine, ou cis-isomères du β-carotène (Murphy, 2002). Ces chiffres sont
toujours l’objet de recherche et controverses (Tang, 2010).
29
33..33 LLeess lléégguummeess ffeeuuiilllleess ddaannss ll’’aalliimmeennttaattiioonn tthhaaïïllaannddaaiissee
Les fruits et légumes font partie de l’alimentation de base en Thaïlande. Une
consommation de fruits et de légumes est généralement recommandée car ce sont
de bonnes sources de vitamines et de minéraux. L’augmentation d'une portion de
fruits et légumes par jour réduit les risques de maladies coronariennes de 4 %, le
risque d'accident vasculaire cérébral de 6 %. Leur consommation participe à la
diminution de la pression artérielle et à la prévention durable de certaines maladies
chroniques (obésité, certains cancers, etc.) (Appel et al., 1997; Joshipura et al.,
2001; Ammerman et al., 2002). La recommandation quotidienne de consommation
de fruits et légumes est « au moins 5 portions/jour » avec des portions de 80 g
(OMS, 2003)10.
En Thaïlande, les recommandations alimentaires sont faites sous forme de drapeau
de nutrition dont le but est d’encourager et promouvoir une alimentation plus saine
avec une bonne quantité de fruits et légumes (Figure 7).
Figure 7 : Recommandations nutritionnelles en Thaïlande
10 OMS: Promouvoir la consommation de fruits et légumes dans le monde ;
http://www.who.int/dietphysicalactivity/fruit/fr/
30
Cette recommandation préconise aux thaïlandais de consommer quotidiennement
quatre à six portions de légumes et de trois à quatre portions de fruits. En général,
les individus ne consomment pas assez de fruits et légumes. Le changement rapide
de la vie sociale et l'occidentalisation des comportements au cours des dernières
décennies ont été associés à des changements dans la consommation alimentaire
des individus (Winichagoon, 2013). Une augmentation de la consommation de
produits issus des fast-foods et de boissons gazeuses a été observée (Kosulwat,
2002).
L’alimentation est basée sur la consommation de riz associé à des
accompagnements à base de viandes, fruits de mer, poissons, légumes et herbes
(Kosulwat, 2002).
Figure 8 : Légumes feuilles et herbes aromatiques importants dans l’alimentation en Thaïlande: a) Liseron d’eau (Ipomoea aquatica Forsskal.), b) Chou chinois (Brassica oleracea L. var. alboglabra Bailey), c) Pak choi (Brassica chinensis L. var. parachinensis Bailey), d) Moringa (Moringa oleifera Lam.), e) Chaphlu (Piper sarmentosum Roxb.), f) Brède chouchou (Sechium edule Jacq.), g) Coriandre (Coriandrum sativum L.), h) Menthe (Mentha spicata L.) et i) Basilic Thaï (Ocimum basilicum L.)
La disponibilité des produits animaux a augmenté pendant les dernières décennies,
mais compte tenu de leur disponibilité encore faible et de leur prix élevé, ils sont
consommés modérément. Le soja contribue de manière importante aux apports en
31
protéines. Les légumes feuilles ont une place prépondérante dans l’alimentation, et
les variétés principalement consommées11 sont présentées dans la figure 8.
En Thaïlande, les légumes sont consommés environ 5 jours par semaine. Le nombre
moyen de portions (½ tasse de légumes cuits, 1 tasse de légumes crus) de légumes
consommés est 1,8 (Satheannoppakao et al., 2009). Les femmes thaïlandaises
consomment plus fréquemment les légumes que les hommes. Cette consommation
ainsi que celles des fruits augmente avec le niveau d'éducation et les revenus du
ménage. Il existe donc un gradient croissant de consommation du milieu rural vers le
milieu urbain. La majorité des fruits et légumes sont cultivés dans les zones rurales
et transportés vers les marchés urbains. Par conséquent, la disponibilité,
l'accessibilité et la variété des fruits et légumes sont plus élevées dans les grandes
villes (Kanungsukkasem et al., 2009; Satheannoppakao et al., 2009). Leurs teneurs
en micronutriments sont présentées dans l’annexe 5.
3.3.1 Les légumes feuilles consommés
La Thaïlande est un pays agricole et l’économie nationale dépend en partie de
l'exportation du riz et des produits alimentaires. Sur la superficie totale de 51 millions
d'hectares du pays, environ 20,8 millions d'hectares (41 %) sont classés comme
terres arables, 0,8 millions sont dédiés au pâturage, 13,5 millions d'hectares (26 %)
correspondent aux forêts, et 15,9 millions d'hectares (31 %) sont non classés4. Les
exploitations se répartissent pour la riziculture (11 010 000 ha), pour les cultures de
montagne (5,2 millions d'hectares), pour les fruits et les cultures arboricoles (3 330
000 ha), pour les légumes et fleurs (140 000 ha) et pour les pâturages (0,12 millions
d'hectares). Comparativement aux récoltes de légumineuses ou céréales, les
cultures de légumes donnent des rendements élevés atteignant 10-30 tonnes/ha.
Plusieurs variétés de légumes sont cultivées dans les zones rurales au niveau des
ménages et pour l’autoconsommation, la vente locale ou la commercialisation en
ville. Les espèces sont nombreuses et les plantes sont parfois cultivées pour
plusieurs parties comestibles (i.e. chou chinois, chou pommé, la tomate, le
gingembre et l'échalote).
11 FAO, the vegetable sector in Thailand review, 1999; http://www.fao.org.
32
La culture de légumes fait partie intégrante de la vie rurale et périurbaine ; elle
constitue la principale source de revenu des ménages12. La production de légumes
varie considérablement selon les régions, les deux principales étant les régions du
Nord et Nord-Est. Les villes principales concernées sont Pathum Thani, Nonthaburi,
Nakhonpathom, Ratchaburi, Nakhon Ratchasima, Chiang Mai et Songkhla (Centre
for Agricultural Information, 1996). Les productions sont même exportées vers la
capitale ou l’étranger.
Les légumes les plus courants sont le liseron d’eau, les ciboulettes chinoises, le chou
frisé chinois, Pak Choy et le mini concombre. L’accessibilité des légumes est
différente selon la région et la saison. Par exemple, les populations vivant près des
points d’eau ou des rivières ont un accès facile aux légumes grâce à la pratique de la
culture et cueillette des légumes verts (i.e. liseron d’eau). En revanche, dans la
région du Nord-Est, une région plus grande en superficie et de population, avec une
disponibilité modérément faible de légumes (38,2 kg/personne/an), l’accessibilité des
légumes dans les groupes à faible revenu est limitée au jardinage et à la collecte de
légumes indigènes dans les forêts5. Le système de commercialisation et de transport
des légumes en Thaïlande est efficace et assez bien organisé. Les légumes produits
dans les régions rurales sont transportés et distribués dans les grandes villes ou les
grands marchés locaux. Les grands marchés de légumes dans chaque région sont5:
dans la région centrale : Pathumthani
dans le Nord : Chiang Mai
dans le Nord-Est: Udonthani et Nakhonratchasima
dans l’Ouest : Nakhonpathom et Angthong
dans le Sud : Nakornsrithammarat
dans le centre urbain : Bangkok
Les légumes sont consommés de différentes façons: les légumes crus sont
couramment utilisés comme plat d'accompagnement alors que les légumes cuits
sont consommés mélangés avec de la viande, du poisson et d'autres aliments. Les
pratiques culinaires courantes utilisées sont le sauté, la grillade, la cuisson dans
l’eau et la friture.
12 FAO, the vegetable sector in Thailand review, 1999; http://www.fao.org.
33
Figure 9 : Plats thaïlandais à base de légumes feuilles et d’herbes aromatiques: a) Salade des légumes feuilles, b) Soupe d’escargot et feuille de chaphlu au curry, c) Sauté de liseron d’eau, d) Salade de légumes feuilles, e) Omelette aux feuilles de moringa, f) Sauté de brède chouchou, g) Salade de poulet haché épicé à la menthe, h) Sauté de foie de porc à la coriandre et i) Soupe de curry vert au basilic thaï
Un repas thaïlandais commun se compose de riz, légumes cuits, et d’un plat de
curry. Les légumes sont souvent cuits à l'eau, dans l'huile, incorporés avec le lait de
coco. Ils sont blanchis et servis avec des sauces piments d’oiseaux, et même
consommés sous forme brute. Les populations à faibles revenus consomment du riz
gluant, les légumes avec des sauces piments et du poisson séché ou du poulet rôti.
La plupart des légumes sont consommés non transformés, en conserve ou marinés.
34
Les légumes déshydratés sont principalement utilisés comme ingrédients dans la
préparation de soupes13.
Les herbes aromatiques couramment utilisées dans la cuisine thaïlandaise sont le
basilic Thaï, le coriandre et la menthe. Les plats typiques thaïlandais à base de
légumes feuilles sont présentés ci-dessus (Figure 9).
3.3.2 Structure des légumes feuilles
Les feuilles sont les principaux organes photosynthétiques des plantes. L'énergie de
la lumière y est convertie en énergie chimique. Une feuille contient entre 80 et 90 %
d’eau et 10 à 20 % de matière sèche. Elle est composée de trois tissus différents : le
derme, le réseau vasculaire.
Le tissu dermal ou l'épiderme, est une couche protectrice externe qui sert à la
défense contre les blessures et l'invasion par des organismes étrangers. Sur la
surface de la feuille, il sécrète une substance cireuse formant une couche, appelée la
cuticule, permettant de limiter les pertes en eau. L'épiderme inférieur est percé de
pores appelés stomates. Ceux-ci permettent aux échanges gazeux cellulaires et à la
lumière d’atteindre les couches cellulaires plus profondes. Le mésophylle est
constitué d'un parenchyme jouant un rôle important dans la photosynthèse. Il est
subdivisé en deux parties: vers la face supérieure, le parenchyme palissadique,
riches en chloroplastes, et vers la face inférieure se trouve le parenchyme lacuneux
(ou spongieux).
Le tissu vasculaire est responsable du transport de l'eau et des éléments nutritifs
dans toute la plante. Deux types de cellules composent ces tissus : les cellules du
xylème qui déplacent l'eau, et les cellules de phloème, qui transportent les
nutriments.
Les tissus de soutien peuvent être divisés en trois catégories, en fonction de la
nature des parois cellulaires. (1) Les cellules du parenchyme: elles ont des parois
primaires minces et généralement restent en vie après qu'ils deviennent matures. (2)
Les cellules collenchymes : ensemble de parenchyme et chromoplastes, ces cellules
ont des parois primaires minces avec quelques zones d'épaississement secondaire
qui sert de support structurel supplémentaire dans les régions de la nouvelle
13 FAO, the vegetable sector in Thailand review, 1999; http://www.fao.org.
35
croissance. (3) Les cellules sclérenchymes se composent en parois primaire et
secondaires lignifiées mortes qui assurent la rigidité et imperméabilité à la plante.
Les différents tissus de feuille et une cellule sont illustrés sur la figure 10.
Figure 10: Structure des différents tissus et cellules d’une feuille (Thomson Higher Education 2007, Pearson Education 2009)
Les légumes feuilles ont un épiderme (supérieur et inférieur) et un tissu mesophylle
contenant des cellules palissadiques ou spongieuses (Figure 11). Les cellules
palissadiques de forme allongée sont perpendiculaires à l’épiderme supérieur; elles
ont une densité élevée en chloroplastes (riches en caroténoïdes) et sont le siège de
la photosynthèse.
Figure 11 : Coupe transversale des feuilles d’épinard ; UE : épiderme supérieur, LE : épiderme inférieur, P : Mésophylle palissadique, S : Mésophylle spongieuse. Le barre d’échelle indique 100 µm (Boese et Huner, 1990)
36
Les caroténoïdes sont synthétisés et s'accumulent dans le chloroplaste et
chromoplaste. Le chromoplaste est une lipoprotéine plastide à basse densité
résultant de la conversion ou transition directe des chloropastes ou indirecte des
autres plastides14, dans le cas de la maturité des fruits et légumes qui donnent la
couleur rouge ou jaune (Lopez-Juez et Pyke, 2004; Kilambi et al., 2013).
L’accumulation des lipides et les caroténoïdes a lieu plus précisément dans les sous-
structures des chromoplastes, appelés plastoglobules.
Les plastoglobules jouent un rôle dans la régulation de métabolisme des
caroténoïdes. Plusieurs enzymes tel que ζ-carotène déstructurase, lycopène β-
cyclase et β-carotène hydroxylases ont été trouvées dans cet organite. Les
différentes protéines nommées plastoglobullines sont associées aux plastoglobules
et aident à l’accumulation des caroténoïdes. Les interactions entre ces protéines et
les caroténoïdes ont également été identifiées (Vishnevetsky et al., 1999; Ytterberg
et al., 2006; Nogueira et al., 2013). La régulation de la biogenèse de chromoplaste
joue donc un rôle crucial de la biosynthèse qui influence la teneur et l’espace de
stockage des caroténoïdes (Liu et al., 2004; Bréhélin et Kessler, 2008; Lu et Li, 2008;
Cazzonelli et Pogson, 2010; Egea et al., 2010).
Chez les fruits et légumes, les chromoplastes peuvent être présents sous plusieurs
formes: globulaire, membranaire, tubulaire, réticulaire-globulaire et cristalline (Grilli
Caiola et Canini, 2004; Vasquez-Caicedo et al., 2005; Kim et al., 2009; Schweiggert
et al., 2011; Jeffery et al., 2012; Zeng et al., 2015). La morphologie des
chromoplastes des fruits influenceraient la bioaccessibilité des caroténoïdes
(Schweiggert et al., 2012).
Un schéma représentant la structure précise des complexes caroténoïdes-protéines
du chromoplaste a été proposé (Figure 12). Les caroténoïdes, en association avec
les lipides neutres (tocophérols et quinones prényle), sont séquestrés dans le noyau
central, leurs queues hydrophobes polaires du galactolipide ou des phospholipides
sont orientées vers le noyau.
Ils sont entourés par une mono-couche lipidique polaire, les têtes polaires sont
orientées vers l'extérieur, en interaction avec des protéines (30-35 kDa) (Katz et al.,
1995).
14 Les organites non-photosynthétiques contenus dans les cellules
37
Figure 12 : Modèle de structure du plastoglobule (Bréhélin et Kessler, 2008)
Dans les feuilles des plantes supérieures, la vitamine E particulièrement l'α-
tocophérol se trouve à l'intérieur de chloroplastes. Sa concentration est plus élevée
dans les feuilles vertes foncées que celles dont la couleur est verte claire (Bramley et
al., 2000).
En ce qui concerne les polyphénols, ils sont souvent liés à des polysaccharides, des
acides organiques, ou les uns aux autres. Les composés phénoliques simples tels
que l'acide benzoïque ou le benzaldéhyde ou leurs dérivés sont habituellement liés
de façon covalente à des polysaccharides de la paroi cellulaire de la plante, en
formant des liaisons esters avec l'arabinose dans l'hémicellulose ou avec un noyau
lignine (Ota et al., 2011). Les autres polyphénols, tels que les anthocyanes et les
tanins, ont tendance à s'accumuler dans les vacuoles, alors que les flavonoïdes
peuvent rester dans le cytosol où ils sont synthétisés majoritairement sous forme
libre (Kitamura, 2006). Ainsi, pour la bioaccessibilité, la rupture des parois cellulaires
est nécessaire.
3.3.3 Parois pectocellulosiques: primaire, secondaire, lamelle moyenne
La paroi cellulaire végétale est une structure moléculaire complexe interconnectée de
polysaccharides, glycoprotéines et composés phénoliques qui entourent et protègent
la cellule, c’est une caractéristique distinctive des végétaux nécessaires à leur survie.
38
La mobilité limitée des plantes les oblige à s'adapter et à résister à des conditions
environnementales difficiles. La survie vis-à-vis des attaques par des agents
pathogènes et par des herbivores est également indispensable. La structure formée
par les polysaccharides et les protéines de la paroi cellulaire permettent aux plantes
de résister ou réguler les pressions internes et/ou externes. En effet, elle fournit une
barrière structurale à certaines molécules. En outre, les parois cellulaires sont une
source de nutriments, de fibres et de l'énergie et agissent comme un tampon entre
l'environnement et le contenu protoplasmique qui joue divers rôles dans la vie des
tissus et organes. La paroi cellulaire a une structure complexe divisée en 3 couches
distinctes: les parois primaires et secondaires et la lamelle moyenne (Figure 13).
Figure 13 : Structure des différentes parois végétales (Dinwoodie, 1975), source: https://amazingseaweed.wordpress.com/a-propos/)
La paroi primaire mesure 1 à 3 microns d'épaisseur. Elle est formée par un réseau
lâche de microfibrilles (5-15 nm de large et 20-40 nm d’élargissement), du
xyloglucane de cellulose β-(1-4) liés entre eux par des liaisons hydrogènes,
englobées dans une matrice amorphe fortement hydratée de pectines et
d’hémicelluloses (Mccann et al., 1990). C’est une paroi mince et flexible, composée
de 90 % de polysaccharides et de 10 % de protéines pariétales (extensine). Certains
composés tels que les glycoprotéines ou les composés phénoliques sont liés à la
paroi primaire (Carpita et Gibeaut, 1993). Un modèle de l’assemblage de la paroi
primaire est présenté dans la figure 14. Le squelette de la paroi végétale est formé
par un réseau de cellulose, dans lequel sont dispersées les substances pectiques,
les hémicelluloses et les protéines (Carpita et Gibeaut, 1993).
39
Figure 14 : Modèle de la structure de la paroi primaire (Carpita et Gibeaut, 1993)
La paroi secondaire se compose de trois couches successives S1, S2 et S3 (Figure
13) qui se distinguent par l’orientation de leurs fibres de cellulose qui donne une
grande résistance à la paroi. Cette paroi a une structure rigide, inextensible et
faiblement hydratée (20 % d’eau maximum), constituée essentiellement de
microfibrilles de cellulose cristalline, organisées en couches concentriques. Ce type
de paroi ressemble à celle de la paroi primaire mais les microfibrilles sont, dans ce
cas-là, liées entre elles par des glucuronoarabinoxylanes. Cette paroi résulte de
l’épaississement de la paroi primaire par dépôt de lignine (i.e. polymères phénoliques
tridimensionnels dérivés d’acide hydroxycinnamique).
La lamelle moyenne est un espace intercellulaire situé entre deux cellules
adjacentes. Sa fonction est d’assurer la cohésion de l’ensemble. Elle est constituée
principalement des pectines qui sont des hétéro-polysaccharides composés d’acide
galacturonique.
La paroi primaire chez les plantes dicotylédones et de quelques monocotylédones se
compose de trois grandes classes de polysaccharides (la cellulose, les
hémicelluloses et les pectines). Cette paroi contient une teneur moindre en cellulose ;
en revanche, elle est riche en pectines pouvant atteindre 35 % de la masse pariétale.
Les xyloglucanes sont les hémicelluloses majoritaires. Cette paroi contient une
protéine structurale HRGP (protéines riches en hydroxyproline) qui la rend moins
extensible. Quant à la paroi secondaire, elle est caractérisée par une quantité
40
importante de cellulose et une faible teneur en pectines environ 5 % (Carpita et
Gibeaut, 1993). La composition des différentes parois pectocellulosiques est détaillée
ci-dessous.
3.3.4 Constituants des parois pectocellulosique
Les parois des cellules végétales contiennent plusieurs types de polysaccharides qui
sont regroupés généralement en deux catégories: 1) les polysaccharides pectiques
comprenant des homogalacturonanes et rhamnogalacturonanes I et II, et 2) les
polysaccharides hémicellulosiques correspondant aux xyloglucanes, glucomannanes,
xylanes et glucanes (Harholt et al., 2010; Scheller et Ulvskov, 2010). Les parois de
cellules végétales contiennent également de nombreuses protéines et
glycoprotéines, y compris des enzymes et protéines structurales (Rose et Lee, 2010).
La cellulose, très répandue dans le règne végétal, est un polymère de β-D-glucose
lié en β-(1-4) est stabilisé par des liaisons hydrogènes intramoléculaires donnant une
conformation structurale en ruban cristallin. Un assemblage des fibres cellulosiques
forme des microfibrilles (Figure 15)
Figure 15 : Assemblage des fibres cellulosiques15
Les hémicelluloses (linked-glycans), contrairement à la cellulose, englobent des
molécules dont la structure ramifiée et le degré de ramifications sont variés. Les
polymères hémicellulosiques s’associent à la cellulose par des liaisons non
15 http://slideplayer.fr/slide/1362897/
41
covalentes et permettent ainsi aux microfibrilles cellulosiques d’être indirectement
mais solidement reliées les unes aux autres (Figure 16) (Mccann et al., 1990). Elles
peuvent également établir des liaisons covalentes avec les pectines par
l’intermédiaire de ramifications d’arabinanes (Thompson et Fry, 2000).
Figure 16 : Schéma de l’organisation des celluloses, hémicelluloses, pectines et protéine structurale (HRGP)16
Les pectines, majoritairement présentes dans la paroi primaire, sont les
macromolécules pariétales les plus diversifiées (Carpita et Gibeaut, 1993). Elles
regroupent des polysaccharides hétérogènes complexes, riches en résidus acide
galacturonique (GalA), plus ou moins chargés négativement. La structure de pectine
est formée par l’acide α-D-galacturonique lié en α-(1-4). Les pectines natives sont
constituées de l'association covalente de trois molécules dont la structure primaire
est basée sur la longue chaîne linaire homogalacturonique (HG: zone lisse) 65 % qui
porte des sucres dérivés rhamnoses. Le HG est liée aux chaînes
rhamnogalacturoniques (RG I et RG II: zone hérissée) associées avec plusieurs
sucres et acides (Figure 17). Une particularité des pectines est leur capacité à former
une matrice hydratée pouvant s’organiser en gel.
16 http://www.camelclimatechange.org/view/view/160427/
42
Acide α- D- galacturonique
Figure 17 : Structure des pectines et de l’acide galacturonique. AG: arabinogalactane, HG: homogalacturonane, RG: rhamnogalacturonane, XG: xylogalacturonane (Leclere et al., 2013)
Les protéines de la paroi cellulaire
La paroi cellulaire contient quelques glycoprotéines dont les fonctions structurales ou
enzymatiques ont été décrites.
Les extensines : les protéines structurales liées aux parois primaires dont
l’hydroxyle proline, sérine, lysine et tryrosine sont les constituants principaux. Ces
protéines peuvent être liées à des L-arabinofuranose dont les liaisons sont de type β
43
- (1-2) pour la partie glucidique. Elles représentent de 1 à 10 % de la paroi (Fry,
1988).
Les enzymes pariétales: elles agissent sur des substrats variés et sont localisées
dans la paroi. Les peroxydases pariétales sont responsables de la réticulation des
extensines, les glycosyl-transférases responsables des transferts des sucres et les
hydrolases modifient les polysaccharides pariétaux (McNeil et al., 1984).
Les arabinogalactane-protéines: elles se trouvent sur la membrane plasmatique et
la paroi cellulaire et jouent un rôle important dans la reconnaissance et la
signalisation cellulaire (Du et al., 1996; Ellis et al., 2010). Ces protéines contiennent
une partie glucidique constituée d’arabinogalactanes. En revanche, la partie
protéique ne représente qu’une faible quantité (2 % à 10 %) (Saulnier et Brillouet,
1989).
Pendant le vieillissement des cellules végétales, la lignine incruste la cellulose et les
hémicelluloses afin de donner une certaine rigidité à l’ensemble de la paroi. Cette
lignine est présente majoritairement dans la paroi secondaire mais peut également
exister dans la paroi primaire ou la lamelle moyenne (Monties, 1980). En effet, ce
sont des polymères de composés phénoliques résultant de la copolymérisation de
trois types d’alcools aromatiques: l’alcool coumarylique, l’alcool coniférylique et
l’alcool sinapylique (Boudet, 2000). Les familles de composés phénoliques sont
nombreuses dans les plantes à l’état de monomères et polymères. Leurs structures
seront détaillées ci-dessous.
Les composées phénoliques
Les composés phénoliques sont des métabolites secondaires des plantes qui ont
des structures et fonctions diverses. Les composés phénoliques sont importants pour
la qualité sensorielle et nutritionnelle des aliments. En effet, ils contribuent à leur
couleur et à l’astringence des produits. Les végétaux riches en polyphénols sont
bénéfiques pour la santé de l’homme. Les études épidémiologiques suggèrent que le
pouvoir antioxydant de ces composés permet de lutter contre le vieillissement
cellulaire et également contre l’athérosclérose (Bouayed et al., 2011; González et al.,
2011; Khurana et al., 2013). Ils participeraient à la réduction de l'incidence de
plusieurs maladies chroniques, telles les maladies cardiovasculaires (Joshipura et
44
al., 2001; Ruesten et al., 2013), le diabète de type 2 (Sargeant et al., 2001; Liu et al.,
2014) et plusieurs types de cancers (cancer du sein et de la prostate) (Lunet et al.,
2005; Yan et Spitznagel, 2009; Dong et Qin, 2010; Masala et al., 2012).
Les composés phénoliques ont un noyau aromatique portant un ou plusieurs
groupes hydroxyles et leur structure peut varier de celle d'une molécule phénolique
simple (les acides phénoliques) à celle d'un polymère complexe de masse
moléculaire élevée (stilbène, flavonoïdes, isoflavonoïdes, lignanes, lignines, tanins
condensés) (Balasundram et al., 2006).
Les composés phénoliques peuvent être classés selon la complexité de leur
squelette de base, du degré de modification de ce squelette et des liaisons possibles
de ces composés avec d’autres molécules. Ils peuvent être classés principalement
en flavonoïdes et non flavonoïdes. Les flavonoïdes (C15: C6-C3-C6) peuvent être
subdivisés en flavonols, les flavones, les isoflavones et les anthocyanes. Les
flavonoïdes sont liés à des sucres par des liaisons glycosidiques. Cette glycosylation
peut avoir des conséquences sur la modification de la couleur des pigments ou une
augmentation de l'hydrosolubilité et modification des propriétés biologiques des
molécules. Les non flavonoïdes comprennent diverses classes de polyphénols tels
que les stilbènes et les acides phénoliques (Bravo, 1998).
Une autre façon consiste à les classer selon leur solubilité: ceux qui sont solubles
dans l'eau (acides phénoliques, phénylpropanoïdes, les flavonoïdes et les quinones)
et les composés insolubles dans l'eau (tanins condensés, lignines liés au paroi
cellulaire et les acides hydroxycinnamiques) (Rispail et al., 2005).
Les acides phénoliques appartiennent à deux groupes, les acides hydrobenzoïques
et les acides hydroxycinnamiques, ces derniers sont représentés majoritairement
chez les végétaux, généralement présents sous forme d’esters.
Les tanins
Les tanins sont des composés phénoliques polymères particulièrement difficiles à
dégrader, chimiquement et enzymatiquement. Selon la nature des constituants
impliqués et selon le type de condensation, on obtient des composés plus ou moins
complexes qui peuvent impacter la solubilité. Les tanins sont capables d’établir une
interaction avec les protéines (albumines, hémoglobine) en solution et de les
précipiter. Les tanins peuvent être distingués en deux grands groupes selon la
45
réactivité chimique ou selon les compositions chimiques: tanins hydrolysables et les
tanins condensés.
Les tanins hydrolysables ou gallotanins, sont des polymères d’acide gallique. Ils
sont caractérisés par le fait qu'ils se dégradent par hydrolyse chimique (alcaline ou
acide) ou enzymatique. Une partie non phénolique est alors libérée ainsi qu'une
partie phénolique constituée d'acide gallique ou d'acide ellagique (dimère de l'acide
gallique). Les tanins hydrolysables sont abondants chez les arbres et arbustes. Une
forme simple de ce type de tanins est le pentagalloylglucose, molécule très réactive
qui est à l'origine de la plupart des formes complexes (Figure 18A);
Les tanins condensés (ou proanthocyanidines) sont des polymères d'oligomères de
(+)-catéchine et/ou d’épicatéchine (Figure 18B). Seules des hydrolyses par attaques
chimiques fortes sont capables de libérer les sous unités sous forme de cyanidine ou
delphinidine.
Figure 18 : Structure chimique de deux types de tanins
Certains polyphénols avec un nombre élevé de groupes hydroxyles ont une affinité
relativement élevée pour les protéines. Les tanins avec plus de 12 groupes
hydroxyles peuvent se lier fortement à des protéines telles que des albumines, non
seulement à partir de la matrice alimentaire, mais aussi à partir de la salive (proline:
protéine salivaire), ce qui entraîne des complexes qui donne la sensation
46
d’astringence, tandis que les polyphénols avec une faible masse moléculaire et de
substitutions hydroxyles, par exemple la quercétine, peuvent être moins influencés
(Hagerman, 1989; Cai et Bennick, 2006). Les polyphénols peuvent également former
des complexes et diminuent l’absorption des polysaccharides (Shimizu, 2010;
Forester et al., 2012; Le Bourvellec et Renard, 2012) et réduisent l'absorption de
certains minéraux et oligo-éléments tels que le fer, le zinc et le cuivre et le sodium
(Bravo, 1998; Hurrell et al., 1999; Kim et al., 2011).
Sources alimentaires des composés phénoliques
Les fruits et légumes riches en polyphénols sont: les myrtilles arbustives (Vaccinium
corymbosum) 160–480 mg d’anthocyanes, flavonoïdes (quercétine), d’acides
phénoliques (acide chlorogénique)/100 g MF; la mûre (Rubus fruticosus) 130–405
mg d’anthocyanes, flavonoïdes (épicatéchine), acide phénolique (acide ellagique)
/100 g MF; le thé vert (Camellia sinensis) 29–103 mg de flavonols (épicatéchine,
épigallocatéchine gallate)/100 mL; le vin rouge (Vitis vinifera) 25–300 mg d’acides
phénoliques, anthocyanes, tanins, stilbènes (resvératrol)/100 mL (Rothwell et al.,
2013). La teneur en tannins de plusieurs légumes feuilles a été étudiée et elle varie
de 15 mg à 1,3 g/100 g tel que consommé pour les feuilles de coléus (Celosia
argentea) et Vayunarayani (Delonix elata, Gamb.) (Gupta et al., 2005).
33..44 CCoonncclluussiioonn eett qquueessttiioonnss ddee rreecchheerrcchheess
Les vitamines liposolubles sont des micronutriments au centre de l’attention grâce à
leurs effets bénéfiques pour la santé humaine. Les caroténoïdes et les tocophérols
sont des composés bioactifs présents dans les légumes feuilles, ces derniers sont
des aliments de base peu coûteux et sont consommés dans les pays les moins
développés. Mais les micronutriments dans les légumes feuilles ne sont pas tous
absorbés, ce qui complexifie les problèmes d’apports en nutriments chez les
populations de groupes vulnérables. La recherche scientifique sur la digestion des
lipides et les vitamines liposolubles a évoluée au fil des années (Carriere et al.,
1993; Hedrén et al., 2002b; Favé, 2006; Granado-Lorencio et., 2007; Colle et al.,
2012), pourtant, le mécanisme d’absorption des caroténoïdes n’est toujours pas clair.
Plusieurs études de digestion ont donc été effectuées pour mieux comprendre les
comportements des composés d’intérêt et pour éclairer les mécanismes mis en jeu.
47
Les études de cette thèse sont concentrées sur la bioaccessibilité des légumes
feuilles asiatiques. La Thaïlande est un pays où la transition socio-économique ainsi
que les changements de mode de vie et de consommation ont, d’ores et déjà,
amélioré l’alimentation et l’état nutritionnel des populations où, par conséquent, les
carences en micronutriments et les risques de pathologies associées ont diminué
(Winichagoon, 2013). Il est intéressant de voir dans quelle mesure les ressources
locales disponibles en Thaïlande peuvent participer à une bonne couverture des
besoins en micronutriments des populations notamment vulnérables et à faibles
revenus.
Il est connu que la bioaccessibilité des caroténoïdes dans les légumes feuilles crus
est faible. Les questions de recherche de cette thèse sont les suivantes :
Quels sont les déterminants de la bioaccessisbilité des caroténoïdes et des
tocophérols dans les légumes feuilles frais ?
Quelle est l’influence des pratiques culinaires et des opérations unitaires sur la
bioaccessibilité des caroténoïdes et des tocophérols ?
Les changements de structures des légumes feuilles après cuisson
permettent-ils d’expliquer la modulation de la bioaccessibilité des vitamines
lipophiles pendant la digestion in vitro ?
48
Matériels et méthodes
49
4 Matériels et méthodes
44..11 LLeess mmaattiièèrreess pprreemmiièèrreess eett rrééaaccttiiffss
Plusieurs lots de chaque variété de légumes feuilles ont été achetés le jour des
déterminations de bioaccessibilibité des micronutriments. Les tiges ont été éliminées.
Les feuilles de même taille et couleur ont été sélectionnées dans différentes zones
des branches puis mélangées pour avoir un échantillon représentatif de l’ensemble.
Les feuilles sont ensuite lavées à l’eau distillée puis séchées 5 minutes sur papier
absorbant.
Les standards (β-carotène, α-carotène, lutéine, α-tocophérol, δ-tocophérol, cyanidine
chlorine, delphinidine chlorine), les solvants et enzymes de digestion (pepsine 800-
2,500 U/mg, pancréatine B1750, bile extrait du porc B8631) ont été achetés à Sigma-
Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France).
44..22 MMéétthhooddeess mmiiccrroossccooppiiqquueess
4.2.1 Inclusion des feuilles crues et transformées
Des feuilles fraiches de brède chouchou et moringa ont été sectionnées
transversalement à l’aide d’un scalpel de manière à obtenir des échantillons
d’environ 1,5 cm. La fixation a été réalisée par une solution de 2 % de
paraformaldéhyde à 25 % et 1,5 % de glutaraldéhyde dilué dans un tampon
phosphate de sodium (200 mM, pH 7) additionné de 1 % de caféine. Après découpe,
les feuilles sont placées dans la solution de fixation puis sous vide par deux cycles
de 30 minutes. Elles sont ensuite conservées à 4°C sur une table agitante et à
l’obscurité. Après 14 jours de fixation, le fixateur est remplacé par de l’éthanol 30 %
pendant une heure.
La déshydratation des feuilles est ensuite poursuivie par immersion dans des bains
de degré d’alcool croissants (50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %) pendant une
heure à chaque fois et à température ambiante. L’immersion est ensuite faite dans
un mélange d’éthanol/butanol (v/v) à nouveau, 24 h à 4°C sous agitation douce à
l’obscurité. Un bain est réalisé dans le butanol pur pendant une journée, puis un
second pendant 3 semaines.
50
Le butanol pur est remplacé par un mélange de butanol/résine (v/v) pendant 24h,
puis par la résine pure Technovit Kulzer 7100 (500 mL – méthacrylate de 2-
hydroxyéthyle) additionnée d’un activateur (Hardener II) (1 g/100 mL) pendant une
journée puis dans un second bain de résine pendant 3 semaines.
L’inclusion des feuilles a été réalisée par addition de 0,5 mL de durcisseur (Hardaner
II) à 7,5 mL de résine Technovit 7100. Environ 1,4 mL de ce mélange est distribué
dans des moules en plastique. Puis les sections de feuilles sont placées dans ces
puits de manière à obtenir des coupes transversales. La polymérisation s’effectue
pendant 24 h à température ambiante. Des plots en polychlorure de vinyle (PVC)
sont collés à l’aide d’un mélange durcissant composé de méthyl méthacrylate, N,N-
diméthyl-p-toluidine, dibenzoyl péroxide (Technovit 3040, Kulzer) pendant 1 h. Des
coupes de 4 µm d’épaisseur sont réalisées par un microtome (Microm HS 355 S) et
déposées sur une lame de verre dégraissée et séchée.
Des colorations spécifiques sont réalisées pour mettre en évidence les protéines, les
polysaccharides totaux, les substances pectiques, les tanins et les lipides. Les
observations sont réalisées à l’aide d’un microscope optique, aux grossissements x5,
x10, x20, x40 et x100. Chaque image est ensuite traitée à l’aide du logiciel
Photoshop CS6 pour insérer l’échelle d’observation.
4.2.2 Coloration des parois cellulaires et protéines
Double coloration des polysaccharides et des protéines : cette double coloration
permet, d’une part, de visualiser les polysaccharides en rouge fuschia (acide
périodique-Schiff) et, d’autre part, les protéines en bleu voire noir (Naphtol Blue
Black).
Protocole : la coupe est oxydée pendant 5 min par l’acide périodique H5IO6 2 %
dans l’eau à température ambiante, rincée à l’eau courante et à l’eau distillée puis
colorée au réactif de Schiff (Sigma) à l’obscurité pendant 10 min. Après lavage à
l’eau sulfureuse (5 % d’une solution de métabisulfite de sodium dans une solution de
HCl à 0,05 %) pendant 2 min puis rinçage dans trois bains d’eau courante et 1 bain
d’eau distillée, chaque lame est colorée par une solution de Naphtol Blue Black (1 %
dans l’acide acétique 7 % p/v) pendant 1 à 2 minutes. Après un rinçage rapide à
l’eau courante, les échantillons sont immergés dans trois bains successifs d’acide
51
acétique 7 % jusqu’à décoloration quasi-totale de la résine. Les paniers contenant
les lames sont mis à sécher durant une nuit à température ambiante sous hotte et à
l’abri de la lumière.
Le lendemain, les coupes sont recouvertes par une lamelle collée à l’aide d’un milieu
de montage Isomount 2000 (Q-Path/VWR Chemicals) possédant le même indice de
réfraction que l’air (~ 1,000293). Les observations microscopiques sont réalisées à
l’aide d’un microscope optique (Leica Lentz DMRB 301-370) et les prises de vues
sont effectuées par une caméra numérique (Evolution MP 5.0 color media
Cybernetics Cooled RTV 32-0040C-140) fixée au microscope et reliée à un
ordinateur. Le logiciel Q-Capture Pro 7 (Scop Pro, 2011) est utilisé pour réaliser les
prises de vues.
Coloration des pectines : Les substances pectiques sont colorées par une solution
aqueuse de rouge de ruthénium 3 % pendant 10 minutes à température ambiante.
Après rinçage à l’eau distillée, les lames sont séchées à température ambiante une
nuit. Chaque lame est recouverte d’une lamelle et collée à l’aide du milieu de
montage (Isomount).
4.2.3 Coloration des tanins condensés
La coloration des tanins condensés a été réalisée selon le protocole de (Brillouet et
Escoute, 2012) et appliquée aux échantillons de feuilles de brède chouchou et de
moringa inclus en résine comme décrit précedemment. Le caféine interagit avec les
tanins en formant des complexes insolubles (Cai et al., 1990). Une solution de
tampon de Warole pH 7 a été formulée à partir d’une solution d’acide acétique à 1,2
% et une solution d’acétate de sodium déshydraté 2,7 % dans laquelle a été dissout
0,025 % de bleu de toluidine. Les sections de feuilles ont été colorées pendant 5
minutes avec colorant afin de mettre en évidence les tanins en bleu vert.
Les coupes sont rincées deux fois à l’eau distillée puis séchées une nuit sous hotte à
température ambiante. Les lames sont recouvertes d’une lamelle de verre à l’aide du
milieu de montage (Isomount).
52
4.2.4 Coloration des lipides et vitamines liposolubles
Les coupes sont fixées dans le paraformaldéhyde 4 % dissout dans un tampon
phosphate en présence de 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) 4 % pendant 16 h. Les
échantillons sont ensuite lavés deux fois pendant 15 minutes dans le tampon
phosphate et le glycérol, puis, deux fois à nouveau pendant 15 min dans le tampon.
Ils sont enfin déshydratés dans l’éthanol 50% pendant 1 h à 70°C avant d’être inclus
dans la résine Technovit 7100 (Heraeus Kulzer).
Des sections de feuilles d’une épaisseur de 16 µm sont réalisées au vibratome,
incubées dans l’éthanol 50 % pendant 30 secondes, colorées au Noir Soudan puis
rincées à l’eau milli-Q. Le Noir Soudan permet de colorer les lipides et les vitamines
liposolubles en noir.
44..33 MMéétthhooddeess bbiioocchhiimmiiqquueess
4.3.1 Détermination de la matière sèche
La matière sèche a été déterminée sur les légumes feuilles par séchage à 105°C
pendant 24 h dans un four (J.P Selecta, Bacelona, Spain).
4.3.2 Dosage des protéines totales
Les dosages de l’azote ont été effectués par la méthode Kjeldahl (Bietz, 1974).
L’azote organique est transformé en sulfate d’ammonium par acide sulfurique
concentré (H2SO4) à chaud, en présence d'un mélange de catalyseurs (K2SO4 et
CuSO4). Après le dosage acido-basique (NaOH/ H2SO4) en présence de l’indicateur
(mélange de rouge de méthyle et vert de bromocrésol) dans l’acide borique (H3B03),
l’azote ammoniacal est dosé par mesure de la coloration bleue. La teneur en
protéines est ensuite calculée en multipliant la teneur en azote total par un facteur de
6,25.
4.3.3 Dosage des parois cellulaires
Principe : le traitement à l’éthanol 80 % bouillant du matériel végétal permet de
purifier les parois du contenu cytoplasmique et vacuolaire des cellules. Cette étape
53
assure une élimination des constituants cellulaires de faibles masses moléculaires
(acides organiques, sucres simples, pigments, etc...), ainsi que l’inactivation des
enzymes végétales endogènes et la précipitation des pectines naturellement
solubles dans l’eau. Les parois végétales insolubles dans l’alcool sont retenues sur
fritté puis déshydratées par différents solvants de volatilité croissante qui éliminent
les lipides et pigments restants. La teneur en paroi des végétaux correspond au
matériel insoluble dans l’alcool (MIA), elle peut être estimée par gravimétrie.
Protocole: 2 g de légumes feuilles frais sont additionnés de 4 volumes d’éthanol
bouillant pour un volume de matière végétale à 90 % d’humidité. Après
homogénéisation au Turrax (Prolabo, France), le mélange est porté à ébullition
pendant 15 min. Après filtration sur fritté de porosité 3 μm (DURAN®, Wertheim,
Germany), le résidu est lavé successivement par deux volumes d’alcool pur,
d’acétone et d’éther puis totalement déshydraté par passage pendant une nuit à
l’étuve sous vide à 55°C pendant 24 h. Le résidu pesé correspond aux parois
cellulaires.
4.3.4 Dosage des pectines
Principe : les polysaccharides du matériel pariétal sont hydrolysés en oses neutres
et en acides uroniques par l’acide sulfurique concentré (Ahmed et Labavitch, 1978).
Le dosage colorimétrique (Blumenkrantz et Asboe-Hansen, 1973) des monomères
acides libérés est réalisé en présence de MHDP (meta-hydroxydiphényle) qui
interagit avec les acides uroniques pour donner un complexe rose. Ce dosage ne
permet pas de distinguer l’acide galacturonique de l’acide glucuronique. La teneur de
ce dernier étant très faible dans les végétaux, la teneur en acides uroniques est
assimilée à celle de l’acide galacturonique.
Protocole : 5 mg de MIA sont dispersés en présence de 2 mL d’H2SO4 concentré à
4°C. Après dissolution, le volume est ajusté à 10 mL par addition d’eau distillée
goutte à goutte. Le dosage des acides uroniques s’effectue à partir de 400 µL d’une
solution de pectines dans l’eau. 400 L d’échantillon ou de solution étalon d’acide
galacturonique (0-100 mg/L) sont incubés pendant 10 min à 100°C en présence de
2,4 mL de tétraborate de sodium 12,5 mM solubilisé dans H2SO4 concentré. Après
54
refroidissement, 40 L de MHDP à 0,15 % dans la soude 125 mM sont ajoutés et les
échantillons laissés 10 min exactement à température ambiante. La densité optique
est lue à 520 nm. Des blancs sont réalisés pour chaque échantillon en remplaçant le
MHDP par la soude 125 mM car les oses neutres peuvent interférer avec le dosage
en développant une couleur brune. Les résultats sont exprimés en acide
anhydrogalacturonique en multipliant les valeurs obtenues par un facteur de
correction de 0,907.
4.3.5 Dosage des tanins condensés par CLHP
Principe : Les proanthocyanidines ou tanins condensés ont été déterminés par la
méthode de butanol-HCl après une dépolymérisation catalysée par un acide en
présence d’un nucléophile (Porter et al., 1985). La cyanidine et delphinidine sont les
monomères libérés. Elles sont quantifiées par chromatographie liquide.
Protocole : L’hydrolyse a été réalisée directement sur 50 mg de poudre de feuilles
lyophilisées sans étape d’extraction préliminaire afin de doser les tanins condensés
totaux et pas uniquement les composés extractibles (Tarascou et al., 2010). Les
échantillons ont été solubilisés dans 6 mL de butanol-HCl (95:5, v/v) et 0,2 mL de
réactif ferrique (NH4Fe (So4)2 2 % dans HCl 2M, p/v). Les échantillons sont vortexés
puis chauffés à 95°C dans un bain-marie pendant 45 minutes. Les solutions ont été
ensuite refroidies dans la glace puis filtrées sur une membrane
polytétrafluoroéthylène (PTFE) 0,2 µm et enfin analysés à l’CLHP. Un étalonnage
externe est réalisé avec des solutions de cyanidine ou delphinidine diluées dans le
butanol-HCl et le réactif ferrique à 2 % sur une gamme de 0,5 à 25 mg/L. Les
résultats sont exprimés en mg équivalent cyanidine ou delphinidine pour 100 g de
feuilles fraîches.
Les conditions d’analyse de l’CLHP sont les mêmes pour l’analyse des
proanthocyanidines et de l’acide gallique. Les chromatographies ont été effectuées
avec un équipement Dionex P680 et la colonne utilisée est une LiChroCART® 250-2
Purospher® STAR (4,6 mm i.d × 250 mm, RP-18e 5 μm, Merck KGaA, Allemagne).
La phase mobile est un mélange de 2 éluants à 0,5 mL/min. La phase A est l’acide
formique et l’eau milli-Q (2:98, v/v) et la phase B un mélange d’éthanol, eau milli-Q et
acide formique (69:29:2, v/v/v). Le gradient appliqué progresse de 0 à 100 % de
55
solvants sur une période de 38 minutes (Annexe 6). Après élution, les composés
sont quantifiés par un détecteur UV-visibles à barrette de diodes (Dionex UVD
340U). Les chromatogrammes ont été analysés à longueur d’onde d’absorption
maximale de la cyanidine et de l’acide gallique dans la phase mobile (i.e. 550 et 280
nm respectivement) (Figure 19).
Figure 19 : Chromatogramme des composés hydrolysés de tanins condensés et hydrolysables
Cyanidine
Acide gallique
56
4.3.6 Dosage des tanins galloylés par CLHP
Principe : Les tanins hydrolysables ou gallotanins ont été déterminés après une
dépolymérisation catalysée par un acide. L’acide gallique libéré est quantifié par
CLHP.
Protocole : 10 mg de poudre des feuilles lyophilisées sont hydrolysés par 0,1 mL de
H2SO4 94 % dans un tube de verre scellé avec un bouchon. Les échantillons ont été
chauffés à 100°C pendant 26 h (Inoue et Hagerman, 1988). Après réaction, 2 mL de
l’eau milli-Q et 4 mL de NaOH 0,5 M ont été ajoutés. Le pH a été ajusté à 2,0 ± 0,2.
Les échantillons ont été ensuite dilués 8 fois dans le méthanol et filtrés sur une
membrane cellulose 0,45 µm et enfin analysés par l’CLHP. Les résultats sont
exprimés en mg d’acide gallique équivalent pour 100 g de feuilles fraîches. L’acide
tannique a été utilisé comme témoin positif.
Les conditions d’analyse de l’acide gallique par CLHP sont les mêmes que celles
utilisées pour l’analyse des produits d’hydrolyse des proanthocyanidines.
4.3.7 Dosage des caroténoïdes et tocophérols par CLHP
L’extraction des caroténoïdes et tocophérols des légumes feuilles frais ou
transformés a été adaptée d’une méthode précédemment publiée (Taungbodhitham
et al., 1998). Les échantillons sont broyés au Turax (Prolabo, France) pendant 1
minute en présence de 15 mL d’éthanol/hexane (4:3, v/v). Après centrifugation
pendant 30 minutes à 10°C et 10000 rpm (Heraeus Multifuge X1R, Thermo Fisher
Scientific, Villebon sur Yvette, France), le surnageant est additionné de 10 mL de
NaCl 10 % (p/v). Après décantation pendant 10 min, la phase inférieure est éliminée.
La phase organique est lavée par 10 mL d’eau distillée, puis évaporée sous azote et
repris les résidues dans 2 mL d’acétone. Après filtration sur membrane minisart
SRP4 de porosité 0,2 µm en PTFE (Sartorius Palaiseau, France), 20 µL d’échantillon
sont injectés en CLHP.
Le CLHP utilisé est équipé d’une polymérique YMC30 (4,6 mm i.d x 250 nm, 5 µm de
taille de particules) (YMC, INc Wilmington NC) et un détecteur UV-visible à barrette
de diodes. L’élution accomplie par un radient de deux mélanges de solvants (A =
méthanol et eau milli-Q, 60:40 (v/v), et B = méthanol, méthyl tert-butyl-éther et eau
57
milli-Q, 28,5:67,5:4 (v/v/v) sur 31 min à un débit de 1 mL/min (pompe Dionex P680).
Le gradient appliqué progresse de 0 à 100 % de solvants est présenté (Annexe 7).
Les chromatogrammes des caroténoïdes et tocophérols sont présentés en figure 20.
Figure 20 : Chromatogramme des caroténoïdes et tocophérols
44..44 DDéétteerrmmiinnaattiioonn ddee llaa bbiiooaacccceessssiibbiilliittéé ddeess ccoommppoossééss ppaarr ddiiggeessttiioonn iinn vviittrroo
Malgré ses inconvénients, la digestion in vitro reste la méthode la plus accessible
pour faire du screening car elle est moins coûteuse et plus rapide. Ainsi, elle permet
de comparer des matrices alimentaires ou d’évaluer l’impact de traitements
Tout trans-lutéine
Tout trans-β-carotène
δ-Tocophérol
α-Tocophérol
58
technologiques (Failla et al., 2008). Il existe de nombreux protocoles, celui utilisé
dans notre étude a été adapté de (Reboul et al., 2006).
Principe : La digestion a été simulée in vitro (DIV) en 3 étapes successives: phase
orale, phase gastrique et phase intestinale. Pour améliorer la micellisation des
caroténoïdes, 80 µL d’huile de colza (dilué dans acétone 32 %) ont été additionnés
au début de la digestion (Hedrén et al., 2002a; Mulokozi et al., 2004a).
Protocole : Les légumes feuilles (~2 g) ont été coupés (1,5 cm2) puis introduits dans
une bouteille ambrée en présence de 15 mL d’une solution orale (pyrogallol 1,3%
dans le NaCl 0.9 %). Les échantillons sont incubés 10 minutes à 37°C dans un bain-
marie avec une agitation douce (IKAMAG® RT 15 power). Le pH de la phase
gastrique est ajusté à 4,0 ± 0,1 avec de l’HCl 1 M et de 2 mL de pepsine de porc (4%
dans HCl 0,1 M). Le mélange a été par suite incubé à 37°C pendant 30 min. À la fin
de la phase gastrique, le pH a été ajusté à 6,0 ± 0,1 par addition de 800 µL de
tampon bicarbonate de soude 0,9 M avant d’ajouter 9 mL d’une solution intestinale :
pancréatine de porc (0,2 %) et bile de porc (1,2 %) dissous dans le citrate trisodium
(0,1 M, pH 6). Après, 4 mL de bile de porc 0,1 g/mL a été additionné à nouveau. Les
échantillons ont été incubés pendant 30 min puis les digestas sont centrifugés à 10
000 rpm pendant 1 h à 10°C (Heraeus Multifuge X1R, Thermo Fisher Scientific,
Villebon sur Yvette, France). Enfin, 10 mL sont prélevés à l’aide d’une seringue et
filtrés sur une membrane d’acétate cellulose de porosité 0,2 µm pour isoler les
fractions micellaires. Les composés lipophiles ont ensuite été extraits.
Après digestion in vitro, 10 mL de milieu digestif sont extraits par 20 mL
d’éthanol/hexane (4:3, v/v). Le mélange est homogénéisé puis 20 mL de NaCl 25 %
(p/v) sont additionnés. Après 10 min de décantation à l’abri de la lumière, la phase
organique est re-extraite avec 20 mL d’éthanol/hexane (4:3, v/v) puis lavée avec 15
mL d’eau distillée. La phase organique est séchée sous azote et les résidus dissouts
dans 400 µL d’acétone. Les extraits sont immédiatement filtrés sur membranes
PTFE 0,2 µm et analysés par CLHP.
59
44..55 MMéétthhooddeess rrhhééoollooggiiqquueess
Principe : une des propriétés des polysaccharides est d’augmenter la viscosité des
solvants même quand ils sont présents à faibles concentrations. Les pectines sont
des polymères acides chargés dont la viscosité peut être mesurée en présence de
forces ioniques suffisantes afin de s’affranchir des répulsions électrostatiques que
leur ionisation pourrait générer (Crandall et Wicker, 1986). À partir du temps
d’écoulement des solutions de pectines, on peut déterminer les vicosités (relative,
réduite et inhérente) des solutions.
Protocole : 2 mL des solutions de milieu digestif contenant des pectines ont été
insérés dans un viscosimètre capillaire (Ubbelohde n°53710) pour déterminer la
viscosité. Les mesures sont réalisées à 25°C.
44..66 AAnnaallyysseess ssttaattiissttiiqquueess
Les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel Statgraphics Plus 5.1
(Statistical Graphics corp., Warrenton, VA). Les comparaisons entre groupes ont été
faites par analyse de variance à un facteur (ANOVA) en considérant une valeur de p
< 0,05 comme significative. Les corrélations ont été déterminées par une analyse en
composantes principales (PCA) à l’aide du logiciel Statgraphics plus 5.1 et R.
60
Résultats
5 Résultats obtenus
61
Chapitre 1 - Déterminants de la bioaccessibilité des carotènes et de l’α-tocophérol dans les légumes feuilles frais
62
55..11 CChhaappiittrree 11 –– DDéétteerrmmiinnaannttss ddee llaa bbiiooaacccceessssiibbiilliittéé ddeess ccaarroottèènneess eett ddee ll’’αα--
ttooccoopphhéérroollss ddaannss lleess lléégguummeess ffeeuuiilllleess ffrraaiiss ((aarrttiiccllee 11))..
Le profil nutritionnel des légumes feuilles est intéressant mais la bioaccessibilité
des vitamines lipophiles (caroténoïdes et α-tocophérol) est faible. Huit variétés de
légumes feuilles frais (coriandre, menthe, basilic thaï, liseron d’eau, lalot, brède
chouchou, moringa et perilla) consommés de manière endémique en Asie du Sud-
Est ont été étudiées. Leur capacité à libérer des caroténoïdes et α-tocophérol
bioaccessibles a été évaluée par digestion in vitro et leurs compositions
biochimiques (protéines, teneurs en parois cellulaires, polysaccharides, pectines
et tanins condensés et hydrolysables) ont été analysées. Des corrélations
statistiques (analyse en composantes principales) ont été recherchées entre les
variables compositionnelles des aliments et leur capacité à relarguer des
composés d’intérêt pendant le processus de digestion « in vitro ». L’objectif est
d’identifier quels sont les facteurs qui favorisent ou, au contraire, limitent la
bioaccessibilité des micronutriments lipophiles dans les matrices légumes feuilles.
63
Determining factors of lipophilic micronutrient bioaccessibility in
several leafy vegetables
WICHIEN SRIWICHAI1, JACQUES BERGER1, CHRISTIAN PICQ1, SYLVIE
AVALLONE2,*
1IRD; UMR 204, IRD/Université Montpellier/SupAgro (NUTRIPASS), 911 avenue
Agropolis, BP 64501, 34394 Montpellier, Cedex 5, France;
2Montpellier SupAgro; UMR 204, IRD/ Université Montpellier/SupAgro (NUTRIPASS),
911 avenue Agropolis, BP 64501, 34394 Montpellier, Cedex 5, France
ABSTRACT
Micronutrient deficiencies are still a public health issue in least developed countries.
Promoting diet diversification is a promising strategy. Numerous fruits and vegetables
are rich in micronutrients but some of these compounds are poorly bioaccessible.
Our objective was to identify the biochemical determinants of the micronutrient
bioaccessibility in leaves. The contents in cell walls, pectins, tannins and proteins of
the leafy vegetables were assessed and correlations with the micronutrient
bioaccessibility were explored.
The leafy vegetables have interesting nutritional profiles with noticeable amounts in
protein, provitamin A (β-carotene) and α-tocopherol for some species. Their cell wall
contents greatly varied from 3.4 to 8.7 g for 100 g as well as their pectin percentages.
Only the Perilla and drumstick leaves contained condensed tannins. In fresh leaves,
the contents in bioaccessible carotenoids were low. The correlation study highlighted
that the carotenoid bioaccessibility was negatively correlated to the pectin contents of
the leaves.
Keywords: micellarisation; in vitro digestion; pectins; tannins; β-carotene.
5.1.1 Introduction
Vitamin deficiencies are public health issues in Africa and South-East Asia. It affects
an estimated 190 million preschool-age children and 19.1 million pregnant women
around the world.(WHO, 2009; Singh and West, 2004). Populations with low incomes
64
have vitamin intakes mainly from fruits and vegetables. Unfortunately, in some food
matrix, these compounds are poorly available during human digestion.
Physiologically, lipophilic nutrients need to be released from food matrix and
incorporated into micelles during digestion before being absorbed (i.e.
bioaccessibility) (Parada and Aguilera, 2007). Carotenoid bioavailability and
bioconversion are affected by numerous factors described by the SLAMENGHI
system: it depends on the Species of carotenoids, the Linkages at molecular level,
the Amount of carotenoid, the Matrix effect, the presence of Effectors, the Nutrient
status of the host, the Genetic variability, the Host related factors and the Interactions
among these variables (Castenmiller and West, 1998).
In plants, carotenoids are located in chromoplasts which are surrounded by the cell
wall (Vishnevetsky et al., 1999). Their potential release and incorporation into
micelles depends on the disruption of the overall plant tissue and the breakdown of
the cell walls during mastication (Low et al., 2015). The cell wall is a complex
structure divided in 3 distinct layers: the primary and secondary cell walls and the
middle lamella. The glycoproteins and phenolic compounds are found in primary cell
wall while cellulose and hemicellulose are found in primary and secondary wall
(Sandhu et al., 2009). The middle lamella also contains pectin which is a hetero-
polysaccharide mainly constituted of galacturonic acid.
The plant cell wall composition and structure determine the wall strength and the cell
adhesion (Waldron et al., 1997). During ripening and processing, the cell separates
according to the dissolution of the middle-lamellar pectic polysaccharides. The
structure of a plant tissue also depends on the cell-wall chemical bonds. Some
phenolic compounds can be covalently linked to the polysaccharides in the plant cell
wall (Kitamura, 2006).
Regular consumption of plants rich in phenolic compounds affects lipid metabolism
and has a lipid-lowering effect (Crespy and Williamson, 2004). According to in vitro
and in vivo studies, regular consumption of green tea impairs the intestinal
absorption of dietary lipids (Koo and Noh, 2007). Catechins interfere with the
emulsification, digestion, and micellar solubilization of lipids; the latter step being a
key mechanism of the intestinal absorption of dietary lipids. Furthermore, some
polyphenols (e.g. naringenin) decrease the carotenoid uptake by Caco-2 cells
(Tachibana et al., 2004). In the same way, diets rich in pectins avoid the micelle
65
formation during digestion; the oil emulsion is embedded in a gel-like pectin (Borel et
al., 1996; Verrijssen et al., 2014). The rheological properties of pectins could
increase the viscosity of the duodenal medium and impair the activities of lipase and
bile acids (Koseki et al., 1989; Wang et al., 2001). In human, clinical studies have
highlighted the negative effect of diets rich in pectins on carotenoid bioavailability
(Rock and Swendseid, 1992; Riedl et al., 1999).
The aim of the present work was to identify the key determinants of the
bioaccessibility of lipophilic micronutrients (β-carotene, lutein, α-tocopherol) in fresh
leafy vegetables. Leafy vegetables with distinct biochemical profiles were
characterized in terms of composition (cell wall, pectin, protein and tannin contents)
and their capacity to release micronutrients was determined by in vitro digestion. The
correlations between the biochemical profile of the leaves and the micronutrient
bioaccessibility were evaluated by statistical analysis.
5.1.2 Materials and methods
Materials and chemicals
Solvents, HPLC standards (α-carotene, β-carotene, lutein, α-tocopherol, δ-
tocopherol, cyanidin, delphinidin, tannic acid) and enzymes (pepsin 800-2,500 U/mg,
pancreatin B1750, bile extract porcin B8631) were obtained from Sigma-Aldrich
(Saint Quentin Fallavier, France). The polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes
were obtained from Sartorius (Palaiseau, France).
Tableau 6 : Thai, English and scientific names of the eight leafy vegetables
English name Thai names Scientific names
Coriander Phak chee Coriandrum sativum L.
Mint Saranae Mentha spicata L.
Thai basil Horapa Ocimum basilicum L.
Water spinach Phak boong Ipomoea aquatic Forssk.
Chaphlu Chaphlu Piper sarmentosum Roxb.
Chayote Fuk meaw Sechium edule Jacq.
Drumstick Marum Moringa oleifera Lam.
Perilla Nga khee mon Perilla frustescens L.
Eight leafy vegetables frequently consumed in South-East Asia were identified
among the literature (Table 6). Around 5 batches of each leafy vegetable were
66
purchased in an Asian market (ParisStore Montpellier). In order to limit experimental
variations, leaves with same colour and size were chosen. The final quantity of
homogeneous leaves was approximately 60 g in fresh state. Then, the steams were
removed and the vegetables were washed with distilled water. The day of purchase,
the leaves (5 × 1 g) were submitted to in vitro digestion (IVD). Another 10 g was used
for the dry matter assessment and 30 g was lyophilized for 24 hours and pulverized
for protein and tannin determination. The rest of the samples was frozen for cell wall,
pectin and micronutrient determinations.
Dry matter determination
The dry matter (DM) contents were determined by drying the samples 24 h at 105°C.
Samples were then weighted precisely on a Mettler AE166 balance (Viroflay,
France).
In vitro digestion (IVD) protocol
The IVD protocol was adapted from a published procedure (Reboul et al., 2006). As
previous researches have shown that lipids enhance carotenoid micellarisation, 80
µL of colza oil (diluted in acetone 32 %) was added since the beginning of digestion
(Hedrén et al., 2002a; Mulokozi et al., 2004a).
Samples (~1 g) were manually cut in 1.5 cm² pieces, weighted precisely in a amber
screw caped bottle and 32 mL of oral solution (pyrogallol 1.3 % in NaCl 0.9 %) were
added. Samples were incubated for 10 min at 37°C with gentle stirring (IKAMAG® RT
15 power). The gastric phase started then with adjusting the pH to 4.0 ± 0.1 by
adding 500 µL of 1 M HCl, and then 2 mL of porcine pepsin (4 % in 0.1 M HCl). The
mixture was incubated at 37°C for 30 min with gentle stirring again. Thereafter, the
pH was raised to 6.0 ± 0.1 by adding 800 µL of 0.9 M of sodium bicarbonate buffer
and, 9 mL of the intestinal solution (porcine pancreatin 0.2 %, and porcine bile extract
1.2 % dissolved in 0.1 M of trisodium citrate, pH 6) was added. Then, 4 mL of porcine
bile extract at 0.1 g/mL were added. The samples were incubated for 30 min in a
stirring water bath at 37°C. Digesta were centrifuged at 4000 g for 1 h at 10°C
(Heraeus Multifuge X1R, Thermo Fisher Scientific, Villebon sur Yvette, France).
Then, 10 mL was collected with a needle fitted to a syringe and filtered through a 0.2
67
µm cellulose acetate membrane to recover the micellar fraction. Lipophilic
compounds were then extracted.
Determination of total and bioaccessible carotenoids and tocopherols
Carotenoids and tocopherols were extracted from 50 mg. Samples were ground
(Turrax, Prolabo, France) for 1 min with 15 mL of ethanol/hexane (4:3, v/v) and then
centrifuged for 30 min at 10°C and 4000 g (Heraeus Multifuge X1R, Thermo Fisher
Scientific, Villebon sur Yvette, France) (Taungbodhitham et al., 1998). This study
evaluated a suitable extraction method for a wide range of sample matrices in
carotenoid analysis. Using canned tomato juice as a representative sample, it is
shown that two solvents of low biological hazard, ethanol and hexane are the most
suitable for extracting carotenoids from the matrix. The use of double extraction,
each with 35 mL of ethanol: hexane mixture (4:3, by volume), resulted in good
recoveries of carotenoids (lycopene 96 %, α-carotene 102 % and β-carotene 93–100
%). Coefficients of variation conducted on different days were: lycopene 5 % and β-
carotene 7 %. An application of the established method to various kinds of fruit and
vegetable matrices is also shown, using carrot and spinach as representative
samples of root and leafy vegetables, for determining recoveries of added
carotenoids. The average percent recoveries of added carotenoids from canned
tomato juice, carrot and spinach were: 101, 99.8 and 101 % for α-carotene (12.4,
24.8, 49.6 and 99.2 μg/10 mL of added α-carotene); and 98.1, 99.7 and 96.1 % for β-
carotene (25.5, 50.9, 101 and 201 μg/10 mL of added β-carotene). These similar
recoveries over the explored concentration ranges confirm that the application of
established extraction method is unaffected by differences in matrix composition of
the samples (Taungbodhitham et al., 1998). Afterward, the supernatant was
transferred into a glass funnel and 10 mL of NaCl 10 % was added (p/v). The sample
was gently homogenized and decanted during 10 min. The lower phase was
discarded and the organic phase was washed with 10 mL of distilled water. After
settling for 10 min, organic extracts were dried under nitrogen and residues were
dissolved in 2 mL of acetone. After filtration on a 0.2 µm PTFE minisart SRP4
membrane (Sartorius), sample (20 µL) was injected into the HPLC.
After in vitro digestion, 10 mL of digesta were isolated and the lipophilic compounds
were extracted by adding 20 mL of ethanol/hexane (4:3, v/v). Samples were
68
homogenised and, then, 20 mL of NaCl 25 % were added (p/v). After 10 min of
settling in the dark, the organic phase was re-extracted with 20 mL of ethanol/hexane
(4:3, v/v) and washed with 15 mL of distilled water. The organic phase was then dried
under nitrogen and residues were dissolved in 400 µL of acetone. The extracts were
immediately filtered through 0.2 µm PTFE membranes and analysed. The content in
bioaccessible carotenoids corresponds to the amounts of compounds transferred to
the aqueous micellar phase at the end of IVD. The bioaccessibility (in %)
corresponds to the amount of compounds transferred to the micellar phase
compared to the initial contents in the fresh leaves.
Elution was performed with a Dionex P680 pump. The column was a polymeric C30
(4.6 mm i.d × 250 mm, 5 μm particle size, YMC, Inc Wilmington NC). The mobile
phase comprised of two mixes at a flow rate of 1 mL/min. A mix constituted of
methanol and milli-Q water, 60:40 (v/v), and B mix constituted of methanol, methyl
tert-butyl-ether and milli-Q water, 28.5:67.5:4 (v/v/v). The gradient applied
progressed from 100/0 to 0/100 (A/B) over a period of 31 min and the temperature
was 25°C. A UV-visible photodiode array detector (Dionex UVD 340U) was used and
chromatograms were analysed at the wavelength of maximum absorption of the
carotenoids and α-tocopherol in the mobile phase (450 and 292 nm respectively).
External calibration was used in the range of 0.5 to 25 mg/L.
Retinol equivalents (RE) were calculated using a conversion factor of 12 for β-
carotene and of 24 for the other provitamins A (α-carotene, β-cryptoxanthine) for 1
retinol and expressed in mg RE/100 g (Murphy, 2002).
Determination of protein content
Protein content was determined by the AFNOR NF V03-050 standard method
(nitrogen content determined by the Kjeldahl method) with a conversion factor of
6.25.
Determination of alcohol-insoluble residues (AIRs) and pectin contents
The cell walls were isolated by precipitation in boiling ethanol to remove low-
molecular-weight components (Selvendran, 1975). Leafy vegetables (containing 1
part of water) were combined with boiling ethanol (4 parts) and ground 1 min (Turrax,
Prolabo, France). The mixture was boiled for another 15 min and then filtered on a
69
funnel of porosity 3 μm (DURAN®, Wertheim, Germany). The residue was
extensively washed with ethanol, acetone, and ether, one after the other, and finally
dehydrated in a vacuum oven (55°C; 24 h) and weighed. As leafy vegetables are rich
in proteins, the cell wall contents were calculated by subtracting the protein content
from the residue weight (Selvendran and O’Neill, 1987).
The pectin contents of the cell walls were determined by galacturonic acid content
without preliminary desesterification by the m-phenylphenol procedure (Blumenkrantz
and Asboe-Hansen, 1973; Ahmed and Labavitch, 1978).
Determination of condensed tannin and gallotannin
Condensed tannins (also called proanthocyanidins) were measured using the
butanol-HCl assay (Porter et al., 1985). Condensed tannins were oxidized to
anthocyanidins (cyanidin and delphinidin) and quantified by liquid chromatography.
The reaction was conducted directly on 50 mg of freeze dried powder without
preliminary extraction (Tarascou et al., 2010). Samples were solubilised in 6 mL of
butanol-HCl (95:5, v/v) and 0.2 mL of ferric reagent (NH4Fe (So4)2 2% in 2M HCl,
w/v). After vortexing, samples were heated at 95°C for 45 min. The solutions were
cooled, filtered through 0.2 µm PTFE membranes and then analyzed with liquid
chromatography. External calibration was realized by the use of stock solutions of the
pure chemicals (cyanidin or delphinidin) diluted in butanol-HCl and ferric reagent 2 %
on the range of 0.5 to 25 mg/L. The contents in condensed tannins are expressed in
mg equivalent of cyanidin or delphinidin for 100 g of fresh leaves.
Gallotannins were determined after acid hydrolysis and the gallic acid liberated was
quantified by liquid chromatography. The hydrolysis was conducted directly on 10 mg
of freeze dried powder by adding 0.1 mL of H2SO4 94 % in a glass tube sealed with a
screw cap. Samples were heated at 100°C for 26 h (Inoue and Hagerman, 1988).
Afterward, 2 mL of milli-Q water and 4 mL of 0.5 M NaOH were added. The pH was
adjusted precisely to 2.0 ± 0.2. The samples were thereafter diluted 8 fold in MeOH
and filtered through 0.45 µm cellulose membranes and then analyzed with liquid
chromatography. External calibration was realized by the use of stock solution of the
pure gallic acid in the range of 0.5 to 30 mg/L. The contents of gallotannins are
expressed in mg equivalent of gallic acid for 100 g of fresh leaves. Tannic acid was
used as positive control.
70
The HPLC conditions were the same for the anthocyanidin and gallic acid analysis.
Elution was performed with a Dionex P680 pump. The column was LiChroCART®
250-2 Purospher® STAR (4.6 mm i.d × 250 mm, RP-18e 5 μm, Merck KGaA,
Germany). The mobile phase comprised of two mixes at a flow rate of 0.25 mL/min.
The mix A was formic acid and milli-Q water (2:98, v/v), and the mix B was obtained
with methanol, milli-Q water and formic acid (69:29:2, v/v/v). The elution program
was performed at 25°C and a constant flow-rate of 0.25 ml/min passing from 0 % of
B to 8 % of B in 8 min, and then rising to 100 % of B in 12 min (for 8 min). The
program included washing and reconditioning of the column for 15 min. A UV-visible
photodiode array detector (Dionex UVD 340U) was used and chromatograms were
analysed at the wavelength of maximum absorption of cyanidin, delphinidin and gallic
acid in the mobile phase (i.e. 550 and 280 nm respectively).
Statistical analysis
All the experiments (biochemical characterization and in vitro digestion) were realised
with 5 repetitions for each vegetable. Data were assessed by analysis of variance
(one-way ANOVA) using Statgraphics plus 5.1 (Virginia, USA). Significance was
accepted at probability p < 0.05. Correlations between the bioaccessibility of the
micronutrients and the biochemical composition of the leaves were evaluated using
principal component analysis by Statgraphics plus 5.1 (Virginia, USA) and R
software.
5.1.3 Results
The dry matter, protein, cell wall and tannin contents of the leafy vegetables.
The dry matter contents of the eight leafy vegetables ranged from 10.6 % to 24.2 %
(Table 7). These results are in agreement with previously published data for
coriander (9.1-13.1 %), mint (11.8-13.8 %), water spinach (8.3-13 %), chaphlu (11.4
%) (Singh et al., 2001; Santos et al., 2014). The protein contents of the leaves were
rather high and in good accordance with previously published data (Singh et al.,
2001; Santos et al., 2014). Several proteins were identified in leafy vegetables such
as extensins, arabinogalactan proteins and expansin (Showalter, 1993; Cassab,
1998).
71
Tableau 7 : Nutritional profile of the fresh leafy vegetables
Vegetables n DM
(g/100 g) Protein
(g/100 g) AIR
(g/100 g) Pectin
(g/100 g)
Condensed tannin
(mg/100 g)
Coriander 5 12.6 ± 0.3c 4.6 ± 0.7d 3.4 ± 0.9a 0.4 ± 0.1b,c -
Mint 5 14.9 ± 1.8d 3.3 ± 0.4b 8.7 ± 0.4e 1.2 ± 0.1e -
Thai basil 5 11.1 ± 0.7a,b 2.4 ± 0.2a 6.0 ± 0.4c 0.7 ± 0.1d -
Water spinach
5 10.6 ± 0.4a 3.7 ± 0.2b,c 4.7 ± 0.9b 0.4 ± 0.1c -
Chaphlu 5 17.0 ± 1.0e 4.1 ± 0.4c,d 8.5 ± 0.9e 1.2 ± 0.2e -
Chayote 5 11.9 ± 0.6b,c 4.3 ± 0.3d 4.6 ± 0.7b 0.4 ± 0.1c -
Drumstick 5 24.2 ± 0.7f 8.7 ± 0.5e 8.1 ± 0.4e 0.2 ± 0.1a 77.2 ±7.2a
Perilla 5 16.8 ± 0.3e 4.5 ± 0.2d 7.2 ± 0.4d 0.3 ± 0.03a,b 556.6 ±13.8b n: number of repetitions. DM: dry matter. Proteins were calculated by N x 6.25. AIR: alcohol-insoluble residue. Pectins were determined by multiply the uronic acids with a factor of correction 0.907. - : not detected. Data are presented as mean ± standard deviation for 100 g of fresh weight. Values with distinct lowercase superscript letters in the same column are significantly different (p≤ 0.05).
Cell wall contents of the leafy vegetables were estimated by the determination of
alcohol-insoluble residues (AIRs) after subtracting the protein contents (Table 7). It
corresponds to the polysaccharide of the primary cell wall and the middle lamella
(cellulose, hemicellulose and pectin). The AIRs ranged from 3.4 to 8.7 g for 100 g in
wet basis. The leaves with the highest contents of cell walls were, in decreasing
order, mint, chaphlu and drumstick leaves. The lowest AIRs were found in coriander
(3.4 g/100 g) which is approximately 1.5 fold lower than the others.
Large varietal differences were observed in term of pectin contents which ranged
from 0.2 to 1.2 g for 100 g of leaves. The leaves with the lowest pectin contents were
drumstick, coriander and water spinach. The pectin amount of the AIRs accounted
for less than 14 % in all the species: 2.5 % in drumstick, 14.4 % in chayote, 10.5 % in
coriander, 13.9 % in mint, 12.4 % in Thai basil and 9.3 % in water spinach.
As part of the tannins is not extractable from plant tissue, tannin hydrolysis was
performed directly on the dried leaf powder. Condensed tannins were detected only
in drumstick and perilla leaves (77 and 556 mg/100 g respectively). The condensed
tannins of drumstick were only constituted of procyandins while the condensed
tannins of perilla were constituted of 94 % of cyanidin or 6 % of delphinidin. Whatever
the leaf species, no gallotannins were detected.
72
The carotenoid and tocopherol contents of the leafy vegetables
The main carotenoids were β-carotene and lutein (Table 8). The carotenoid profiles
are in agreement with previously published data (Singh et al., 2001; Kidmose et al.,
2006; Lako et al., 2007; Santos et al., 2014; Kopsell et al., 2005; Daly et al., 2010).
According to their contents in β–carotene, 7 leafy vegetables can be considered as
rich sources of provitamin A (range between 0.3 and 1 mg RE/100 g) and the
drumstick leaves are a very rich source of provitamin A (1 mg/100 g) (WHO). The
micronutrient richness of the drumstick leaves could be due to the highest level of dry
matter of the batch used in our work. The α-tocopherol was not detected in three
leafy vegetables (water spinach, chaphlu and chayote).
Tableau 8 : Micronutrient content of the fresh leafy vegetables
Vegetables n Lutein
(mg/100g) β-Carotene (mg/100g)
RE (mg/100g)
α-Tocopherol (mg/100g)
Coriander 5 7.9 ± 0.9a,b 6.4 ± 0.5b,c 0.53 ± 0.04b,c 3.9 ± 0.5c
Mint 5 8.2 ± 0.2a,b 5.7 ± 0.2b 0.47 ± 0.01b 1.4 ± 0.2a
Thai basil 5 7.7 ± 0.6a,b 6.2 ± 0.5b,c 0.52 ± 0.04b,c 4.2 ± 0.4c,d
Water spinach 5 10.2 ± 1.3c 7.1 ± 0.9c 0.59 ± 0.08c -
Chaphlu 5 15.8 ± 2.9d 4.3 ± 0.5a 0.36 ± 0.04a -
Chayote 5 7.4 ± 0.6a 4.4 ± 0.1a 0.32 ± 0.10a -
Drumstick 5 7.9 ± 1.1a,b 15.4 ± 0.7e 1.28 ± 0.06e 4.6 ± 0.2d
Perilla 5 9.2 ± 1.2b,c 11.9 ± 1.7d 0.80 ± 0.07d 1.9 ± 0.4b n: number of repetitions. RE: Retinol Equivalent Data are presented as mean ± standard deviation for 100 g of fresh weight Values with distinct lowercase superscript letters in the same column are significantly different (p≤ 0.05).
The bioaccessibility of carotenoids and α-tocopherol of the fresh leafy
vegetables
The bioaccessibility corresponds to the amount of compounds transferred to the
micellar phase at the end of IVD compared to the initial food contents. The
bioaccessibility is expressed in percentage or in mg for 100 g of food as eaten. In the
latter case, the initial content of the food will have a great importance.
In the figures 21 and 22, the leafy vegetables are classified in increasing order of
pectin content from the left to the right; it clearly appears that the leaves with the
lowest contents in pectin are the richest in tannins.
73
Figure 21 : Contents in bioaccessible micronutrients (mg/100 g FW) and their relative bioaccessibility (%) in the leafy vegetables. β-carotene (A, B), lutein (C, D). Different letters above each bars indicate significant difference (p < 0.05)
75
Whatever the leaves, the content in bioaccessible β-carotene was always very low (<
0.5 mg/100 g FW) as well as its bioaccessitility (< 1 %). The lutein bioaccessibility was
significantly higher than the β-carotene one (almost 2 fold higher). The leaves with the
highest contents in bioaccessible β-carotene and lutein were chayote and perilla. For
mint and Thai basil, similar contents in bioaccessible β-carotene were obtained by in
vitro digestion (Daly et al., 2010).The content in bioacessible -tocopherol among leafy
vegetables is little documented in the literature (Reboul et al., 2006; Nagao et al., 2013).
In our experiments, the content in bioacessible -tocopherol was 10 fold higher than the
β-carotene one.
Figure 22. Contents in bioaccessible α-tocopherol (mg/100 g FW) and their relative bioaccessibility (%) in the leafy vegetables. Different letters above each bars indicate significant difference (p < 0.05)
Determinants of the carotenoid and α-tocopherol bioaccessibility in the fresh leafy
vegetables
The aim of our work was to assess the key biochemical determinants of the carotenoid
bioaccessibility in fresh leafy vegetables. The relationships between the variables
(biochemical composition, bioaccessibility of the micronutrients) were explored by
principal component analysis. The representation of the variables with the principal
component analysis accounted for 80.2 % of the variability of the data (Figure 23). In the
tested leaves, the contents of bioaccessible β-carotene, lutein and condensed tannins
were positively correlated. Indeed, the leaves with the higher bioaccessible carotenoids
were drumstick and perilla which exhibited very low pectin and cell wall contents and
76
noticeable amount of condensed tannins. The α-tocopherol bioaccessibility was not
correlated with any variable in our study.
Figure 23 : Principal component analysis of the micronutrient bioaccessibility and the biochemical composition (AIR, pectin, protein, tannins) of the leaves. % β-carotene: bioaccessibility of the β-carotene. % lutein: bioaccessibility of the lutein. % α-tocopherol: bioaccessibility of the α-tocopherol. Proteins (g/100 g FW). Pectins (g/100 g FW). % pectin: percentage of pectin in the cell wall. AIR: alcohol insoluble residue corresponding to the cell wall content (g /100 g FW). Tannins: condensed tannins (mg/100 g FW). DM: dry matter
5.1.4 Discussion
The leafy vegetables have interesting nutritional profiles with noticeable amounts of
provitamin A, α-tocopherol and proteins. Their consumption in the human diet should
participate to fulfill several human requirements.
In the fresh leafy vegetables, the content in bioaccessible carotenoids was low because
no previous treatments were applied to destructure the food matrix. The contents in
bioaccessible carotenoids and -tocopherol of fresh leaves are of the same order of
previously published data even if they are lower. The main difference between the
protocols concerns the initial size of the leaves submitted to in vitro digestion. In our
case, the leaves were cut in 1.5 cm2 pieces while other researchers finely chopped the
samples. Furthermore, most studies reported carotenoid bioaccessility in leaves after
culinary treatments (cooking, grinding). The latter treatments generally improve the
micronutrient release by food matrix during the course of digestion. Our experiments
were conducted on fresh materials because our purpose was to assess the specific role
77
of the structural components on the micronutrient release. To reach this objective, the
plant tissue has to be digested without previous culinary destructuration.
The higher bioaccessibility of lutein is explained by its structure and polarity (Hof et al.,
2000; Rich et al., 2003). Indeed, xanthophylls are more polar which results in a higher
incorporation into the micelles than hydrocarbons (such as -carotene) (Tyssandier et
al., 2001; Granado-Lorencio et al., 2007).
Carotenoids are located in the chromoplasts which are embedded by cell walls. As the
carotenoid bioaccessility is very low in all the fresh samples, the cell wall integrity indeed
is a physical barrier for the carotenoid release. The cell walls are constituted of
polysaccharides not degraded throughout human digestion; only few of them are
hydrolyzed by the gut microflora. According to our correlation study, the pectin content of
the leaves impairs the carotenoid bioaccessibility. Due to their physicochemical
properties, pectins are partially soluble in water and acidic solution. These
polysaccharides can diffuse to the digestive medium during the incubation at 37°C in
acidic condition (data not shown). As a consequence, the micelle formation could be
avoided because a gel-like pectin appears (Borel et al., 1996; Verrijssen et al., 2014).
The increase in duodenal medium viscosity also impairs the lipase activity and bile salt
effect (Koseki et al., 1989; Wang et al., 2001; Vahouny and Cassidy, 1985).
The leafy vegetables rich in condensed tannins had very low content in pectin and cell
wall. In these leaves, the micronutrient bioaccessibility was high and it’s the reason why
the correlation study indicates a positive link between the bioaccessibility and the tannin
content. The protein content of the leaves has no effect on α-tocopherol or carotenoid
bioaccessibility probably because they are easily hydrolyzed thanks to the digestive
protease (pepsin, trypsin).
Our work highlights the key parameter that negatively governs the bioaccessibility of β-
carotene and lutein during the in vitro digestion. More investigation is needed to
elucidate the mechanism involved in the lipid-lowering effect of pectins. But the current
results could help breeders in selecting cultivars with optimal characteristics (i.e. high
micronutrient content, low pectin amount) to improve the incorporation of lipophilic
micronutrients into micelles and their absorption by the human gut.
78
Chapitre 2 – Influence des traitements culinaires et opérations unitaires sur la bioaccessibilité des caroténoïdes et de l’α-tocophérol de deux légumes feuilles couramment consommés en Asie
79
55..22 CChhaappiittrree 22aa –– IInnfflluueennccee ddeess ttrraaiitteemmeennttss ccuulliinnaaiirreess eett ooppéérraattiioonnss uunniittaaiirreess ssuurr
llaa bbiiooaacccceessssiibbiilliittéé ddeess ccaarroottéénnooïïddeess eett αα--ttooccoopphhéérrooll ddeess ffeeuuiilllleess ddee mmoorriinnggaa
Les légumes feuilles peuvent être consommés frais, ou incorporés après un traitement
de conservation dans des recettes traditionnelles. Les traitements appliqués (cuisson,
séchage, broyage) i) diminuent plus ou moins le profil nutritionnel et le pouvoir
antioxydants des produits et, ii) modifient la bioaccessibilité des composés d’intérêt par
modification des matrices alimentaires.
Le chapitre 2 contient 2 articles qui visent à déterminer l’influence des traitements
culinaires et des procédés de transformation sur la bioaccessibilité des caroténoïdes et
α-tocophérol de deux légumes feuilles couramment consommés en Asie :
Les feuilles de l’arbre moringa (article 2 accepté au journal LWT - Food Science
and Technology)
Les feuilles de brèdes chouchou (article 3 soumis à Food Research International).
Les traitements culinaires appliqués sont la cuisson dans l’eau, la cuisson à la vapeur et
la friture et les procédés de conservation sont la congélation, la lyophilisation, la
stérilisation, le séchage (solaire, four), le broyage plus ou moins fin et l’encapsulation en
gélules. Pour expliquer les variations de bioaccessibilité observées dans les échantillons
traités, le changement de la structure des feuilles a été évalué par histologie et
colorations spécifiques.
80
Article 2 - Influence des
traitements culinaires et des
opérations unitaires sur la
bioaccessibilité des
caroténoïdes et de l’α-
tocophérol des feuilles de
Moringa
81
Improvement of the content in bioaccessible lipophilic micronutrients
in raw and processed drumstick leaves (Moringa oleifera Lam.)
Wichien Sriwichai1, Myriam Collin2, Timothy J. Tranbarger2, Jacques
Berger1, Sylvie Avallone3,*
1IRD; UMR 204, IRD/Université Montpellier/SupAgro (NUTRIPASS), 911 avenue
Agropolis, BP 64501, 34394 Montpellier, Cedex 5, France
2Institut de Recherche pour le Développement, UMR DIADE 2, IRD/CIRAD F2F-
Palmiers, IRD, 34394 Montpellier, France, 34394 Montpellier cedex 5, France
3Montpellier SupAgro; UMR 204, IRD/ Université Montpellier/SupAgro (NUTRIPASS),
911 avenue Agropolis, BP 64501, 34394 Montpellier, Cedex 5, France.
ABSTRACT
Our objective was to evaluate the influence of cooking (boiling, steaming, frying) and
processing (freezing, freeze-drying, sun drying, oven drying, sterilization or powdering)
on the micronutrient profile of drumstick leaves (β-carotene, lutein, α-tocopherol) and the
bioaccessibility of the latter after in vitro digestion.
Fresh drumstick leaves contain a high level of carotenoids and α-tocopherol with a very
low bioaccessibility (< 1 %). Freezing, steaming and sterilization preserve the more the
micronutrients and most of the processing methods improve the contents in
bioaccessible β-carotene, lutein and α-tocopherol. Among the cooking practices, only
steaming was efficient to increase the compound release. The structural changes of the
leaf tissue during processing partially explain the modulation of the bioactive compound
release during the course of in vitro digestion. After boiling and steaming, the cells of
epidermis and mesophyll were slightly disorganized while frying induced a deep
destructuration of the overall tissue with cell wall rupture.
Keywords: cooking, vitamin retention, in vitro digestion, food destructuration, diffusion.
5.2.1 Introduction
The potential of indigenous trees to combat desertification and contribute to the well-
being and food security of local population was studied since decades (Nesbitt et al.,
82
2010). The drumstick tree (Moringa Oleifera Lam.) is interesting because it provides
environmental services and could bring other added values for human well-being. The
integration of Moringa tree in farming and pastoral systems could improve the
sustainability of local food systems by providing livelihoods and diet diversification
(Morton, 1991).
In traditional medicine, Drumstick is known for its effect on the digestive tract
(bactericide, antidiarrheal, laxative), kidney function (diuretic) and anti-inflammatory
effect (Arun Giridhari et al., 2011; Paliwal et al., 2011; Sharma et al., 2012; Coppin et al.,
2013). Several human studies have highlighted the anti-hyperglycemic, anti-dyslipidemic
and antioxidant activities properties of drumstick. In northern countries, encapsulated
drumstick powder is already commercialized by the pharmaceutical industry for its
antioxidant capacity, anti-hyperglycemic as well as lipid and cholesterol lowering effect
(William et al., 1993; Kumari, 2010; Nambiar et al., 2010; Arun Giridhari et al., 2011;
Kushwaha et al., 2014).
In Africa and Asia, distinct parts of the tree are consumed such as flowers, leaves, fruits,
bark, grains or roots. The leaves can be integrated in salad, traditional sauces, or soups
in raw or processed form; young leaves can also be steam cooked (Sallau et al., 2012).
The drumstick leaves have a quantifiable amounts of proteins, essential fatty acids,
minerals, vitamins (B, C, E, provitamin A) and a wide variety of polyphenols (flavonoids,
chlorogenic acid) (Ramachandran et al., 1980; Makkar and Becker, 1996; Aslam et al.,
2005; Amaglo et al., 2010; Coppin et al., 2013). The consumption of the leaves could
fulfill the recommended daily requirements of several macro and micronutrients. In fresh
or dried forms, the addition of drumstick leaves increases the content in iron, proteins
and vitamin A of traditional dishes (Ejoh et al., 2010). In animal models (gerbil, mouse),
the carotene bioavailability was high with raw and dehydrated drumstick leaf
consumption (Nambiar and Seshadri, 2001a; Ejoh et al., 2010). After few weeks of
depletion, the addition of tropical leafy vegetables to the gerbil’s diet increased the
vitamin A liver stores while serum retinol was not affected by the treatment. In the latter
study, the high carotenoid bioavailability was attributed to the small particle size of
powdered leaves (Ejoh et al., 2010).
Vitamin deficiencies are public health issues in Africa and South-East Asia and still
concern an estimated 190 million preschool-age children and 19.1 million pregnant
women (WHO, 2009). Populations with low incomes have insufficient micronutrient
intakes especially in vitamin A. Some carotenoids with provitamin A activity (β-carotene)
83
and vitamin E (α-tocopherol) have the antioxidant properties and contribute to several
functions such as cell growth and integrity, tissue differentiation, immunological defense
and vision. The drumstick leaves are rich in these bioactive compounds but their
biological effects are still controversial. Leafy vegetables and particularly drumstick
leaves could have a low nutritional efficacy because of their structure and biochemical
composition (rich in fibers and phenolic compounds).
The effect of processing on the nutritional value of drumstick leaves has been
investigated for several years but the capacity of the leaves to deliver their micronutrient
during digestion is not documented. The aim of the present work was to assess the
influence of several treatments on the content in total and bioaccessible β-carotene,
lutein and α-tocopherol of drumstick leaves.
5.2.2 Material and methods
2.1. Materials and chemicals
Solvents, HPLC standards (β-carotene, α-carotene, lutein, α-tocopherol, δ-tocopherol)
and enzymes (pepsin 800-2,500 U/mg, pancreatin B1750, bile extract porcin B8631)
were obtained from Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). The
polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes were obtained from Sartorius (Palaiseau,
France). Capsule in hydroxypropyl methylcellulose (HPMC) were bought in a local
drugstore.
Drumstick leaves (1 kg) were purchased from Gopal and Co supermarket (Paris) and
leaves with same color and size were chosen to limit experimental variations.
Vegetables were cleaned with distilled water and the stem and other inedible parts were
removed. Raw leaves (5 × 1 g) were directly submitted to in vitro digestion to assess the
content in bioaccessible micronutrients. Then, treatments were applied to 11 batches of
leaves (10 g) for further analysis.
2.2. Dry matter assessment
The dry matter (DM) contents of the raw and processed leaves were determined by
drying the leaves in oven (24 h at 105°C). Dry matter was then weighed precisely on a
Mettler AE166 balance (Viroflay, France).
84
2.3. Processing methods and culinary treatments
Ten treatments were applied to 2 g drumstick leaves (Fig. 1) with 5 repetitions for each
one. Some treatments correspond to Thai cooking and the others are preservation
methods. Boiling was realized in milli-Q water, stir-frying in colza oil, and the equipment
used for the treatments were as follows:
freeze-drying Alpha 1-2 LD plus, Christ (Osterode, Germany)
oven dryer (Radnor, Pennsylvania, USA)
grinder from IKA (Staufen, Germany). Grinding for 1 and 3 min provides particle
size of 1 mm and 200 µm respectively
For encapsulation, 0.5 g of fine powdered leaves was introduced in hydroxypropyl
methylcellulose (HPMC) capsules. After treatments, the samples were weighed to
determine the cooking yields (Figure 24).
Figure 24 : Treatments applied to drumstick leaves before in vitro digestion
85
2.4. In vitro digestion protocol (IVD)
The IVD protocol was adapted from a published procedure with the addition of 80 µL of
colza oil (diluted in acetone 32 %) at the beginning of digestion to enhance carotenoid
micellarisation (Hedrén et al., 2002a; Reboul et al., 2006). Samples (2 g) were mixed in
an amber screw-capped bottle with 15 mL of oral solution (pyrogallol 1.3 % in NaCl 0.9
%). Samples were incubated for 10 min at 37°C with gentle stirring (IKAMAG® RT 15
power, IKA, Staufen, Germany). The gastric phase started then by adding 500 µL of 1 M
HCl and adjusting the pH to 4.0 ± 0.1, and then 2 mL of porcine pepsin (4 % in 0.1 M
HCl). The mixture was incubated at 37°C for 30 min with gentle stirring. Thereafter, the
pH was raised to 6.0 ± 0.1 by adding 800 µL of 0.9 M of sodium bicarbonate buffer
before the addition of 9 mL of the intestinal solution: porcine pancreatin (0.2 %) and
porcine bile extract (1.2 %) dissolved in 0.1 M of trisodium citrate, pH 6. Then, 4 mL of
porcine bile extract at 0.1 g/mL were added. The samples were incubated for 30 min in a
stirring water bath at 37°C. Digesta were centrifuged at 4000 g for 1 h at 10°C (Heraeus
Multifuge X1R, Thermo Fisher Scientific, Villebon sur Yvette, France). Finally, 10 mL
was collected with a needle fitted to a syringe and filtered through 0.2 µm cellulose
acetate membrane to recover the micellar fraction. Lipophilic compounds were then
extracted.
2.5. Determination of total and bioaccessible carotenoids and tocopherols
Carotenoids and tocopherols were extracted from 50 mg of raw or processed leaves.
Samples were ground (Turrax, Prolabo, Coueron, France) for 1 min with 15 mL of
ethanol/hexane (4:3, v/v) and then centrifuged for 30 min at 10°C and 4000 g (Heraeus
Multifuge, Thermo Fisher Scientific, Villebon sur Yvette, France) (Taungbodhitham et al.,
1998). The supernatant was transferred into a glass funnel and 10 mL of NaCl 10 % was
added (p/v). After 10 min, the lower phase was discarded and the organic phase was
washed with 10 mL of distilled water. Organic extracts were recovered, dried under
nitrogen and residues were dissolved in 2 mL of acetone. After filtration on 0.2 µm PTFE
membranes (minisart SRP4, Sartorius), sample (20 µL) was injected into the HPLC.
After in vitro digestion, the micronutrients were extracted on 10 mL of digesta by adding
20 mL of ethanol/hexane (4:3, v/v). Samples were homogenized and 20 mL of NaCl 25
% were added (p/v). After 10 min, the organic phase was re-extracted with 20 mL of
ethanol/hexane (4:3, v/v) and washed with 15 mL of distilled water. The organic phase
86
was dried under nitrogen and residues were dissolved in 400 µL of acetone. The
extracts were filtered through 0.2 µm PTFE membranes and analyzed with HPLC.
Elution was performed with a Dionex P680 pump. The column was a polymeric C30 (4.6
mm i.d × 250 mm, 5 μm particle size, YMC Europe, Schermbeck, Germany). The mobile
phase comprised of two mixes at a flow rate of 1 mL/min. Mix A constituted of methanol
and milli-Q water, 60:40 (v/v), and B mix constituted of methanol, methyl tert-butyl-ether
and milli-Q water, 28.5:67.5:4 (v/v/v). The gradient applied progressed from 100 % to 0
% (A/B) over a period of 31 min and the temperature was approximately 25°C. A UV-
visible photodiode array detector (Dionex UVD 340U) was used and chromatograms
were analyzed at the wavelength of maximum absorption of the carotenoids and α-
tocopherol in the mobile phase (450 and 292 nm respectively). External calibration was
used in the range of 0.5 to 25 mg/L.
Retinol equivalents (RE) were calculated using a conversion factor of 12 for β-carotene
and of 24 for the other provitamins A (α-carotene) for 1 retinol and expressed in mg
RE/100 g (Murphy, 2002).
2.6 Light microscopy
Samples (raw or processed leaves) were fixed for 2 weeks in 0.2 M phosphate buffer at
pH 7.2, supplemented with 2 % (v/v) paraformaldehyde, 1 % (w/v) caffeine, and 1.5 %
(v/v) glutaraldehyde at 4°C (Morel et al., 1992). Progressive dehydration of samples was
realized with ethanol from 50 to 100 %, transfer to butanol/ethanol 1:1 (v/v), and then
100 % butanol. Each sample was impregned in Technovit 7100 resin (Heraeus Kulzer
GmbH, Wehrhrim/Ts, Germany). Semi-thin sections of 4 µm were cut using a Historange
microtome (LKB Broma, Uppsala, Sweden). Sections were stained with specific
reagents as follow: i) periodic acid-Schiff’s reagent (Sigma–Aldrich, Lyon, France) and
with naphtol blue black (NBB) to specifically reveal polysaccharides (in pink) and
proteins (in dark blue) (Morel et al., 1992); ii) ruthenium red to stain pectins (in pink)
(Sterling, 1970); iii) toluidine blue to reveal tannins in greenish blue (Brillouet and
Escoute, 2012). Observations and microphotographs were performed with a Leica
camera (Wetzlar, Germany) DMRB 301-370 light microscope (Evolution MP 5.0 color
media Cybernetics Cooled RTV 32-0040C-140).
87
2.7. Statistical analysis
The micronutrient content of the moringa leaves was compared after 3 culinary
treatments and 7 preservation methods applied with 5 repetitions. Data were assessed
by F-test in one-way analysis of variance (ANOVA) using Statgraphics plus 5.1 (Virginia,
USA). Significance was accepted at probability P < 0.05.
5.2.3 Results and discussion
3.1. Effects of culinary treatments and processing method on the dry matter content and
micronutrient profile
In the raw leaves, the major lipophilic compounds were β-carotene, lutein and ɑ-
tocopherol and their respective quantities were 63, 32, and 57 mg for 100 g DM (Table
9). These results are in accordance with previously published data (Nambiar and
Seshadri, 1998; Saini et al., 2014a). The DM was rather high 24 % as well as the RE
content (5.3 mg for 100 g DM) as previously observed (2.5 mg for 100 g DM) (Kidmose
et al., 2006).
Tableau 9 : Micronutrient profile of raw and processed drumstick leaves for 100 g DM
Transformation n DM
(g/100g) β-carotene (mg/100g)
Lutein (mg/100g)
α-tocopherol (mg/100g)
RE (mg/100g)
Raw 5 24.2 ± 0.7c 63.6 ± 3.0a 32.5 ± 4.5a,b 57.6 ± 12.1a 5.3 ± 0.3a
Freezing 5 22.2 ± 1.8c 46.2 ± 4.5b 34.8 ± 3.0 a,b 58.4 ±12.1a 3.8 ± 0.4b
Freeze-drying 5 93.8 ± 1.2d 30.6 ± 3.9e 31.3 ± 6.0b 56.0 ± 6.9a,b 2.6 ± 0.3e
Boiling 5 8.5 ± 0.7a 21.8 ± 3.1f 21.9 ± 2.6c 42.2 ± 3.9c 1.8 ± 0.3f
Steaming 5 15.2 ± 3.2b 51.2 ± 5.1b 37.8 ± 2.9a 45.8 ±11.2c,b 4.3 ± 0.4b
Frying 5 97.8 ± 4.4e 10.4 ± 0.4g 9.9 ± 1.0d 6.4 ± 1.3e 0.9 ± 0.0g
Sterilization 5 8.5 ± 0.7a 45.8 ± 2.5b,c 32.5 ± 1.4a,b 27.1 ± 1.0d 3.8 ± 0.2c,b
Sun drying 5 93.4 ± 0.6d 15.2 ± 3.3g 20.2 ± 2.2c 14.6 ± 2.0e 1.3 ± 0.3g
OvD-CG 5 96.0 ± 1.8d,e 34.6 ± 6.1e 34.6 ± 4.9a,b 49.3 ±10.4a,b,c 2.9 ± 0.5e
OvD-FG 5 96.0 ± 1.8d,e 40.1 ± 3.7c,d 37.5 ± 6.8a 41.0 ± 9.0c 3.3 ± 0.3c,d
OvD-FGE 5 96.0 ± 1.8d,e 35.4 ± 4.9d,e 35.8 ± 4.7a,b 27.5 ± 1.1d 2.9 ± 0.4d,e
n: number of repetitions. DM: dry matter. RE: retinol equivalent. Data are presented as the mean ± standard deviation. Values with distinct lowercase superscript letters in the same column are significantly different (p≤ 0.05). OvD-CG: oven drying and coarse grinding. OvD-FG: oven drying and fine grinding. OvD-FGE: oven drying, fine grinding and encapsulation.
88
The DM in cooked leaves ranged from 8.5-22.2 % and drying leaded to dehydrated
products with low residual water contents (4 to 6 %). The steam cooking, freezing and
sterilization were the treatments which preserve the best β-carotene and retinol
equivalent (RE), with respective loss ranging from 19-27 % and 16-37 %. In contrast,
drastic losses of β-carotene and RE were observed after frying and sun drying.
Thermal and mechanical treatments (oven drying-fine grinding and encapsulation) also
induced compound loss (> 45 %). During the leaf grinding and encapsulation, the
surface area in contact with atmosphere and light was increased which caused the
micronutrients loss by oxidation reactions. As observed in our work, sun drying (with
light exposures) can induce drastic loss reaching 80 % (Park, 1987; Craft et al., 2002;
Saini et al., 2014a; Knecht et al., 2015).
Steaming preserved more carotenoids than cooking in water where losses ranged from
24 to 83 % (Jayarajan et al., 1980; Dikshit et al., 1988; Grimme et al., 1984; Dietz et al.,
1988; Mazzeo et al., 2011). Frying was the treatment that degraded the more the
biochemical compounds.
3.2. Influence of culinary treatments and processing on the contents in
bioaccessible micronutrients
Once the IVD was completed, the lipophilic bioaccessible compounds are released from
the food matrix and transferred to the micelles of the digestive medium. In raw leaves,
the contents in bioaccessible β-carotene, lutein and ɑ-tocopherol were low (< 2 mg/100
g DM) as well as their relative bioaccessibility (< 3 %) (Figure 25, 26 and 27).
Xanthophylls were more bioaccessible than carotenes as observed in numerous studies
(Pérez-Gálvez and Mínguez-Mosquera, 2005; Reboul et al., 2006; Granado-Lorencio et
al., 2007; Palmero et al., 2014). The content in bioaccessible ɑ-tocopherol was always
higher than carotenoids whatever the treatment. Most of the processing methods (freeze
drying, steaming, sterilization, sun drying, oven drying and encapsulation) increased
significantly the contents in bioaccessible micronutrients and the effect of the
preservation step was always higher for lutein (12 fold increase) than β-carotene (4 fold
increase).
89
Figure 25 : Contents in bioaccessible β-carotene in the raw and processed drumstick leaves (mg/100 g DM). Different letters above each bar indicate significant difference (p < 0.05). OvD-CG: oven drying and coarse grinding. OvD-FG: oven drying and fine grind. OvD-FGE: oven drying, fine grinding and encapsulation
Figure 26 : Contents in bioaccessible lutein in the raw and processed drumstick leaves (mg/100 g DM). Different letters above each bar indicate significant difference (p < 0.05). OvD-CG: oven drying and coarse grinding. OvD-FG: oven drying and fine grind. OvD-FGE: oven drying, fine grinding and encapsulation
90
When drying was combined with grinding, the contents in bioaccessible micronutrients
were improved. Grinding improved the diffusion of the compounds from the cells to the
digestive medium; it opened the cells by breaking their walls and reducing the particle
size to less than 1 mm or 0.3 mm according to the grinding time. It was previously
demonstrated in wheat, that fine grinding allows disruption of plant cell walls and
improves phenolic acid bioaccessibility (Hemery et al., 2010).
After steaming and sterilization, the leaves became softer than the raw ones (data not
shown) probably due to the long duration of the thermal treatment (15 min).
Improvement of carotenoid and ɑ-tocopherol micellarisation was already observed after
boiling in water (Nambiar and Seshadri, 2001a; Lemmens et al., 2010b; Moelants et al.,
2012). Frying did not improve the content in bioaccessible compounds probably because
the treatment induces important losses of carotenoids by chemical reactions (Achir et
al., 2010).
Figure 27 : Contents in bioaccessible α-tocopherol in the raw and processed drumstick leaves (mg/100 g DM). Different letters above each bar indicate significant difference (p < 0.05). OVD-CG: oven drying and coarse grinding. OVD-FG: oven drying and fine grind. OVD-FGE: oven drying, fine grinding and encapsulation
Encapsulation of dried and powdered leaves was an efficient way to deliver
bioaccessible compounds. The HPMC capsule was not a physico-chemical barrier for
91
the micronutrient release; experimentally, it was dissolved in 5 min in the digestive
medium.
3.3. Structural changes after culinary treatments
To improve the micronutrient bioaccessibility, the cells have to be opened by
destructuration. The light micrographs clearly show that the leaf was organized with an
upper and lower epidermis, and a mesophyll tissue comprised of palisade and spongy
cells. The vascular bundles were also visible at the middle of the cross section (Fig.
28A-B). The palisade mesophyll was composed of elongated cells perpendicular to the
upper epidermis; the contents of palisade cells stain blue with periodic acid-Schiff’s
reagent/NBB suggesting a high amount of protein (Figure 28A). Tannin containing cells
appeared greenish blue with toluidine blue, green with ruthenium red, but were also
discernible as distinct cells with periodic acid-Schiff’s reagent/NBB within the spongy
mesophyll (Fig. 28A and 29G). According to the scale, we clearly see that the cells have
a size (length and width) lower than 100 µm. Grinding the leaves to 1 mm or 200 µm
particle size only opened a fraction of the leaf cells
Morphological and qualitative changes were observed after all the treatments. In boiled
and steamed leaves, epidermal and palisade mesophyll cells appeared intact and were
similar to untreated leaves (Figure 28C, 28D, 28F, 29H and 29I). Some spongy cells
appeared slightly disorganized after boiling and steaming. Frying promoted a loss of
integrity of both epidermal and mesophyll cells, and a loss of protein and tannin. Upper
and lower epidermal layers were no longer visible while the palisade and spongy cells
appeared ruptured and disorganized. In contrast, both boiling and steaming did not
appear to rupture the cells, while the blue staining pattern showed the protein content
was more diffuse (Figure 28C, 28D and 28F). No apparent structural difference was
observed between the boiled and steamed that could explain the higher bioaccessibility
measured in the latter. However, a comparison of sections of boiled and steamed
samples stained with Ruthenium Red and NBB indicated a loss of tannin from cells in
the steamed samples, while the tannins were still observed in the boiled samples (Figure
28C, 28D, 28F).
92
Figure 28 : Light micrographs of drumstick leaves. Cross section, x20: raw leaves (A – C) and cooked leaves (D boiled, E: fried, F: steamed). Periodic acid-Schiff’s and naphtol blue black staining (A, C, D, E and F), toluidine blue staining (B). E: epidermis. PC: palisade cells; SC: spongy cells; VB: vascular bundle, CT: condensed tannins, NCT: none contain condensed tannins (orange arrow pointing). Scale bars = 100 µm.
E SC
E VB 4A
PC
4F
NCT
4B
CT
4C
CT
4D
CT
4E
93
Figure 29 : Light micrographs of drumstick leaves. Cross section, x20: raw leaves (G) and cooked leaves (I: boiled, J: fried, H: steamed). Ruthenium red staining (G, H, I, J). CT: condensed tannins, NCT: none contain condensed tannins (orange arrow pointing). Scale bars = 100 µm
In raw leaves, cell wall and plastid substructure are a physicochemical barrier for
bioaccessibility (Vishnevetsky et al., 1999; Palmero et al., 2013). In general, cooking
such as boiling improves the carotene bioaccessibility by changing cell morphology and
softness (De Belie et al., 2000; Miglio et al., 2008; Palmero et al., 2014). This was not
observed in our case maybe because drumstick leaves are tree leaves with a higher
mechanical resistance; their cell wall thickness is probably higher than other soft leafy
vegetables.
Cooking (boiling, steaming) with moist heat (with water or steam) involves gentle heat
transfer from a liquid or vapor to food; the temperatures used are rather moderate (<
110°C) and the vitamins are rather well retained by the leaves. On the contrary, during
frying, the heat transfer is more intense because the oil temperature was maintained at
4G
CT
4H
NCT
4J 4I
CT
94
180°C; in these conditions, the compounds are highly degraded by chemical reactions
(isomerisation and cleavage) and the food matrix is destructured. As a consequence, the
vitamin bioaccessibility in % is increased because some cells were opened by frying but
the overall content in bioaccessible vitamins is very low because most of them were
degraded by chemical reactions.
The methods of preservation tested are based on water activity decrease (drying,
lyophilization), microorganism destruction (sterilization) or conservation in negative
temperatures (freezing, lyophilization). Except for sterilization, the temperatures applied
during the operation units were moderate and the vitamins were well retained. The
combination of thermal and mechanical treatments by grinding is the best way to
increase bioaccessible carotenoid and tocopherol contents because it induces a cell
rupture. The sterilization at 121°C under pressure also favors the leaf destructuration;
they are easily dispersed in small pieces during the in vitro digestion (data not shown).
5.2.4 Conclusion
As other leafy vegetables, drumstick leaves contain a high level of carotenoids and
vitamin E (ɑ-tocopherol) but, the contents in bioaccessible micronutrients are very low in
the fresh product. The operation units which preserve the more the micronutrient and RE
contents were freezing, steaming and sterilization while frying and sun-drying cause
drastic loss. Drying leaves at moderate temperature (60°C) and grinding them was the
best way to increase the content in bioaccessible β-carotene, lutein and tocopherol.
Encapsulation of dried-powdered leaves was also an efficient way to deliver
bioaccessible compounds during in vitro digestion. Even with the best combination of
operation units (drying plus grinding), a great proportion of the bioactive compounds are
still not released from the moringa leaves; grinding in smaller particle sizes (< 200 µm)
would allow to better functionalize drumstick leaf powder.
95
Article 3 - Influence des
traitements culinaires et des
opérations unitaires sur la
bioaccessibilité des
caroténoïdes des brèdes
chouchou
96
55..33 CChhaappiittrree 22bb –– IInnfflluueennccee ddeess ttrraaiitteemmeennttss ccuulliinnaaiirreess eett ooppéérraattiioonnss uunniittaaiirreess ssuurr
llaa bbiiooaacccceessssiibbiilliittéé ddeess ccaarroottéénnooïïddeess ddeess bbrrèèddeess cchhoouucchhoouu ((aarrttiiccllee 33))
Effects of cooking and drying on the carotenoid
bioaccessibility of chayote leaves (Sechium edule)
Wichien Sriwichai1, Myriam Collin2, Timothy J. Tranbarger2, Jacques Berger1, Sylvie
Avallone3,*
1IRD; UMR 204, IRD/Université Montpellier/SupAgro (NUTRIPASS), 911 avenue
Agropolis, BP 64501, 34394 Montpellier, Cedex 5, France
2Institut de Recherche pour le Développement, UMR DIADE 2, IRD/CIRAD F2F-
Palmiers, IRD, 34394 Montpellier, France, 34394 Montpellier cedex 5, France
3Montpellier SupAgro; UMR 204, IRD/ Université Montpellier/SupAgro (NUTRIPASS),
911 avenue Agropolis, BP 64501, 34394 Montpellier, Cedex 5, France.
ABSTRACT
Promoting the consumption of plants rich in provitamin A is potentially a means of
combatting vitamin A deficiency. Leafy vegetables can be a good source of
micronutrients but their bioavailability in the gut is impaired by the food structure.
Stabilization techniques (sun-drying, oven-drying, freeze-drying & powdering) and
cooking (boiling, steaming, stir-frying) were applied in order to assess how carotenoid
(β-carotene and lutein) bioaccessibility in chayote leaves could be maximized.
Retention of β-carotene and lutein was highest after freezing, freeze-drying and
steaming with the lowest losses. The highest contents of bioaccessible β-carotene and
lutein were observed after steaming or freeze-drying followed by grinding (2.6 mg/100 g
DM and 8.6 mg/100 g DM respectively). Leaf grinding produces particle size ranging
from 1 mm to 200 µm with some opened cells; steaming did not induced deep structural
modification of the leaf tissue but change the textural properties of the later which
became softer. Structural changes were mostly observable after deep-frying.
97
Keywords: β-carotene, cell wall, dehydration, in vitro digestion, thermal treatment,
particle size
5.3.1 Introduction
Chayote (Sechium edule Jacq. Swartz) (also known as christophine, mirliton, choke,
chocho or vegetable pear) is a Cucurbitaceae from Mexico and Central America
(Harriman, 1998). This plant is widely cultivated for human consumption. In Latin
America, just as in other areas, almost all parts of this plant are consumed. Indeed,
fruits, roots and shoots are an important in the local diet. The leaves have anti-
inflammatory, antihypertensive, antioxidant and antimicrobial properties attributable to
their bioactive compounds (Ribeiro et al., 1988; Flores, 1989; Gordon et al., 2000;
Ordoñez et al., 2006; Ordoñez et al., 2009; Lombardo-Earl et al., 2014). In many
countries, the young leaves are boiled, steamed, stewed or stir-fried while dried leaves
are used to prepare an infusion. They are a good source of fatty acids, amino acids,
minerals, polyphenols and carotenoids (Ellong et al., 2015).
In the literature, most of the papers were focused on the nutritional profile of chayote
fruit which is low in calories and soluble sugars but rich in minerals. The shoots and
young leaves have been much less studied even if raw leaves have a noticeable amount
of β-carotene and lutein (Sriwichai et al., 2016). Over the last ten years, studies have
been carried out to assess the micronutrients and the phenolic compounds of chayote
roots, fruits and shoots for the human health benefit (Shiga et al., 2015; Yang et al.,
2015).
Carotenoids have several biological properties such as antioxidant, protection against
macular degeneration and modulator of the immune function (Bendich and Olson, 1989);
(Young and Lowe, 2001; Mozaffarieh et al., 2003). Improving the bioaccessibility of the
carotenoids offers the prospect of reducing vitamin A deficiency as well as preventing
many diseases. However, while processing chayote leaves might improve
bioaccessibility, it might also diminish the carotene and provitamin A content, possibly so
much as to impede achievement of the recommended level of vitamin A. The effects of
alternative methods of leaf preservation and cooking on carotenoid bioaccessibility were
awaiting evaluation.
Since chayote leaves can be stored dry, in a refrigerator or be frozen before being
consumed, the present work seeks to assess the influence of several operation units
(sun-drying, oven-drying, freeze-drying and powdering) or common cooking practices
98
(boiling, steaming, stir-frying) on the digestibility of chayote leaves and their capacity to
release carotenoids (β-carotene and lutein) through in vitro digestion. Microscopy
analysis was used to gain a greater understanding of the mechanism involved in
carotenoid release from the leaf matrix during digestion.
5.3.2 Material and methods
2.1 Materials and chemicals
Solvents, HPLC standards (β-carotene, α-carotene, lutein) and enzymes (pepsin 800-
2,500 U/mg, pancreatin B1750, bile extract porcin B8631) were obtained from Sigma-
Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). The polytetrafluoroethylene (PTFE)
membranes were obtained from Sartorius (Palaiseau, France).
Chayotes (Sechium edule Jacq. Swartz) were purchased from an Asian grocery in
France (ParisStore Montpellier). To limit experimental variation, only young leaves of the
same color and size were selected from the purchased batch; the final quantity of
homogeneous leaves weighed approximately 165 g in their fresh state. After the stems
had been removed, the young leaves were rinsed with distilled water. Some of these (5
× 1 g) were submitted to in vitro digestion (IVD) on the day of purchase. Another 10 g
was used for dry matter assessment.
The other part of the batch was used for the processing (11 × 2 g with 5 repetitions). The
total and bioaccessible carotenoids were then determined.
2.2 Dry matter assessment
The dry matter (DM) contents were determined on fresh and processed samples after
drying for 24 h at 105°C in an oven (Selecta, Barcelona, Spain). The residues were then
weighted precisely on a Mettler AE166 balance (Viroflay, France).
2.3 Processing and cooking methods
Eight treatments were applied to 2 g of young chayote leaves (Figure 30) with 5
repetitions for each treatment. Boiling and steaming were done with milli-Q water, the
stir-frying with colza oil. The equipment used for processing was as follows:
● freeze-dryer Alpha 1-2 LD plus 5, Christ (Osterode, Germany)
● oven dryer (Radnor, Pennsylvania, USA)
99
● grinder from IKA (Stufen, Germany). Grinding for 1 and 3 min produces particle
sizes of 1 mm and 200 µm respectively
After processing, the samples were weighed in order to determine the cooking yields.
Figure 30 : Treatments applied to chayote leaves before in vitro digestion
2.4 In vitro digestion protocol (IVD)
The IVD protocol was adapted from a published procedure (Reboul et al., 2006). Lipids
enhance carotenoid micellarization, hence 80 μL of colza oil (diluted in acetone 32 %)
was added at the start of digestion (Hedrén et al., 2002b; Mulokozi et al., 2004a).
Samples after processing were mixed in an amber screw-capped bottle, and then 15 mL
of the solution (oral phase) (pyrogallol 1.3 % in NaCl 0.9 %) was added. Samples were
incubated for 10 min at 37°C during which they were gently stirred (IKAMAG® RT 15
power, IKA, Staufen, Germany). The gastric phase was then started by adjusting the pH
to 4.0 ± 0.1 by adding 500 µL of 1 M HCl, and then 2 mL of porcine pepsin (4 % in 0.1 M
HCl). The mixture was incubated at 37°C for 30 min with the same gentle stirring. The
pH was then raised to 6.0 ± 0.1 by adding 800 µL of 0.9 M of sodium bicarbonate buffer,
and 9 mL of intestinal solution (porcine pancreatin 0.2 % and porcine bile extract 1.2 %
dissolved in 0.1 M trisodium citrate, pH 6). A further 4 mL of porcine bile extract (0.1
100
g/mL) was added. The samples were incubated for 30 min in a stirring water bath at
37°C. Digesta were centrifuged at 4000g for 1 h at 10°C (Heraeus Multifuge X1R,
Thermo Fisher Scientific, Villebon sur Yvette, France). A part of the supernatant (10 mL)
was collected with a needle fitted to a syringe and filtered through a 0.2 µm cellulose
acetate membrane to recover the micellar fraction. The carotenoids were then extracted.
2.5 Determination of total and bioaccessible carotenoids
Samples were ground (Turrax, Prolabo, Coueron, France) for 1 min with 15 mL of
ethanol/hexane (4:3, v/v) and then centrifuged for 30 min at 10°C and 4000g (Heraeus
Multifuge X1R, Thermo Fisher Scientific) (Taungbodhitham et al., 1998). The
supernatant was then transferred into a glass funnel into which 10 mL of NaCl 10 % was
added (p/v). The sample was gently homogenized and left decanted for 10 min. The
lower phase was discarded and the organic phase rinsed with 10 mL of distilled water.
After settling for 10 min, the organic extracts were dried under nitrogen and the residues
dissolved in 2 mL of acetone. Samples were filtered on a 0.2 µm PTFE minisart SRP4
membrane (Sartorius) and 20 µL was injected into the HPLC.
After in vitro digestion, the bioaccessible carotenoids were extracted from the micellar
fraction by adding 20 mL of ethanol/hexane (4:3, v/v). Samples were homogenized with
a Turrax (Prolabo, Coueron, France) and, then, 20 mL of NaCl 25 % were added (p/v).
After 10 min of settling in the dark, the organic phase was re-extracted with 20 mL of
ethanol/hexane (4:3, v/v) and washed with 15 mL of distilled water. The organic phase
was then dried under nitrogen and the residues were dissolved in 400 µL of acetone.
The extracts were immediately filtered through 0.2 µm PTFE membranes and analyzed.
Elution was performed with a Dionex P680 pump. The column was a polymeric C30 (4.6
mm i.d × 250 mm, 5 μm particle size, YMC Europe, Schermbeck, Germany). The mobile
phase comprised two mixes at a flow rate of 1 mL min-1. Mix A was constituted of
methanol and milli-Q water, 60:40 (v/v), and mix B constituted of methanol, methyl tert-
butyl-ether and milli-Q water, 28.5:67.5:4 (v/v/v). The gradient applied progressed from
100 to 0 (A/B) over a period of 31 min; the temperature was a constant 25°C. A UV-
visible photodiode array detector (Dionex UVD 340U) was used and chromatograms
were analyzed at the wavelength of maximum absorption of the carotenoids in the
mobile phase 450 nm. External calibration was used on the range of 0.5 to 25 mg/L.
Retinol equivalents (RE) were calculated using a conversion factor of 12 for β-carotene
and of 24 for the other provitamin A (α-carotene) for 1 retinol and expressed in mg
101
RE/100 g (Murphy, 2002). The content in bioaccessible β-carotene corresponds to the
amounts of compounds transferred to the micellar fraction at the end of IVD. The
bioaccessibility (in %) corresponds to the amount of compounds transferred to the
micellar phase compared to the initial contents in the fresh leaves.
2.6 Light microscopy
Samples (raw or processed leaves) were fixed for 2 weeks in 0.2 M phosphate buffer at
pH 7.2, supplemented with 2 % (v/v) paraformaldehyde, 1 % (w/v) caffeine, and 1.5 %
(v/v) glutaraldehyde at 4°C (Morel et al., 1992). Progressive dehydration of samples was
realized with ethanol from 30 to 100 %, transfer to butanol/ethanol 1:1 (v/v), and then
100% butanol. Thereafter, each sample was impregnated into Technovit 7100 resin
(Heraeus Kulzer GmbH, Wehrhrim/Ts, Germany). Semi-thin sections of 4 µm were cut
using a microtome (microm HM 355 S, Francheville, France). Sections were stained with
specific reagents as follows: i) periodic acid-Schiff’s reagent (Sigma–Aldrich, Lyon,
France) and with Naphthol Blue-Black (NBB) to specifically reveal polysaccharides (in
pink) and proteins (in dark blue) (Morel et al., 1992); ii) ruthenium red to stain pectins (in
pink) (Sterling, 1970). Observations and microphotographs were taken with a Leica
camera (Wetzlar, Germany) DMRB 301-370 light microscope (Evolution MP 5.0 color
media Cybernetics Cooled RTV 32-0040C-140).
2.7 Statistical analysis
All the experiments were undertaken with 5 repetitions for each processed sample. Data
were assessed by F-test in one way analysis of variance (one-way ANOVA) using
Statgraphics plus 5.1 (Virginia, USA). Significance was accepted at probability P < 0.05.
5.3.3 Results and discussion
3.1 Dry matter, carotenoid content and retinol equivalent of the fresh Chayote
leaves
The DM of the raw chayote leaves was 12 % and β-carotene and lutein were their main
carotenoids (36.7 and 61.6 mg respectively for 100g DM) (Table 10). The RE in fresh
chayote leaves was 0.3 mg/100 g corresponding to approximately 3.1 mg/100 g RE
when dried. In the literature, the nutritive values of the fruit and stem were reported but
the carotenoid contents of the leaves were still uncertain (Lim, 2012).
102
Tableau 10 : Micronutrient profile of raw and processed chayote leaves for 100 g DM
n: number of repetitions. DM: dry matter. RE: retinol equivalent. Data are presented as the mean ± standard deviation. Means with distinct lowercase superscript letters in the same column are significantly different (p≤ 0.05). FD-coarse grinding: freeze drying and coarse grinding. FD-fine grinding: freeze drying and fine grinding.
3.2 Influence of processing and cooking on the carotenoid contents
Once the leaves had been processed, the carotenoid content decreased further
depending on the type of cooking. Steam cooking reduced the carotenoids the least,
while the losses observed for other processing methods (< 20 %) were in good
agreement with previously published data (Mulokozi and Svanberg, 2014; Pugliese et
al., 2014; Bureau et al., 2015). The hot vapor and the long duration of steaming may
favor the release the protein-bound carotenoids, enabling them to be more readily
extracted (Grimme et al., 1984). The carotenoid retention and loss during chayote
leaves processes were calculated (the complete data are not shown here). The
modulate loss of compounds after freeze-drying and grinding (15-47 %) is probably due
to oxidation since the process increases substantially the surface area in contact with
light and the atmosphere. The unsaturated carotenoid carbon chain is susceptible to
isomerization or degradation under light exposure and during thermal processing,
especially in extreme conditions. The results are in good accord with those of (Saini et
al., 2014a), who found that for drumstick leaves the retention of total carotenoids, trans
β-carotene and lutein was highest in the case of cabinet tray drying and lyophilization.
Treatments n DM (mg/100g) β-carotene (mg/100g)
Lutein (mg/100g)
RE (mg/100g)
Raw 5 11.9 ± 0.6c 36.7 ± 2.5a 61.6 ± 5.4a 3.1 ± 0.2a
Freezing 5 13.8 ± 1.1c 23.2 ± 3.5e 32.1 ± 1.3d 1.9 ± 0.3e
Boiling 5 13.2 ± 2.2c 27.8 ± 4.1d 28.7 ± 4.9d 2.3 ± 0.3d
Steam cooking 5 13.8 ± 1.4c 34.8 ± 4.9a,b 49.7 ± 8.0b,c 2.9 ± 0.4a,b
Stir-frying 5 81.3 ± 13.6b 1.0 ± 0.3g 10.3 ± 3.7e 0.1 ± 0.03g
Sun-drying 5 92.3 ± 3.0a 16.2 ± 3.7f 34.1 ± 4.6d 1.4 ± 0.3f
Oven-drying 5 91.0 ± 1.1a 31.9 ± 1.6b,c 47.3 ± 4.3c 2.7 ± 0.1b,c
FD-coarse grinding 5 94.5 ± 0.9a 30.9 ± 1.0b,c,d 53.4 ± 4.3b 2.6 ± 0.1b,c,d
FD-fine grinding 5 94.5 ± 0.9a 29.7 ± 2.6c,d 51.6 ± 4.5b,c 2.5 ± 0.2c,d
103
However, freezing the leaves could damage the tissue and cell structure and favor the
oxidation of tissues impacted by the formation of water crystals.
Carotenoid loss was most pronounced in the case of drying under sunlight, which
probably causes isomerization, oxidation or enzymatic reaction (Aman et al., 2005;
Kidmose et al., 2006; Achir et al., 2010; Saini et al., 2014a). Stir-frying at 180°C
eliminates most of the water product and degrades deeply the carotenes. The
isomerization of trans-β-carotene into cis isomers induces a carotenoid loss, and as a
consequence, the content in bioaccessible carotenoids becomes lower (Deming and
Erdman, 2009).
3.3 Influence of cooking methods and drying processes on the content in
bioaccessible carotenoids
In raw leaves, the contents in bioaccessible β-carotene and lutein were low (< 1
mg/100g DM) and likewise their bioaccessibility (< 1 %) (Figures 31 and 32). The
content in bioaccessible lutein was 3 times higher than that β-carotene, ranging from 0.4
to 8.6 mg/100g DM and its bioaccessibility from 1.7 to 19.0 %.
104
Figure 31 : Bioaccessibility and the content in bioaccessible β-carotene in the fresh and processed chayote leaves (mg/100 g DM). Different letters above each bar indicate significant difference (p < 0.05). FD-coarse grinding: freeze drying and coarse grinding. FD-fine grinding: freeze drying and fine grinding
The type of carotenoid constitutes an important factor determining the effect of
transformation or thermal processing on their bioaccessibility (Palmero et al., 2014).
Xanthophyll carotenoids are more bioaccessible than carotenes as the polar carotenoids
are distributed at the surface of emulsions and can transfer directly from these
emulsions to the mixed micelles, (Ryan et al., 2008).
.
Except for stir-frying, all the treatment applied increase the contents in bioaccessible β-
carotene of the leaves on the range of 0.2 to 2.6 mg/100g DM. The bioaccessibility was
also improved from 3.8 to 8.8 %. The most efficient treatments were freeze-drying
followed by coarse or fine grinding, steam cooking. Stir-frying did not improve the
content in bioaccessible compounds in comparison to the fresh leaves because it
induces important losses through chemical reactions.
105
Figure 32 : Bioaccessibility and the content in bioaccessible lutein in the fresh and processed chayote leaves (mg/100 g DM). Different letters above each bar indicate significant difference (p < 0.05). FD-coarse grinding: freeze drying and coarse grinding. FD-fine grinding: freeze drying and fine grinding
The highest increases in the bioaccessibility reached 20-fold and 95-fold for β-carotene
and lutein respectively. The results could be explained by water crystals forming during
freezing which probably damages the cell integrity and favor the compound release.
Disruption of the wall or organelle membranes by mechanical treatment could break
down carotenoid-bound proteins since they are tightly bound to subcellular lipids; this
facilitates the release of carotenoids to digestive enzymes, thereby increasing their
incorporation into mixed micelles (Hedrén et al., 2002a; Palmero et al., 2014). The more
leaves were ground down, the more the carotenoids became bioaccessible; that
reducing particle size increases β-carotene bioaccessibility has been reported previously
(Tydeman et al., 2010b; Moelants et al., 2012). The size of the leaf cells ranged from 10
to 80 µm. Grinding for 1 and 3 min produces particle sizes of 1 mm or 200 µm and only
a part of the cells will be opened by the later treatment. However, it was already enough
to significantly enhance the carotene release throughout digestion.
106
3.4 Structural changes after processing or cooking methods
To gain an insight into the effects that the different processing treatments might have on
micronutrient bioaccessibility, cross sections of raw and processed leaves were fixed
and stained with specific colors (Figure 33, 34). The leaf is organized with an upper and
lower epidermis, and a mesophyll tissue organized with a layer of palisade and spongy
cells which size ranged from 10 to 80 µm (Figure 33A). Periodic acid-Schiff’s
reagent/NBB stains the organelles of the palisade cells in blue and pink, suggesting a
high amount of protein and polysaccharide (Figure 33A). The pectins of the cell walls
were stained in pink with ruthenium red (Figure 33B).
Figure 33 : Light micrographs of chayote leaves: (Cross section, x20): Raw leaves (A and B) and cooked leaves (C: boiled, D: steamed). Periodic acid-Schiff’s and naphtol blue black staining (A, C, D), ruthenium red staining (B). E: epidermis, PC: palisade cells, SC: spongy cells, T: trichome. Scale bars = 100 µm
4B
E
4A
PS
SC E T
4D 4C
107
Frying leads to a disintegration of both the epidermal and mesophyll layers, and
probably a loss of protein, polysaccharides and lipids. The upper and lower epidermal
layers cease to be discernable; the cells appear ruptured and disorganized (Figure 34E
and 34H). In boiled and steamed leaves, the epidermal and mesophyll appear intact and
the cells were not break down as observed in untreated leaves (Figure 33C, 33D, 34F
and 34G). The clear blue pattern of protein suggests that it is more diffuse in boiling than
steaming. By contrast, the pink staining pattern of the polysaccharides is more diffuse
after steaming than boiling (Figure 33C and 33D).
Figure 34 : Light micrographs of chayote leaves: (Cross section, x20): cooked leaves (F: boiled, G: steamed, E and H: fried). Ruthenium red staining (F, G and H). Scale bars = 100 µm
The cell-wall polysaccharide and chromoplast substructure constitute physical barriers to
micronutrient bioaccessibility (Vishnevetsky et al., 1999; Palmero et al., 2013). After
boiling and steaming the leaves become tender; the softness might change the leave’s
physical properties during in vitro digestion by favouring the cell break down and
4H
4F
4G
4E
108
increase the carotenoid micellarisation (Miglio et al., 2008; Bechoff et al., 2011). As
previously observed (Ali and Al-Hemaid, 2011), chayotes are a creeping plant; the cell
structure and composition of their leaves might be different from those of common
vegetables, most obviously because of the morphology of their trichome (epidermis
outgrowths on leave’s surface) (Figure 33A); these hydrophobic hairs avoid the leaf to
dissolve in the medium during in vitro digestion (data not shown) and, thus, hinder the
digestive enzymes to be in contact with the food.
5.3.4 Conclusion
Chayote leaves are rich in carotenoids but in raw leaves their bioaccessibility is very low.
Except for stir-frying, all the treatment applied increase the bioaccessibility of the
carotenes or xanthophylls with an increase ranging from 20 to 85-fold. Steaming was an
efficient way to improve the food digestibility without structural modification of the overall
tissue; however, textural changes were observed because the leaves become tender.
The combination of drying plus grinding was also efficient but the reduction of particle
size. In local communities, drying the chayote leaves under sunlight, grinding them in
small scale units and then boiling the powdered leaves would improve intestinal
absorption and help reduce micronutrient deficiency of local population.
109
Chapitre 3 - Mise au point d’une méthode d’isolement et de dosage des pectines et tanins présents dans le milieu de digestion in vitro de légumes feuilles (article 4)
110
55..44 CChhaappiittrree 33 –– MMiissee aauu ppooiinntt dd’’uunnee nnoouuvveellllee mméétthhooddee dd’’iissoolleemmeenntt eett ddee ddoossaaggee
ddeess ppeeccttiinneess eett ttaanniinnss pprréésseennttss ddaannss llee mmiilliieeuu ddee ddiiggeessttiioonn iinn vviittrroo ddee
lléégguummeess ffeeuuiilllleess ((aarrttiiccllee 44))
Dans la continuité des résultats obtenus au Chapitre 1, nous avons souhaité approfondir
la compréhension des mécanismes impliqués dans la faible micellisation des
caroténoïdes et tocophérols des légumes feuilles. Les teneurs en pectines des légumes
feuilles ont été le seul déterminant identifié qui empêchait la micellisation des
caroténoïdes. Les tanins condensés, quant à eux, avaient plutôt un effet protecteur
probablement liés à leurs propriétés antioxydantes.
La question à laquelle nous avons souhaité répondre dans cette partie était: « les
légumes feuilles pour lesquelles la bioaccessibilité des caroténoïdes et tocophérols est
faible sont-ils ceux pour lesquels le milieu digestif est le plus concentré en pectines et/ou
tanins ? ». En effet, les pectines sont très solubles dans l’eau et les acides, elles ont
pour propriétés de gonfler en s’hydratant et d’augmenter la viscosité des milieux dans
lesquelles elles sont présentes. Lors de leur solubilisation au cours de la digestion, la
formation des micelles mixtes des caroténoïdes dans le milieu digestif serait empêchée
par les pectines. Dans la mesure où une fraction du milieu digestif des 8 variétés de
légumes feuilles avait été conservée au congélateur après chaque digestion in vitro (soit
40 digestats au total), nous avons mis au point une méthode permettant de récupérer
les fibres et tanins à partir d’un milieu digestif témoin, puis les digestats ont été
analysés.
L’objectif était de voir si les différences de bioaccessibilité des caroténoïdes et
tocophérols pouvaient être expliquées par des différences de concentrations locales en
pectines, tanins, ou en matières insolubles dans l’alcool. Le chapitre 3 propose donc i)
une méthode simple pour quantifier les polysaccharides, pectines et tanins condensés
de milieux digestifs et ii) les résultats obtenus pour les légumes feuilles étudiés,
l’ensemble étant présenté sous forme d’un projet d’article.
111
New method to quantify pectins and condensed tannins in
the in vitro digestive medium of vegetables
Wichien Sriwichai1, Sotheary Sann1, Jacques Berger1, Sylvie Avallone2,*
1IRD; UMR 204, IRD/Université Montpellier/Montpellier SupAgro (NUTRIPASS), 911
avenue Agropolis, BP 64501, 34394 Montpellier, Cedex 5, France
2Montpellier SupAgro; UMR 204, IRD/ Université Montpellier/ Montpellier SupAgro
(NUTRIPASS), 911 avenue Agropolis, BP 64501, 34394 Montpellier, Cedex 5, France.
ABSTRACT
During human digestion, the structure of the fruits and vegetables impairs the
bioavailability of nutrients. The aim of the present work was to quantify the pectins and
tannin contents of 40 digestive mediums obtained after in vitro digestion of 8 leafy
vegetables in order to assess the influence of the latter components on the lipophilic
micronutrient micellisation. A new method was developed to precipitate and quantify
specifically the pectins and condensed tannins in digestive medium.
After in vitro digestion of 8 leafy vegetables, the digestive medium was collected, freeze-
dried and alcohol-insoluble-residues were prepared with boiling ethanol 80 %. The
residue was recovered and weighed and pectins and tannins were quantified after
hydrolysis. The dry matter contents of in vitro digestive medium ranged from 21.2 to 25.8
g/L. The dry matter of digestive medium contained pectins (~0.2 g) and tannins (23
mg/L) when proanthocyanidols were indeed present in the raw material. The digestive
mediums were 10 fold more concentrated in pectins than tannins. According to the
leaves, 9 % to 68 % of the initial pectins have diffused from the leaves to the digestive
medium. No correlation was identified between the pectin and tannin contents of the
digestive medium and the contents in bioaccessible lipophilic micronutrients after in vitro
digestion.
Keywords: micelle; diffusion; alcohol-insoluble residues; proanthocyanidins.
112
5.4.1 Introduction
Green leafy vegetables are a source of various micronutrients. In plants, cells are
surrounded by walls which confer the mechanical protection and the structural
characteristics of vegetables and fruits. The plant walls are a network of
polysaccharides, pectins, glycoproteins, and phenolic compounds and constitute a
physicochemical barrier for compound release from the plant matrix during digestion and
partially determine the bioaccessibility of micronutrients (Lemmens et al., 2010b;
Palmero et al., 2013). Among the cell wall components, pectins are one of the major
components. They are located in the middle lamella, primary cell and secondary walls
are rather soluble in water and aqeous medium (Sandhu et al., 2009). Their
physicochemical properties can change once in contact to liquid (i.e. high solubility in
water) as they can swell and form a gel.
Regular dietary intake of plant foods rich in fiber and polyphenolic compounds lowers
the risk of coronary heart disease (Fava et al., 2006). Dietary fibers considerably impact
exocrine secretions of the pancreas and liver throughout digestion process (Chater et
al., 2015). In human clinical study and in vitro assays, pectins have a negative effect on
the absorption of lipids and carotenoids (Rock and Swendseid, 1992; Riedl et al., 1999;
Deming et al., 2000; Espinal-Ruiz et al., 2014).
These polysaccharides increase the viscosity of the duodenal medium and impair the
activities of lipase and bile acids (Koseki et al., 1989; Pasquier et al., 1996; Wang et al.,
2001). Pectins should avoid incorporation of lipophilic compounds (fatty acids, vitamin E,
carotenoids) in micelle by partitioning bile salts and lipids in the gel phase (Borel et al.,
1996). This mechanism partially impairs the absorption of micelles by the small intestine.
Since decades, the antioxidant and lipid-lowering effects of tea beverage was also
demonstrated (Crespy and Williamson, 2004). The regular consumption of plants or
beverages rich in phenolic compounds has been shown in in vitro (Fava et al., 2006;
Koo and Noh, 2007). An epidemiological study in Japan highlighted that serum
cholesterol levels were inversely related to the consumption of green tea while no
association was observed with serum triglycerides and high-density lipoprotein
cholesterol (Kono et al., 1992). In clinical study, consumption of green tea in a period of
42 days also induces a moderate but significant decrease in LDL cholesterol (Erba et al.,
2005). The inclusion of black tea in a diet also reduces total and LDL cholesterol by
113
significant amounts and, therefore, may reduce the risk of coronary heart disease
(Davies et al., 2003).
However, the efficacy of the foods rich in pectins or tannins often appears to be greater
than the sum of their biologically active parts. The beneficial effect could be attributed to
up regulation of the colon-systemic metabolic axis and fibers and many polyphenols
could be converted into biologically active compounds by the colonic microbiota.
In recent years, the influence of some phenolic compound on the carotenoids
bioaccessibility has been demonstrated (Reboul et al., 2007) as well as the effect of
concentration and degree of methyl-esterification of pectins (Yonekura and Nagao,
2009; Verrijssen et al., 2014). However, the detailed mechanism involved in the
modulation of carotenoid bioaccessibility is still uncertain. The latter polymers have a
complexe structure and a specific behavior of the human gut conditions.
Numerous methods allow quantifying the pectins and tannins in foods, but, up to now,
these methods were not used to isolate and quantify them in a complex medium like
digestive medium (Satoshi, 1956; Blumenkrantz and Asboe-Hansen, 1973; Ahmed and
Labavitch, 1978; Carré and Haynes, 1922; Ibarz et al., 2006; Łękawska-Andrinopoulou
et al., 2013). These biological fluids contain high amount of water, bile salts, chlorhydric
acid and electrolytes. Therefore, the present work proposes a simple and efficient
method to i) recover pectins and tannins among digestive medium and ii) quantify them
specifically after an hydrolysis step coupled with colorimetric assay high performance
liquid chromatography (HPLC).
5.4.2 Materials and methods
Materials and chemicals
Solvents, HPLC standards (cyanidin chloride, delphinidin chloride) and enzymes (pepsin
800-2,500 U/mg, pancreatin B1750, bile extract porcin B8631) were obtained from
Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). Grapes seed condensed tannins
powder (degree of polymerization 40) was obtained from Science for Oenology research
unit, France. The polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes were obtained from
Sartorius (Palaiseau, France).
Eight leafy vegetables frequently consumed in South-East Asia were identified among
the literature and used for the study: Coriander (Coriandrum sativum L.), Mint (Mentha
spicata L.), Thai basil (Ocimum basilicum L.), Water spinach (Ipomoea aquatic Forssk.),
114
Chaphlu (Piper sarmentosum Roxb.), Chayote (Sechium edule Jacq.), Drumstick
(Moringa oleifera Lam.), Perilla (Perilla frustescens L.). Around 5 batches of each leafy
vegetable were purchased in an Asian market (ParisStore Montpellier). In order to limit
experimental variations, leaves with same colour, size and aspect were chosen. The
final quantity of homogeneous leaves was approximately 60 g in fresh state. Then, the
steams were removed and the vegetables were washed with distilled water. The day of
purchase, the leaves (5 × 1 g) were submitted to in vitro digestion (IVD). Another 10 g
was used for the dry matter assessment and 30 g was lyophilized for 24 hours and
pulverized for tannin determination. The rest of the samples were frozen for cell wall,
pectins and micronutrient determinations.
Dry matter determination
The dry matter (DM) contents were determined by drying the samples 24 h at 105°C.
Samples were then weighed precisely on a Mettler AE166 balance (Viroflay, France).
In vitro digestion (IVD) protocol
The IVD protocol was adapted from a published procedure (Reboul et al., 2006). As
previous researches have shown that lipids enhance carotenoids micellarisation (Hedrén
et al., 2002a; Mulokozi et al., 2004a), 80 µL of colza oil (diluted in acetone 32 %) was
added since the beginning of digestion. Samples (~1 g) were manually cut in 1.5 cm²
pieces, weighed precisely in an amber screw capped bottle and 15 mL of oral solution
(pyrogallol 1.3 % in NaCl 0.9 %) were added. Samples were incubated for 10 min at
37°C with gentle stirring (IKAMAG® RT 15 power). The gastric phase started then with
adjusting the pH to 4.0 ± 0.1 by adding 500 µL of 1 M HCl, and then 2 mL of porcine
pepsin (4 % in 0.1 M HCl). The mixture was incubated at 37°C for 30 min with gentle
stirring again. Thereafter, the pH was raised to 6.0 ± 0.1 by adding 800 µL of 0.9 M of
sodium bicarbonate buffer and, 9 mL of the intestinal solution (porcine pancreatin 0.2 %,
and porcine bile extract 1.2 % dissolved in 0.1 M of trisodium citrate, pH 6) was added.
Then, 4 mL of porcine bile extract at 0.1 g/mL were added. The samples were incubated
for 30 min in a stirring water bath at 37°C. Digesta were centrifuged at 4000 g for 1 h at
10°C (Heraeus Multifuge X1R, Thermo Fisher Scientific, Villebon sur Yvette, France).
Recovery of the polysaccharides and tannins in the digestive medium
After the IVD, approximately 31 mL of the digestive medium was recovered and freeze-
115
dried during 24 hours at - 51°C (Alpha 1-2 LD plus Christ, Germany). The residue was
used directly to precipitate the alcohol insoluble residues (AIRs) which correspond to the
polysaccharides and to determine the tannins which have diffused to the digestive
medium. The insoluble material was isolated by precipitation with boiling ethanol 80 % to
remove low-molecular-weight components (Selvendran, 1975). The mixture was boiled
for 4 min and filtered on a funnel of porosity 3 μm (DURAN®, Wertheim, Germany). The
residue was washed with pure ethanol, acetone, and ether, one after the others, and
finally dehydrated in a vacuum oven (55°C, 24 h) and weighed.
A validation of the procedure to recover the polysaccharide, pectins and condensed
tannins from digestive medium was realized with 10 repetitions. A mixture of cellulose,
hemicellulose, glucose, citrus pectins and grape seed tannins was subjected to IVD.
Afterward, the digestive medium was freeze-dried and alcohol-insoluble residues were
prepared by boiling the sample in ethanol (80 %) for during 15 min. After filtration on a
funnel of porosity 3 μm (DURAN®, Wertheim, Germany), the residue was used for
pectin and tannin quantifications.
Determination of alcohol-insoluble residues (AIRs) and pectins contents
The residues form freeze-dried digestive mediums were mixed with 30 mL boiling
ethanol 80 % for 4 min. They were then filtered through a crucible (sintered glass, pore
diameter 3 μm). The residues were afterward extensively washed with pure ethanol,
acetone, and ether, successively, and finally dehydrated in a vacuum oven (55°C, 24 h)
and weighed.
The pectins contents were determined from the AIRs expressed as galacturonic acid
content without preliminary deesterification by the m-phenylphenol procedure
(Blumenkrantz and Asboe-Hansen, 1973; Ahmed and Labavitch, 1978). Approximately
100 mg of AIRs residues were hydrolyzed in 2 mL H2SO4 and then dissolved in 8 mL
milli-Q water. 400 µL of solution were added in 2.4 mL sodium tetraborate solution in
H2SO4 and heated at 100°C for 10 min then cooled. Finally, 40 µL meta-hydroxydiphenyl
(MHDP) 0.15 % dissolved in NaOH 125 mM was added to each sample and NaOH 125
mM was used in the blank. The optical density of samples was measured at 520 nm with
a spectrometer (Shimadzu UV spectrophotometer Kyoto, Japan) exactly after 10 min of
MHDP or NaOH addition. A calibration curve was realized with pure galacturonic acid on
the range of 0 to100 mg/L.
116
Determination of proanthocyanidins
Proanthocyanidins (also called condensed tannins) were measured using the butanol-
HCl assay (Porter et al., 1985). Condensed tannins were determined after acid-
catalysed depolymerisation in the presence of a nucleophile. The cyanidin and
delphinidin were quantified by liquid chromatography. The hydrolysis was conducted on
0.2 g of freeze-dried digestive medium without preliminary extraction (Tarascou et al.,
2010). Samples were solubilised in 6 mL of butanol-HCl (95:5, v/v) and 0.2 mL of ferric
reagent (NH4Fe (So4)2 2 % in 2M HCl, w/v). After vortexing, samples were heated at
95°C for 1 hour. The solutions were cooled, filtered through 0.45 µm PTFE membranes
and then analyzed with liquid chromatography. External calibration was realized by the
use of stock solution of the pure chemicals (cyanidin or delphinidin) diluted in butanol-
HCl and ferric reagent 2 % on the range of 0.5 to 25 mg/L. Results were expressed in
percentage of cyanidin or delphinidin equivalent for 1 L of digestive solution.
The HPLC elution was performed with a Dionex P680 pump. The column was
LiChroCART® 250-2 Purospher® STAR (4.6 mm i.d. × 250 mm, RP-18e 5 μm, Merck
KGaA, Germany). The mobile phase was two mixes at a flow rate of 0.5 mL/min. The
mix A was formic acid and milli-Q water (2:98, v/v), and the mix B was obtained with
methanol, milli-Q water and formic acid (69:29:2, v/v/v). The gradient applied progressed
from 0 to 100 % of solvents over a period of 38 min. A UV-visible photodiode array
detector (Dionex UVD 340U) was used and chromatograms were analyzed at the
wavelength of maximum absorption of cyanidin in the mobile phase (i.e. 550 nm).
Statistical analysis
All the experiments (in vitro digestion and polysaccharide, tannin and pectins
determination) were realized with 5 repetitions. Data were assessed by analysis of
variance (one-way ANOVA) using Statgraphics plus 5.1 (Virginia, USA) and SPSS.
Significance was accepted at probability p < 0.05.
5.4.3 Results and discussion
Validation of the pectins and tannins recovery of the digestive medium
The precision of the method was assessed by a repeatability study with 10 repetitions
within one day and the coefficient variations were calculated (Table 11). The coefficients
117
of variations were always lower than 6.4 %. Furthermore, the AIR, pectins and tannin
recovery was high and reached 97.0, 91.0 and 99.7 % respectively.
Tableau 11 : Validation of polymers from digestive medium
Biochemical components n Recovery (%) CV
AIRs 10 97.0 ± 6.2 6.4
Pectins 10 91.0 ± 5.2 5.8
Tannins 10 99.7 ± 1.2 1.2 n: number of repetitions. CV: coefficient of variation. AIR: alcohol-insoluble residue of the digestive medium. Pectins were determined by multiply the uronic acids with a factor of correction 0.907. Data are presented as the mean ± standard deviation.
The dry matter, alcohol-insoluble-residues, pectins and tannin contents of the
digestive medium
The dry matter contents of the eight digestive medium ranged from 21.2 g/L to 25.8 g/L
(Table 12). These dry matters are composed of 8 % of bile salts and the digestive
enzymes approximately. While preparing the alcohol insoluble residues (AIRs), 73 % of
the residue is lost with filtration because it corresponds to alcohol soluble components.
The AIRs represent approximately 18 % the dry matter of the digestive medium and are
composed of proteins (digestive enzymes, cell walls), cell wall polysaccharides and
tannins. The diffusion of the latter component was calculated according to their initial
contents of the leaves.
Among the 40 digestive medium of the leafy vegetables, the AIRs concentrations ranged
from 4.6 to 21.6 g/100 g while pectin concentrations ranged from 0.1 to 0.4 g/100 g.
Tannins were detected only in drumstick and perilla variety in accordance with their
respective biochemical profile (Sriwichai et al., 2016). Only a part of the tannins is
extractable from plant tissue and only a small part seem to diffuse progressively into the
digestive liquid. The concentrations of condensed tannins were 21.3 mg and 24.9 mg
/100 g in drumstick and perilla leaves. Finally, pectins were much more concentrated
(10-fold higher) than tannins in the liquid medium. The contents in pectins and
condensed tannins in digestive medium (g/L and mg/L) are shown in figure 35.
118
Tableau 12 : Polymer contents of 40 digestive medium and percentage of diffusion
Vegetables n DM (g/L)
AIRs (g/100 g)
Pectins (g/100 g)
% pectin diffusion
Tannins (mg/100
g)
% tannin diffusion
Coriander 5 25.3 ± 0.7 4.6 ± 2.9a 0.11 ± 0.03a 31.5 ± 8.3a - -
Mint 5 21.2 ± 3.8 9.2 ± 2.5a 0.39 ± 0.14b 32.2 ± 12.2a - -
Thai basil 5 24.9 ± 3.7 15.9 ± 4.0b 0.21 ± 0.08a 29.5 ± 14.7a - -
Water spinach
5 24.4 ± 2.0 17.9 ± 2.2b 0.14 ± 0.02a 32.7 ± 7.4a - -
Chaphlu 5 24.5 ± 2.5 21.6 ± 2.7b 0.11 ± 0.03a 8.7 ± 1.8a - -
Chayote 5 23.6 ± 2.3 20.2 ± 3.3b 0.09 ± 0.04a 19.2 ± 6.a - -
Perilla 5 25.8 ± 2.8 18.1 ± 3.1b 0.19 ± 0.04a 64.7 ± 18.1b 24.9 ± 1.6 4.5 ± 0.6a
Drumstick 5 24.8 ± 2.2 17.8 ± 1.9b 0.14 ± 0.06a 67.5 ± 11.1b 21.3 ± 6.5 27.1 ± 5.8b
n: number of repetitions. DM: dry matter of the digestive medium. AIR: alcohol-insoluble residue of the digestive medium. Pectins were determined by multiply the uronic acids with a factor of correction 0.907. - : not detected. Data are presented as the mean ± standard deviation. Values with distinct lowercase superscript letters in the same column are significantly different (p≤ 0.05).
In green tea infusion, pectins was shown to diffuse 0.065 % (Ele-Ekouna et al., 2011).
Thus, these polysaccharides can diffuse to the digestive medium during the incubation
at 37°C in acidic condition (data not shown). As a consequence, the micelle formation is
avoided because gel-like pectins appears (Borel et al., 1996; Verrijssen et al., 2014).
The increase in duodenal medium viscosity could impair the lipase activity and bile salt
effect (Vahouny and Cassidy, 1985; Koseki et al., 1989; Pasquier et al., 1996; Wang et
al., 2001).
Pectins can be extracted by hydrochloric acid from solid matrix and then, precipitated by
alcohol (Kalapathy and Proctor, 2001). In the same way, the physicochemical conditions
of the human gut allow the diffusion into the digestive medium. While solubilized, they
can form a gel-link and have a lipid lowering effect. This metabolic property was
identified in epidemiological study but their cholesterol lowering effect was only
assessed as small (Brown et al., 1999).
119
Figure 35 : Contents in pectins and condensed tannins (g/L and mg/L digestive medium). Different letters above each bars indicate significant difference (p < 0.05)
The depolymerization of condensed tannins is favored by a high temperature in acidic
medium. The acidic pH and temperature of IVD might be insufficient for the hydrolysis
and release them from the leaves to impair the micellization.
As shown in the table 12, pectin diffusion percentages in digestive medium ranged from
8.7 % to 67.5 %. The diffusion of tannis in Drumstick and Perilla was 27 % and 5 %
respectively.
Correlation between the contents in polysaccharide and tannins of the digestive
medium and the carotenoids and α-tocopherol bioaccessibility
The relationships between the variables (AIRs, pectins and tannins contents of the
digestive medium and the contents in bioaccessible micronutrients) were explored by
linear regression to assess which chemical compounds has a positive or negative
effects. No positive or negative association between the variable was significant.
120
5.4.4 Conclusion
A method was successfully developed to quantify alcohol-insoluble-residues, pectins
and tannins in the digestive medium obtained in vitro experiments. After digestion of 8
leafy vegetables, the pectins contents were much higher (10-fold) than tannins
components whatever the leafy vegetable. Our work did not show any correlation
between the polysaccharide and tannins diffusion and the micellisation of the lipophilic
micronutrients.
A freeze drying (-52°C) and a long storage (12 months) of digestive medium in negative
temperature (-40°C) before analysis might impact the physico-chemical properties of
pectins and condensed tannins and cause the loss of their content. The pH change
during in vitro giestion may probably modify physically the structure of pectins. Pectins
and tannins loss in various products provoked by chemical oxidation or enzymatical
degradation during freezing and storage have been reported (Roe and Bruemmer, 1981;
Hoo and Mclellan, 1987; Fuchigami et al., 1995; Lisiewska and Kmiecik, 2000; Roe et
al., 2009; Oszmiański et al., 2009; Einhorn-Stoll et al., 2015; Zhang et al., 2015a).
Therefore, no correlation between the pectins or tannins contents of the digestive
medium and the carotenoids and α-tocopherol bioaccessibility in this study might be
explained by the loss of compounds during samples storage in negative temperature
and during freeze drying process.
The compounds (pectins and tannins) diffused from raw products into digestive medium
are sensitive to the environmental storage conditions that have a negative effect on the
result of investigation. The addition of powdered compounds into liquid food rich in
micronutrient is another choice to avoid the compounds degradation and to confirm the
hypothesis of micronutrient micellisation impaired by pectins or tannins.
121
Discussion
122
6 Discussion générale
Cette thèse avait pour premier objectif d’étudier les déterminants de la bioaccessibilité
des caroténoïdes et tocophérols dans les légumes feuilles consommés en Asie du Sud-
Est. L’influence des opérations unitaires et des traitements culinaires courants sur la
bioaccessibilité des composés d’intérêts a été évaluée. Les huit variétés des légumes
feuilles thaïlandais ont été choisies en fonction de leur disponibilité au cours de l’année
sur les marchés et également en fonction de l’acceptabilité de ces variétés au sein de la
population.
Les légumes feuilles intéressants
Le brède chouchou et le moringa sont consommés de manière endémique dans de
nombreux pays. Pourtant, leurs valeurs nutritionnelles sont peu documentées. Les
informations sur les compositions nutritionnelles des fruits et racines de brède chouchou
ont été communiquées mais rien sur les feuilles (Shinga et al., 2015; Yang et al., 2015).
Les 8 légumes feuilles étudiés (coriandre, menthe, basilic Thaï, liseron d’eau, lalot,
brède chouchou, moringa et perilla) sont riches en protéines, lutéine et β-carotène. Des
tanins condensés (tanins catéchiques) ont été identifiés dans les feuilles de moringa et
perilla mais aucune d’entre elles ne contenait de tanins galliques. Les feuilles de
moringa se distinguent par leur richesse en protéines, β-carotène, α-tocophérol et
tanins.
Dans les régions du Nord et du Nord-Est de la Thaïlande ainsi que dans les pays voisins
(Cambodge, Laos), les légumes feuilles étudiés sont utilisés pour préparer des soupes
et intégrés avec d’autres ingrédients dans des plats sautés ou cuits dans l’huile. Compte
tenu de leur profil nutritionnel, ils sont une bonne source de caroténoïdes
provitaminiques (0,3-1,3 mg ER/100g MF) qui pourrait contribuer à la couverture des
besoins en vitamine A17. Le coriandre, la menthe, le basilic Thaï sont également
intéressants au niveau de leur qualité nutritionnelle, mais ces feuilles sont utilisées
comme condiments, c’est à dire en petite quantité. Certaines feuilles (menthe, moringa
17 L’apport en ER recommandé est de 0,6 mg ER/ 100g MF chez l’homme adulte. Requirements of
vitamin A, iron, folate and vitamin B12. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation. Rome, Food and
Agriculture Organization of the United Nations, 2004 (FAO Food and Nutrition Series, No. 23).
123
et perilla) ont des teneurs élevées en parois cellulaires (fibres, pectines) et tanins qui
pourraient freiner l’absorption des micronutriments.
Les déterminants de la bioaccessibilité des micronutriments lipophiles
Comme évoqué précédemment, certains légumes feuilles sont consommés à la fois
cuits et crus. La bioaccessibilité des vitamines lipophiles dans les légumes feuilles crus
est faible. Certains composés contenus dans la matrice alimentaire freinent la
bioaccessibilité. Par conséquent, des corrélations statistiques (analyse en composantes
principales) ont été recherchées entre les teneurs en protéines, tanins, parois
cellulaires, pectines et la bioaccessibilité des micronutriments.
Les teneurs en β-carotène, lutéine bioaccessibles et les teneurs en tanins condensés
sont corrélées positivement. Les tanins pourraient protéger les vitamines liposolubles
des réactions d’oxydation pendant la digestion. En revanche, les teneurs en β-carotène
et lutéine bioaccessibles sont anticorrélées avec le pourcentage de pectines des parois
cellulaires. Les fibres sont difficiles à digérer à cause de leurs compositions globales
(celluloses, hémicelluloses, pectines) et leurs organisations dans l’espace. Les pectines
semblent avoir un effet négatif sur la bioacessibilité des caroténoïdes. Partiellement
solubles dans l’eau et les acides, elles diminueraint la micellisation des caroténoïdes.
Une consommation des légumes feuilles riches en fibres et composés phénoliques
pourrait diminuer les maladies cardiovasculaires (Fava et al., 2006). Les études in vitro
montrent que les composés phénoliques diminuent l’absorption des lipides au niveau
intestinal (Fava et al., 2006; Koo et Noh, 2007). Les études épidémiologies et cliniques
montrent qu’une consommation de thé vert diminue la concentration sérique en
cholestérol (Kono et al., 1992; Erba et al., 2005). Pendant la digestion humaine, les
fibres diminuent les sécrétions du pancréas, les pectines augmentent la viscosité du
milieu digestif et diminuent l’activité des lipases et acides biliaires (Koseki et al., 1989;
Pasquier et al., 1996; Wang et al., 2001; Chater et al., 2015).
Depuis longtemps, les études chez l’homme ont prouvé que la biodisponibilité des
caroténoïdes diminue lorsque ces composés sont coingérés avec des fibres et pectines.
La biodisponibilité du β-carotène des épinards sous forme liquide ne contenant pas de
fibres est plus élevée que celle des feuilles entières ou broyées (Castenmiller et al.,
1999). La concentration en caroténoïdes plasmatiques, mais pas celle de l’α-tocophérol,
diminue de 33–43 % lors une consommation de repas contenant plusieurs catégories de
124
fibres, particulièrement les pectines et les alginates (Riedl et al., 1999). Par ailleurs,
l’addition de 12 g de pectines de citrus dans le repas diminue significativement la
concentration du β-carotène plasmatique (Rock et Swendseid, 1992).
In vitro, les pectines diminuent l’absorption de lipides et caroténoïdes (Rock et
Swendseid, 1992; Riedl et al., 1999; Deming et al., 2000; Espinal-Ruiz et al., 2014). Ces
polymères d’acide galacturonique peuvent diffuser dans le milieu digestif pendant la
digestion et former des gels qui ralentiraient la formation des micelles (Borel et al., 1996;
Verrijssen et al., 2014). Les pectines augmentent la viscosité du milieu liquide et
diminuent la diffusion des lipases ou sels biliaires (Vahouny et Cassidy, 1985; Koseki et
al., 1989; Pasquier et al., 1996; Wang et al., 2001). Une schématisation de l’influence de
la présence des pectines sur la formation des micelles est proposée ci-dessous (Figure
36).
Figure 36 : Schéma de micellisation des caroténoïdes impactée par la présence de pectines
Les mécanismes impliqués seraient les suivants :
Les pectines augmentent la viscosité et ralentissent le transport des enzymes
vers leurs substrats.
125
Les pectines interagissent avec les sels biliaires et les lipases, impliqués dans la
formation de micelles.
Les pectines empêchent le contact entre les micelles et l'intestin grêle.
La micellisation du β-carotène et de la lutéine est empêchée en présence d’alginates de
sodium de viscosité moyenne ou élevée (300 et 500 mP/s) (Yonekura et Nagao, 2009).
Les mêmes auteurs ont démontré que l’absorption des caroténoïdes par les cellules
caco-2 diminuait en présence d’alginates de sodium de viscosité croissante et des
pectines (pomme, citrus) de pourcentage de degrés d’estérification variables (34,9-75,2
%).
De même, la concentration en pectines et leur degré d’estérification modulent la
bioaccessibilité des caroténoïdes et les tailles des micelles d’une émulsion huile dans
eau (Verrijssen et al., 2014). Des émulsions enrichies en β-carotène ont été préparées à
partir de purées des carottes mixées dans l’eau et émulsifiées dans un mélange d’huile
d’olive et pectines de citrus avec des degrés d’estérification de 99 %, 66 % et 14 %. Une
diminution de la taille des gouttelettes d’huile est observée lorsque l’on augmente la
concentration en pectines du milieu. Après la phase gastrique, la taille des émulsions
est quasiment identique. Les pectines de degré d’estérification faible (14 %) créent des
gels pectiques dans lesquels les gouttelettes sont emprisonnées. Des liaisons Ca2+
pourraient être établies. Après la phase intestinale, seules les pectines de degré
d’estérification moyen forment des gels pectiques et piègent encore les gouttelettes
d’huile. La viscosité des émulsions de différents degrés d’estérification chute après les
phases gastrique et intestinale.
Dans notre étude, nous avons observé une coloration marron voire noire du milieu
digestif des feuilles de moringa et perilla; cette coloration est différente de celle des
autres légumes feuilles (Figure 37). La coloration pourrait être due à la présence de
tanins ayant diffusés à l’état plus ou moins oxydés. Pour valider cette hypothèse, les
pectines et tanins condensés des milieux digestifs des légumes feuilles ont été
quantifiés.
126
Figure 37 : Milieu digestif des légumes feuilles crus. Milieu DIV : témoin négatif, COR : coriandre, MEN : menthe, BAS : basilic Thaï, LIS : liseron d’eau, BRE : brède chouchou, MOR : moringa, PER : perilla
Teneurs en polysaccharides, pectines et tanins dans le milieu digestif des
légumes feuilles
La viscosité des milieux digestifs a, tout d’abord, été évaluée par mesure du temps
d’écoulement dans un viscosimètre capillaire. Aucune différence significative n’a été
observée. Nous avons donc i) adapté la méthode de précipitation à l’alcool des parois
cellulaires de végétaux aux milieux digestifs, ii) quantifié les pectines et tanins dans ces
derniers avec des techniques d’hydrolyses couplées à la CLHP ou à la
spectrophotométrie. La méthode de purification a été validée en utilisant des mélanges
de pectines, tanins et celluloses. Selon les légumes feuilles, la concentration en
pectines des milieux digestifs varient entre 0,03 et 0,1 g/L. La diffusion de tanins n’est
observée qu’après digestion de feuilles de moringa et perilla et les concentrations
atteintes sont faibles (de l’ordre de 3 à 4 mg/L). Les concentrations des pectines
diffusées sont 10 à 25 fois plus élevées que celles des tanins condensés.
Les pectines sont des polymères très solubles dans l’eau et les solutions acides. Le
milieu digestif à 37°C se compose essentiellement d’eau, d’enzymes de digestion, sels
biliaires, HCl et soude qui permettent aux pectines des légumes feuilles de se
solubiliser. Une étude de régression linéaire entre la concentration en pectines diffusées
dans le milieu digestif et la bioaccessibilité des vitamines liposolubles des huit variétés
des légumes feuilles n’a pas permis de confirmer que ces polymères ont un effet négatif
sur la micellisation des caroténoïdes et tocophérols. Les 40 milieux digestifs ont été
stockés pendant plusieurs mois avant d’être analysés ; ils ont également subi des
127
étapes successives pouvant induire une dégradation des pectines (digestion in vitro
avec des phases acides et alcalins, congélation plusieurs mois, lyophilisation,
précipitation à l’alcool bouillant). Les pectines sont peut être présentes mais sous des
formes évoluées non accessibles au dosage biochimique. Les pertes de pectines et
tanins sont possible oxydation chimique ou dégradation enzymatique pendant la
congélation ou le stockage des produits (Roe et Bruemmer, 1981; Hoo et Mc Lellan,
1987; Fuchigami et al., 1995; Lisiewska et Kmiecik, 2000; Roe et al., 2009; Oszmiański
et al., 2009; Einhorn-Stoll et al., 2015; Zhang et al., 2015a). Les pectines subissent
notamment des réactions de β-élimination pendant les traitements thermiques de
légumes (Lemmens et al., 2009; Ribas-Agustí et al., 2014).
Pour donner quelques éléments de comparaison, une infusion de thé vert contient
environ 0,065 % des pectines des feuilles initiales (Ele-Ekouna et al., 2011). Dans notre
étude, les pectines des légumes feuilles crus diffusent de 8 % à 59 % ; ces
pourcentages de diffusions sont 10 fois plus élevés que ceux obtenus pour le thé vert.
La matrice des feuilles (i.e. épaisseurs, propriétés mécaniques) et les caractéristiques
physico-chimiques du milieu environnant (infusion versus milieu digestif) semblent avoir
un impact sur la solubilisation des pectines. Au cours de la digestion, le milieu acide puis
basique doit offrir des conditions favorables à la solubilisation de la lamelle moyenne
des cellules végétales.
Influence de traitements culinaires et opérations unitaires sur la bioaccessibilité
des vitamines liposolubles de légumes feuilles
Deux études approfondies ont été menées sur le moringa et les brèdes chouchou. Le
moringa est une variété intéressante car il est consommé de manière endémique par les
populations asiatiques. Par ailleurs, il est promu dans le cadre de projet de reboisement
pour lutter contre la désertification. De par la composition de ses feuilles, il pourrait
contribuer à la sécurité alimentaire des populations locales qui utilisent également
d’autres parties de la plante à des fins médicinales (Nesbitt et al., 2010). Son intégration
dans les fermes et systèmes pastoraux améliorerait la durabilité des systèmes
alimentaires locaux (Morton, 1991).
D’un point de vue histologique, les deux feuilles sont organisées de la même manière.
En revanche, les feuilles de moringa ont des cellules à tanins alors que les brèdes
chouchou ont des trichomes. Nous suggérons, comme hypothèse, que les tanins ont un
128
effet protecteur sur les micronutriments contre l’oxydation, et que les trichomes
pourraient impacter défavorablement le comportement de brède chouchou pendant la
digestion in vitro, en diminuant l’affinité des feuilles fraiches pour le milieu digestif.
Les feuilles de moringa crues contiennent un niveau important de caroténoïdes et
vitamine E (α-tocophérol) mais le contenu en composés bioaccessibles est vraiment
faible (< 1 %). Dans les deux cas, les séchages et broyages augmentent la
bioaccessibilité des micronutriments. La déshydratation permet de stabiliser les feuilles
par élimination d’eau et limite donc les réactions de dégradation des composés. Les
feuilles déshydratées sont cassantes, ce qui permet lors du broyage de rompre plus ou
moins finement les tissus ; ainsi, une partie des cellules est ouverte par l’opération. Les
broyages grossiers et fins génèrent des particules de 1 mm et 200 µm ; les observations
microscopiques nous ont permis de constater que les cellules des feuilles de moringa
ont des tailles inférieures à 100 µm et celles de brède chouchou varient de 10 à 80 µm.
Les broyages utilisés ne permettent pas de rompre toutes les cellules et des amas de
tissus doivent encore exister dans les poudres. Cela explique pourquoi, même dans les
poudres, la bioaccessibilité n’est pas de 100 %. La surface de contact entre les
contenus cellulaires et le solvant de digestion pourrait encore être maximisée.
L’encapsulation en gélules d’hydroxypropyl methylcellulose (HPMC) n’est pas un facteur
limitant pour la libération des micronutriments ; elle se solubilise aisément pendant la
digestion.
Les cuissons douces (eau, vapeur) améliorent davantage la bioaccessibilité des
micronutriments des brèdes chouchou que celle des feuilles de moringa. Les feuilles de
moringa proviennent d’un arbre et apparaissent plus résistantes au toucher que la
plupart des légumes feuilles potagers. Une cuisson dans l’eau de courte durée (3 min)
semble ne pas être suffisante pour modifier la structure et l’intégrité de l’aliment.
La seule pratique culinaire qui améliore le contenu en micronutriments bioaccessibles
des feuilles de moringa est la cuisson à la vapeur. Une longue durée de cuisson (15
min) en contact avec l’eau chaude ou la vapeur d’eau chaude pourrait assouplir les
feuilles et favoriser la rupture des parois cellulaires pendant la digestion in vitro et
augmenter la libération des micronutriments.
Parmi les micronutriments étudiés, la bioaccessibilité (%) de l’α-tocophérol des légumes
feuilles crus est 10 fois plus élevée que celle du β-carotène. La bioaccessibilité de la
lutéine est toujours plus supérieure à celle du β-carotène, mais dans le même ordre de
grandeur. La teneur α-tocophérol bioaccessible est 6 fois plus élevée que celle de
129
caroténoïdes des légumes feuilles cuits ou transformés. Ces comportements distincts
peuvent être expliqués par des différences physicochimiques liées à la structure même
des composés. La lutéine est plus polaire donc mieux incorporée dans les micelles que
le β-carotène. Comme la lutéine, l’α-tocophérol a un groupement hydroxyle polaire (OH)
sur le noyau chromanol. En revanche, la bioaccessibilité de l’α-tocophérol est meilleure,
probablement parce qu’il résiste mieux à l’oxydation pendant la digestion et la cuisson
(i.e. moins de groupement OH donc moins de dégradation) (Ven het Hof et al., 2000 ;
Tyssandier et al., 2001 ; Goñi et la., Ricch et al., 2003 ; Granado-Lorencio et al., 2007).
L’hydrophobicité des molécules peut influencer leur bioaccessibilité ou biodisponiblité
(Ricch et al., 2003; Back et al., 2005).
Les traitements culinaires et opérations unitaires induisent des modifications de
composition et structure mais la bioaccessibilité des micronutriments reste toujours
faible. Pour couvrir 10 % des besoins en vitamine A journalier, il faudrait manger 900 g
de feuilles cuites à la vapeur ou 8 gélules de 0,2 g des feuilles en poudre.
Le changement morphologique des feuilles de moringa et brède chouchou
Afin de mieux comprendre les mécanismes qui déterminent la bioaccessibilité des
caroténoïdes et tocophérols, les changements de structure des légumes feuilles après
différents traitements ont été évalués par microscopie. Les changements structuraux
des tissus pendant les procédés expliquent partiellement les modulations de
bioaccessibilité. Les feuilles de moringa et de brède chouchou crues et cuites dans
l’eau, à la vapeur et frites ont été fixées, coupées transversalement et colorées
spécifiquement pour visualiser la morphologie des feuilles.
Les feuilles crues sont composées d’un épiderme supérieur et inférieur, et au centre
d’un parenchyme palissadique (cellules allongées perpendiculaires à l’épiderme
supérieur) et d’un parenchyme spongieux (cellules plus rondes avec des zones de vide
où les gaz de respiration végétale peuvent s’échapper). Le parenchyme palissadique est
la zone dédiée à la photosynthèse, il est donc riche en chloroplastes qui contiennent
beaucoup de β-carotène et lutéine.
Selon les méthodes de cuisson, les changements morphologiques ont été plus ou moins
observés. La friture désorganise l’arrangement des cellules et détruit les épidermes
(supérieur, inférieur) et le mesophylle spongieux. L’observation microscopique ne révèle
plus que la présence de spectres de parois ; les contenus cellulaires ne sont parfois
130
même plus visibles. Cette ouverture pourrait libérer les caroténoïdes et l’α-tocophérol
donc augmenter la bioaccessibilité. L’utilisation de températures élevées pendant cette
opération vaporise l’eau contenue dans les cellules (presque 80% de la masse des
feuilles). Cette vaporisation doit détruire les parois cellulaires en créant des pores.
Malheureusement, l’usage de hautes températures pendant cette opération induit
également des réactions de dégradation des composés qui ne sont plus bioaccessibles
(déstructuration de la matrice) mais également moins concentrés (perte réactionnelle).
Dans le cas de la cuisson dans l’eau et à la vapeur, les épidermes et le mesophylle
palissadique ne sont pas endommagés et restent adjacents. En revanche, les cellules
spongieuses sont légèrement désorganisées. Après coloration spécifique, il apparait
que les feuilles cuites à l’eau ou à la vapeur donnent une coloration plus claire que les
feuilles crues ; les protéines, polysaccharides et lipides ne sont plus en amas mais
dispersés dans les cellules. En ce qui concerne les feuilles de moringa, les cellules
contenant des tanins condensés ne sont plus observables après cuisson (vapeur et
friture) ; en revanche, elles sont toujours présentes après cuisson dans l’eau.
La cuisson à la vapeur qui a une durée plus longue (15 min) et une température plus
élevée (110°C) induit un changement au niveau de l’adhésion de cellules de
parenchyme spongieux ce qui améliore la bioaccessibilité. Dans la littérature (Greve et
al., 1994; Ng et Waldron, 1997; Waldron et al., 1997; Lillford, 2000; Bernhardt et Schlich,
2006 ; Miglio et al., 2008; Van Buggenhout et al., 2009), il a été démontré que la cuisson
des légumes feuilles dans l’eau augmente la bioaccessibilité par un changement de
morphologie et de souplesse des légumes. Dans notre étude, cette méthode de cuisson
ne permet pas d’améliorer la bioaccessibilité des micronutriments des feuilles de
moringa alors que l’opération est bénéfique pour le brède chouchou.
La souplesse des feuilles après la cuisson à la vapeur de notre étude pourrait être due i)
à la solubilisation de la feuille, ii) à une diminution de la cohésion intercellulaire donc
augmenter la bioaccessibilité. Deux hypothèses pourraient expliquer ce mécanisme.
1) Les parois des cellules pourraient être endommagées par l’agitation pendant la
digestion in vitro.
2) La souplesse des parois cellulaires augmenterait leur porosité et favoriserait le
transfert des micronutriments vers le milieu sans rupture cellulaires.
131
Intérêt nutritionnel et recommandations alimentaires
Malgré le fait que les feuilles de moringa soient riches en micronutriments et protéines
(Kaitho et al., 1997; Makkar et Becker, 1997 ; Richter et al., 2003; Nambiar et Seshadri,
2001a), elles ont des propriétés hypolipidimiante, hypocholestérolimiante et
hypoglycémique chez l’homme (William et al., 1993; Kumari, 2010; Nambiar et al., 2010;
Arun Giridhari et al., 2011; Kushwaha et al., 2014). Leur consommation pourrait être
encouragée dans le cadre de programme de lutte contre l’obésité et le diabète. En
revanche, leur utilisation chez les personnes carencées en micronutriments est
questionnable. En effet, plusieurs facteurs antinutritionnels (phytates, tanins, inhibiteur
de trypsine) ont été identifiés. Nos travaux ont permis de caractériser en partie les
composés phénoliques (tanins catéchiques) stockés dans des cellules spécialisées; les
teneurs en composés phénoliques pourraient être encore plus élevées dans ces feuilles
(ainsi que celles de perilla) car nous n’avons dosé que les polymères de composés
phénoliques à base de catéchine, épicatéchine et acide gallique. Les feuilles pourraient
également contenir des composés phénoliques simples en concentration importante.
Dans leur globalité, ces composés phénoliques ont des propriétés antioxydantes qui
participent à la chélation de minéraux essentiels (cations di et trivalents tels que le fer ou
le zinc), inhibent les amylases et les protéases et limitent ainsi l’utilisation digestive des
protéines (Mosha et al., 1995; Gidamis et al., 2003; Anwar et al., 2007). L’augmentation
de la quantité ou de la fréquence de consommations des feuilles de moringa et perilla
par les populations carencées pourrait réduire l’absorption d’autres micronutriments et
perturber l’assimilation protéique. Des tels effets ont été observés avec la
consommation de thé (Kono et al., 1992; Erba et al., 2005; Koo and Noh, 2007). Dans le
cadre de programme de diversification alimentaire, la consommation des légumes
feuilles, en général, doit être encouragée mais pas de manière exclusive vis-à-vis du
moringa. En effet, les autres légumes feuilles ont des atouts nutritionnels comparables
avec des teneurs moindres en facteurs antinutritionnels. Il est nécessaire d’avoir une
vision holistique de l’alimentation lorsque l’on souhaite mettre en œuvre de l’éducation
nutritionnelle et ne prendre en considération qu’une partie du profil de l’aliment n’est pas
satisfaisant.
132
Les produits transformés sont intéressants car plus digestibles et les opérations tels que
la cuisson à la vapeur ou le séchage/broyage sont à encourager. La stabilisation par
abaissement de la teneur en eau et broyage, permet de disposer sur l’année de
légumes sous forme de poudre « fonctionnalisée ». Diversifier les modes de
consommation de légumes sous forme fraiche ou transformée pourrait améliorer le
statut nutritionnel des populations. Par ailleurs, les poudres de feuilles sont souvent
utilisées en Asie pour élaborer des sauces plus complexes avec ajout d’huile ou de lait
de coco qui doivent également améliorer l’absorption intestinale des composés.
Les légumes feuilles ont déjà une place importante dans l’alimentation des populations
du Sud-Est asiatique ; ils accompagnent le riz ou d’autres produits amylacés. Ils sont
appréciés, accessibles financièrement, disponibles toute l’année grâce à l’organisation
de circuits de commercialisation entre les zones production et les villes. Enfin, ils
constituent une source de revenus pour les agriculteurs familiaux présents en milieu
rural. Ils contribuent à la durabilité des systèmes alimentaires locaux et ces filières de
productions doivent être soutenues et encouragées.
Il est important de signaler les limitations de cette thèse. Compte tenu de la planification
du travail et des financements disponibles, il n’a pas été possible de réaliser des
enquêtes alimentaires sur le terrain pour déterminer les légumes feuilles à étudier et leur
importance relative dans le régime alimentaire thaïlandais. Ces données permettraient
de mieux évaluer la contribution de ces aliments aux couvertures de besoins des
populations locales. La Thaïlande, comparativement à certains de ses pays frontaliers,
est en cours de résolution des problèmes de carences en micronutriments et son
modèle alimentaire semble contribuer à ces évolutions positives. Le développement
économique du pays est bien entendu, également, un élément important. Il serait donc
intéressant de poursuivre les travaux en complétant les données par des enquêtes
alimentaires, afin de pouvoir tirer des conclusions plus opérationnelles.
Par ailleurs, l’étude menée concerne les caractéristiques biochimique et
physicochimique impliqués dans les mécanismes de relargage et micellisation des
composés lipophiles. Il s’agit d’évaluations in vitro qui ne prennent pas en compte la
physiologie complexe de la digestion humaine où la mastication, la flore colique et les
entérocytes jouent un rôle essentiel dans l’absorption des nutriments. Malgré tout, les
résultats obtenus dans cette étude sont cohérents et relativement comparables à ceux
133
des littératures. Pour mieux comprendre la biodisponibilité réelle chez l’homme des
vitamines liposolubles, des essais cliniques seraient à mettre en place.
134
Conclusion
135
7 Conclusion et perspectives
Les carences en micronutriments, et notamment en vitamine A, sont toujours un
problème de santé publique chez les jeunes enfants et les femmes enceintes dans les
pays les moins avancés (Asie, Afrique). La pauvreté, l’insécurité alimentaire, la
monotonie des régimes alimentaires et la maladie sont des causes majeures de ce
problème. Afin de lutter contre la carence en vitamine A, la consommation des légumes
feuilles riches en caroténoïdes provitaminiques peut être une solution durable car ils
favorisent la diversité alimentaire et nutritionnelle tout en contribuant à la durabilité des
systèmes alimentaires locaux. En effet, ils sont appréciés, accessibles financièrement et
disponibles grâce à l’organisation de circuits de commercialisation qui fournissent des
revenus aux agriculteurs familiaux vivant en milieu rural. Encourager la diversification
alimentaire et la consommation de légumes feuilles sous forme fraîche, séchée et
broyée est intéressant pour favoriser la nutrition, les systèmes alimentaires locaux, en
créant peut être plus de valeur et d’emplois. Des programmes d’éducation nutritionnelle
pourraient être utiles pour communiquer sur les bénéfices nutritionnelles des variétés et
recettes traditionnelles en Asie du Sud-Est.
Les caroténoïdes provitaminiques (i.e. β-carotène), les xanthophylles (i.e. lutéine) et l’α-
tocophérol sont localisés dans les chloroplastes des cellules palissadiques des légumes
feuilles et emprisonnés dans les parois cellulaires ; ils nécessitent une libération pour
être incorporés dans les micelles mixtes (i.e. bioaccessibilité). Les parois cellulaires sont
donc des barrières physico-chimiques limitant la bioaccessibilité des composés
d’intérêts. Les légumes feuilles étudiés sont riches en protéines, en caroténoïdes (β-
carotène et lutéine) et, pour certains, en vitamine E (α-tocophérol). Dans les produits
frais, la bioaccessibilité des vitamines liposolubles des 8 variétés est faible. Les
pectines, composant essentiel de la lamelle moyenne des parois cellulaires, ont été
identifiées comme seul déterminant de la bioaccessibilité du β-carotène et de la lutéine.
Elles semblent limiter la micellisation des vitamines lipophiles.
Parmi les pratiques culinaires courantes et les procédés de transformation des légumes
feuilles, la cuisson à la vapeur, la stérilisation, le séchage au four à température
modérée couplé avec le broyage fin avec ou sans encapsulation sont les procédés qui
augmentent le plus la teneur en micronutriments bioaccessibles. Les changements de la
morphologie des feuilles expliquent partiellement la modulation de bioaccessibilité. En
effet, le procédé qui déstructure le plus les feuilles (i.e. la friture) n’est pas celui qui
136
améliore le plus la bioaccessibilité à cause des champs de température utilisés. Il est
donc nécessaire d’identifier des opérations unitaires qui transforment l’aliment en
ouvrant les cellules qui le composent tout en préservant les composés d’intérêt
nutritionnel des mécanismes de réaction et diffusion. L’évolution de la structure des
feuilles (crues ou transformées) pendant la digestion est en cours d’évaluation afin de
voir comment cette étape physiologique déstructure elle aussi l’aliment. Les résultats, en
cours d’obtention, n’ont pas être intégrés dans cette thèse.
Quelques perspectives de recherches se dégagent de cette thèse. Il serait intéressant
d’identifier des techniques de broyage plus poussèes qui permettent de produire des
poudres de tailles de particules inférieures à la taille des cellules des légumes feuilles (<
au moins à 100µm). Des procédés innovants (broyages plus performants, séparation
des particules selon leurs tailles) pourraient être testés pour concentrer davantage les
poudres en vitamines lipophiles bioaccessibles. Par ailleurs, des transformations telles
que la cuisson sous pression ou sous vide pourraient peut-être améliorer la capacité des
aliments transformés à libérér leurs composés pendant la digestion par déstructuration
de l’aliment. Ces travaux s’inscriraient dans une perspective de fonctionnalisation des
matières premières locales et pourraient, à terme, déboucher sur la création de
nouveaux produits développés par des entreprises locales.
Par ailleurs, l’absorption des micronutriments dans le corps humain est un processus
complexe. Les digestions in vitro utilisées dans nos expérimentations ont l’avantage
d’être peu couteuses et faciles à mettre en œuvre. En revanche, plusieurs facteurs
importants pour évaluer l’absorption intestinale (mouvements péristaltiques, microflores
coliques, état santé de la personne) n’ont pas été pris en compte dans cette étude. Des
études in vivo apporteraient des éléments de compréhenion complémentaires. Il est
toujours nécessaire de mener des recherches pluridisciplinaires sur les transporteurs,
enzymes et gènes responsables de l’absorption et du transport des caroténoïdes dans
le corps humain ; ces connaissances permettront de mieux comprendre les mécanismes
de libération et absorption intestinale qui sont d’un intérêt primordial pour l’amélioration
de l’état nutritionnel des populations mondiales.
137
Références
bibliographiques
138
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162
ANNEXES
163
AAnnnneexxee 11 :: TTeenneeuurrss eenn ccaarroottéénnooïïddeess ccoonnnnuuss ddeess lléégguummeess ((µµgg//gg MMFF))
# : µg/ g MS
Légumes Broccoli
(var. verde calabrese)
Carotte Chou de Bruxelles
Chou frisé Chou fleur (var. White
Rock) Citrouille
Corriandre (var. GS4 Multicut) #
Endive (cv. Anivip)
Epinard # Moringa (cv.
Bhagya) Roquette
Nom botanique Brassica oleracea
var. italica
Daucus carota
Brassica oleracea
var. gemmifera
Brassica oleracea
var, acephala
Brassica oleracea
var. botrytis
Cucurbita maxima
Coriandrum sativum
Chicory Cichorium
intybus
Spinacia oleracea
Moringa oleifera
Eruca sativa
Lutéine 28,05 1,5 11,63 65,22 0,28 - - 59,1 775,8 312,7 74,4
Zeaxanthine - - - - - - - 0,9 15,1 135,4 0,6
β-Cryptoxanthine 0,15 - 1,63 0,21 0,15 - - - - - -
α-Carotène - 45,0 - - - 39,9 - - - - 2,8
β-Carotène 11,38 53,6 0,718 44,0 0,22 172,2 586,1 73,1 365,3 231,5 79,6
carotenoids totaux
46,46 - 39,54 132,9 0,746 236,1 1691,5 - 2386,2 80,8 -
Reférences Kaulmann et al., 2014
Maurer et al., 2014
Kaulmann et al., 2014
Kaulmann et al., 2014
Kaulmann et al., 2014
Carvalho et al., 2014
Divya et al., 2012
Žnidarčič et al., 2011
Lakshminarayana et al.,
2005
Saini et al., 2014b
Žnidarčič et al., 2011
164
AAnnnneexxee 22 :: TTeenneeuurrss eenn ccaarroottéénnooïïddeess eett αα--ttooccoopphhéérrooll aavvaanntt eett aapprrèèss ttrraaiitteemmeennttss ccuulliinnaaiirreess ddeess lléégguummeess
Légumes Composés
Teneur
initiale
(mg/100g)
Cuisson dans l'eau Cuisson à la vapeur/sous
pression Friture
Références
Paramètre Evolutions
(%) Paramètre
Evolutions
(%) Paramètre
Evolutions
(%)
Amarante β-carotène 35,3 # 100°C, 5min -8 10 min -0.7 30 min -1 Yadav et Sehgal, 1995
Amarante β-carotène 35,3 # 100°C, 15min -24 - - - - Yadav et Sehgal, 1995
Artichauts β-carotène 0,3 # 100°C, 15 min 344 12 min, 1 bar 344 170°C, 5
min 270 Ferracane et al., 2008
Artichauts lutéine 1 # 100°C, 15 min 770 12 min, 1 bar 590 170°C, 5
min 300 Ferracane et al., 2008
Brocoli β-carotène 0,63 100°C, 5 min -79 - - - - Zhang et Hamauzu, 2004
Brocoli lutéine 1,08 100°C, 5 min 27 - - - - Zhang et Hamauzu, 2004
Brocoli β-carotène 10,5 # 5 min 134 cuisseur 1 bar,
10 min 90 - -
Gliszczyńska-Swigło et al.,
2006
Brocoli lutéine 6,47 # 5 min 500 cuisseur 1 bar,
10 min 311 - -
Gliszczyńska-Swigło et al.,
2006
Brocoli α-
tocophérol 0.727 # 5 min 75
cuisseur 1 bar,
10 min 23 - -
Gliszczyńska-Swigło et al.,
2006
Brocoli β-carotène 0.05 100°C, 16 min 440 10 min 340 - - Bernhardt et Schlich, 2006
Brocoli α-
tocophérol 0.32 100°C, 16 min 381 11 min 394 - - Bernhardt et Schlich, 2006
165
Carotte β-carotène 30 105°C, 4 min -24 98°C, 6 min -26 - - Pinheiro-Sant’Ana et al., 1998
Citrouilles β-carotène 2,2 100°C, 10 min -49 10 min, 1 bar -71 - - Gayathri et al., 2004
Epinard lutéine 4,2 100°C, 10min 48 - - - - Granado et al., 1992
Epinard β-carotène 63,1 # 100°C, 5min -8 10 min -0.7 30 min -2 Yadav et Sehgal, 1995
Epinard β-carotène 63,1 # 100°C, 15min -26 - - - - Yadav et Sehgal, 1995
Epinard β-carotène 6,2 100°C, 8 min 0 - - 8 min -77 Chang et al., 2013
Epinard lutéine 0,5 100°C, 8 min -72 - - 8 min -75 Chang et al., 2013
Son de riz α-
tocophérol 19,9 # 110°C, 20 min -23 - - - - Anil Kumar et al., 2006
# : pour 100 g de MS
166
AAnnnneexxee 33 :: TTeenneeuurrss eenn ccaarroottéénnooïïddeess eett αα--ttooccoopphhéérrooll aavvaanntt eett aapprrèèss pprrooccééddééss ddee ccoonnsseerrvvaattiioonn
Légumes Composés
Teneur initiale
(mg/100 g)
Réfigiration/ Congélation
Séchage
Référence
Paramètre Evolutions
(%) Paramètre
Evolutions (%)
Amarante β-carotène 35,3 # 5°C, 48 h -0.8 Soliel, 10 h -49 Yadav et Sehgal, 1995
Amarante β-carotène 35,3 # - - four 65°C, 10h -14 Yadav et Sehgal, 1995
Brocoli β-carotène 0,2 -20°C, 1 an -16 - - Howard et al., 1999
Carotte β-carotène 30 - - four 65°C, 7h30 -35 Pinheiro-Sant’Ana et al., 1998
Epinard lutéine 4,2 5°C 0-1,3 - - Granado et al., 1992
Epinard β-carotène 63,1 # 5°C, 48 h -0.6 soleil, 10 h -57 Yadav et Sehgal, 1995
Epinard β-carotène 63,1 # four 65°C, 10h -28
Manioc jaune Caroténoïdes totaux 0,7 # - - soleil 48h 46,6%– 67,14%
Vimala et al., 2011
Moringa β-carotène 36,9 - - soleil 2-3 jours 187 Saini et al., 2014a
Moringa lutéine 18,2 - - soleil 2-3 jours 119 Saini et al., 2014a
Moringa α-tocophérol 271,0 - - Soliel 2-3 jours 204 Saini et al., 2014a
Tomate β-carotène 2,7 # - - four 160°C, 20
min 115 Hwang et al., 2012
Tomate lutéine 1,1 # - - four 160°C, 20
min 55 Hwang et al., 2012
Tomate α-tocophérol 8 # - - four 160°C, 20
min 47 Hwang et al., 2012
# : pour 100 g de MS
167
AAnnnneexxee 44 :: BBiiooaacccceessssiibbiilliittéé ddeess ccaarroottéénnooïïddeess eett ttooccoopphhéérroollss aapprrèèss lleess ttrraaiitteemmeennttss tthheerrmmiiqquueess
Légumes Composés Teneur initiale
mg/100 g)
Traitements appiliqués Bioaccessibilité légume cru (%)
Bioaccessibilité après cuisson
(%) Référence
Cuisson Paramètre
Amaranth β-carotène 8,0 dans l'eau, à la vapeur, fiture
100°C, 10 min; 13 min, 1 bar; 100°C, 10 min
10 12; 14; 25 Vimala et al., 2011
Carotte β-carotène non précisé dans l'eau; +huile
d'olive 100°C, 15 min; 10% huile 30 80
Hornero-Méndez et Mínguez-Mosquera, 2007
Courgette lutéine non précisé dans l'eau; grillé; micro-onde; à la
vapeur
100°C, 10 min; 10 min; 800W, 5 s; 10 min
46 61; 28; 50; 57 Ryan et al., 2008
Epinard β-carotène 58 # dans l'eau 98°C, 20 min < 0,2 2 Courraud et al., 2013
Epinard lutéine 59 # dans l'eau 98°C, 20 min < 0,2 7 Courraud et al., 2013
Epinard lutéine 2,7 dans l'eau; micro-
onde 10 min; 800 W 64 74; 38 O’Sullivan et al., 2008
Fenugrec β-carotène 9,0 à la vapeur; broyage fin
non précisé 8 14 Veda et al., 2008
Manioc β-carotène 0,2 dans l'eau; friture 120°C, 45 min; 180°C, 8min 5 5; 14 Gomes et al., 2013
Patates douces Ejumula
β-carotène 31,4 # dans l'eau; à la
vapeur; friture; four 92°C, 20 min; 94°C, 30 min; 170°C, 10 min; 180°C,15 min
24 40; 40; 54; 32 Tumuhimbise et al., 2009
Pigment rouge
β-carotène non précisé dans l'eau; grillé; micro-onde; à la
vapeur
100°C, 10 min; 10 min; 800W, 5 s; 10 min
13 77; 51; 41; 59 Ryan et al., 2008
168
Pigment rouge
lutéine non précisé dans l'eau; grillé; micro-onde; à la
vapeur
100°C, 10 min; 10 min; 800W, 5 s; 10 min
81 81; 22; 39; 0; 0 Ryan et al., 2008
pistach α-tocophérol 1,1 Toréfié non précisé 5,8 98 Mandalari et al., 2013
Tomate β-carotène non précisé dans l'eau; grillé; micro-onde; à la
vapeur
100°C, 10 min; 10 min; 800W, 5 s; 10 min
6 47; 46; 40; 29 Ryan et al., 2008
Tomate lutéine non précisé dans l'eau; grillé; micro-onde; à la
vapeur
100°C, 10 min; 10 min; 800W, 5 s; 10 min
83 85; 62; 37; 51 Ryan et al., 2008
# : pour 100 g de MS
169
AAnnnneexxee 55 :: CCoommppoossiittiioonn nnuuttrriittiioonnnneellllee ddeess lléégguummeess ffeeuuiilllleess ccoouurraammmmeenntt ccoonnssoommmmééss eenn AASSEE
Nom Francais
Energie (kcal)
Teneur en eau
(g)
Protéine (g)
Lipide (g)
Glucide (g)
Fibre (g)
Cendre (g)
Ca (mg)
Fe (mg)
Zn (mg)
VitA: RAE (µg)
β-carotène (µg)
Vit B1 (mg)
Vit B2 (mg)
Vit C (mg)
Niacine
(mg)
vit B6 (mg)
Folate (µg)
Liseron d’eau
19 92,7 1,75 0,35 0,51 3,3 1,4 31 1,78 0,41 84 1003 0,02 0,13 10,4 0,77 0,0 -
Chou chinois
21 92,2 2,40 0,30 0,60 3,0 1,5 164 0,98 0,60 97 1162 0,09 0,15 72,8 0,83 0,14 79
Pakchoi 20 93,3 1,85 0,19 1,56 2,1 1,0 136 1,20 0,50 192 2306 0,05 0,18 33,5 0,63 0,28 58
Moringa 92 75,0 6,25 2,00 10,0 3,8 - 525 6,75 0,62 551 6630 0,06 0.05 220 0,80 - -
Chaphu 76 81,0 4,00 5,70 1,30 1,9 2,3 396 7,60 0,60 - - 0,13 0,11 10 3,40 - -
Brède chouchou
60* 87,0 3.33 0,4* 0,7* 1,2* 1,2* 58* 2,50* - 148 1770 0,08 0,18* 12,5 1,10 - -
Coriandre 26 90,4 2,30 0,30 2,00 3,0 2,0 91 1,50 0,20 183 2195 0,09 0,22 70,0 0,90 0,18 52
Menth 49 88,2 3,65 0,79 3,37 6,8 - 217 1,70 0,47 358 4300 0,09 0,26 23,9 1,25 0,13 110
Basilic Thai
36 88,4 2,90 0,10 4,80 2,0 1,8 155 7,60 0,80 226 2713 0,11 0,15 21,0 0,90 0,17 86
* : veleurs des nutriments de tiges et jeunes feuilles
Sources : Table de compositon nutritionnelle Ciqual 2008; Ramachandran et al., 1980; Yeoh et Wong, 1993; Saade, 1996; Singh et al., 2001; M.
Ogle, 2001; Chanwitheesuk et al., 2005; Kidmose et al., 2006; Thurber et Fahey, 2009; Andarwulan et al., 2012; Ellong et al., 2015.
170
AAnnnneexxee 66 :: GGrraaddiieenntt dd’’éélluuttiioonn uuttiilliisséé ppoouurr ssééppaarreerr lleess ccoommppoossééss pphhéénnoolliiqquueess
Temps (min) A (%) B (%)
0 100 0
4 100 0
8 92 8
12 0 100
20 0 100
23 100 0
38 100 0
AAnnnneexxee 77 :: GGrraaddiieenntt dd’’éélluuttiioonn uuttiilliisséé ppoouurr ssééppaarreerr lleess ccaarroottéénnooïïddeess eett
ttooccoopphhéérroollss
Temps (min) A (%) B (%)
0 55 45
5 55 45
11 10 90
16 0 100
19 0 100
27 55 45
31 55 45
Résumé
Les légumes feuilles sont des aliments sources de diversité alimentaire chez l’homme mais la faible
biodisponibilité des caroténoïdes (β-carotène et la lutéine) et de l’α-tocophérol limite leur intérêt
nutritionnel. Cette thèse avait pour objectif d’identifier les déterminants de la bioaccessibilité de
micronutriments lipophiles dans 8 légumes feuilles frais ou transformés du Sud-Est asiatique. L’influence
des traitements culinaires et procédés de conservation sur le profil nutritionnel des aliments et la
bioaccessibilité des composés a été évaluée par digestion in vitro. Les changements de structure ont été
évalués par microscopie et colorations spécifiques. Les teneurs en pectines ont été le seul déterminant
identifié dans la faible bioaccessibilité. La cuisson à la vapeur, la stérilisation et le séchage doux (60°C)
couplé au broyage augmentent le plus la bioaccessibilité. En revanche, la friture déstructure profondément
l’aliment et dégrade les vitamines par réaction de dégradation à hautes températures. L’ouverture des
cellules est un élément important dans la bioaccessibilité des composés mais la composition des légumes
elle-même influence le devenir digestif. En conclusion, les légumes feuilles frais et transformés ont un profil
nutritionnel intéressant. Le moringa a un profil nutritionnel comparable aux autres légumes feuilles à
l’exception des composés phénoliques qu’il contient. Diversifier les modes de consommation de légumes
sous forme fraîche ou transformée pourrait améliorer le statut nutritionnel des populations.
Title: Determining factors of carotenoids and tocopherols bioaccessibility of leafy vegetables: comparison
of variety and influence of processing
Abstract
Leafy vegetables contribute to human diet diversification but the low bioavailability of carotenoids (β-
carotene and lutein) and α-tocopherol decrease their nutritional interest. This thesis aimed at identifying the
determining factors of lipophilic micronutrients in 8 fresh leafy vegetables consumed in Southeast Asia. The
influence of culinary treatments and preservation process on the nutritional profile and the micronutrient
bioaccessibility were evaluated by in vitro digestion. The structural changes were assessed by microscopy
and specific colorations. The pectin contents of the leaves were the only determinant identified in the low
bioaccessibility. Steaming, sterilization and gentle drying (60°C) coupled with grinding increase greatly the
bioaccessibility. However, frying disorganizes deeply the food structure and degrades the vitamins by
degradation reactions at high temperatures. The opening of the cells is an important factor in the
bioaccessibility of the compounds but the composition of the vegetable itself influences the digestive
behaviour. In conclusion, fresh and processed vegetables have an interesting nutritional profile. Moringa
has a nutritional profile similar to other leafy vegetables except for its phenolic compound content.
Diversifying the vegetable consumption in fresh or processed form could improve the nutritional status of
populations.
Dicipline: Science des aliments et Nutrition
Mots clés: vitamine A, stabilité, bioaccessibilité, légumes feuilles, pratiques culinaires, microstructure
Intitulé et adress du laboratoire : IRD, UMR 204-Nutripass « Nutrition et alimentation des populations
aux Suds » IRD/Université Montpellier, 911 avenue Agropolis 34394 Montpellier cedex 5, France.
