Effekt des anti-gangliosidären monoklonalen Antikörpers ... · ganglioside monoclonal antibody AA4 selectively inhibits IgE-induced signal transduction pathways in rat basophilic

Aus der Kinderklinik der Universität Düsseldorf

Direktor: Prof. Dr. med. H. G. Lenard

Effekt des anti-gangliosidären monoklonalen Antikörpers AA4

auf die intrazelluläre Calciumkonzentration in RBL-2H3-Zellen.

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin

einer

Hohen Medizinischen Fakultät

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Marius Skasa

aus Falkenberg in Polen

1999

Teilergebnisse dieser Arbeit wurden in: Stephan V., Seibt A., Dukanovic D., Skasa

M., Swaim W.D., Berenstein E.H., Siraganian R.P., Wahn V. (1997) �Anti-

ganglioside monoclonal antibody AA4 selectively inhibits IgE-induced signal

transduction pathways in rat basophilic leukemia cells� , Mol. Immunol., 34, 227-

235 veröffentlicht.

Dekan: Professor Dr. med.Gert Muhr

Referent: Privat-Dozent Dr.med.Volker Stephan

Koreferent

Tag der mündlichen Prüfung:

______________________________________________________________________________

To my three ladies with love

1 1 1 1 1 EINLEITUNG ........................................................................................................................................ 1

1.1 PHYSIOLOGIE DER HUMANEN MASTZELLEN UND BASOPHILEN GRANULOZYTEN........................................... 21.1.1 Morphologie und Ultrastruktur ........................................................................................... 31.1.2 Mediatoren............................................................................................................................ 61.1.3 Rezeptoren der Zelloberfläche............................................................................................ 151.1.4 Abstammung und Differenzierung ...................................................................................... 171.1.5 IgE-Rezeptor mit hoher Affinität ........................................................................................ 19

1.1.5.1 Struktur und Verteilung ...................................................................................................................201.1.5.2 Interaktionen des humanen IgE-Rezeptors ...................................................................................... 23

1.2 AGONISTEN DER HUMANEN BASOPHILEN GRANULOZYTEN UND MASTZELLEN ........................................... 281.3 FUNKTION DER BASOPHILEN GRANULOZYTEN UND MASTZELLEN ........................................................... 311.4 RBL-2H3-ZELLEN ALS VERSUCHSMODELL FÜR DIE HUMANEN BASOPHILEN GRANULOZYTEN UND

MASTZELLEN .................................................................................................................................. 371.4.1 Beschreibung der RBL-2H3-Zellinie .................................................................................. 371.4.2 Beschreibung der RBL-2H3-m3.7-Zellinie ......................................................................... 381.4.3 Signalübertragungsmechanismen in RBL-Zellen ............................................................... 39

1.4.3.1 Intrazelluläres Calcium ...................................................................................................................441.4.3.2 Degranulation .................................................................................................................................47

1.5 GANGLIOSID G D1b

............................................................................................................................................................................................. 481.5.1 Allgemeines ......................................................................................................................... 481.5.2 Der monoklonale Antikörper AA4 ...................................................................................... 49

1.6 FRAGESTELLUNG ............................................................................................................................. 51

2 MATERIALIEN UND METHODIK................................................................................................. 55

2.1 QUIN-2 ALS INDIKATOR FÜR CALCIUMKONZENTRATION ......................................................................... 552.1.1 Chemische Eigenschaften von Quin-2 ................................................................................ 552.1.2 Physikalische Eigenschaften von Quin-2 ........................................................................... 572.1.3 Prinzip der spektrofluometrischen Messungen mit Quin-2 ................................................ 592.1.4 Kalibrieren der Calziumkonzentration bei den Messungen mit lebenden Zellen ............... 61

2.2 ZELLKULTUR................................................................................................................................... 642.3 ZELLSTIMULATION ........................................................................................................................... 65

2.3.1 Messung der Serotoninfreisetzung ...................................................................................... 672.3.2 Messung der intrazellulären Calciumkonzentration........................................................... 69

3 ERGEBNISSE........................................................................................................................................ 73

3.1 BESTIMMUNG DER SPEKTRALEN EIGENSCHAFTEN VON QUIN-2............................................................... 733.1.1 Anregungs- und Emissionsspektrum von Quin-2/AM ......................................................... 733.1.2 Anregungs- und Emissionsspektrum von Quin-2................................................................ 753.1.3 Anregungs- und Emissionsspektrum von Quin-2/Ca2+

................................................................................................ 763.2 BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTE DES KOMPLEXES QUIN-2/Ca2+

............................................................................ 783.3 BESTIMMUNG DER ABHÄNGIGKEIT DER FLUORESZENZINTENSITÄT VON DER QUIN-2/Ca²+-KONZENTRATION ....

................................................................................................................................................793.4 AUTOFLUORESZENZ DER NATIVEN RBL2H3-ZELLEN .............................................................................. 813.5 ERMITTLUNG DER OPTIMALEN UND SUBOPTIMALEN ANTIGENKONZENTRATION FÜR DIE

STIMULATIONSVERSUCHE ................................................................................................................. 823.6 UNTERSUCHUNG DER EFFEKTIVITÄT DES LADEVERFAHRENS VON RBL-2H3-ZELLEN MIT QUIN-2/ AM .......... 84

3.6.1 Angebotene Quin-2/AM-Konzentration versus intrazelluläre Quin-2-Konzentration ....... 853.6.2 Ladezeit versus intrazelluläre Quin-2-Konzentration ........................................................ 86

3.7 UNTERSUCHUNG DER AUSWIRKUNG DER UNTERSCHIEDLICHEN QUIN-2/AMM-KONZENTRATIONEN

AUF DIE FUNKTION DER RBL2H3-ZELLEN .......................................................................................... 87

Inhaltsverzeichnis I______________________________________________________________________________

3.8 BESTIMMUNG DER EXTRAZELLULÄREN QUIN-2 FRAKTION BEI ROUTINEMÄSSIG GELADENEN

RBL-2H3-PROBEN .......................................................................................................................883.9 MESSUNG DER SEROTONINFREISETZUNG UND DES CALCIUMEINSTROMS ................................................... 89

4 DISKUSSION ........................................................................................................................................ 99

4.1 ETABLIERUNG DER METHODIK ........................................................................................................... 994.2 EFFEKT DES ANTI-GANGLIOSIDÄREN MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS AUF DIE CALCIUMKONZENTRATION UND

SEROTONINFREISETZUNG DER RBL-2H3- UND RBL-2H3-M3.7-ZELLEN ........................................101

5 ZUSAMMENFASSUNG ..................................................................................................................... 109

6 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................................ 111

7 DANKSAGUNG .................................................................................................................................. 130

8 LEBENSLAUF .................................................................................................................................... 131

II Inhaltsverzeichnis______________________________________________________________________________

Verzeichnis der Abbildungen

Abbildung 1 Humane Mastzelle der Haut..................................................................... S. 4Abbildung 2 Schema der Synthese der Lipidmetaboliten in humanen Mastzellen....... S. 9Abbildung 3 Biologische Effekte der Mediatoren, Proteasen und Zytokinen der

Mastzellen................................................................................................S. 13Abbildung 4 Struktur des hochaffinen IgE Rezeptors (FcεRI).................................... S. 22Abbildung 5 Mastzellen als Effektorzellen der angeborenen und erworbenen Immunität.

................................................................................................................S. 33Abbildung 6 Ein hypothetisches Modell der Interaktion der Mastzellen und T- und B-

Lymphozyten........................................................................................... S. 35Abbildung 7 Schema der Signalübertragungsmechanismen in RBL-2H3-Zellen....... S. 41Abbildung 8 Struktur der α-Galaktosyl Derivate des Gangliosids GD

1b......................S. 50

Abbildung 9 Formeln von Quin 2 und Quin 2/AM...................................................... S. 55Abbildung 10 Absorptions- und Emissionsspektra von Quin 2 bei unterschiedlichen

Calciumkonzentrationen..........................................................................S. 58Abbildung 11 Schema eines Spektrofluorometers...................................................... S. 60Abbildung 12 Absorptionsspektrum von Quin 2/ AM. ..............................................S. 74Abbildung 13 Emissionsspektrum von Quin 2/ AM. ..................................................S. 74Abbildung 14 Absorptionsspektrum von Quin 2. ........................................................S. 75Abbildung 15 Emissionsspektrum von Quin 2. ...........................................................S. 76Abbildung 16 Absorptionsspektrum von Quin 2/Ca2+. ................................................S. 77Abbildung 17 Emissionsspektrum von Quin 2/Ca2+. ..................................................S. 77Abbildung 18 Bestimmung der Dissoziationskonstante des Komplexes Quin 2/Ca2+. .....S.79Abbildung 19 Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der Konzentration des Kom

plexes Quin 2/Ca2+.................................................................................S.80Abbildung 20 Absorptionsspektra der nativen RBL-2H3-Zellen im Vergleich zum Ab

sorptionsspektrum von Komplex Quin 2/Ca2+. ......................................S.81Abbildung 21 Emissionsspektra der nativen RBL-2H3-Zellen im Vergleich zum Emissions

spektrum von Komplex Quin 2/Ca2+. ....................................................S.82Abbildung 22 Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration der stimulierten RBL-

2H3-Zellen in Abhängigkeit von DNP35

HSA-Konzentration................S.83Abbildung 23. Abhängigkeit der Serotoninfreisetzung der RBL-2H3-Zellen von der

DNP35

HSA-Konzentration. ...................................................................S.84Abbildung 24. Abhängigkeit der intrazellulären Quin-2 Konzentration in RBL-2H3-Zel-

len von der angebotenen extrazellulären Quin-2/AM Konzentration....S.85Abbildung 25. Abhängigkeit der intrazellulären Quin-2 Konzentration in RBL-2H3-Zel

len vom Dauer des Ladevorganges mit Quin-2/AM. ...........................S. 86Abbildung 26. Abhängigkeit der Serotoninfreisetzung in RBL-2H3-Zellen von der ange

botenen extrazellulären Quin-2/AM Konzentration.............................S. 87

Verzeichnis der Abbildungen III______________________________________________________________________________

Abbildung 27. Abhängigkeit des Anstieges der intrazellulären Calciumkonzentration inRBL-2H3-Zellen von der angebotenen extrazellulären Quin-2/AM Konzentration. ..................................................................................................S. 88

Abbildung 28. Spontane Serotoninfreisetzung der RBL-2H3 und RBL-2H3-m3.7-Zellen. ..............................................................................................................S. 90

Abbildung 29. Serotoninfreisetzung der RBL-2H3 und RBL-2H3-m3.7-Zellen nach der Stimulation. .........................................................................................S. 91

Abbildung 30. Basale intrazellulären Calciumkonzentration in RBL-2H3 und RBL-2H3- m3.7-Zellen in Abhängigkeit von Präinkubation mit monoklonalem Anti körper AA4. ......................................................................................S. 93

Abbildung 31. Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration in RBL-2H3 und RBL- 2H3-m3.7-Zellen nach der Stimulation. .............................................S. 94

Abbildung 32. Effekt des monoklonalen anti-gangliosidären Antikörpers AA4 auf die Serotoninfreisetzung und die intrazelluläre Calciumkonzentration in RBL- 2H3 und RBL-2H3-m3.7-Zellen nach der Stimulation. .....................S. 96

Abbildung 33. Effekt des Maus-Antikörpers der IgG1-Klasse auf die Serotoninfreisetzung und die intrazelluläre Calciumkonzentration in RBL-2H3-Zellen nach der Stimulation mit DNP

35HSA. ..............................................................S. 97

IV Verzeichnis der Abbildungen______________________________________________________________________________

1______________________________________________________________________________

1 Einleitung

Die humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten wurden erstmalig

von Paul Ehrlich im Jahr 1877 (1) resp. 1879 (2) entdeckt und beschrieben. Der

Erstbeschreiber charakterisierte seine Entdeckung als sich basophil anfärbende,

mit prominenten, metachromatischen, cytoplasmatischen Granula ausgestattete

Zellen, deren Funktion er damals in Speicherung der phagozytierten Nährstoffe

sah. Erst im Laufe des folgenden Jahrhunderts konnten weitere Erkenntnisse über

die zentrale Rolle, die diese Zellen mit von ihnen sezernierten Mediatoren bei den

Entzündungs- und Überempfindlichkeitsreaktionen spielen, gewonnen werden. Die

beiden Zellpopulationen weisen Gemeinsamkeiten in ihrer Struktur, Funktion und

Aktivierungsmechanismen auf. Beide enthalten zahlreiche prominente Granula,

die sich durch hohen Gehalt an sulphatierten Proteoglykanen metachromatisch

anfärben lassen. Mastzellen und basophile Granulozyten synthetisieren und spei-

chern Histamin und Proteasen, die bei Aktivierung freigesetzt werden. Die physio-

logische Aktivierung durch die Kreuzaggregation der hochaffinen Immunglobulin

E-Rezeptoren (FcεRI) über die Bindung der Antigene, die von antigenspezifischen

Immunglobulin E-Moleküle erkannt und gebunden werden, resultiert in der

Degranulation und Freisetzung der präformierten und de novo synthetisierten Media-

toren sowie in der Induktion der Transkription der mRNA der zahlreichen Zytokine.

Die Mediatoren und die Zytokine definieren die Rolle der beiden Zellpopulationen

bei der Auslösung der allergischen bzw. inflammatorischen Reaktionen. Die Mast-

zellen sind die Haupteffektorzellen der allergischen Sofortreaktion, wo basophile

Granulozyten eine wichtige Rolle in der Spätreaktion (late phase reaktion) und in

der Überempfindlichkeit-Typ IV-Reaktionen (delayed-type hypersensitivity), vor

allem der humanen Haut und Lungen, spielen.

Darüber hinaus wird eine wichtige Funktion der Mastzellen und der

basophilen Granulozyten in vielen weiteren physiologischen Reaktionen des

menschlichen Organismus vermutet. Im Laufe des letzten Jahrzehntes gewonne-

ne Erkentnisse lassen eine wichtige Rolle, die diese beide Zellpopulationen über

die Synthese und die Freisetzung der Zytokine nicht nur als Effektorzellen der

allergischen Reaktionen aber auch in der Initierung und Modulation der Immun-

antwort bei den inflammatorischen Reaktionen, bei antimikrobiellen Abwehrreak-

tionen, bei der endogenen Fibrino- und Thrombolyse und bei der Entstehung der

Organfibrose spielen, erkennen.

Die früher angenommenen Ähnlichkeiten dieser beiden Zellpopulationen

konnten durch die Erkentnisse über weitgehende Differenzen hinsichtlich der Mor-

phologie, Repertoire an Mediatoren, Zytokine und Oberflächenrezeptoren sowie

Funktion, wo IgE vermittelte Mediatorenfreisetzung nur eine Facette der sehr aus-

differenzierten Effektormechanismen darstellt, weitgehend widerlegt werden. Wei-

terhin bleibt die eigentliche Rolle, die diese beiden Populationen unter physiologi-

schen Bedingungen spielen, weitgehend unklar.

1.1 Physiologie der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten

Die Mastzellen sind eine klassische gewebeständige Population und daher

unter physiologischen Bedingungen in der Blutbahn und im Knochenmark so gut

wie nicht anzutreffen. In Rahmen der malignen Mastozytose und Mastzellen-Leuk-

ämie kommen die neoplastischen Klone der Mastzellen im peripheren Kreislauf

vor. Bei gesunden Individuen verteilen sich die Mastzellen in allen bindegewebigen

Strukturen, vor allem in der Nähe der Blut- und Lymphgefäße, der Nerven und in

den Schleimhäuten des Respirations- und Gastrointestinaltraktes. Die Mastzellen

können in fast allen Gewebearten vorkommen, finden sich jedoch überwiegend

an den großen Körperbarrieren und in bestimmten muskulären Organen wie Herz,

Gefäße und Uterus.

Die basophilen Granulozyten finden sich nur in einer kleinen Anzahl in der

Blutbahn und stellen ca. 0,2% (0,0-1,0%) der gesamten Leukozytenpopulation

dar. Sie finden sich vermehrt intravasal bei allergischen und parasitären Reaktio-

nen sowie bei neoplastischen Erkrankungen des hämatopoetischen Systems und

beim myelodysplastischen und myeloproliferativen Syndrom. Die Gewebe-

penetration erfolgt nur in Rahmen einer Entzündungsreaktion. Trotz einzelner

funktioneller und phänotypischer Eigenschaften, die die humanen basophilen

Granulozyten mit den Mastzellen teilen, wie die Expression von FcεRI und

2 1 Einleitung______________________________________________________________________________

Physiologie der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten 3______________________________________________________________________________

Histaminliberation, sind die humanen basophilen Granulozyten entwicklungsge-

schichtlich, phänotypisch und funktionell eng mit den eosinophilen Granulozyten

verwandt (3).

1.1.1 Morphologie und Ultrastruktur

Die reifen Mastzellen (4, 5, 6) sind runde oder ovale mononukleäre, ca.

12,6-13,5 µm messende Zellen. Deren Cytoplasma ist mit multiplen, im Durch-

schnitt ca. 1000, mit Volumen von 0,3 µm3, basophilen sekretorischen Granula

gefüllt. Der Nucleus ist mit 4-7 µm relativ groß, rund, nicht selten exzentrisch gele-

gen und von den Granula verdeckt. Elektronenmikroskopische Untersuchungen

der Ultrastruktur der Mastzellen zeigen villöse Strukturen auf der Zelloberfläche,

einzelne Mitochondrien, einen schwach ausgeprägten Golgi-Apparat, rauhes

endoplasma-tisches Reticulum, Ribosomen und fibrilläre Strukturen des

Zytoskeletts. Es finden sich cytoplasmatische Filamente und lipidhaltige Körper-

chen (lipid bodies), deren Funktion die Synthese der Arachidonsäuremetaboliten

ist. Die sekretorischen Granula sind mit der Zellmembran verbunden und enthal-

ten verschiedene Ultrastrukturen wie �scrolls�, Kristalle und Partikel oder eine Kom-

bination dieser drei Strukturen. Die für die Sekretionsgranula der basophilen

Granulozyten typischen Charcot-Leyden-Kristalle (CLC) finden sich nicht. Die

Granula der Mastzellen speichern die präformierten Mediatoren (s. Kap. 1.1.1.2),

die in Rahmen der Degranulation nach der Aktivierung der Zelle freigesetzt wer-

den. Es konnten zwei Typen der Degranulation für Mastzellen und basophile

Granulozyten gezeigt werden: 1. die schrittweise verlaufende Degranulation

(piecemeal degranulation) mit typischen Zeichen der leeren bzw. halbleeren Granula

ohne Verschmelzung miteinander oder mit der Zellmembran und mit Verbleib der

entleerten Granula im Cytoplasma (7) sowie 2. die anaphylaktische Degranulation

mit konfluierenden Granula, Exocytose und Entleerung der Riesengranula durch

Verschmelzung mit der Zellmembran (8). Die immuncytochemischen Untersuchun-

gen von Irani et al. (9) zeigten das Vorhandensein zweier unterschiedlicher Phä-

notypen der humanen Mastzellen, die abhängig von ihrem Gehalt an neutralen

Proteasen MCT und MC

TC genannt werden. Die MC

TC-Mastzellen enthalten die

Tryptase und die Chymase und machen die Mehrheit der Mastzellenpopulation

der Haut, der Synovia, des Herzens, der intestinalen Submukosa und 10 % der

Mastzellen der Lunge aus. Die MCT -Mastzellen enthalten nur die Tryptase, sind

vorwiegend in der intestinalen Mucosa anzutreffen und machen ca. 90% der pul-

monalen Mastzellenpopulation aus. Bei den beiden Subpopulationen finden sich

die Unterschiede beim Auftreten bei bestimmten Krankheitsbildern und Hinweise

auf die Unterschiede in dem Satz ihrer Zytokine, was die Annahme der divergie-

renden funktionellen Bedeutung als berechtigt erscheinen läßt. Die MCT -Mast-

zellen scheinen primär in die Abwehrfunktionen des Organismus eingebunden zu

sein. Ihre Anzahl ist um die Zentren der Proliferation der Th2-Lymphozyten sowie

Abbildung 1 Humane Mastzelle der Haut. Aus: Dvorak A.M. (1997) �New aspects of mast cellbiology.�Int.Arch.Allergy Immunol., 114, 1-9

4 1 Einleitung______________________________________________________________________________

bei allergischen und parasitären Erkrankungen erhöht und bei Patienten mit ange-

borenen und erworbenen Immundefektsyndromen (congenital and acquired

immunodeficiency syndrome) erniedrigt (10). Die MCTC

-Mastzellen scheinen für

die Angiogenese und die Geweberemodelierung verantwortlich zu sein. Sie finden

sich in erhöhter Anzahl nur bei fibrotischen nicht jedoch bei allergischen und para-

sitären Erkrankungen. Auch die Oberflächenrezeptoren dieser beiden

Subpopulationen weisen einige Unterschiede auf. Da die beiden Subtypen FcεRI

exprimieren, sind sie verständlicherweise in der Lage an allen IgE-vermittelten

Reaktionen teilzunehmen.

Lichtmikroskopisch (11) präsentieren sich die basophilen Granulozyten als

mittelgroße, polymorphe, runde Zellen mit einem Durchmesser von 10-18 µm. Ihr

Kern ist vielgestaltig entweder monolobulär oder bi -bzw. multilobulär, teilweise

eingestülpt mit grober Chromatinstruktur. In der panoptischen Färbung nach

Pappenheim imponiert diese als rotviolet. Das Cytoplasma der basophilen

Granulozyten, da oxyphil, färbt sich rosa. In dem Cytoplasma finden sich multiple,

unterschiedlich große, kugelförmige, basophile also blauviolet gefärbte Granula,

die über dem Zellkern liegen. An der Zelloberfläche finden sich unregelmäßige

Membranfortsätze. Elektronenmikroskopisch stellen sich die basophilen Granula

mit einem Durchmesser von 0,2-1,2 µm als eine Ansammlung von feinen Parti-

keln von einer zweischichtigen Membran umgeben mit unterschiedlich

elektronendichten Einlagerungen dar. Diese Granula enthalten präformierte Media-

toren. Die Charcot-Leyden-Kristalle können manchmal detektiert werden, sind aber

für diese Zellpopulation, da auch in eosinophilen und basophilen Myelozyten an-

zutreffen, nicht spezifisch. Die Zellen enthalten Mitochondrien und cytoplasmatische

glykogenhaltige Vesikel. Der Golgi-Apparat und das endoplasmatische Reticulum

treten nicht besonders prominent auf. Die Degranulationsmechanismen mit

�piecemeal degranulation� und �anaphylactic degranulation� entsprechen denen

der Mastzellen.


1.1.2 Mediatoren

Eine Aktivierung der humanen Mastzellen führt über die Kreuzvernetzung

der hochaffinen Immunglobulin-E Rezeptoren (FcεRI´s) zur Degranulation und Frei-

setzung der metabolisch aktiven Mediatoren. Mediatoren sind hormonähnliche

Wirkstoffe, die durch verschiedene Zellen bzw. Gewebe produziert und im Rah-

men der physiologischen und pathologischen Reaktionen sezerniert und auf cha-

rakteristische Weise entweder in der Nähe oder entfernt ihrer Bildungsstätte wirk-

sam werden (12). Die von Mastzellen synthetisierten Mediatoren können in

präformierte Mediatoren der sekretorischen Granula, nach der Aktivation de-novo

synthetisierte Lipidmediatoren und Zytokine aufgeteilt werden.

Die basophilen Granulozyten so wie die Mastzellen reagieren auf die Akti-

vierung via Kreuzvernetzung der FcεRI´s mit Degranulation und Liberation der

präformierten Mediatoren, de-novo Synthese und Freisetzung der Lipidmediatoren

und Zytokine. Trotz der vielfachen Ähnlichkeiten der beiden Populationen zeich-

nen sich die grundlegenden Unterschiede ab.

Die Gruppe der präformierten Mediatoren umfaßt Histamin, Proteoglykane,

neutrale Serinproteasen, Sulphatasen und Exoglykosidasen.

Histamin (4-(2�-Aminoäthyl)-Imidazol) ist das einzige von humanen Mast-

zellen produzierte biogene Amin (13), das die besondere und herausragende

Funktion dieser Zellen bei den inflammatorischen Reaktionen mitdefiniert. Das

durch die Decarboxylierung der Aminosäure Histidin im Golgi-Apparat entstehen-

des Histamin wird als Komplex mit Carboxilgruppen der Seitenketten der

Proteoglykane und Proteine in den sekretorischen Granula gespeichert. Das do-

minierende Proteoglykan der humanen Mastzellen ist zu 75 % das Heparin. Das

Histamin wird im geringerem Grade auch an ein anderes Proteoglykan

Chondroitinsulphat E gebunden. Die Bindung an die Proteoglykane beeinflußt die

Freisetzungsgeschwindigkeit des Histamins und der Proteasen. Die Proteoglykane

stabilisieren das Histamin sowie weitere Mediatoren wie neutrale Proteasen und

saure Hydrolasen. Sie entfalten selbständige Wirkungen wie Inhibition der Kom-

plement- und Kallikreinkaskade, Antikoagulation und Verstärkung der Bindung

zwischen dem Kollagen und Fibronectin. Der Gehalt an Histamin in den Mast-

zellen variiert abhängig vom Ort ihres Vorkommens zwischen 1-3 pg / Zelle

6 1 Einleitung______________________________________________________________________________


(Mastzellen der Mucosa) bis 3-8 pg / Zelle (Mastzellen der Lunge, Haut, des lym-

phatischen Gewebes und des Intestitiums). Nach der Freisetzung entfaltet das

Histamin über spezifische H1, H

2, H

3 und H

ic-Rezeptoren seine mannigfaltige

Wirkung. Via H1-Rezeptor kommt es u.a. zur Dilatation und Erhöhung der Gefäß-

permeabilität, Kontraktion der glatten Muskulatur besonders des Respiration- und

Gastrointestinaltraktes. Über H2-Rezeptor wird die zytotoxische Wirkung der Lym-

phozyten, Mediatorenfreisetzung und Rezeptorenexpression der Granulozyten

erhöht. Die Aktivierung der H3-Rezeptoren bewirkt die Freisetzung von PGI

2 durch

die Endothelzellen u.a.. Hic ist ein intrazellulärer Histamin-Rezeptor mit Wirkung

der Promotion der Zellproliferation und des Wachstums. Da das Histamin in vivo

durch Histamin-N-Methyltransferase und Diaminoxidase (Histaminase) relativ

schnell (1-2 Min.) degradiert wird, erscheint die Wirkung des Histamins auf den

direkten Ort seiner Sekretion beschränkt zu sein.

Die Gruppe der neutralen Proteasen umfaßt die Tryptase, Chymase und

Carboxypeptidase B.

Die Tryptase ist eine tetramerische Trypsin-ähnliche Serinprotease mit ei-

nem MG von ca. 130 kD. Tryptase aktiviert die Kollagenase und Urokinase, be-

sitzt die Kallikreinartige Aktivität der Degradation der Matrixproteine wie Fibronectin

und Kollagen Typ VI, stimuliert die Freisetzung von IL-8 und ist mitogen für

Fibroblasten, Epithelzellen und glatte Muskelzellen der Trachea. Die weiteren wich-

tigen Funktionen der Tryptase sind die Spaltung des Komplementfaktors C3 in

C3b und C3a, die chemotaktische Wirkung auf eosinophile und neutrophile

Granulozyten, die Induktion der Synthese von Kollagen I durch die Lungenfibro-

blasten sowie zusammen mit Heparin die Biodegradation von C3a und

bronchodilatatorischen Peptide zu inaktiven Peptide (14). Die zwei Formen der

Tryptase, α-Tryptase und β-Tryptase, sind Produkte der Transkription zweier

unterschiedlicher Gene. Die α-Tryptase wird konstitutionell sezerniert. Ihre

intravasale Konzentration spiegelt die Anzahl der Mastzellen des Organismus wie-

der. Die β-Tryptase wird in den sekretorischen Granula gespeichert und ihre

intravasale Konzentration korreliert mit dem Grad der Aktivierung der Mastzellen

(15). Die Chymase ist eine monomerische Chymotrypsin-ähnliche Protease, die

Prokollagenase und Gelatinase aktiviert, IL-4 degradiert und für die Konversion

von IL-1 zu IL-1β und Angiotensin I zu Angiotensin II verantwortlich ist (16). Die

weiteren wichtigen Funktionen sind die Biodegradation von Kollagen Typ IV und

Aufschließen der dermal-epidermalen Verbindungen (junctions). Die Carboxy-

peptidase B ist eine 35 kDa Metalloprotease, die für die Entfernung der

carboxyterminalen Residuen der zahlreichen Proteine wie Angiotensin, Leu-

Enkephalin, Neuromedin und Neurotensin zuständig ist und mit dem Phänotypus

MCT der Mastzellen assoziiert ist. Sowohl Tryptase wie Chymase und

Carboxypeptidase B sind in den sekretorischen Granula als Komplexverbindun-

gen mit Heparin enthalten und werden nach der Aktivierung der Zelle freigesetzt.

Die neutrale Protease Cathepsin G wird in MCT-Mastzellen gefunden. Die maturen

Mastzellen enthalten in ihren sekretorischen Granula eine Anzahl der Hydrolasen

wie β-Hexosaminidase, β-Glukuronidase, β-D-Galaktosidase und Arylsulphatase,

die gleichzeitig mit Histamin bei der Degranulation freigesetzt werden.

Histamin ist der wichtigste präformierte Mediator der basophilen Granulozyten

(17). Es wird durch die Decarboxylierung des Histidins im Golgi-Apparat synthe-

tisiert und an das Proteoglykan Chondroitinsulfat A gebunden und in sekretori-

schen Granulae gespeichert. Chondroitinsulfat A weist strukturelle Verwandschaft

mit Chondroitinsulfat E der Mastzellen auf und seine Wirkung ist mit der des

Heparins identisch jedoch schwächer ausgeprägt. Der Gehalt an neutralen

Serinproteasen unterscheidet die basophilen Granulozyten eindeutig von den

Mastzellen. Die Chymase und die Carboxypeptidase werden von basophilen

Granulozyten nicht synthetisiert, die Tryptase nur in kleinsten, kaum detektierbaren

Mengen.

Weitere wichtige Gruppe der Mediatoren der Mastzellen sind die Metaboliten der

Arachidonsäure (Lipidmediatoren).

Im Gegensatz zu den präformierten Mediatoren werden die Lipidmediatoren

erst nach der Aktivierung der Mastzellen via FcεRI oder durch Zytokine de-novo

synthetisiert und freigesetzt. Mindestens zwei Phospholipasen A2 (PLA

2) sind für

die Mobilisierung von Arachidonsäure in Mastzellen verantwortlich (18).

Cytosolische Phospholipase A2 (cPLA

2) wird durch FcεRI-vermittelten Anstieg

der ([Ca²+]i) aktiviert. Nach der dadurch bedingten Translokation zur Kernmembran

generiert sie freie Arachidonsäure, die überwiegend zur Leukotriensynthese ver

8 1 Einleitung______________________________________________________________________________


wendet wird. Die sekretorische Phospholipase A2 (sPLA

2) lagert in Granulaeund

wird nach der Aktivierung der Zelle via FcεRI oder durch Zytokine freigesetzt. Die

sekretorische Phospholipase A2 ist ein nicht Arachidonsäure-spezifisches En-

zym, das neben der Hydrolyse der Phospholipiden, wie Phosphatydilcholin der

äußeren Zellmembran, zu Arachidonsäure eine Mediatorenrolle zu erfüllen scheint.

Durch sPLA2 generierte Arachidonsäure wird vorwiegend zur Prostanoiden-

synthese verwendet.

Arachidonsäure ist ein Substrat für die 5-Lipooxygenase (5-LO) und zwei

Isoenzymen der Cyclooxygenase COX-1 und COX-2. Die 5-LO ist ein mikrosomales

Enzym, das nach der Zellaktivierung an die Zellkernmembran transloziert und an

ein 18 kDa Protein (FLAP, 5-lipooxygenase activating protein) bindet (19).

Abbildung 2 Schema der Synthese der Lipidmetaboliten in humanen Mastzellen. Aus: Marone G., Casolano

V., Patella V., Florio G., Triggiani M. (1997) �Molecular and cellular biology of mast cell and basophil.�, Int.

Arch. Allergy Immunol., 114, 207-217

Antigen

Lysophospholipide

AAAA

LTC4

LTA4 LTA4

LTC4

AA

ProstaglandineThromboxane

ProstaglandineThromboxaneZellkern

FLAP

sekretorischesPLA2

cytosolischesPLA2

5-LO

COX-1

COX-2COX-2mRNA

endoplasmatischesReticulum

FLAP ist ein integrales Protein der perinuklearen Membran und stabilisiert die

Bindung von 5-LO, cPLA2 und Leukotriene an der Zellkernmembran. 5-LO gene-

riert über Hydroperoxyeicosatetraenoiksäure (5-HPETE) LTA4, aus dem durch en-

zymatische Kopplung mit reduziertem Glutathion durch LTC4-Synthase LTC

4 ent-

steht. Intrazelluläres LTC4 wird über einen Carrier extracellulär transportiert und

konvertiert zu LTD4 und LTE

4. LTC

4, LTD

4 und LTE

4 wurden früher unter dem Be-

griff �slow reacting substances of anaphylaxis� zusammengefaßt. Kleine Mengen

von LTA4 werden von cytosolischen LTA

4-Hydrolase zu LTB

4 konvertiert. Das

Lysophospholipid, das nach der Hydrolyse von der Arachidonsäure aus dem 1-O-

Alkyl-2-azyl-sn-glyzeryl-3-phosphorylcholin entsteht, wird nach der Azetylierung

zum PAF (platelet actvating factor). PAF induziert die Aggregation und Degranulation

der Thrombozyten, erhöht den Luftwegenwiderstand und führt zur systemischen

Hypotension, was eine Rolle von PAF als Mediator in der systemischen Anaphyla-

xie impliziert. Die beiden Isoenzyme der Cyclooxygenase sind in den Mastzellen

präsent. COX-1 ist die stabile konstitutionelle Isoform, die in den meisten huma-

nen Zellen präsent ist. Die andere Isoform, COX-2, wird nur von aktivierten

Entzündungszellen einschließlich der Mastzellen und basophilen Granulozyten

exprimiert. COX-1 scheint für die IgE-induzierte-, COX-2 für die Zytokine-induzier-

te Synthese der Prostanoide verantwortlich zu sein. Die Cyklooxygenasen kon-

vertieren die Arachidonsäure sequentiell zu intermediären Metaboliten PGG2 und

PGH2. Das letzte wird durch Glutathion-abhängige PGD

2-Synthase in PGD

2 über-

führt. Die Sekretion der Leukotriene und Prostaglandine konnte als abhängig von

der Lokalisation der Mastzellen gezeigt werden. Die Mastzellen der Lunge, des

Herzens und der Mucosae sezernieren PGD2 und LTC

4, die der Haut PGD

2 und

sehr geringe Mengen oder kein LTC4. Alle Mastzellen sezernieren kleine Mengen

an LTB4 und LTA

4, das möglicherweise die Leukotrienensynthese in den

inflamatorischen Loci dadurch verstärkt, daß Endothelzellen und Thrombozyten

über eine LTC4-Synthase verfügen, die LTA

4 direkt zu LTC

4 konvertiert. Die Wir-

kung der Leukotriene LTC4, LTD

4 und LTE

4 gleicht der des Histamins über H

1-

Rezeptoren, ist jedoch wesentlich potenter. Sie induzieren eine prolongierte

Bronchokonstriktion (ca. 10-1000 Mal potenter als Histamin), erhöhen die Gefäß-

permeabilität, induzieren die Konstriktion der arteriellen, arteriolären und der

10 1 Einleitung______________________________________________________________________________


intestinalen, glatten Muskulatur. PGD2 entfaltet über ihren spezifischen DP-Re-

zeptor bzw. Thromboxan-Rezeptor sehr vielfältige Wirkung u.a. inhibiert sie die

Thrombozytenaggregation, verursacht die Kontraktion der glatten Muskulatur des

Respiration- und Gastrointestinaltraktes sowie der Gefäße, ist chemotaktisch für

die neutrophilen Granulozyten vergrößert die Gefäßpermeabilität, was zum ge-

steigerten Einfluß der Serumproteine wie Komplementfaktoren, Immunglobuline

etc. in das Gewebe führt, und verstärkt die von LTD4 vermittelte Neutrophilie. Dar-

über hinaus verursacht LTB4 die Adhäsion der Leukozyten an den Endothelzellen

mit nachfolgender Migration der ersten in die Gewebe.

Die Synthese der Metaboliten der Arachidonsäure wird in basophilen

Granulozyten ähnlich wie unter Kap. 1.1.1.2 beschrieben, initiiert. Im Gegensatz

zu den Mastzellen produzieren die basophilen Granulozyten keine nennenswer-

ten Mengen an Prostanoiden. Der Hauptlipidmediator ist Leukotrien LTC4, das

nur nach der Aktivation der Zelle via FcεRI de-novo in großen Mengen syntheti-

siert wird.

Zytokine sind Proteine oder Glykoproteine, die von Lymphozyten syntheti-

siert und sezerniert werden und andere Zellen aktivieren oder ihre Funktion beein-

flussen (20).

Die humanen Mastzellen generieren eine Reihe von proinflammatorischen

wie immunmodulierenden Zytokine (21). Für diese Zellpopulation konnte entwe-

der auf mRNA- oder Proteinebene die Synthese von Interleukine IL-1, IL-3, IL-4,

IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13 und IL-16 sowie von GM-CSF, TNF-α und

Chemokine wie MIP-1α und MIP-1β (macrophage inflammatory protein) nachge-

wiesen werden. Auch ein Unterschied im Repertoire der sezernierten Zytokine

zwischen den MCTC

und MCT-Subpopulationen der humanen Mastzellen konnte

demonstriert werden. So wird das IL-4 vorwiegend von MCTC

sezerniert und IL-5

und IL-6 fast ausschließlich von MCT-Subpopulation synthetisiert (22).

Die Wirkung der einzelnen Interleukine ist pleiotrop und unterliegt den man-

nigfachen Wechselwirkungen der verschiedenen Zellpopulationen, so daß das

Wissen über einzelne durch sie ausgelöste Aktionen weiterhin noch lückenhaft ist

und die in vitro gewonnenen Erkenntnisse nicht ohne weiteres auf in vivo Verhält-

nisse übertragen werden können. Um so mehr müssen die in vitro gewonnenen

.

Informationen als einzelne Facetten eines komplizierten Netzwerkes aus verschie-

denen Mediatoren und Zellpopulationen angesehen werden.

Das Interleukin-1 kann die Expression der Adhäsionrezeptoren verstärken.

Es induziert die Synthese der anderen Interleukine (IL-2, IL-6, IL-8) und Zytokine

und verstärkt zusammen mit IL-6 die Aktivierung der T-Lymphozyten. IL-1 indu-

ziert die Proliferation der mesenchymalen Zellen. Das Interleukin-2 ist ein essen-

tieller Wachstumsfaktor, Chemoattraktant und Induktor der Produktion von IL-5

für die T-Zellen. Das Interleukin-3 wurde als das wichtigste Interleukin für das

Wachstum, Entwicklung und Aktivierung der Mastzellen identifiziert. Darüber hin-

aus ist es notwendig für die lokale Proliferation dieser Zellpopulation und der

eosinophilen Granulozyten. Das Interleukin-4, das seine funktionellen Eigenschaften

weitgehend mit Interleukin-13 teilt, ist essentiell für die Induktion der Umschaltung

(switching) der B-Lymphozyten zu den IgE produzierenden Isotypen. Die Ent-

wicklung und Wachstum der Th2-Lymphozyten aus den Th0-Lymphozyten sowie

Induktion der Adhäsionsmoleküle an den Endothelzellen, wie z.B. VCAM-1 (vascular

cell adhesion molecule-1) werden von diesen Interleukinen gesteuert. Das

Interleukin-5 zeigt einen starken regulatorischen Effekt auf die Eosinophilopoese,

Differenzierung, Aktivierung sowie lokale gewebeständige Proliferation der

eosinophilen Granulozyten. Das Interleukin-6 induziert die Differenzierung der B-

Lymphozyten, Aktivierung der T-Lymphozyten und wirkt als Kopromotor der IgE-

Produktion. Das Interleukin-8 wirkt als ein potenter Aktivator und Chemoattraktant

für die neutrophilen Granulozyten. Das Interleukin-10 kann in vitro die Aktivität der

Thymozyten, Mastzellen und B-Lymphozyten stimulieren. Eine Inhibition der

Zytokinproduktion durch die Makrophagen, eosinophile und neutrophile

Granulozyten und Th1-Lymphozyten konnte demonstriert werden. Die Anwesen-

heit des Interleukins-12 zusammen mit IL-4 induziert die Entwicklung der Th2-

Lymphozyten. Die Rolle des Interleukins-13 ist der IL-4 ähnlich. Es stimuliert die

B-Lymphozyten, wirkt bei der Isotypenumschaltung der B-Lymphozyten und be-

günstigt die Transformation der Monozyten zu den dendritischen Zellen. Über

eine weitgehende Homologie der IL-4 und IL-13 Rezeptoren wird spekuliert. Die

IL-4 und IL-13 und der lösliche Ligand des CD40-Rezeptors (CD40L), die die

Produktion von Immunglobulin E durch die B-Lymphozyten induzieren, werden

12 1 Einleitung______________________________________________________________________________

sowohl von humanen Mastzellen wie auch basophilen Granulozyten sezerniert

(23). Humane Mastzellen sind bis dato die einzige bekannte Zellpopulation, die

konstitutionell d.h. vor jeglicher Aktivierung TNF-α synthetisiert und sezerniert.

Das TNF-α wird als Schlüsselzytokin der allergischen Reaktionen und der anti-

bakteriellen Abwehr bezeichnet wird. Es ist für das Priming der Leukozyten und

dadurch für die de novo Synthese der Zytokine sowie für die verstärkte Sekretion

der endothelialen und epithelialen Adhäsionsmoleküle und Chemokine verant-

wortlich. Die regulatorische Rolle scheint über das Initiieren der Dissoziation von

NF-κB, die auch IL-5 und GM-CSF verursachen, bedingt zu sein (24). Darüber

hinaus konnte neulich in den Granula der Mastzellen SCF (stem cell factor) nach-

gewiesen werden, was für den autokrinen Charakter dieses Mediatores, der eine

essentielle Rolle in dem Wachstum und der Differenzierung spielt und als che-

motaktischer Faktor der Mastzellen identifiziert werden konnte (weiter s. Kap.

1.2), spricht.


Abbildung 3 Biologische Effekte der Mediatoren, Proteasen und Zytokinen der Mastzellen. Aus ChurchM.K., Levi-Schaffer F. (1997) �Updates on cells and cytokines: the human mast cell.�, J. All. Clin. Immunol..,99,155-160.

Die Zytokine-Produktion der humanen basophilen Granulozyten unterschei-

det sich von deren der Mastzellen. Die herausragende Rolle spielen Interleukin-4

und Interleukin-13, die nur von dieser Zellpopulation konstitutionell exprimiert wer-

den. IL-4 und IL-13 konnten sicher in ruhenden, nicht aktivierten wie in via FcεRI

aktivierten Zellen in granulären Strukturen nachgewiesen werden (25, 26). Inter-

essanterweise konnte für diese Zellen weder eine andere Zytokine-mRNA noch

der Nachweis eines anderen Zytokine auf der Proteinebene gezeigt werden. Es

werden keine weitere Zytokine, die dem Th1 oder Th2-Phänotyp entsprechen,

exprimiert. Die IL-4 und IL-13 besitzen die Fähigkeit, Th-2-Immunantwort zu indu-

zieren und zu verstärken. Die Th-2-Immunantwort ist eine Immunantwort, die über-

wiegend durch Aktivierung der Th2 Population der T-Helfer Lymphozyten gekenn-

zeichnet ist. Die Lymphokine der Th2-Lymphozyten wie IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10,

IL-13 nicht aber IL-2, IL-12 und INFγ der Th1-Population werden bevorzugt in

entzündlichen Infiltraten der allergischen Reaktionen gefunden und sind wichtige

Modulatoren der Funktion der eosinophilen und basophilen Granulozyten. Es wird

angenommen, daß eine Th-2-Immunantwort typischerweise einen Entzündungs-

typ initiiert, der dem der allergischen Entzündung entspricht, während die Th-1-

Immunantwort eher zum Typ der pyogenen Entzündung mit neutrophil-monozytärem

Infiltrat führt. Durch die alleinige Sekretion von IL-4 und IL-13 durch die basophilen

Granulozyten wird die Annahme verstärkt, daß diese Zellpopulation eine wichtige

Rolle in der Immunomodulation der Th-2-Immunantwort spielt. Die IL-4 induziert

die erhöhte Expression der Adhäsionsmoleküle wie VCAM-1, was zur gesteiger-

ten selektiven transendothelialen Migration der vielen Zellpopulationen insbeson-

dere der eosinophilen Granulozyten führt. Die weiteren Mediatoren sind CD40L

und Chemokine. Das lösliche Ligand für CD40 Rezeptor (CD40L) wird nach der

Stimulation der basophilen Granulozyten via FcεRI freigesetzt und spielt zusam-

men mit IL-4 und IL-13 eine wichtige Rolle in der Induktion der IgE Produktion von

B-Lymphozyten (s.Kap. 1.1.3) (27).

14 1 Einleitung______________________________________________________________________________

1.1.3 Rezeptoren der Zelloberfläche

An der Oberfläche der Mastzellen und basophilen Granulozyten exprimierte

Moleküle können in: 1. Immunglobulinrezeptoren, 2. Rezeptoren für Wachstums-

und Differenzierungsfaktoren (Zytokinrezeptoren), 3. Rezeptoren für die

Komplementfaktoren 4. Adhäsionsrezeptoren und Erkennungsmoleküle aufgeteilt

werden (28).

Die beiden Populationen exprimieren nur die hochaffinen Rezeptoren für

die Immunglobulin E (FcεRI) aber keine niedrigaffinen (FcεRII/CD23). Die huma-

nen Mastzellen und die basophilen Granulozyten besitzen auch die niedrigaffinen

Rezeptoren für das Immunglobulin G (FcγRII, CD w23). Durch die Kreuzvernetzung

mit dem hochaffinem IgE Rezeptor (FcεRI) können die Subtypen von FcγRII

(FcγRIIB1 und FcγRIIB2) über ITIM-Sequenz (immunoreceptor tyrosine based

inhibitory motif, eine hochkonservierte Sequenz der elf Aminosäuren, die zwar

strukturell und funktionell ITAMs (Kap. 1.1.5.2) ähnlich ist, aber inhibitorisch auf

die Signalübertragungsmechanismen wirkt) die FcεRI-vermittelte Aktivierung der

Signalübertragungsmechanismen unterbinden (29).

Die humanen Mastzellen exprimieren regelmäßig ein Rezeptor für SCF (stem

cell factor syn. c-kit ligand receptor/mast cell growth factor). SCF ist das essentiel-

le Zytokine für Differenzierung und Wachstum der Mastzellen (siehe Kap. 1.1.4),

induziert die Mediatorensekretion der reifen Zellen, vermutlich auch auf dem

autokrinen Wege. Die über den SCF-Rezeptor vermittelten Signale induzieren bzw.

modulieren die Proliferation, Chemotaxis, Migration und Adhesion der Mastzellen.

Die weiteren Zytokinrezeptoren konnten bis dato nicht detektiert werden.

Auf der Oberfläche der basophilen Granulozyten finden sich funktionelle

Rezeptoren für das Interleukin-3 (30), Interleukin-5 und GM-CSF (granulocyte

monocyte colony stimulating factor, CD 116) (31, 32), die zur Superfamilie der

Rezeptoren der hämatopoetischen Wachstumsfaktoren gehören (hemopoietin

receptor superfamily, HRS). Diese Zytokine regulieren die Differenzierung und

Funktion der humanen basophilen und eosinophilen Granulozyten. Neulich konn-

te auf der Oberfläche der basophilen Granulozytenauch ein CCR3-Chemo-

kinenrezeptor identifiziert werden. Weiterhin konnten die Rezeptoren für die


inhibitorischen Wachstumsfaktoren INF-γ (Interferon-γ CD 119) und TGF-β

(transforming growth factor-β) sowie für das Interleukin-1 (IL-1RII, CD 121b) und

das Interleukin-8 gefunden werden.

Die Komplementfaktoren C3a, C4a, C5a, die früher unter dem Namen

Anaphylotoxine zusammengefasst wurden, induzieren die Mediatorenfreisetzung

aus den basophilen Granulozyten. Auf den humanen Mastzellen der Haut (MCTC

)

konnte ein C5a-Rezeptor (C5aR, CD 88) identifiziert werden. Die Bindung von

C5a an diesem Rezeptor verursacht die Histaminliberation. Die anderen

Mastzellpopulationen exprimieren keine weiteren Rezeptoren für die Komplement-

faktoren. Die humanen basophilen Granulozyten besitzen die folgenden Rezepto-

ren: CR1 (CD35), CR3/C3biR (CD11b), CR4 (CD 11c) und C5aR. Die CR1 und

CR4 binden die Komplementfaktoren C3b/C4b.

Die Gruppe der Erkennungsmoleküle (recognition molecules, RM) setzt sich

aus drei Familien: Integrine, Selektine und Mitglieder der Immunglobulin-Super-

familie (immunoglobulin supergene family) zusammen. Die RM-Mitglieder agieren

miteinander (intracellular recognition) und mit extrazellulären Matrixbestandteilen

(wie Kollagen, Fibronektin, Laminin). Manche spielen eine Rolle bei der Antigen-

präsentation bzw. �erkennung, binden die immunomodulatorischen Faktoren oder

mikrobiellen/viralen Epitope (33). Die Moleküle dieser Gruppen ermöglichen die

Migration der Leukozyten in die Gewebe. Der erste Schritt, die lose Assoziation

der Zellen an das Endothel, bedarf der Anwesenheit der Selektine und ihrer

kohlenhydrathaltigen Liganden. Die basophilen Granulozyten exprimieren das L-

Selektin (CD62L), das GlyCAM-1, CD43 und MAdCAM-1 bindet. Die Mastzellen

besitzen E- und P-Selektin auf ihrer Oberfläche, die an kohlenhydrathaltigem Lewis-

Blutgruppenantigen (CD15) binden. Die engere Adhäsion der Leukozyten an das

Endothel bedarf einer Aktivierung durch die Chemokine . Die darauf folgende Leu-

kozyten-Diapedese scheint durch die β1- und β

2-Integrine sowie Mitglieder der

Immunglobulin-Superfamilie (ICAM-1=intracellular adhesion molecule, VCAM-

1=vascular cell adhesion molecule, PECAM-1=platelet-endothelial cell adhesion

molecule) reguliert zu werden (34). Die Mastzellen exprimieren β1-(VLA=very late

antigen, VLA-4a und VLA-5a mit Liganden Fibronektin und VCAM-1) und β3-

Integrinen (CD41/CD61 mit Liganden Fibrinogen und Fibronektin, CD51/CD61

16 1 Einleitung______________________________________________________________________________

mit dem Ligand Vitronektin) (35). Die basophilen Granulozyten besitzen β1- (VLA-

3 mit Liganden Kollagen und Laminin, VLA-4, VLA-5) und β2-Integrine (LFA-

1=leukocyte function-associated antigen mit Liganden ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3,

Mac-1 mit Liganden C3bi, ICAM-1, p150,95 mit Liganden Fibronektin und C3bi)

(36). Von den Moleküle, die der Immunoglobulin-Superfamilie angehören,

exprimieren die basophilen Granulozyten PECAM-1 sowie ICAM-1, ICAM-2 und

ICAM-3. Die drei letzten binden an LFA-1. Die Mastzellen haben auf ihrer Oberflä-

che ICAM-1.

Die weiteren wichtigen Erkennungsmoleküle, die von den beiden

Zellpopulationen exprimiert werden, sind die MHC-Antigene (major histocompability

complex antigens), die Selbst-Erkennungsmechanismen der interzellulären Inter-

aktionen ermöglichen. MHC-Antigene der Klasse I werden von Mastzellen und

basophilen Granulozyten, MHC-Antigene der Klasse II nur von aktivierten Mast-

zellen exprimiert. Die Mastzellen und basophilen Granulozyten tragen auf ihrer

Zelloberfläche CD40-Ligand, das an CD40 der B-Lymphozyten bindet. Diese Wech-

selwirkung verursacht zusammen mit IL-4 und IL-13 die Induktion der Immun-

globulin E-Synthese in B-Lymphozyten.

1.1.4 Abstammung und Differenzierung

Seit langem wurde auf Grund der morphologischen und funktionellen Ähn-

lichkeiten eine gemeinsame Ontogenese der humanen basophilen Granulozyten

und Mastzellen vermutet. Die zahlreichen Arbeiten von Dvorak et al. (37, 38, 39)

konnten den gemeinsamen Ursprung der basophilen Granulozyten und Mastzellen

von den aus dem Nabelschnurblut isolierten Vorläuferzellen (agranular precursors

cells) beweisen. Die Untersuchungen von Kirshenbaum et al. (40, 41) zeigten die

gemeinsame Abstammung dieser beiden Zellpopulationen von CD 34+ multi-

potenten Stammzellen des Knochenmarkes. Durch die Elimination der Vorläufer-

zellen für die T-Zellen (CD2+), B-Zellen (CD19+ und CD20+), eosinophile

Granulozyten und Makrophagen (CD14+) konnte die Abstammung der Mastzellen

von diesen Zellpopulationen ausgeschlossen werden. Rottem et al. (42) haben

die Vorläuferzellen der Mastzellen als CD34+/FcεRI−-Population identifiziert.


Der hämatopoetische Stem-cell-factor SCF (Ligand des Protoonkogenes

c-kit-Tyrosinkinase) wurde als essentielles Zytokin für die Reifung und den

Differenzierungsprozeß der CD43+/FcεRI −-Zellen zu den reifen humanen Mast-

zellen gefunden (43, 44) und wird synonym auch als MGF (mast cell growth factor)

bezeichnet. Die Rezeptoren für SCF (CD117) konnten identifiziert und isoliert wer-

den (45). Zusammenfassend entwickeln sich die maturen Mastzellen aus den

multipotenten hämatopoetischen Vorläuferzellen (multipotent colony forming

progenitors cells), die primär das Knochenmark besiedeln. Diese verlassen das

Knochenmark und zirkulieren in der Blutbahn als colony forming mast progenitor

cells, die CD43-Antigen sowie SCF (MGF)-Rezeptor auf ihrer Oberfläche

exprimieren und noch kein FcεRI besitzen. Nach der Migration in die Gewebe

differenzieren sie unter dem Einfluß von SCF, der in der membrangebundenen

Form von nativen Fibroblasten (und wahrscheinlich auch von anderen Stroma-

und Endothelzellen) exprimiert wird, in die funktionell reifen Mastzellen. Die her-

anreifenden Mastzellen exprimieren FcεRI und FcγRII/III, bevor die charakterischen

Sekretionsgranula erscheinen und sie morphologisch erkannt werden können. Es

wird angenommen, daß Differenzierung- und Reifungsprozesse auch von den

anderen Zytokine, wie IL-3, moduliert bzw. beeinflußt werden können. Die Vor-

läuferzellen konnten in geringer Anzahl im peripherem Kreislauf insbesondere bei

Patienten mit Mastocytose gefunden werden.

Dieser Entwicklungsmodus konnte von Kitamura et al (46) bei Nagetieren

(Maus, Ratte) untersucht und eindeutig bewiesen werden. Bei den Nagetieren

erscheinen die Vorläufer der Mastzellen während der Embryogenese zuerst im

Dottersack, gefolgt von der Leber. Die Kolonisation der anderen Geweben nimmt

ihren Ausgang in der Leber und die in die Gewebe eingewanderte Vorläuferzellen

bleiben da lebenslang proliferationsfähig, obwohl das Knochenmark die wichtigste

Quelle dieser Zellen für die erwachsenen Tiere repräsentiert. Derartige eindeutige

Beweise konnten für die humanen Mastzellen bis dato noch nicht vollständig er-

bracht werden.

Die basophilen Granulozyten entwickeln sich aus den pluripotenten hämato-

poetischen Stammzellen zu den myelomonozytären Vorläuferzellen. Die Phänotyp-

merkmale dieser beiden Zellformen, die für die basophile Linie der Granulozyto-

18 1 Einleitung______________________________________________________________________________


poese charakteristisch wären, konnten noch nicht identifiziert werden. Die ersten

Vorläuferzellen der basophilen Granulozyten (basophile Myeloblasten), die phä-

notypisch untersucht werden konnten, unterscheiden sich deutlich in der

Rezeptorenausstattung von den Vorläufern der Mastzellen. Auf ihrer Oberfläche

exprimieren sie CD40 und Interleukin-3-Rezeptor jedoch kein Rezeptor für SCF.

Die basophilen Myeloblasten entstammen direkt den myelomonozytären Vorläufer-

zellen. Der Maturationsprozeß vollzieht sich im Knochenmark unter dem essenti-

ellen Einfluß von Interleukin-3 (47). Auch für Interleukin-5 und GM-CSF

(Granulozyten, Monozyten colony stimulating factor), die neben des IL-3 zur Super-

familie der Rezeptoren der hämatopoetischen Wachstumfaktoren gehören, konn-

te in vitro ein Einfluß auf die Differenzierung der Vorläuferzellen der basophilen

Granulozyten demonstriert werden. Diese Tatsache ist auf die gemeinsame βββββ-

Kette der dimerischen Rezeptoren für IL-3, IL-5 und GM-CSF zurückzuführen (48).

Der nächste Schritt der morphologischen Differenzierung nach den basophilen

Myeloblasten ist die Entwicklung zum basophiler Promyelozyt, Myelozyt, jugendli-

chem Granulozyt, stabkernigem und segmentkernigem basophilem Granulozyt,

der die ausdifferenzierte, reife Form darstellt. Im Gegensatz zu den Mastzellen

verlassen erst die maturen segmentkernigen basophilen Granulozyten das Kno-

chenmark und sind in der Blutbahn einzutreffen. Die ersten sekretorischen Granula

treten, noch unreif, im Stadium des Promyelozyten auf.

1.1.5 IgE-Rezeptor mit hoher Affinität

Der hochaffine Rezeptor für Immunglobulin E (FcεRI) gehört zur großen

Familie der Rezeptoren, die an der Oberfläche der Zellen des Immunsystems

exprimiert sind und das Fc-Segment der Immunglobuline binden (multichain

immunrecognition receptors MIRR) (49).

Die Rolle dieser Rezeptoren ist die Bindung der spezifischen Immunglobulin-

Moleküle und über Signalübertragungsmechanismen die Aktivierung der Zellen.

Der hochaffine Immunglobulin E-Rezeptor (FcεRI) tritt in zwei Formen auf. Die

tetramerische Form von FcεRI (αβγ2) wird überwiegend von basophilen

Granulozyten und Mastzellen exprimiert. Seine Anwesenheit definiert die

Effektorrolle dieser Zellpopulationen bei allen IgE-vermittelten Reaktionen. Die

Aktivation der Zellen via FcεRI über die Bindung der Rezeptoren mit Immunglobulin

E-Moleküle, die an einem polyvalentem Antigen gebunden sind, und nachfolgen-

der Kreuzvernetzung der Rezeptoren führt zur Degranulation und konsekutiver

Freisetzung der Mediatoren, Biosynthese und Sekretion von Metaboliten der

Arachidonsäure (wie Leukotriene und Prostanoide) und der Zytokine (s. Kap. 1.1.2).

Im letztem Jahrzehnt konnte die Expression der trimerischen Form von FcεRI

(αγ2) auf den Antigenpräsentierenden Zellen (APC-antigen presenting cells) wie

epidermalen Langerhans�chen Zellen (50), dermalen und peripheren dendritischen

Zellen sowie Monozyten und eosinophilen Granulozyten gezeigt werden. Im Un-

terschied zu den basophilen Granulozyten und Mastzellen fehlt dem FcεRI, der

von APC�s exprimiert wird, die klassische β-Kette. Die Expression des FcεRI er-

möglicht den APC�s die spezifische Antigenaufnahme via Endocytosis. Es wird

angenommen, daß die APC�s mit Zuhilfenahme dieses Mechanismus die weitere

IgE-Synthese über die Rekrutierung der T-Helfer 2 (Th2)-Lymphozyten ankurbeln.

Dadurch erscheint die Rolle der APC�s bei der Initierung der primären Immun-

antwort denkbar (51).

1.1.5.1 Struktur und Verteilung

FcεRI�s erscheinen bereits frühzeitig im Laufe des Reifungprozesses an

der Oberfläche der reifenden Mastzellen und basophilen Granulozyten noch be-

vor in Rahmen der Zelldifferenzierung die typischen sekretorischen Granula auf-

treten und die Zellen noch undifferenziert sind. Die unmittelbaren Vorläufer der

Mastzellen und basophilen Granulozyten, die multipotenten hämatopoetischen Vor-

läuferzellen, exprimieren noch kein FcεRI. Die Transfektionsstudien mit cDNA für

α-, β- und γ-Untereinheiten lassen vermuten, daß die einzelnen Untereinheiten

vor dem Verlassen des prä-Golgi-Apparates, wo sie posttranskriptional modifiziert

werden, zu endständigen Rezeptor-Molekülen gebunden werden. Interessanter-

weise können α- und γ-Untereinheiten in Abwesenheit der β-Untereinheit zum

funktionstüchtigen Rezeptor binden, was am ehesten an die Funktion der β-Un-

tereinheit als Verstärker der Signalintensität zurückzuführen ist. Die FcεRI sind

20 1 Einleitung______________________________________________________________________________

über die gesamte Oberfläche der exprimierenden Zellen verteilt, ein

cytoplasmatisches Depot, der die kompletten Rezeptor-Moleküle enthält, wurde

nicht identifiziert. Die Rezeptormoleküle sind, vor IgE-Bindung, innerhalb der Zell-

membran hoch mobil und frei beweglich. Ihre Anzahl beträgt zwischen 103 und

106 pro Zelle und wird in vivo über den IgE -Spiegel reziprok reguliert.

Der FcεRI ist ein tetramerischer Komplex aus einer α-Kette (FcRα), einer

β-Kette (FcRβ) und einem Dimer aus zwei identischen γ-Ketten (FcRγ). Der FcεRI

ist in der Zellmembran eingebettet und kreuzt diese insgesamt sieben Mal (52)

Die α-Kette besteht aus einem langen extracellulären Segment, der zwei

Immunglobulin E-bindende Domänen enthält, aus einem einzelnen kurzen trans-

membranösen Teil sowie aus einem relativ kurzen cytoplasmatischen Abschnitt.

Anhand der Analyse vom komplementären DNA wurde die Länge der α-Kette auf

260 Aminosäuren bestimmt. Das extrazelluläre Segment mißt ca. 180 Aminosäu-

ren, auf die IgE-bindenden Domänen entfallen 40 resp. 42 Aminosäuren. Diese

werden von jeweils zwei Cystein-Moleküle, die über Disulfidbrücken verbunden

sind, geformt. Das Molekulargewicht der α-Kette beträgt ca. 55 kd (45-65 kDa).

Sie ist glykolisiert, wahrscheinlich um dieses Polypeptid vor einem Angriff der Se-

rumproteasen zu schützen. Insgesamt finden sich sechs Aminosäuren, die N-

glykolisiert werden. Das Immunglobulin E bindet an der α-Kette des FcεRI mit

seinem Fc Fragment. Durch Lyse mit Papain entstehendes Fc Fragment enthält

die Cε2, Cε3 und Cε4-Domänen. Trotz zahlreicher Untersuchungen mit

monoklonalen Antikörpern, die gegen die einzelnen Epitope der Domänen des Fc-

Fragmentes gerichtet sind, ist es leider noch nicht eindeutig gelungen, die spezifi-

schen Domänen, die direkt mit der α-Kette eine Bindung eingehen, zu identifizie-

ren. Es gibt jedoch deutliche Hinweise auf die besondere Rolle der N-terminalen

Region der Cε3 Domäne für die Bindung an FcεRα (53).

Die einzelne β-Kette (MW 33 Kd) kreuzt die Zellmembran insgesamt vier

Mal, ihre N- und C-terminalen Kettenenden befinden sich intracytoplasmatisch.

Die β-Kette besteht aus 244 Aminosäuren und ist im Gegensatz zu der α-Kette

nicht glykolisiert. Die β-Kette besteht aus zwei Untereinheiten, die durch die

Proteolyse separiert werden können. Die β1-Untereinheit ist mit der Zellmem-

bran assoziiert, die β2-Untereinheit ist ein phosphoryliertes Polypeptid mit MW


Die beiden über eine Disulfidbrücke verbundenen γ-Ketten (MW jeweils 9

kD) bilden ein Dimer und besitzen jeweils einen sehr kurzen extraplasmatischen

Anteil, ein einzelnes transmembranöses Segment und einen langen cytoplasma-

tischen Anteil. Die Länge einer γ-Kette beträgt 68 Aminosäuren. Die Disulphidbrücke

besteht zwischen den intramembranös liegenden Anteilen der γ-Ketten, den

Cysteinresten (Cys7-Cys7). Die γ-Kette kann an vier Threonin-Residuen

phosphoryliert werden. Es konnte eine hochgradige Homologie zwischen den Genen

für die γ-Kette und ζ-Kette des T-Lymphocyten Rezeptors (TCR) gezeigt werden,

die die Entstehung der beiden Gene durch Duplikation vermuten läßt. Die γ-Kette

ist mit FcγRIIIa der Makrophagen und mit dem humanen CD16- FcγRIIIAaassoziiert.

Möglicherweise erfüllen die γ-Untereinheiten dieser Rezeptoren und die homologe

22 1 Einleitung______________________________________________________________________________

Fc RIe a

Fc RIe g Fc RIe b

Syk p56Lyn

SH2

SH2

SH3

SH3P

P

P

S

S

S

S

von 9-10 kDa und repräsentiert den cytoplasmatischen Anteil der β-Kette. Die β-

Kette gehört der Familie der CD20-Moleküle und ist für FcεRI spezifisch.

Abbildung 4 Struktur des hochaffinen IgE Rezeptors (FcεRI). Aus: Xu Y., Potter J. W., Willmann C. L.

(1996), �The function of src family tyrosine kinases in hematopoietic cells.� Leukemia Research, 20, 229-234

ζ-Kette der TCR eine sehr ähnliche, wenn nicht sogar identische Rolle in Rahmen

der Signalübertragungsmechanismen. FcRIβ und FcRIγ besitzen sog. ITAMs (s.

Kap. 1.4.3), die für die eigentliche Signalübertragung von essentieller Bedeutung

sind.

1.1.5.2 Interaktionen des humanen IgE-Rezeptors

Der FcεRI (54) bindet mit dem Immunglobulin E-Molekül in 1:1 Stöchiometrie

(55, 56) und folgt wegen des Überschußes an FcεRIs in vivo als pseudomono-

molekuläre Reaktion der Kinetik der Reaktion der ersten Ordnung.

IgE + FcεRI ⇔ IgE-FcεRI

Die Bindungkonstante Ka ist mit 109-1010 M-1 sehr hoch (57) und entsprechend ist

die Interaktion sehr spezifisch und kann durch den Überschuß an anderen

Immunoglobuline nicht inhibiert werden. Die Reaktionsgeschwindigkeitskonstante

k1 beträgt 105 M-1s-1, die Geschwindigkeitskonstante k

-1 für die Dissoziation des

Komplexes IgE-FcεRI ist mit 10-5 M-1s-1 sehr klein. Aufgrund dessen ist die Halb-

wertszeit t1/2

der Bindung des Immunglobulins E an den zellulären Rezeptoren mit

20 bis 100 Stunden in vitro sehr lang. In vivo dürfte t1/2

eben noch länger sein, da

intakte IgE-Moleküle nach der Dissoziation von FcεRI die Bindungen mit weiteren

Rezeptoren einhergehen können. Die Interaktionen von monovalenten IgE-

Mölekülen führen zur keinerlei Aktivierung der Signalübertragungsmechanismen

der FcεRI exprimierenden Mastzellen und basophilen Granulozyten. Erst die Kreuz-

vernetzung und die darauffolgende Aggregation der FcεRI´s durch an polyvalentem

Antigen gebundene IgE-Moleküle bzw. bivalente Antikörper gegen FcεRI verursa-

chen wahrscheinlich die strukturellen Konformationsänderungen der Tertiärstruktur

der Untereinheiten des Rezeptors, die zur weiteren, die eigentliche Signal-

übertragung umfassenden Ereignissen führen (s. Kap. 1.4.3). Die Anzahl der Ag-

gregationen (receptor cross-links) zwischen den einzelnen FcεRI, die notwendig

sind, um eine Aktivierung herbeizuführen, wurde mit einigen (ca.20) bis

einigen Tausend (Medianwert ca. 2500) für die basophilen Granulozyten


.

und Maszellen bestimmt (58). Die maximale Freisetzung des Histamins konnte

bei der Aggregation der ca. 10% aller FcεRI gemessen werden. Eine messbare

Antwort kann detektiert werden, wenn ca. 100 Rezeptoren von den ca. 3∗105 pro

Zelle aggregieren (59).

Die Interaktion zwischen dem Antigen, IgE-Moleküle und FcεRIs resultiert in der

Kreuzvernetzung und Aggregation der Rezeptoren an der Zelloberfläche. Nach

ca. 30-60 sec. kommt es zur Formation der kettenartigen Aggregate, die relativ

schnell (t1/2

3-5 Min.), wie das für RBL-Zellen gezeigt werden konnte (60), über

coated pits mitsamt der IgE-Moleküle internalisiert und wahrscheinlich nachfol-

gend degradiert werden.

Die cytoplasmatischen Anteile der FcRβ und FcRγ enthalten sog.

�immunreceptor tyrosine-based activation motifs � (ITAMs früher auch �antigen

recognition activation motif� ARAM genannt). Dieser Begriff bezeichnet hoch-

konservierte Aminosäurensequenzenmotive der Polypeptiden, die regelmäßig in

den cytoplasmatischen Anteilen der Untereinheiten der Antigenrezeptoren der B-

und T-Lymphozyten sowie Rezeptoren des Fc-Regions der Immunoglobuline (wie

FcεRI, FcβRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcαR) detektiert werden können und erstmalig

von Reth (61) beschrieben wurden. Diese Sequenzenmotive wurden als eigentli-

ches morphologisches Korrelat der Signalübertragung identifiziert. Die Versuche

von Romeo et al. und Irving et al. (62, 63, 64) zeigten, daß diese Sequenzen,

wenn isoliert und an die Domänen der Moleküle gebunden, die an sich zu keinerlei

Signalübertragung fähig sind, die Chimärenrezeptoren formen. Diese Chimären-

rezeptoren weisen in der Signalübertragung die Funktionen auf, die mit Funktio-

nen der naturellen Antigenrezeptoren identisch sind. Die ITAMs existieren in einer

oder mehreren Kopien an cytoplasmatischen Anteilen der für die Signalübertragung

verantwortlichen Untereinheiten der Rezeptoren. Jede Kopie besteht aus der Se-

quenz der 26 Aminosäuren D/EX7D/EX

2YX

2L/IX

7YX

2L/I. (Ein-Buchstabe-Code für

die Aminosäuren: D= L-Asparaginsäure, E=L-Glutaminsäure, Y=L-Tyrosin, L=L-

Leucin und I=L-Isoleucin). X bezeichnet die anderen Aminosäuren, die in der ITAM-

Sequenz nicht konserviert sind. Der FceRI besitzt je eine ITAM-Sequenz in den β-

und γ-Ketten also insgesamt drei Sequenzen pro Rezeptor-Tetramer.

Nach der Bindung des spezifischen Antikörpers an die α-Untereinheit des

24 1 Einleitung______________________________________________________________________________

IgE-Rezeptors kommt es über die Aktivierung einer rezeptorständigen Tyrosinkinase

zur raschen und vorübergehenden Phosphorylierung der beiden Tyrosinresten der

ITAM-Sequenzen, was zum Entstehung der temporären Bindungsstellen für die

weitere Tyrosinkinasen führt. Die Phosphorylierung der ITAM-Sequenzen der β-

und γ-Ketten kann bereits 5-15 sec. nach der Aggregation der FcεRI´s detektiert

werden (65, 66). Diese Mechanismen initiieren die weiteren Signalübertragungs-

mechanismen. Die Bindung der Tyrosinkinasen an die ITAM-Sequenzen geschieht

über sog. SH-Domänen der Tyrosinkinasen.

Die Generation der Interaktionen zwischen zwei Proteinen, die für die wei-

tere Übertragung der Information verantwortlich sind, ist ein essentieller Mecha-

nismus der zellulären Signalübertragung. Die an der Signalübertragung unmittel-

bar beteiligten Proteine besitzen eine oder mehrere kleine Domänen, die es erlau-

ben mit ihren Partnern durch die Erkennung der bestimmten Peptidsequenzen ein

Komplex zu bilden. Diese Domänen sind durch die Induktion der Konformations-

veränderungen nach der Bindung an die Partner-Proteine an der Regulation der

eigenen oder dessen enzymatischer Aktivität beteiligt. Von der Bedeutung für die

Signalübertragungsmechanismen der FcεRI´s sind SH2 und SH3 Domänen der

Proteine. Neben dieser existiert noch eine weitere Reihe der Protein-bindenden

Domänen. Die SH2-Domänen bestehen aus einer hochkonservierten Sequenz

von ca. 100 Aminosäuren und binden die Phosphotyrosin-enthaltende Peptide.

Die SH3-Domänen bestehen aus einer Sequenz von ca. 60 Aminosäuren und

binden die Prolinreiche-Peptide (67, 68).

Die Aggregation des tetramerischen FcεRI verursacht über die

Autophosphorylation der Lyn-Proteintyrosinkinase ihre Aktivation (69). Die Lyn-

Proteintyrosinkinase, ein Vertreter der Familie der Src-Proteintyrosinkinasen, bin-

det über ihre SH2-Domäne an der ITAM-Sequenz der β-Kette und ist in der inne-

ren Schicht der Zellmembran über ihr N-terminalen Glycinrest verankert. Der Me-

chanismus dieser Aktivation ist zur Zeit noch unklar, am wahrscheinlichsten er-

scheinen durch die Aggregation des Rezeptors verursachte Konformations-

änderungen für den Vorgang verantwortlich zu sein. Lyn-Tyrosinkinase

phosphoryliert die N-terminalen Tyrosinreste der ITAMs jeder γ-Kette (70). Durch

die Änderungen der Tertiärstruktur der ITAM-Sequenzen der γ-Kette kommt es zur


Bildung der temporären Bindungstellen für die SH2-Domänen und zur Interaktion

mit denen der Proteintyrosinkinase der Syk Familie. Eine effiziente Bindung der

Syk- Proteintyrosinkinase verlangt der Transphosphorylierung der beiden ITAM-

Sequenzen der FcRγ (71). Durch die Bindung wird eine Änderung der Konformation

der Syk Proteintyrosinkinase verursacht, was zur Autophosphorylierung und Akti-

vierung ihrer enzymatischen Aktivität führt. Weitere durch die Aggregation der

FcεRI aktivierten Proteintyrosinkinasen sind Btk- und Emt- Proteintyrosinkinasen

der Tec-Familie, Fer, FAK (fokal adhesion kinase) und MAP-Proteintyrosinkinasen

(mitogen activated protein kinase) (72). Die durch die Aggregation der FcεRI´s

induzierte Tyrosinphosphorylierung wird durch die transmembranösen und

cytoplasmatischen Proteintyrosinphosphatasen wie Proteintyrosinphospatase

CD45 reguliert. Diese dephosphorylieren die ITAM-Sequenzen der FcRβ und FcRγ,

jedoch keine Tyrosin-phosphorylierte Proteintyrosinkinasen Lyn und Syk (73).

Die Syk Proteintyrosinkinase phosphoryliert und aktiviert viele weiteren

Proteine, die SH2-Domänen besitzen. Diese Proteine, wie Phospholipasen

(Phospholipase A2, Phospholipase C-γ1 (74), Phospholipase C-γ2, Phospholipase

D), Phospholipidkinasen, Adaptor-Moleküle und mit dem Cytoskeleton assoziierte

Proteine wie FAK und seine potentiellen Substrate wie Fap (FAK associated

protein) und Paxillin, aktivieren weitere Pfade der zellulären Signalübertragung.

Eine dieser Proteine ist die Phospholipase C-γ1, die polyphosphatidyl-

inositolspezifisch ist und das Entstehen von 1,2-Diazylglyzerol (1,2-DAG) und

Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3) durch Spalten der Membran-Phospholipide wie

Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat (IP2) katalysiert (75). IP

3 aktiviert Proteinkinase

C und führt über die Bindung an einem spezifischen IP3-Rezeptor, der ein Ligand-

aktivierter Ionenkanal der Organellenmembrane ist (76), zur Mobilisierung der

Calciumkationen aus den cytoplasmatischen Depots (vor allem aus dem

endoplasmatischen Reticulum), was wiederum zu Calciumabhängiger Aktivierung

der weiteren Moleküle wie cytoplasmatischer Phospholipase A2

führt. Die

Phospholipase A2 generiert Phospholipide, die wahrscheinlich die Fusion der Mem-

bran der sekretorischen Granula mit der Zellmembran bewirken. Durch die Fusion

der beiden Membranen kommt es zur Degranulation und Freisetzung der

26 1 Einleitung______________________________________________________________________________

präformierten Mediatoren. Phosphoinositol-3-Kinase wird nach der Aggregation

der FcεRI´s aktiviert und katalysiert die Phosphorylierung des Sphingosins in das

Sphingosin-1-Phosphat. Sphingosin-1-Phosphat spielt eventuell eine wichtige

Rolle in der Aktivierung der Freisetzung des Calciums aus den cytoplasmatischen

Depots und konsekutiv in der nachfolgenden Aktivierung des Calciumflusses aus

dem extrazellulären Raum in die Zelle.

Die Aggregation der FcεRI´s aktiviert über den Austauschfaktor Sos, der

an die Adaptor-Proteine Grb2 bindet, den Ras-Pfad der Signalübertragung. Das

Grb2 wird nach der FcεRI -vermittelten Phosphorylierung der Shc-Proteintyrosin-

kinase aktiviert. Ras phosphoryliert Raf1, das die MEK-Kinasen phosphoryliert,

die wiederum die MAP-Kinasen phosphorylieren. Die Translokation der MAP-

Kinasen ins Innere des Zellkerns führt zur Aktivierung der Transkriptionsfaktoren

und dadurch zur Expression der Genprodukte wie Interleukine.

Mannigfache Untersuchungen zeigen eine FcεRI-vermittelte Induktion der

Zytokinproduktion. Die Arbeitsgruppe von Marone et al. (77) konnte ein NFAT-1

immunreaktives Protein (nuclear factor of activated T cells) detektieren. NFAT-1

ist in die Regulation der mRNA-Transkription der meisten von den humanen Mast-

zellen und basophilen Granulozyten sezernierten Zytokine (IL-3, IL-4, IL-5, GM-

CSF, TNF-α und vielleicht IL-13) involviert.

Viele anderen Moleküle werden konstitutionell phosphoryliert und dieser

Prozeß wird durch die Aggregation der FcεRI nicht verstärkt. Dazu gehören zahl-

reiche an der Adaptor-Moleküle Grb2 bindenden Proteine wie Sos, ein Nukleotiden-

Austauschfaktor,der an der SH3-Domäne der Grb2 bindet und Shc, das an der

SH2-Domäne der Grb2 bindet.

Es konnte gezeigt werden, daß FcRγ für die eigentliche Signalübertragung

verantwortlich ist, wo FcRβ als ein Verstärker des Signals fungiert. Die FcRβ-

Untereinheit besitzt im Gegensatz zu FcRγ keine Fähigkeit die Zellaktivierungs-

vorgänge zu initiieren. Die Intensität des Signals gemessen anhand der Aktivie-

rung der Syk-Tyrosinkinase und des Anstieges der intrazellulären Calcium-

konzentration wird um den Faktor 5-7 verstärkt. Der Mechanismus der Amplifika-

tion des Signals involviert die ITAM-Sequenz der FcRβ-Untereinheit. Diese fun-

giert als eine Art Anker für Lyn-Tyrosinkinase und verstärkt dadurch die Lyn-


abhängige Phosphorylationvon FcRγ verstärkt. Phosphorylation von FcRγ führt

wiederum zu verstärkten Aktivation der Syk-Tyrosinkinase und verstärkten Mobi-

lisation der Calciumionen aus den cytoplasmatischen Depots und somit zur Erhö-

hung der Intensität des Signals (78).

1.2 Agonisten der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten

Die Mastzellen und die basophilen Granulozyten werden durch die Kreuzvernetzung

der IgE-Rezeptoren u.a. zur Freisetzung und de novo Synthese von Mediatoren

aktiviert. Darüber hinaus konnten für diese beiden Zellpopulationen eine Reihe

der Substanzen identifiziert werden, die eine FcεRI-unabhängige Aktivierung be-

wirken.

Die Mastzellen können durch eine Reihe der weiteren Faktoren wie

Neuropeptide, �basic compounds�, Peptide, Anaphylotoxine, Lektine, Zytokine

und Adhäsionsmoleküle aktiviert werden. Die daraus resultierende Degranulation

erscheint morphologisch der FcεRI-induzierten ähnlich, ihr können jedoch grund-

sätzlich andere biochemischen Prozesse zugrunde liegen.

Die Familie der polybasischen Moleküle (�basic compounds�) faßt Compound

48/80, Mastoparan, Polymyxin B und die Polymere der basischen Aminosäuren

um. Alle diese Substanzen scheinen die Degranulation der Mastzellen (79) über

einen gemeinsamen Mechanismus der Aktivierung der G-Proteine auszulösen.

Das Vorhandensein spezifischer Rezeptoren konnte nicht demonstriert werden.

Die Gruppe der Peptide, die die Aktivierung der Mastzellen herbeiführen,

besteht aus den Peptide, die eine zur CH4-Domäne der IgE korrespondierende

Sequenz (Residuen 497-506) besitzen, wie ACTH und Mellitin; Neuropeptide wie

Substanz P, CGRP (calcitonin gene-related peptide), Somatostatin, VIP (vasoactive

intestinal polipeptide) und Neurotensin (80) und dem rab3A Peptide (81). Die

Mechanismen der Aktivierung der Mastzellen durch diese Peptide sind noch nicht

genau geklärt, obwohl für manche eine Aktivierung der G-Proteine wahrscheinlich

erscheint.

Die multiplen Zytokine, für die eine Aktivierung der Mastzellen demonstriert

werden konnte, wie Interleukine (IL-1, IL-3, IL-8), GM-CSF, SCF , PF4 (platelet

28 1 Einleitung______________________________________________________________________________

factor 4) und Chemokine wie MIP-1α (macrophage inflammatory protein) verfügen

über eigene spezifische Rezeptoren, die die Aktivierung über das Initiieren der

Signalübertragungsmechanismen propagieren.

Der Stem Cell Factor (SCF) verfügt über einen Rezeptor, der aus einer

extrazellulären Untereinheit, die für die Bindung der SCF-Moleküle verantwortlich

ist, einer cytoplasmatischen Untereinheit mit Eigenschaften einer Proteintyrosin-

kinase und einer transmembranösen Untereinheit besteht. Die Bindung von SCF

an dem SCF-Rezeptor resultiert in der Autophosphorylation des Rezeptors und

über die Bindung von Phospholipase-γ1 und Phosphatidylinositol-3-Kinase an den

SH2-Domänen des Rezeptors in der Aktivierung dieser beiden Enzyme. Diese

und weitere durch die Bindung von SCF an seinem Rezeptor bedingte Ereignisse

wie Aktivierung der p21ras, über die Phosphorylierung bedingte Aktivierung einer

cytoplasmatischen Proteintyrosinkinase der Src-Familie Tec, Tyrosin-

phosphorylierung der Proteintyrosinphosphatasen PTP 1C und PTP 1D;

Tyrosinphosphorylierung der Adaptor-Protein Grb2 resultieren in einem ganzen

Spektrum der zellulären Reaktionen, die die biologische Funktion von SCF für die

Mastzellen definieren. Diese Funktion beinhaltet die Degranulation mit Freiset-

zung der Mediatoren, die �down-regulation� der FcεRI, Chemotaxis sowie die Wir-

kung als essentieller Faktor für die Proliferation, Entwicklung und Reifung der

immaturen und maturen Mastzellen. Die Mastzellen exprimieren β1- und β

3-Integrine,

die Hauptrezeptoren der Zelloberfläche, über die die Adhäsion der Zellen mitein-

ander wie auch mit den Bestandteilen der extrazellulären Matrix (Kollagen,

Fibronectin, Fibrinogen, Vitronectin etc.) ermöglicht wird. Die Bindung der Agoni-

sten an die Integrine führt zur Aktivierung der Src Proteintyrosinkinase, die über

die Phosphorylierung der zahlreichen cytoplasmatischen Proteine die mehrere

Pfade der Signalübertragung initiiert und somit für die biologischen Funktionen

wie Verstärkung der FcεRI-vermittelten Degranulation und die Modulation der Dif-

ferenzierung und Proliferation verantwortlich ist. Es konnte eine Reihe der Protei-

ne identifiziert werden, die nach der Aktivierung der Integrine über SH2- und SH3-

Domänen an Src Proteintyrosinkinase binden, einer Tyrosinphosphorylierung un-

terliegen und somit aktiviert werden. Dazu gehören u.a. fokale Adhesionsproteine

wie p125Fak, Paxillin, Talin, α-Aktin und Cas und die regulatorischen Proteine wie

Agonisten der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten 31______________________________________________________________________________

Grb2, das Ras-MAP-Pfad aktiviert, und C-crk.

Die kutanen Mastzellen exprimieren eigenständige Rezeptoren für die

Komplementfaktoren C3a und C5a, deren Aktivierung zur Mediatorenfreisetzung

führt (82) und einen chemotaktischen Einfluß ausübt. Diese Rezeptoren gehören

der Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren von Rhodopsin-Typ an. Auch

den Adhesionsmoleküle wie E- und P-Selektine sowie ICAM-1 wird ein aktivieren-

der Einfluß auf die Funktion der Mastzellen nachgesagt. Für die humanen kardia-

len Mastzellen konnte eine Aktivierung durch ECP (eosinophil cationic protein)

und MBP (major basic protein) demonstriert werden (83).

Auch die humanen basophilen Granulozyten werden neben der FcεRI-ver-

mittelten Aktivierung durch eine Reihe anderer Substanzen aktiviert. Diese Funk-

tion konnte für die Chemokine wie IL-8, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 (monocyte

chemotactic proteins 1-4), RANTES und MIP-1α (macrophage inflammatory

protein), Komplementfaktoren C3a und C5a und u.a. demonstriert werden.

Die Chemokine gehören zur Familie der Zytokine, wirken jedoch nicht als

die Modulatoren der zellulären Funktionen, sondern als deren Trigger. Sie werden

abhängig von der Position der beiden ersten Cysteingruppen in CXC-(die

Cysteingruppen voneinander durch eine Aminosäure getrennt) und in CCC-

Chemokine (die Cysteingruppen direkt einander folgend) unterteilt. Die humanen

basophilen Granulozyten besitzen auf ihrer Zelloberfläche die spezifischen

Chemokin-Rezeptoren, die zur Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an-

gehören. Das Interleukin-8 auch NAP-1 (neutrophil-activating peptide), das zur

Familie der C-X-C-Chemokine gehört, übt über seinen spezifischen Rezeptor ei-

nen chemotaktischen Einfluß auf die humanen basophilen Granulozyten (84) aus

und zeigt nur schwach ausgeprägte Aktivierung der Degranulation.

Die Desensibilisierungsexperimente zeigen die Existenz von zumindest drei

unterschiedlichen Rezeptoren für die C-C-Chemokine auf der Oberfläche der hu-

manen basophilen Granulozyten (85). Der CCR3-Rezeptor konnte eindeutig iden-

tifiziert werden. Die Vertreter der Familie der �monocyte chemotactic protein� wie

MCP-1, MCP-2, MCP-3 und MCP-4 induzieren stärker als die anderen C-C-

Chemokine wie RANTES (regulated on activation, normal T expressed and

secreted) und MIP-1α (macrophage inflammatory protein) die Histaminfreisetzung.

30 1 Einleitung______________________________________________________________________________

RANTES, MIP-1α und MCP-3 üben einen spezifischen chemotaktischen Einfluß

auf die humanen basophilen Granulozyten aus (86). Ein weiteres von basophilen

und eosinophilen Granulozyten exprimiertes Chemokin, Eotaxin 2, das spezifisch

an CCR3-Rezeptor bindet, wirkt chemotaktisch auf die basophilen Granulozyten

und induziert die Freisetzung von Histamin und Leukotriene wie LTC4. Auch für

andere Substanzen wie Zytokine PAF (platelet activating factor), ECP (das

eosinophile kationische Protein) und Analogon der bakteriellen Lipoproteine wie

fMLP konnte ein aktivierender Einfluß auf die Funktion der basophilen Granulozyten

gezeigt werden

1.3 Funktion der Mastzellen und basophilen Granulozyten

Die Rolle, die diese beiden Zellpopulationen in den Überempfindlichkeits-

reaktionen spielen, scheint durch zahlreiche in vitro und in vivo Untersuchungen

gut untermauert zu sein (87). Über die Rolle als Effektorzellen der Über-

empfindlichkeitsreaktionen herausgehende Funktion der Mastzellen und

basophilen Granulozyten bei den Abwehrmechanismen, Regulation der Immun-

antwort, Entwicklung einer Fibrose und bei endogener Fibrinolyse und

Thrombolyse ist ein Objekt der zahlreichen Hypothesen.

Die allergische Reaktion wird in die Phase der Sensibilisierung und die

Effektorphase unterteilt. Die Effektorphase besteht aus einer Früh- (Sofortreaktion)

und Spätreaktion. Die Sofortreaktion tritt nur wenige Minuten nach der

Allergenexposition auf und wird durch die Bindung der Antigen-Immunglobulin E-

Komplexe an FcεRI�s der gewebeständigen Mastzellen der Haut und der Schleim-

häute des Respirations- und Gastrointestinaltraktes ausgelöst. Die Bindung der

allergenspezifischen IgE-Moleküle an FcεRI�s führt zur Kreuzvernetzung der Re-

zeptoren, Initialisierung der Signalübertragungsmechanismen und konsekutiver

Freisetzung der Mediatoren wie Histamin, Proteasen und Lipidmediatoren wie

PGD2, LTB

4, LTC

4 und PAF (88). Deren Wirkung bedingt das klinische Bild einer

Sofortreaktion mit Rötung der Haut, Muskelkontraktionen der glatten Muskulatur

wie zum Beispiel Bronchokonstriktion, Gefäßdilatation, Permeabilitätssteigerung

der Gefäße und Ödembildung durch das Transudat. Die Annahme der Schlüssel-

Funktion der Mastzellen und basophilen Granulozyten 31______________________________________________________________________________

-rolle der Mastzellen bei der Auslösung der Sofortreaktion wird durch die folgen-

den Befunde untermauert (89): die allergische Sofortreaktion zeigt einen Anstieg

der intravasalen Konzentration von Histamin, Tryptase, LTC4 und PGD

2, die alle-

samt von Mastzellen sezerniert werden. Die erhöhten Spiegel von Histamin und

Tryptase werden in der BAL-Flüssigkeit bei dem allergischen Asthma bronchiale,

im nasalen Sekret bei exogener Rhinitis, in der Tränenflüssigkeit bei allergischen

Konjunktivitis und intravasal bei systemischen anaphylaktischen Reaktionen ge-

funden. Die Sofortreaktion ist in der Regel innerhalb von 0,5-2 Stunden schnell

reversibel und führt nicht zur Gewebedestruktion. In etwa 2-24 Stunden (meist 4-

8 Stunden) folgt meist eine Spätreaktion (late phase reaction). Diese ist durch ein

zelluläres Infiltrat aus zunächst Neutrophilen und später folgenden mononuklären

Zellen wie Lympho- und Monozyten bedingt. Charakteristisch für dieses Infiltrat ist

das vermehrte Auftreten von eosinophilen und basophilen Granulozyten sowie

Mastzellen und Abwesenheit von Tryptase und PGD2. Die Aktivierung der

Effektormechanismen dieser drei Zellpopulationen bildet die molekulare Grundla-

ge für die klinische Symptomatik der allergischen Spätreaktion (90).

Den basophilen Granulozyten wird eine besondere Rolle in Rahmen der

Spätreaktion zugeschrieben, da sie multiple Rezeptoren auf ihrer Oberfläche

exprimieren, auch von FcεRI´s unabhängig stimuliert werden können und Media-

toren und Zytokine freisetzen können. Vor allem die Eigenschaft, große Mengen

an LTC4 und kein PGD

2 zu sezernieren, spricht für diese Annahme (91, 92).

Die Immunantwort kann in die native und erworbene aufgeteilt werden. Es

finden sich multiple Hinweise auf eine herausragende Rolle der humanen Mast-

zellen und basophilen Granulozyten in diesen beiden Prozessen. Es konnte de-

monstriert werden, daß eine Anzahl der bakteriellen Faktoren wie Pepstatin A

(93), Typ 1 Fimbriae der E. coli (94), Protein A der Staphylococcus aureus (95),

Protein L der Peptostreptococcus magnus (96) u.a. sowie virale Faktoren wie gp120

des HIV und Protein Fv (97), das regelmäßig bei chronischen viralen Hepatitiden

im Serum gefunden wird, eine Aktivierung der Mastzellen und/oder der basophilen

Granulozyten hervorrufen können. Die Mastzellen zeigten die Fähigkeit zur

Phagozytose der lebenden bakteriellen Organismen wie Enterobacteriae und Ver-

arbeitung deren Antigene für die Präsentation zusammen mit MHC Klasse I -Mole-

32 1 Einleitung______________________________________________________________________________

küle den T-Lymphozyten (98). Das TNF-α, das konstitutionell nur von Mastzellen

sezerniert wird, zeigt eine Aktivierung der neutrophilen Granulozyten, die eben-

falls eine Rolle in der antimikrobiellen Abwehr spielen kann. Auch die Präsenz der

MHC Klasse II-Moleküle auf Mastzellen (MMC-like bone marrow derived mast cells,

BMMC�s) und Antigenpräsentation zu den CD4+ T-Lymphozyten konnte demon-

striert werden (99, 100). Diese Untersuchungen haben zeigen können, daß BMMC�s

alle Kriterien der APC�s (antigen presenting cells) erfüllen 1. Internalisation und

Degradation der Antigenproteine zu immunogenen Peptide 2. Expression des

Komplexes MHC Klasse II-Peptid auf der Zelloberfläche und 3. stimulierende Wir-

kung auf die T-Lymphozyten. Diese Mechanismen sind nur auf die exogenen An-

tigene beschränkt. Sie betreffen nicht die endogenen Autopeptide und Autoantigene.

Abbildung 5 Mastzellen als Effektorzellen der angeborenen und erworbenen Immunität. Aus:

Mecheri S. und David B. (1997) �Unravelling the mast cell dilemma: culpritor or victim of its

generosity ?�, Immunology Today, 18, 212-215


Alle diese Tatsachen unterstützen die Annahme der wichtigen Rolle, vor

allem der Mastzellen, in der Initiation und Immunomodulation der Immunantwort.

Die genauen Mechanismen bleiben aber weiterhin noch hypothetisch.

Es finden sich Hinweise auf die wichtige Rolle von TNF-α in der Induktion

der Mobilisation der neutrophilen Granulozyten in Rahmen der Entzündung-

reaktionen, die durch die Immunkomplexe induziert werden. Diese Induktion invol-

viert die Immunglobulin G-Fc Rezeptoren, was unter Berücksichtigung der Tatsa-

che, daß die Mastzellen die FcγRII und FcγRIII exprimieren, die Annahme erlaubt,

daß die Mastzellen eventuell auch die Immunantwort in den Entzündungsreaktionen

induzieren können. Darüber hinaus konnte eine zytotoxische Aktivität der Mast-

zellen, die durch die monoklonalen Antikörpern gegen TNF-α inhibiert wird, de-

monstriert werden (101), was für die Annahme der Induktion der nichtspezifischen

Zytotoxizität der Mastzellen durch TNF-α spricht. Auch den humanen basophilen

Granulozyten wird eine Rolle bei der Immunantwort gegen die bakteriellen und

viralen Erregern zugeschrieben, da eine Reihe dieser wie Staphylokoken (102),

Escherichia coli (103), Salmonellen (103), Candida albicans (104) und Vibrio

cholerae (105) die Freisetzung von Histamin von basophilen Granulozyten stimu-

lieren.

Die basophilen Granulozyten und Mastzellen können über die Sekretion

von IL-4 die Differenzierung der Th0- in die Th2-Subpopulation der T-Lymphozy-

ten initiieren. Die Triggerung der Freisetzung von IL-4 konnte für die Antigen-prä-

sentierende Mastzellen demonstriert werden, so daß dieser Prozeß MHC II-ab-

hängig erscheint. Die weiteren wichtigen Eigenschaften der Mastzellen und der

basophilen Granulozyten sind die Induktion der Proliferation und Differenzierung

der B-Lymphozyten über MC-BSA. Die humanen Mastzellen und die basophilen

Granulozyten sezernieren CD40L und können über ein CD40-Rezeptor mit B-Lym-

phozyten interagieren (23). Diese Interaktion und Einfluß von IL-4 führen zur Diffe-

renzierung der B-Zellen in die IgE-produzierenden Plasmazellen. Ein hypotheti-

sches Modell dieser Interaktion ist in der Abbildung 6 dargestellt.

Den Fibroblasten und Mastzellen, insbesondere dem MCCT

-Phänotyp, wird

die Schlüsselrolle in den Prozessen der Geweberemodellierung und Gewebefibrose

zugeschrieben. Unter den physiologischen Bedingungen besteht ein Gleich-

34 1 Einleitung______________________________________________________________________________

-gewicht zwischen fibrolytischer und fibrogener Aktivität, während die Fibrose durch

eine exzessive Produktion von Kollagen und anderen Bestandteile der extra-

zellulären Matrix verursacht ist. Diese Überproduktion ist entweder durch eine

gesteigerte Aktivität der Fibroblasten, oder eine Fibroplasie bedingt. Das Histamin

und LT4 steigern die Proliferationsrate und Kollagenproduktion der Fibroblasten.

Tryptase und Chymase degradieren die Bestandteile der extrazellulären Matrix,

aktivieren die Kollagenasen und stimulieren die Proliferation der Fibroblasten. Die

Zytokine der Mastzellen wie TNF-α und IL-4 stimulieren ebenso die Proliferation

der Fibroblasten. Im Gegenzug können die Fibroblasten die Replikation, die

Adhärenz, die phänotypische Variabilität und die funktionelle Aktivität der Mast-

zellen über die Freisetzung von SCF, IL-8 und MCAF (mast cell activity factor)

regulieren. Diese gegenseitigen Einflüße zwischen den Fibroblasten und Mast-

zellen könnten die Basis des physiologischen Gleichgewichtes zwischen

Abbildung 6 Ein hypothetisches Modell der Interaktion der Mastzellen und T- und B-Lymphozy-

ten. Aus: Mecheri S. und David B. (1997) �Unravelling the mast cell dilemma: culpritor or victim of

its generosity ?�, Immunology Today, 18, 212-215


fibrolytischer und fibrogener Aktivität bilden, dessen Störung in einer Gewebefibrose

münden könnte. Über diese bidirektionale Rückkopplung könnten die Mastzellen

bei der Geweberemodelierung und Entstehung einer Fibrose eine Rolle spielen.

Diese Hypothese scheint durch die erhöhte Anzahl der Mastzellen und ihre erhöh-

te Aktivität u.a. bei idiopathischer dilatativer und ischämischer Kardiomyopathie,

die durch die Fibrose des Myocards gekennzeichnet sind, untermauert zu sein.

Die weiteren nosologischen Entitäten, die mit diesen Befunden einhergehen, sind

Sklerodermie, Asthma bronchiale und die fibrotischen Lungenerkrankungen.

Die endogene Fibrinolyse ist ein Teil der Reparationsvorgänge, die einer

entzündlichen oder anderen lokalen mit transienter Fibrinablagerung einherge-

henden Reaktion folgen. Eine besondere Rolle der Mastzellen in der Regulation

dieses Prozesses wird postuliert (106). Eine Reihe der Mediatoren der Mastzellen

zeigt die Eigenschaften, die diese Hypothese sehr wahrscheinlich erscheinen las-

sen. Die Tryptase degradiert das Fibrinogen und aktiviert die Pro-Urokinase.

Chymase inaktiviert das Thrombin. Heparin wirkt als Kofaktor für Antithrombin III

(AT III) und aktivierender Kofaktor von Tryptase und tPA (tissue plasminogen

activator). Die Mastzellen exprimieren enzymatisch aktives tPA und die u-PA-Re-

zeptoren. Die Expression der Inhibitoren von tPA und u-PA konnte bis dato nicht

demonstriert werden (107). Zusammenfassend exprimieren die Mastzellen eine

Reihe der fibrinolytischen Substanzen und sind imstande die Fibrinolyse in vitro zu

induzieren. Es erscheint möglich, daß die Mastzellen zunächst die �capillary

leakage� induzieren und dann an lokaler Fibrinolyse teilnehmen. Da für die Endothel-

zellen (EC) die Freisetzung von SCF demonstriert werden konnte, wäre es mög-

lich, daß Thrombin-aktivierte EC�s SCF synthetisieren und freisetzen, der die Che-

motaxis und Akkumulation von Mastzellen bewirkt. Diese könnten dann vermehrt

tPA sezernieren und die Fibrinolyse und endogene Thrombolyse bewirken.

Es bestehen fundierte Hinweise auf eine regulatorische Funktion der Mast-

zellen im Prozeß der Angiogenese. Die Mastzellen der Bindegewebe sind

topografisch mit den kleinen Gefäßen assoziiert. Die erhöhte Anzahl der Mast-

zellen findet sich bei vielen Prozessen, die mit gesteigerten Angiogenese einher-

gehen, wie Wundheilung, Ovulation, Hämangiome, Neoplasien und in

dysfunktionellem Myocard. Zahlreiche Mediatoren der Mastzellen weisen einen

36 1 Einleitung______________________________________________________________________________

ausgeprägten angiogenetischen Effekt wie Histamin (über H1- und H

2-Rezepto-

ren), Heparin und TNF-α. Die weiteren Mediatoren der Mastzellen sind in die

Regulation der Funktion der Endothelzellen involviert. TNF-α induziert die Ex-

pression von ELAM-1 (endothelial leukocyte adhesion factor) von Endothelzellen.

Die Tryptase überführt prä-ANF (atrial natriuretic factor) in seine aktive Form

ANF. Andere Untersuchungen suggerieren, daß die Mastzellmediatoren wie Hist-

amin und Heparin die anderen Zellpopulationen wie die Makrophagen und

Fibroblasten zu Freisetzung von angiogenetischen Proteasen und Zytokine sti-

mulieren. TGF-α erhöht die Expression von VEGF (vascular endothelial growth

factor) von Fibroblasten und Epithelzellen. VEGF stimuliert direkt die Proliferati-

on und Migration der Endothelzellen. Heparin potenziert die Wirkung eines der

stärksten angiogenetischen Faktoren FGF (fibroblast growth factor) durch die

Erhöhung der Affinität von FGF zu seinem Rezeptor und die Hemmung der FGF-

Degradation. Im Gegenzug induzieren FGF, PDGF und VEGF die chemotakti-

sche Migration der Mastzellen.

Alle diese aufgeführte hypothetische Annahmen bedürfen der weitergehen-

den Untersuchungen, die zu der eventuellen Bestätigung führen können.

1.4 RBL-2H3-Zellen als Versuchsmodell für die humanen Mastzellen und

basophilen Granulozyten

1.4.1 Beschreibung der RBL-2H3-Zellinie

Die RBL-2H3 Zellinie (rat basophilic leukemia cell line) wurde kloniert und

isoliert im 1978 in Laboratorium der Immunologie des Nationalen Institutes für die

stomatologische Forschung (Laboratory of Immunology at the National Institute of

Dental Research, National Institutes of Health, Bethesda, USA) aus den basophilen

Zellen der Wistarratten (108). Die RBL-2H3-Zellinie ist eine in der Kultur adhärent

wachsende stabile Zellinie, die die hochaffinen Immunoglobulin E-Rezeptoren

(FcεRI) in Zahl von ca. 3∗105 membranständig exprimiert. Die weiteren von dieser

Zellinie exprimierten Rezeptoren sind SCF-Rezeptor, niedrigaffine IgG-Rezepto-

ren FcγRII und FcγRIII (109) und die Adhäsionsmoleküle wie Integrine und


Adenosinrezeptoren (A2a

, A2b

, A3). Interessanterweise wird die Subform der

niedrigaffinen IgG-Rezeptoren (FcγRII) FcγRIIB1 im Gegensatz zur Subform

FcγRIIB2 nur von den stimulierten RBL-2H3-Zellen exprimiert. Die FcγRIIB2-Re-

zeptoren werden von den stimulierten und ruhenden RBL-2H3-Zellen exprimiert.

Die punktuelle Mutation der Asparaginsäure in der Position 814 des SCF-Rezeptors

wird für das neoplastische Wachstum dieser Zellinie verantwortlich gemacht (110).

Die Rezeptoren für die Komplementfaktoren C3a und C5a werden nicht detektiert.

Interessanterweise inhibiert den Komplementfaktor C3a die FcεRI-vermittelte Ak-

tivierung der RBL-2H3-Zellen, am wahrscheinlichsten durch die Bindung an FcRβ

(111). Die RBL-2H3-Zellen lassen sich problemlos in großer Zahl kultivieren. Durch

ihre Eigenschaften erfüllt diese Zellinie die wesentlichen Voraussetzungen als ein

Modell für die Mastzellen und die basophilen Granulozyten. Durch die Aggregati-

on der FcεRIs kommt es zur Zelldegranulation und konsekutiver Freisetzung von

Histamin, Serotonin sowie anderer zellulären Mediatoren. Die RBL-2H3-Zellen wur-

den zur Untersuchung der Struktur der Immunglobulin E Rezeptoren eingesetzt.

Mit Hilfe dieser Zellinie konnte erstmalig die Struktur der hochaffinen IgE-Rezep-

toren identifiziert werden (112). Diese Erkentnisse führten mittelbar zur Klonierung

der humanen FcεRI, der Entdeckung der Signalübertragungsmechanismen der

FcεRI sowie der verschiedenen Aspekte der zellulären Signalvorgänge wie die

Aktivation der Proteinkinasen, Phospholipasen, G-Proteinen und Einfluß der in-

trazellulären Calciumkonzentration auf diese Vorgänge.

1.4.2 Beschreibung der RBL-2H3-m3.7-Zellinie

Die Zellinie RBL-2H3-m3.7 exprimiert die humanen muskarinen Acetylcholin-

rezeptoren Subtyp 3 auf ihrer Oberfläche. Diese neue Zellinie entstand durch die

Transfektion der Zellen mit AP 129 Retrovirus, in dessen Genom ein humaner m3-

mAChR Gen aus der G418 resistenten NIH-3T3-Fibroblasten-Zellinie integriert

wurde (113). Die Zellen der RBL-2H3-m3.7-Zellinie wachsen analog der

Mutterzellinie adhärent und stabil in Zellkulturen und lassen sich in großer Zahl

kultivieren. Durch die Bindung eines Acetylcholinagonisten wie Carbachol

(Carbamylcholinchlorid) kommt es durch die Aktivation des mit G-Protein-gekop-

38 1 Einleitung______________________________________________________________________________

-pelten Rezeptors zum Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration mit kon-

sekutiver Degranulation und damit zur Freisetzung von Mediatoren wie Histamin,

Serotonin und anderen. Diese Zellinie ist bis auf m3-AChR mit der Zellinie RBL-

2H3 phänotypisch identisch.

Die RBL-2H3-m3.7-Zellen können entweder über m3-ACh-Rezeptor oder

über Immunglobulin E-Rezeptor stimuliert werden. Diese Tatsachen erlaubt die

Diskriminierung zwischen diesen zwei unterschiedlichen Pfaden der Signal-

übertragung wie auch die Untersuchung der Modulation der einzelnen Pfade durch

exogene Faktoren. Die Faktoren, die Signalübertragungsmechanismen an nur ei-

nem der Rezeptoren beeinflußen, bleiben auf diese Weise ohne Einfluß auf die

Ereignisse, die aus der Aktivierung des anderen Rezeptors resultieren.

1.4.3 Signalübertragungsmechanismen in RBL-2H3-Zellen

Die Signalübertragungsmechanismen in �rat basophilic leukemia� Zellen

(RBL-2H3-Zellen) werden am Beispiel des Immunglobulin E-Rezeptors vorgestellt.

Darüber hinaus existiert eine Fülle an Erkenntnissen über die weiteren Mechanis-

men der Signalübertragung der anderen von RBL-2H3-Zellen exprimierten Re-

zeptoren, deren Darstellung jedoch die Rahmen dieser Arbeit sprengen würde.

Die FcεRI der RBL-2H3-Zellen weisen nur geringgradige Unterschiede im

Vergleich zu humanen FcεRI, die sich vor allem auf die Länge der einzelnen Un-

tereinheiten beziehen. Die strukturellen und funktionellen Eigenschaften der FcεRI

der RBL-2H3-Zellen entsprechen weitgehend der humanen FcεRI, wie unter 1.1.5

beschrieben.

Die Aggregation der FcεRI der RBL-2H3-Zellen resultiert in der Aktivierung

der p53/56lyn Proteintyrosinkinase der Src-Familie. Diese ist über ihre SH4-Domä-

ne (N-terminales Ende) in der Zellmembran verankert. Die Aktivierung wird am

ehesten durch die sterischen und strukturellen Konformationsänderungen der p53/

56lyn -Moleküle, die durch die Aggregation des FcεRI-Tetramers verursacht wer-

den und zur Autophosphorylation der p53/56lyn Proteintyrosinkinase führen. Diese

verursacht die schnelle Phosphorylation der γ-Untereinheiten des FcεRI. Es wer-

den die Tyrosinreste der beiden ITAM-Sequenzen der γ-Untereinheiten

RBL-2H3-Zellen als Versuchsmodell 39______________________________________________________________________________

phosphoryliert. Die ITAM�s weisen die folgende Sequenz auf: (D/E)X2YX

2LX

6-7YX

2-

(L/I). Die Phosphorylation kann nur im aggregierten Zustand des Rezeptors erfol-

gen, eine Disaggregation verursacht eine schnelle Dephosphorylation. Die

phosphorylierten ITAM-Sequenzen der γ-Untereinheiten dienen als hochaffine

Bindungsstellen für die Tandem-SH2-Domänen der Proteintyrosinkinase p72syk.

Die ITAM-Sequenz der FcRβ-Untereinheit fungiert als eine Art Anker für p53/56lyn

und kann dadurch die p53/56lyn -abhängige Phosphorylation von FcRγ verstärkt

(114). Die Bindung an ITAM�s der γ-Untereinheiten aktiviert die katalytische Aktivi-

tät der p72syk, was wiederum zur Autophosphorylation dieser und entstehen der

Bindungsstellen für die SH2-Domänen enthaltenden Proteinen führt. Bis dato konnte

eine Anzahl der Proteine mit katalytischen Eigenschaften identifiziert werden, die

über die Bindung an SH2-Domäne der p72syk aktiviert werden und weitere Pfade

der Signalübertragung eröffnen. Die Phospholipase C-γ1 enthält zwei SH2- und

eine SH3-Domäne. PLC-γ1 katalysiert die Hydrolyse des Phosphatidylinositol 4,5-

biphosphates (IP2) zum 1,2-Diazylglyzerol (1,2-DAG) und Inositol-1,4,5-triphosphat

(IP3). PLC-γ1 wird nach der Bindung an SH2-Domänen der p72syk von dieser

phosphoryliert und danach disloziert in die cytoplasmatische Fraktion (115). Die

durch die Hydrolyse des Phosphatidylinositol 4,5-biphosphates entstehenden Ver-

bindungen fungieren als second messengers in der weiteren Signalübertragung.

Dem 1,2-Diazylglyzerol (1,2-DAG) wird die Aktivierung der Proteinkinase C (PKC)

und der weiteren Kinasen zugeschrieben. 1,2-DAG wird zur biologisch aktiven

Phosphatidylsäure phosphoryliert. Inositol-1,4,5-tris-phosphat (IP3) bindet an dem

eigenen Rezeptor der Membran des endoplasmatischen Reticulums und führt dar-

über zur Freisetzung der dort gespeicherten Calciumkationen, was wiederum zur

Mitaktivierung der Ca2+-abhängigen Enzymen führen kann. IP3 dient als Prekursor

für die Synthese der weiteren Inositolpolyphosphaten (IP4, IP

5, IP

6), die mögli-

cherweise durch die Interaktion mit weiteren intrazellulären Proteinen eine biolo-

gische Rolle spielen. Die Proteinkinase C (PKC) ist eine Threonin/Serinkinase

mit Ca2+-abhängigen und Ca2+-unabhängigen Isoenzymen α und β bzw. δ, ε und

ξ. Die Rolle der PKC wird in der Regulation der Aktivität der Phospholipase A2

und Phospholipase C-γ1 gesehen. Jedes dieser Enzyme wird durch ein Ca2+-

abhängiges und Ca2+-unabhängiges Isoenzym der PKC reguliert. PLA2 von PKCβ

40 1 Einleitung______________________________________________________________________________

und δ (116), PLC-γ1 von PKCα und PKCε (117). Die Aktivierung der PKC verur-

sacht durch die Phosphorylierung der Phosphatidylinositolkinase (PI) und der

Phosphatidylinositol-4-Phosphatkinase (PIP) ein Anstieg der Konzentration von

Phosphatidylinositol-4-Phosphat (PIP) und Phosphatidylinositol-4,5-Biphosphat

(PIP2). Dieser Anstieg Korreliert mit dem Grad der Aktin-Polymerisation, was eine

mögliche Interaktion zwischen den Polyphosphoinositolen und Aktin-bindenden

Proteinen wie Gelsolin und Profilin impliziert. Dadurch könnte die PKC eine Rolle

im Prozeß der Degranulation spielen (118).

Abbildung 7 Schema der Signalübertragungsmechanismen in RBL-2H3-Zellen. Aus:Hamawy

M.M., Mergenhagen S.E., Siraganian R.P. (1995), �Protein tyrosine phosphorylation as a

mechanism of signalling in mast cells and basophils.�, Cell.Signal., 7, 535-544


Ca2+ Fc RIe

b ga b

Integrine

Btk

P

P

P

P

P

P

Ca2+

SH2

SH3

Lyn

P

FAP

P

P P

P

P

Vav

Nck

HS1

MAP

?

PI

a

IP3-K

pp105-115FAK

IP3

PKC

DAGPPP

PPP

PLC 1g

SH2 SH2Syk

P

Paxillin

Die Aggregation der FcεRI verursacht die Phosphorylierung von pp125FAK

(focal adhesion kinase) und Paxillin. Dieser Vorgang bedarf der Aktivierung der

Proteinkinase C und ist calciumabhängig. Die pp125FAK wird durch die p72syk an

Tyrosin-Residuen phosphoryliert. Da die Bindung von mAb AA4 keine

Phosphorylierung von pp125FAK verursacht und nicht in der Degranulation der Zel-

le resultiert, scheint pp125FAK eine Rolle in den Sekretionsvorgänge zu spielen.

Paxillin, ein cytoskelettales Protein, verfügt über die Bindungsstellen für die SH2-

und SH3-Domänen und pp125FAK. Paxillin wird in vitro von pp125FAK phosphoryliert.

Es wird angenommen, daß diese beiden Proteine eine wichtige Rolle in der FcεRI-

vermittelten Degranulation spielen (119). Die Rolle der weiteren cytoskelettalen

Proteine wie Myosin erscheint noch unklar.

Die Aggregation der FceRI´s verursacht die Aktivierung der Sphingosin-

kinase (SK), die Spingosin-1-phosphat synthetisiert. Durch die spezifische Inhibition

der SK bleibt ein FcεRI-vermittelter Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration

fast vollständig aus bei regelrechter Aktivierung der p72syk und einem Anstieg der

IP3-Konzentration (120). Sehr wahrscheinlich kommt es über diesen Mechanis-

mus zum eigentlichen FcεRI-vermittelten Anstieg der intrazellulären Calcium-

konzentration durch die Freisetzung aus dem endoplasmatischen Reticulum. Die-

se Annahme wird durch die Tatsachen unterstützt, daß der IP3 -vermittelte Anstieg

der Ca2+-Konzentration der Degranulation nicht vorauszugehen scheint.

Der FcεRI-vermittelter Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration führt

zur Translokation der cytoplasmatischen Phospholipase A2 (cPLA

2) zur Zellkern-

membran (121), wo die cPLA2 im Komplex mit 5-LO und FLAP die Leukotrienen-

synthese katalysiert.

Die Kreuzvernetzung der FcεRI induziert das NFAT (nuclear factor of

activated T-cells) (122). Dieser ist in die Regulation der mRNA-Transkription der

Zytokine wie IL-3, IL-4, IL-5, GM-CSF, TNF-α und vielleicht IL-13 involviert. Der

FcεRI-vermittelter Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration verursacht

die Aktivierung der Ca2+-abhängigen Phosphatase Calcineurin, die das

cytosolische NFAT dephosphoryliert und dadurch aktiviert, was zur Translokation

von NFAT ins Zellkerninnere führt. NFAT bindet mit Transkriptionsfaktoren der

AP-1 (Fos/Jun)-Familie und generiert die NFAT-AP-1-Bindungstellen, die in den

42 1 Einleitung______________________________________________________________________________

regulatorischen Gen-Regionen der induzierbaren Zytokine der Zellen des Immun-

systems gefunden werden. Ein weiterer Signalpfad, der eine wichtige Rolle in der

Regulation der Gentranskription spielt, ist der Ras-MAP-Kinase-Pfad. Die Aggre-

gation der FcεRI´s aktiviert über den Austauschfaktor Sos, der an die Adaptor-

Proteine Grb2 bindet, den Ras-Pfad der Signalübertragung. Das Grb2 wird nach

der FcεRI-vermittelten Phosphorylierung der Shc-Proteintyrosinkinase aktiviert.

Ras phosphoryliert Raf, das die MEK-Kinasen phosphoryliert, die wiederum die

MAP-Kinasen (mitogen activated proteins kinase) phosphorylieren (123). Die

Translokation der MAP-Kinasen ins Innere des Zellkerns führt zur Aktivierung

der Transkriptionsfaktoren und dadurch zur Expression der Genprodukte wie

Interleukine. Die Rolle der MAP-Kinasen wird in der Integration der verschiede-

nen Pfaden der Signalübertragung, die eine funktionelle Bedeutung für die Re-

gulation des Zellzyklus besitzen, gesehen (124).

In den RBL-2H3-Zellen wird durch den Anstieg der [Ca2+]i und Aktivierung

der PKC die Phospholipase D aktiviert. Diese verursacht ein Anstieg der Konzen-

tration von Phosphatidylsäure und Diglyzeride, die als second messenger fungie-

ren.

Die Phosphatidylinositol-3-kinase (PI3) wird nach der Aggregation der

FcεRI´s aktiviert. Sie katalysiert die Formation der Phosphodiester, die an der

Position 3� des Inositolringes mit einem Fettsäure verbunden sind. Diese Verbin-

dungen inhibieren die Aktivität der Phospholipase C-γ1. Die Phosphatidylinositol-

polyphosphate sind ein Substrat der Proteinen, die Plekstrin-Homologie-Domä-

nen enthalten, wie Btk Proteintyrosinkinase, die Regulatorproteine wie Sos und

Vav, sowie ras-GAP und PLC-γ. Die regulatorische Einheit p85der PI3 ist mit Syk

Proteintyrosinkinase assoziiert. Alle diese Tatsachen erlauben die Annahme, daß

die PI3 in der Kontrolle der Signalübertragung eine Rolle spielen könnte.

Es konnte eine Reihe der weiteren Proteine wie Grb2 (Ras-pathway mit

Sos, Shc, MAP-Kinasen und p95vav), GTP-ase aktivierende Protein der p21ras und

Phosphatidylinositolkinase 3� identifiziert werden, die nach der Zellaktivierung via

FcεRI phosphoryliert bzw. aktiviert werden. Ihre Bedeutung für die FcεRI-vermit-

telten Signalübertragungsmechanismen der RBL-2H3-Zellen ist zur Zeit noch nicht

eindeutig definiert und ein Gegenstand der weiteren Forschungsvorhaben.


1.4.3.1 Intrazelluläres Calcium

Die Calciumkationen spielen eine wichtige Rolle in den Signalübertragungs-

mechanismen. Dank ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften erfüllen

sie in vielen Systemen der fast allen bekannten Organismen die Rolle als spezifi-

scher second messenger. Die Calciumkationen fungieren als ein phylogenetisch

sehr alter Aktivierungsfaktor der katalytischen Aktivität der zahlreichen enzyma-

tisch aktiven Proteine bzw. als Kofaktor der weiteren Aktivierungs- und

Inhibitionsprozessen. Diese Funktion der Calciumkationen konnte für die Prozes-

se der Genexpression, zellulären Sekretion, Kontraktion und des zellulären

Metabolismus nachgewiesen werden (125). In RBL-2H3-Zellen konnte bei der Er-

forschung der Signalübertragungsmechanismen eine Reihe der Ereignisse, bei

denen eine direkte Ca2+-Abhängigkeit besteht, identifiziert werden. Dazu gehören

Aktivierung von PKC, PLA2, NFAT, Degranulation und viele andere.

Ein Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration in den eukaryotischen

Zellen kann entweder durch die Freisetzung der Calciumkationen aus den intra-

zellulären Depots oder durch den Eintritt des Calciums aus dem extrazellulären

Raum in die Zelle erfolgen. In den elektrisch erregbaren Zellen erfolgt dieser Ein-

tritt über die spannungsabhängigen Ionenkanäle. Im Gegensatz zu solchen Zel-

len, wie z.B. Neuronen, verfügen die RBL-2H3-Zellen wie auch die humanen

Mastzellen und die basophilen Granulozyten über keine spannungsabhängigen

Ionenkanäle. In den elektrisch nicht erregbaren Zellen wie in Zellen des Immun-

systems, Endothelien, Epithelien und Hepatozyten erfolgt der Eintritt der Calcium-

kationen in die Zelle über sog. �store-operated Ca2+-entry�, wo der direkte Eintritt

der Calciumkationen in die Zelle über den Füllzustand der intrazellulären Calcium-

depots wie das endoplasmatische Reticulum reguliert wird (126). Die erste De-

monstration dieses Mechanismus gelang Hoth und Penner (127) für die Mast-

zellen und die entdeckten Calciumkanäle (calcium influx channels) wurden ICRAC

(Ca2+ release activated Ca2+ current) genannt. Gegenwärtig stellt ICRAC

den am

besten untersuchten �store-operated Ca2+-entry�-Mechanismus mit der höchsten

Sensitivität für die Calciumkationen dar. Die Existenz der ICRAC

konnte auch für

die RBL-2H3-Zellen demonstriert werden (128).

44 1 Einleitung______________________________________________________________________________

Die Calciumkanäle ICRAC

können durch eine Reihe der Faktoren, die alle-

samt die Eigenschaft der Entleerung der IP3-sensitiven Depots besitzen müssen,

aktiviert werden. Unabhängig von dem Mechanismus der Entleerung der Calcium-

depots zeigen die ICRAC

die identischen Eigenschaften. Sie sind spannungs-

unabhängig, weisen eine hohe Selektivität für die Calciumkationen auf, aber nur

eine sehr geringe Leitfähigkeit des einzelnen Kanals für die Calciumkationen (0,02

pS) (129). Obwohl die molekulare Struktur der ICRAC

noch nicht entschlüsselt wer-

den konnte und die Frage, ob es sich bei diesem Mechanismus um ein Ionenkanal

oder um ein Trägerprotein handelt, noch nicht endgültig beantwortet werden konnte,

sprechen die Indizien dafür, daß ICRAC

ein Ionenkanal mit zumindest zwei Ca2+-

Bindungsplätzen (130) ist.

Es scheint, daß die Aktivierung der ICRAC

nur durch die Entleerung der Inositol-

3-Phosphat sensitiven Depots erfolgen kann. Die anderen Depots wie z.B.

Sphingosin-1-Phosphat sensitive Depots, die auch in RBL-2H3-Zellen detektiert

werden, zeigen keine Wechselwirkung mit dem ICRAC

-abhängigen Eintritt der

Calciumkationen in die Zelle (131). Die Signalübertragung zwischen den IP3-sen-

sitiven Depots und ICRAC

-Ionenkanäle bedarf zumindest zwei Elemente: einen Sensor

des Ca2+-Gehaltes und einen Aktivierungsfaktor. Die molekulare Natur des Sensors

bleibt bis dato unklar. Eine mögliche Rolle der IP3-Rezeptoren selbst und weiteren

Ca2+-bindenden Proteinen wie Calmodulin und Calreticulin, die Haupt-Calcium-

bindendes Protein des endoplasmatischen Reticulums darstellt, wurde postuliert,

konnte jedoch nicht eindeutig bewiesen werden (132, 133). Auch die Natur des

postulierten Aktivierungsfaktor konnte trotz der mannigfachen Untersuchungen

noch nicht geklärt werden. Die hypothetischen Modelle der Signalübertragung, die

die Calcium-Depots mit den ICRAC

-Ionenkanälen verbinden, werden in die Mecha-

nismen der direkten (IP3 und IP

4-Rezeptor , IP

3-Rezeptor Typ3) und indirekten

Kopplung (cGMP, IP4, Tyrosinkinase, Proteinkinase C, Calcium/Calmodulin ab-

hängige Kinase, Proteinphosphatase, Vesikelfusion, kleine G-Proteine, Cytochrom

P-450) vermutet. Für keinen dieser Mechanismen konnte ein eindeutiger Beweis

für seine Rolle erbracht werden. Es konnten mehrere Mechanismen identifiziert

werden, die die Inaktivierung der ICRAC

-Ionenkanäle bewirken. Für die RBL-2H3-

Zellen konnte eine Inaktivierung durch die Calciumkationen, ATP bzw. seinen


Analogon Adenosine 5�-O-(3-thiotriphosphat) (ATPγS) und eine Verstärkung der

Inhibition durch die Stimulation der Proteinkinase C gezeigt werden. Die ICRAC

-

Ionenkanäle werden wie ihre Gegenspieler, die spannungsabhängigen Ionenkanäle,

durch den Anstieg der cytosolischen Calciumkonzentration inhibiert. Hoth und

Penner (134) haben einen lokalen Anstieg der cytosolischen Calciumkonzentration,

der aus den Einfluß über die ICRAC

-Ionenkanäle resultiert, als einen schnellen loka-

len inhibitorischen Feedback-Mechanismus vorgeschlagen. Dieser Mechanismus

könnte eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Zeit und des Ausmaßes von dem

Einfluß der Calciumkationen in die RBL-2H3-Zelle spielen. Für die T-Lymphozy-

ten demonstrierte Inaktivierung der ICRAC

-Ionenkanäle durch das Auffüllen der in-

trazellulären Depots (135) konnte für die RBL-2H3-Zelle nicht nachgewiesen wer-

den. Eine Reihe der Rezeptoragonisten, deren Stimulation zur Aktivierung der

ICRAC

-Ionenkanäle führt, vermittelt die Aktivierung der Proteinkinase C. Diese Akti-

vierung scheint eine Rolle in der Inhibition der ICRAC

-Ionenkanäle in den RBL-2H3-

Zellen als ein negativer Feedback-Mechanismus zu spielen (136).

Obukhov et al. (137) gelang die Identifizierung der anderen Ionenkanäle

in RBL-2H3-Zellen. Diese nicht selektive Kanäle sind durch hohe Leitfähigkeit für

die Calciumkationen, die höher als die der ICRAC

-Ionenkanäle ist, und die fehlende

Aktivierung durch die steigende intrazelluläre Calciumkonzentration charakteri-

siert. Insgesamt könnten diese weniger als ICRAC

zahlreiche Ionenkanäle, die je-

doch eine höhere Leitfähigkeit aufweisen, zu einem hohen lokalisierten und vor-

übergehenden Anstieg der Calciumkonzentration führen, was eine Triggerung

der Sekretion auslösen könnte.

Zusamenfassend folgt der Aggregation der FcεRI in der RBL-2H3-Zellen

in ca. 30 sec. ein transienter Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration

von der basalen Konzentration ( ca. 100-200 nM) (138), der über die Freisetzung

der Ca2+-Kationen aus den intrazellulären Depots (endoplasmatisches Reticulum)

durch IP3 und wahrscheinlich durch Sphingosin-1-Phosphat (s. Kap. 1.4.3) zu-

stande kommt. Die zeitliche Verzögerung ist durch die notwendige Rekrutierung

der cytoplasmatischen Enzyme wie Proteintyrosinkinasen, Phospholipase-1γ und

Sphingosinkinase bedingt. Die maximale intrazelluläre Calciumkonzentration und

Erreichen der transienten Plateauphase mit ca. 1200 nM werden durch den Eintritt

46 1 Einleitung______________________________________________________________________________

der Calciumkationen aus dem extrazellulären Raum über ICRAC

(und möglicherwei-

se über die nicht selektiven, hoch leitfähigen Kationenkanäle) in die Zelle erreicht.

Der Eintritt der Calciumkationen durch die ICRAC

-Ionenkanäle wird durch die Ent-

leerung der IP3-sensitiven Calciumdepots des endoplasmatischen Reticulums aus-

gelöst. Die Natur des Calciumkonzentration-Sensings sowie der Kopplungs-

mechanismen zwischen den Depots und den ICRAC

-Ionenkanäle bleiben zur Zeit

noch weitgehend unklar.

1.4.3.2 Degranulation

Das Verständnis der Mechanismen, die zur Degranulation der RBL-2H3-

Zellen führen, ist weiterhin noch lückenhaft. Die Degranulation (Exocytosis) ver-

langt die Konformationsänderungen der Proteine, die das Cytoskelett formen. Es

erscheint sehr wahrscheinlich, daß die Formation von F-Aktin und Redistribution

der Aktinfilamente zu den morphologischen Veränderungen der Zelle führen, die

letztendlich im Prozeß der Degranulation münden. Zwei durch die FcεRI-vermittel-

te Signalübertragungsmechanismen induzierte Ereignisse scheinen eine beson-

dere Rolle im Prozeß der Degranulation zu spielen: 1. Anstieg der intrazellulären

Calciumkonzentration, die conditio sine qua non der Degranulation repräsentiert

(139) und 2. Aktivierung der PKC. In den Mastzellen wie in den RBL-2H3-Zellen

erfolgt der Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration überwiegend, wenn

nicht ausschließlich über die ICRAC

-Ionenkanäle (140, 141). Die mögliche Funktion

der PKC könnte die Phosphorylierung der Kinase der leichten Myosinketten, die

Interaktion zwischen Aktin und Myosin reguliert und eine Rolle in der

Konformationsänderungen des Cytoskellets spielt, darstellen.

Weitere Proteine, die wahrscheinlich eine Rolle in der Degranulation der

RBL-2H3-Zellen spielen sind p125Fak und Paxillin. Die p125Fak ist ein fokales

Adhäsionsprotein mit Proteintyrosinkinase-Aktivität, die Schlüsselrolle in Integrin-

vermittelten Signalübertragungsmechanismen spielt. Die Aggregation der FcεRI�s

induziert die Tyrosinphosphorylation von p125Fak durch die p72syk . Dieser Vorgang

ist Ca2+- und PKC-abhängig. Die Paxillin, ein cytoskelettales mit α-Aktin reagie-

rendes Protein, wird in vitro durch p125Fak-Kinase Calcium- und Proteinkinase C-


48 1 Einleitung______________________________________________________________________________

abhängig phosphoryliert. Dieser Vorgang kann in vitro auch Ca2+- und PKC-unab-

hängig durch die Aggregation der FcεRI´s induziert werden. Die phosphorylierte

Paxillin bindet an zahlreichen Proteinen des Cytoskelletons.

In RBL-2H3-Zellen konnte eine Reihe regulatorischer G-Proteine nachge-

wiesen werden. Mindestens zwei Vertreter dieser Proteingruppe wird eine Rolle

in der Spätphase der Exocytosis nachgesagt: das heterotrimerisches Gi3-Protein

und ein monomerisches kleines Ras-ähnliches G-Protein, das wahrscheinlich ein

Mitglied der rab3-Familie ist. Die Versuche mit den permeabilisierten peritonealen

Mastzellen der Ratte zeigten, mittels GTPγS (Guanosin 5´-O-triphosphat), eine

Auslösung der Degranulation, die Phospholipase C-unabhängig ist und bei der die

Calciumkationen als ein Modulator der sekretorischen Antwort fungieren. Diese

Befunde suggerierten eine mögliche Rolle eines G-Proteins in der Auslösung der

Degranulation (142). Dieses Protein konnte als Gi3-Protein, das in den Mastzellen

mit in der Zellmembran und in der Membran des Golgi-Apparates gebundenen

Subformen einzutreffen ist, identifiziert werden (143). Die Rolle der kleinen GTP-

bindenden Proteine in dem Prozeß der Sekretion wird als die eines Mediators der

Fusion der sekretorischen Granula impliziert (144). In den peritonealen Mastzellen

der Ratte könnten zwei Isoformen der rab3-Familie der kleinen GTP-bindenden

Proteine (Rab3B und Rab3D) identifiziert werden (145). In den permealisierten

Mastzellen der Ratte konnte, ähnlich wie durch GTPγS, eine Auslösung der kom-

pletten Exocytosis durch ein synthetisches Peptid (Rab3AL), das homolog zu der

Effektor-Domäne der Rab3A ist, demonstriert werden(146).

1.5 Gangliosid G D1b

1.5.1 Allgemeines

Die Ganglioside umfassen die Stoffgruppe, die den Sphingoglykolipiden

zuzurechnen ist. In dieser Gruppe ist die terminale Hydroxylgruppe des Sphingosins

glykosidisch mit mehreren Monosacchariden verknüpft. Die Ganglioside bestehen

aus einem Ceramid-Teil, einem neutralen Oligosaccharid mit meist zwei bis vier

Monosaccharidresten, meist Glukose, Galaktose und N-Acetylgalaktosamin,

sowie einer oder mehreren Sialinsäuren (N-Acetyl- und N-Glykolylneuraminsäuren),

die an den Galaktoseresten ketosidisch gebunden sind. Die charakteristische

Grundstruktur der Ganglioside entsteht durch schrittweise verlaufendes Ankop-

peln von nucleotidaktivierten Kohlenhydratresten (Urapidildiphosphoglukose,

Urapidildiphosphogalaktose, Urapidildiphospho-N-Acetylgalaktosamin und Cytidin-

monophosphat-N-Acylneuraminsäure) an ein Ceramidmolekül (Acylosphingosin)

durch Akzeptor-spezifische Transferasen.

Die Ganglioside sind ein konstitutioneller Bestandteil der Zellmembranen

und können die mannigfachen biologischen Funktionen ausüben. Sie fungieren

als Rezeptoren für die bakteriellen Toxine, spielen eine Rolle in den intrazellulären

Interaktionen und bei den Differenzierungsprozessen und können transmembra-

nöse Signalübertragungsmechanismen modulieren. Die Modulation der Rezeptor-

funktion durch die Inhibition der Tyrosinkinase konnte für die EGF- (epidermal

growth factor), Insulin- und PDGF- (platelet derivated growth factor) Rezeptoren

demonstriert werden. (147, 148, 149). Die an den Ganglioside bindenden

monoklonalen Antikörper üben vielfältigen Auswirkungen an den zellulären

Metabolismus wie Erhöhung der Konzentration an cGMP, Aktivierung der

Proteinkinase C, Stimulierung des intrazellulären Calciumeinflusses und Inhibition

der cAMP-Synthese. Viele dieser Funktionen erscheinen Proteintyrosinkinase-

abhängig.

1.5.2 Der monoklonale Antikörper AA4

Basciano et al. (150) generierten eine Anzahl von monoklonalen Antikör-

pern, die Bindung von IgE an RBL-2H3-Zellen inhibieren. Ein von diesen Antikör-

pern mAb AA4 weist die besonderen Eigenschaften auf. Es bindet nicht an einem

Epitop des FcεRI, obwohl sein Bindungsepitop mit dem IgE-Rezeptor strukturell

eng assoziiert ist, und zeigt die Inhibition der Histaminfreisetzung. Das mAb AA4

gehört zur IgG1-Subklasse. Die Bindungsepitope des mAb AA4 wurden von Guo

et al. (151) als zwei α-Galaktosyl Derivate des Gangliosids GD1b

der RBL-2H3-

Zellen identifiziert. Die Struktur der beiden Antigene konnte, wie in der Abbildung

8 dargestellt, identifiziert werden. Die Anzahl der Bindungsepitope für das mAb

Gangliosid GD1b

49______________________________________________________________________________

50 1 Einleitung______________________________________________________________________________

Abbildung 8 Struktur der α-Galaktosyl Derivate des Gangliosids GD1b

. Nach: Guo N.H., Her

G.R., Reinhold V.N., Brennan M.J., Siraganian R.P., Ginsburg V. (1989) �Monoclonal antibody

AA4, which inhibits binding of IgE to high affinity receptors on rat leukemia cells, binds to novel α-

galaktosyl derivates of ganglioside GD1b

�, J. Biol. Chem., 264, 13267-13272

AA4 ist um den Faktor 10-15 größer als die Anzahl der FcεRI´s. Die Ceramide des

Antigens I enthalten gleiche Mengen an C24:0, C22:0, C20:0, C18:0 und C16:0 N-

Acyl Fettsäuren. Die Ceramidbasen sind überwiegend die Sphingosine mit nur

kleinem Gehalt an Dihydrosphingosin. Die Ceramide des Antigens II enthalten

vorwiegend C24:0 N-Acyl Fettsäure mit viel kleinerem Gehalt an C22:0, C20:0,

C18:0 N-Acyl Fettsäuren. Die Ceramidbasen sind Sphingosine mit ca. 55% und

Dihydrosphingosin mit 45%. Es konnten keine ungesättigten Fettsäuren detektiert

werden.

Für das Gangliosid GD1b

konnte die Inhibition der Aktivität der

Phosphodiesterase der zyklischen Nukleotiden, eines Calmodulin-abhängigen

Enzyms, demonstriert werden (152). Das Gangliosid GD1b

bindet direkt an

Calmodulin, ein wichtiges Ca2+-abhängiges regulatorisches Protein, das insbeson-

dere in der Regulation der mRNA-Transkription eine wichtige Rolle spielt (153).

Die Anzahl der Moleküle des Gangliosids GD1b

auf RBL-2H3-Zellen konnte

Antigen I

Antigen II

3

3

Gal 1-3 Gal 1-3 Gal Nac 1-4 Gal 1-4 Glc 1-1 Cera b b b b

Gal 1-3 Gal 1-3 Gal 1-3 Gal Nac 1-4 Gal 1-4 Glc 1-1 Cera a b b b b

NeuAc 2-8 NeuAc 2a a

NeuAc 2-8 NeuAc 2a a

Fragestellung 51______________________________________________________________________________

mit 1-2∗105/Zelle bestimmt werden. Die Spezifität dieser Derivate für die Ratten-

Mastzellen (154) und die Ähnlichkeit der strukturellen und funktionellen Verände-

rungen der RBL-2H3-Zellen nach der Bindung mit mAb AA4 mit denen nach der

Aktivierung der Zellen via FcεRI konnten demonstriert werden. Es zeigte sich ein

kleiner Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration und der Hydrolyse von

Phosphatidylinositol sowie Redistribution der Proteinkinase C. Swaim et al. (155)

zeigten zusätzlich zu diesen Ereignissen die Tyrosinphosphorylation der β- und γ-

Einheiten des FcεRI, der Phospholipase C-γ1 und der Tyrosinkinasen p53/p56lyn

und p75syk. Diesen Veränderungen folgte keine Histaminfreisetzung. Im Gegen-

satz zur Aktivierung via FcεRI zeigt die Bindung von mAb AA4 an das Gangliosid

GD1b

folgende Unterschiede: 1. die Rate der Kinasenaktivierung und

Phosphorylierung der Substrate ist langsamer 2. die FcεRβ und FcεRγ werden

stärker phosphoryliert 3. pp125FAK und pp105-115 werden nicht phosphoryliert 4.

die Distribution der Phosphoproteine ist unterschiedlich. Minoguchi et al. (156)

gelang der Nachweis der strukturellen Assoziation von α-Galaktosyl Derivate des

Gangliosids GD1b

mit Tyrosinkinase p53/p56lyn der Src-Familie, die nicht sekun-

där zu der Assoziation dieser Kinase mit FcεRI ist. Die weiteren mit dem Gangliosid

GD1b

assoziierten Proteine sind eine pp41/42 kDa Serinkinase und ein pp71-80

Protein. Diese Erkenntnisse belegen die Bedeutung und regulatorische Rolle

des Gangliosids GD1b

bei der Signalübertragung über den IgE-Rezeptor der RBL-

2H3-Zellen.

1.6 Fragestellung

Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren: 1. die Etablierung der Methodik

der Untersuchung der zellulären Vorgänge, die durch die Signalübertragungs-

mechanismen des Immunglobulin E-Rezeptors (FcεRI) in RBL-2H3-Zellen indu-

ziert werden. Als Parameter der Stimulation via FcεRI wurden die Serotonin-

freisetzung und der Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration gewählt.

Diese Vorgänge repräsentieren die Endstrecken der Pfade der intrazellulären

Signalübertragung und erlauben somit den direkten Vergleich der Einflüsse, die

die Stimulation der RBL-2H3-Zellen via FcεRI modulieren. 2. die Untersuchung

52 1 Einleitung______________________________________________________________________________

des Effektes vom Gangliosid GD1b

auf die Signalübertragungsmechanismen des

Immunglobulin E-Rezeptors.

1. Die ersten Schritte der vorliegenden Arbeit beinhalteten die Etablierung

der Methodik der Messung der Serotoninfreisetzung und der intrazellulären

Calciumkonzentration mit intrazellulärem Fluoreszenzindikator Quin-2. Die ver-

schiedenen Zellarten unterscheiden sich in ihrem Gehalt an unspezifischen Ester-

asen, die Hydrolyse von Quin-2/AM in freies, Calcium-bindendes Anion Quin-2

gewährleisten. Das führt dazu, daß die notwendige, extrazelluläre Konzentration

vom Quin-2/AM und der Dauer des Ladevorganges zwischen den unterschiedli-

chen Zellarten sehr stark variieren können und deshalb sollen zwingend bestimmt

werden. Da die Hydrolyseprodukte von Quin-2/AM zellulären Metabolismus

konzentrationsabhängig alteriieren, soll die gewählte Quin-2/AM Konzentration,

bei noch ausreichend hohen Amplitude des Fluoreszenzsignals, die zellulären

Prozesse so wenig wie möglich beeinflussen. Die Bestimmung der spektralen

Eigenschaften von Quin-2/AM, Quin-2 und des Komplexes Quin-2/Ca2+ sowie

der Dissoziationskonstante des Komplexes Quin-2/Ca2+ sollte der Überprüfung

der Validität des gewählten experimentellen Set-up`s dienen.

Der nächste Schritt war es, die die optimale Konzentration vom DNP35

HSA

(an Humanalbumin gekoppelte 35 Moleküle von 2,4-Dinitrophenyl) zu ermitteln.

DNP35

HSA wurde nach der Präinkubation der RBL-2H3-Zellen mit monoklonalem

anti-DNP Antikörper der IgE-Klasse zur direkten Stimulation der Zellen via FcεRI

verwendet.

2. Das Gangliosid GD1b

scheint einen regulatorischen Einfluß auf die Signal-

übertragungsmechanismen des Immunglobulin E -Rezeptors (FcεRI) zu nehmen.

Da eine strukturelle Assoziation des Gangliosids mit Tyrosinkinase p53/p56lyn der

Src-Familie und FcεRI demonstriert werden konnte, erscheint es wahrscheinlich,

daß eine noch nicht definierte Interaktion mit bzw. Einfluß auf die Funktion der

Tyrosinkinasen eine Erklärung dafür sein könnte. Die bis dato vorliegende Arbei-

ten lassen eine inhibitorische Wirkung des monoklonalen Antikörpers AA4 auf die

FcεRI-vermittelte Mediatorenfreisetzung über die Inhibition der intrazellulären

Calciumkonzentration als noch nicht eindeutig erscheinen, da nach der Bindung

des mAb AA4 an die α-Galaktosyl Derivate des Gangliosids GD1b

ein Anstieg der

Fragestellung 53______________________________________________________________________________

intrazellulären Calciumkonzentration der ruhenden, nicht aber über FcεRI stimu-

lierten RBL-2H3-Zellen zu verzeichnen ist. Die vorliegende Arbeit untersucht die

Änderungen der intrazellulären Calciumkonzentration der RBL-2H3-Zellen, die

nach der Inkubation mit mAb AA4 und einem Antigen (DNP35

-HSA) mit Antigen-

spezifischem Antikörper (anti-DNP-IgE) stimuliert werden. Die Arbeit untersucht

die Einflüsse des an dem Gangliosid GD1b

bindenden monoklonalen Antikörpers

AA4 auf die intrazelluläre Calciumkonzentration, deren Anstieg ein Ereignis in

der Signalübertragung über FcεRI darstellt, sowie auf die Serotoninfreisetzung,

die ein Ereignis der Endstrecke der FcεRI-vermittelten Aktivierung der RBL-2H3-

Zellen repräsentiert.

54______________________________________________________________________________

N

N COO-

ON

CH3

COO-

COO-

COO-

CH3O

QUIN2

N

N OCH2OCOCH3

ON

CH3

OCH2OCOCH3

OCH2OCOCH3

OCH2OCOCH3

CH3O

QUIN2 / AM

2 Materialien und Methodik

2.1 Quin-2 als Indikator für Calciumkonzentration

2.1.1 Chemische Eigenschaften von Quin-2

Quin-2 (N (2-((8 (bis (carboxymethyl) amino)-6 methoxy-2-quino linyl) methoxy)-4-

methyl-phenyl-N-carboxymethylglyzin) wurde 1980 von Roger Tsien (157) als neu-

artiger Fluoreszenzindikator für die Messungen der Calciumkonzentration ent-

worfen und synthetisiert.

Abbildung 9 Formeln von Quin 2 und Quin 2/AM

55______________________________________________________________________________

56 2 Materialien und Methodik______________________________________________________________________________

Quin-2 (C26-

H27

N3O

10) ist eine hydrophile Substanz mit Molekulargewicht von 541,52

Dalton. Der Tetracarboxylesther (C38

H43

N3O

18), auch Quin-2/AM genannt, weist

eine ausgeprägte Lipophilie und Molekulargewicht von 829,8 Dalton auf. Quin-2

ist ein Prekursor der großen Familie der Fluoreszenzindikatoren, die direkte Mes-

sung der intrazellulären Ionenkonzentration in vivo ermöglichen, ohne daß irgend-

welche mechanische Manipulationen an den Zellen vorgenommen werden müß-

ten und somit die Messungen an intakten und in ihrer Funktion nur gering alte-

rierten Systemen erlauben. Quin-2 ist, dank seiner strukturellen Eigenschaften

in der Lage eine Komplexverbindung mit einem Calciumkation zu bilden. Eine

Komplexverbindung (158) besteht aus einem zentralen Metallkation, an das eine

oder mehrere Anionen oder Moleküle, die als Liganden bezeichnet werden, ge-

bunden sind. Als Beispiel derartiger Verbindung ist EDTA (Ethylen-

diamintetraessigsäure), der mit dem zentralen Calciumkation insgesamt sechs

Koordinationsbindungen ausbildet, zu erwähnen. Die Komplexverbindungen, die

mehr als eine Bindung mit dem Metallkation bilden, werden als Chelate bezeich-

net und zeigen höhere Stabilität als die Komplexverbindungen, die nur eine Bin-

dung mit dem Kation einhergehen.

Quin-2 ist ein in der Stöchiometrie 1:1 Calciumkationen bindendes Chelat.

Strukturell weist diese tetrakarboxyle Säure gewisse Ähnlichkeiten mit EGTA

(Ethylenglykol-bis-(b-aminoethylether)-N,N,N�,N�-tetraessigsäure) auf, da der Ent-

wurf des Quin-2-Moleküls auf dem der EGTA basierte. Ähnlich wie EGTA hat Quin-

2 (121) ausgeprägte Calcium-Magnesium Selektivität von 104:1, die weitgehend

pH-unabhängig ist. Die Dissoziationskonstante Kd beträgt (bei 37°C, pH=7,05 und

im ionischen Milieu, das dem intrazellulären im Bezug auf die Ionenstärke und -

Konzentration nachempfunden ist) 115 mM. Jeder der Stickstoffatomen der insge-

samt drei imidodiazetischen Gruppen dient als eine Koordinationsstelle, die mit

dem zentralen Calciumkation eine Koordinationsbindung ausbildet. Die Stickstoff-

atome besitzen jeweils ein Elektronenpaar, das nicht an den Bindungen des Quin-

2-Moleküls beteiligt ist und dem Calciumkation zur Bildung einer Koordinationsbind-

ung zur Verfügung gestellt werden kann. Da die Stickstoffatomen sehr stark

deprotoniert sind (die höchste pKa um 6,5) müssen die Protonenpaare zur Bildung

einer Koordinationsbindung nicht displaziert werden, was entscheidend die

Geschwindigkeit der Bindung von Calciumkationen an Quin-2 und der Dissoziati-

on des Komplexes beschleunigt. Die Messungen der Bindungsgeschwindigkeit

zeigten t1/2

von 1 msec und Dissoziations-t1/2

von 10 msec. Die Verschiebung des

Elektronenpaares der Stickstoffatome ist direkt für die Änderung der spektralen

Eigenschaften des Komplexes Quin-2/Ca2+ im Vergleich zu freiem Anion Quin-2

verantwortlich.

2.1.2 Physikalische Eigenschaften von Quin-2

Die Fluoreszenz bezeichnet die Eigenschaft mancher Substanzen bei Be-

strahlung mit kurzwelligen oder ultravioletten Licht die Photonen zu emittieren. Die

Moleküle der Substanz absorbieren die Energie des einfallenden Photons nur wenn

diese Energie der Energiedifferenz der zwei erlaubten angeregten Zuständen ei-

nes Elektrons im Bereich der Atomhülle entspricht. Die absorbierte Photonen-

energie erlaubt einem Elektron ein Übergang von einem niedrig- (Grundzustand)

zu einem höherenergetischem angeregten Zustand. Auf diese Weise absorbierte

Energie wird aufgrund der Vibration und Rotation der Moleküle sowie durch Kolli-

sionen mit anderen Molekülen als Wärme abgegeben und das Elektron kehrt zu

seinem primären niedrig energetischem Grundzustand zurück. Dieser Prozeß nimmt

nur sehr kurze Zeit in Anspruch (ca. 10-12 sec.). Wenn aber die Energieabgabe

nach der Anregung aufgrund der strukturellen Eigenschaften der Moleküle lang-

samer verläuft, kann die absorbierte Energie nicht nur in der oben beschriebenen

Weise aber auch als Emission eines Photons (als charakteristische Spektrallinie)

abgegeben werden. Die charakteristische Energie der emittierten Photonen ist

aufgrund der Energieabgabe durch die Elektronen im angeregten Zustand auf

mechanische Weise deutlich niedriger als die der absorbierten Photonen und ver-

ständlich die Wellenlänge größer.

Die Eigenschaften der fluoreszendierenden Substanzen (159) werden durch

die Begriffe des Emissions-, Absorptionsspektums mit ihren Emissions- und Ab-

sorptionsmaxima sowie quantum yield Qf näher charakterisiert. Das Emissions-

spektrum ist die Wellenlänge-abhängige Variabilität der Fluoreszenzintensität, wenn

die Substanz mit Photonen einer fixen Wellenlänge bestrahlt wird.

Quin-2 als Indikator für Calciumkonzentration 57______________________________________________________________________________

Das Absorptionsspektrum beschreibt diese Variabilität gemessen für eine be-

stimmte und fixe Wellenlänge, wenn die Substanz der Strahlung mit unterschied-

lichen Wellenlänge ausgesetzt ist. Das Emissionsmaximum bezeichnet die Wel-

lenlänge in dem Emissionsspektrum bei der die Fluoreszenzintensität am höch-

sten ist. Das Absorptionsmaximum ist die Wellenlänge, bei der im Absorptions-

spektrum die höchste Fluoreszenzintensität gemessen wird. Qf gibt den Anteil

der Moleküle der Substanz, die nach der Absorption der Energie des Photons

diese als Fluoreszenz abgeben, wieder.


Abbildung 10 Absorptions- und Emissionsspektra von Quin 2 bei unterschiedlichen Calcium-

konzentrationen ( bei 120 mM K+, 20 mM Na+, 1 mM Mg+ und pH=7,05). Aus:Tsien R. Y., Pozzan

T., Rink T. J. (1982) �Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored

with a new intracellulary trapped fluorescence indikator.�, J. Cell. Biol., (94), 325-334.


Durch die Bindung des Calciumkations ändert sich das Emissionsmaximum von

Quin-2 nicht. Der Komplex Quin-2/Ca2+ hat Absorptionsmaximum von 339 nm und

Emissionsmaximum liegt bei 490-500 nm. Aufgrund der Komplexbildung Quin-2/

Ca2+ steigt die Intensität der Fluoreszenz um den Faktor von ca. 6,2.

2.1.3 Prinzip der spektrofluometrischen Messungen mit Quin-2

Die Messung der Calciumkonzentration mit Quin-2 (160) wird mit Hilfe von

einem Spektrofluorometer durchgeführt. Diese Geräte verfügen über eine Licht-

quelle, Filter und Monochromatoren, eine Vorrichtung für die zu messende Probe

und ein Photodetektor. Da die technischen Einzelheiten der verschieden Geräte-

typen variieren, beziehen sich die Ausführungen in diesem Absatz auf das

Spektrofluorometer CA-261 der Firma Jasco, mit dem die Messungen in der vor-

liegenden Arbeit durchgeführt worden sind.

Als die Lichtquelle dient eine 150W Xenonlampe (1), die Photonen des

breiten Spektrums mit hoher Helligkeit emitiert. Diese werden durch einen

eliptischen Spiegel (2) in einem planen Eingangsschlitz des Anregungs-

monochromators (3) fokussiert. Nach dem Verlassen des optischen Zerstreuers

(4) wird der Strahl mit durchgehendem Spektrum durch das optische Gitter (6)

gespalten und nach der Fokussierung durch einen Absorptionsmonochromator

durch die geometrische Anordnung des Ausgangschlitzes (7) kann ein mono-

chromatischer Strahl der vorgewählten Wellenlänge erzeugt werden. Der Strahl

wird im Zentrum der Küvette (11) mit der zu messenden Probe durch einen fla-

chen (9) und einen toroidalen Spiegel (10) fokussiert. Die Fluoreszenzstrahlung

der Probe, d.h. Emissionsphotonen, wird mit einem toroidalen und flachen Spie-

gel (12, 13) auf den planen Eigangschlitz des Emissionsmonochromators (13)

fokussiert. Dieser entspricht in dem Aufbau dem Anregungsmonochromator. Der

monochromatische Lichtstrahl tritt nach dem Verlassen des Monochromators nach

der Fokussierung durch einen flachen Spiegel (14) über einen Eingangsschlitz

(15) in einen Photomultiplier (16), der als Photodetektor dient und wo die einzel-

nen Photonen in die elektrischen Impulse umgewandelt und um Faktor 1∗106-108

verstärkt werden. Die Amplitude des Impulses wird als F bezeichnet und in

relativen Einheiten ausgedruckt. Die in der Küvette untergebrachte Probe wird

dem Licht mit Wellenlänge von 339 nm (Spektrumbreite 5-10 nm) ausgesetzt. Die

Photonen des entstehenden Emissionspektrums werden auf das Emissions-

maximum von 495-500 nm monochromatisiert und nach der Umwandlung in die

elektrischen Impulse im Photomultiplier wird die gemessene Amplitude des Si-

gnals F, die zu der Intensität der Fluoreszenz direkt proportional ist, nach der

Mikroprozessor-gestützten Umrechnung direkt als [Ca2+] angegeben.

Da der Anteil mit Calciumkationen gebundener Quin-2-Moleküle mit der Funktion:

: [Ca2+]=Kd ∗ ([Ca2+-Quin-2]/[Quin-2]) (Formel I) (159)

dargestellt werden kann und aufgrund der direkt proportionalen Abhängigkeit der

Intensität der Fluoreszenz des Komplexes Ca2+-Quin-2 (F) von der absoluten [Ca2+],

geben die Veränderungen der Fluoreszenzintensität die Änderungen der Calcium-

konzentration wieder. Diese kann aus der Gleichung:

[Ca2+]=Kd ∗ (F-F

min)/(F

max-F) (Formel II) (159)

Abbildung 11 Schema eines Spektrofluorometers. Aus: Bashford C.L. und Harris D.A. (Ed.)

�Spectrophotometry and spectrofluorimetry-a practical approach, Oxford, Washington D.C., IRL

Press, 1987


errechnet werden. Fmin

ist die minimale Fluoreszenzintensität, die nach der Ver-

drängung aller Calciumkationen aus ihren Bindungen mit Quin-2 gemessen wird.

Die Verdrängung kann durch die Bindung mit einem Chelaten, der höhere Affinität

als Quin-2 zu Calciumkationen aufweist, wie EGTA mit Kd im Bereich der nM,

durchgeführt werden. Fmax

ist die bei der Sättigung aller Quin-2-Moleküle mit

Calciumkationen gemessene maximale Fluoreszenzintensität. Diese kann durch

die Zugabe der Calciumkationen, deren Konzentration um einige 10-Potenzen höher

als die Quin-2-Konzentration ist, herbeigeführt werden. Kd bezeichnet die effektive

Dissoziationskonstante des Komplexes Quin-2/Ca2+.

In Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Bestimmung des Anregungs-

und Emissionsspektrums für Quin-2-Anion, Quin-2/AM, Quin-2/Ca2+, Dissoziations-

konstante des Komplexes Quin-2/Ca2+ und Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität

des Komplexes Quin-2/Ca2+ von der Calciumkonzentration durchgeführt. Die Er-

gebnisse sind im Kapitel 3 dargestellt.

2.1.4 Kalibrieren der Calciumkonzentration bei den Messungen mit lebenden

Zellen

Die Messung der intrazellulären Calciumkonzentration erfordert den Trans-

fer der Quin-2-Moleküle in die Zellen (161). Da die Zellmembran für das hydrophi-

le Quin-2 Molekül undurchgängig ist, müssen die Zellen einem Azetoxymethylester

von Quin-2 (Quin-2/AM) ausgesetzt werden. Quin-2/AM bindet mit Calciumionen

keinerlei Verbindungen. Quin-2/AM wird üblicherweise mit DMSO (Dimethylsulfoxid)

vermengt, um die bessere Löslichkeit dieser hydrophoben und lipophilen Sub-

stanz in hydrophilen Lösungen zu erreichen. Diese Lösung wird der Zellsuspension

oder in die Kulturflaschen der adhärent wachsenden Zellen zugesetzt. Quin-2/AM

passiert unbehindert die Zellmembran und wird von unspezifischen cytoplasma-

tischen Esterasen zum Quin-2-Anion konvertiert. Dies geschieht durch die schritt-

weise verlaufende Hydrolyse der Esterbindungen aller vier Acetoxymethylgruppen

des Quin-2/AM. Die Konversion des Quin-2/AM zu Quin-2 resultiert in der Ver-

schiebung des Maximums des Emissionsspektrums von ca. 430 zu 490-500 nm,


was jedoch die komplette Hydrolyse aller vier Estergruppen voraussetzt. Nach der

Konversion kann das hydrophile Quin-2-Anion die Zelle nicht verlassen und wird

auf diese Weise passiv intrazellulär angereicht. Die zugesetzten Konzentrationen

von Quin-2/AM zwischen 1 bis 100 µM zeigen für die Messungen zufriedenstellen-

de Intensität der Fluoreszenz nach dem Abschluß des Ladevorgangs. Dabei ge-

messene intrazelluläre Quin-2 Konzentration betragen 0,1-5 mM. Die intrazellulä-

ren Organellen bis auf Zellkern scheinen Quin-2 überhaupt nicht selektiv anzurei-

chern und aufgenommene Menge verteilt sich gleichmäßig intracytoplasmatisch.

Das inkorporierte Quin-2 zeigt eine Zellart-abhängige Zytotoxizität, die am ehe-

sten als durch die Hydrolyseprodukte von Quin-2/AM verursacht aufzufassen ist.

Bei der Hydrolyse entstehen acht Protonen, vier Azetylreste und vier Formaldehyd-

moleküle. Der Formaldehyd beeinträchtigt in höherer Konzentration viele wichtige

metabolische Vorgänge, so kann es zum Beispiel die intrazelluläre ATP-Konzen-

tration mindern, die Laktatproduktion erhöhen, die Glykolyse inhibieren etc. Dar-

auf beruht die Wichtigkeit der Bestimmung der Konzentration-abhängigen Quin-

2/AM-Zytotoxizität, um bei geringsten negativen Einflüssen auf die untersuchten

Zellen die noch optimale Fluoreszenzintensität erreichen zu können. Die Anrei-

cherung von Quin-2 ist an der Vitalität der Zellen angekoppelt, da die stark alte-

rierten bzw. sterbende Zellen ein Austritt von Quin-2 aus der Zelle ermöglichen

(�dye leaking�). Das Ausmaß der Anreicherung ist von der angebotenen

extrazellulären [Quin-2/AM]e Konzentration, dem Dauer des Ladevorganges und

Temperatur-abhängig. Da die verschiedenen Zellpopulationen, abhängig von ih-

rem Gehalt an unspezifischen Esterasen, mit unterschiedlichen Geschwindigkei-

ten die Konversion von Quin-2/AM zum Quin-2-Anion zeigen, soll ein zeitliches

Optimum für jede neu untersuchte Zellpopulation ermittelt werden. Die durch-

schnittliche Dauer des Ladevorganges beträgt bei 37°C zwischen 45 bis 60 Mi-

nuten. Der Ladevorgang verläuft bei der Temperatur von 37°C unter den für die

geladenen humanen Zellpopulationen optimalen physiologischen Bedinungen.

Bei der Temperaturerhöhung oberhalb von 37°C neigt Quin-2/AM zur Aggregati-

on, die niedrigeren Temperaturen beeinträchtigen, durch das Alterieren der un-

spezifischen Esterasen, die Konversionsgeschwindigkeit und -rate sowie können

zur Anreicherung von Quin-2/AM in anderen zellulären Kompartimenten führen,



wo die Hydrolyse nicht vollgezogen werden kann.

Die Messung der intrazellulären Calciumkonzentration erfolgt nach unter

2.1.3 beschriebenen Prinzipien. Die Probe wird in einer Küvette mit einer Rühr-

und Thermostatvorrichtung untersucht. Dies gewährleistet die optimale Tempera-

tur (üblicherweise 37°C) und verhindert weitgehend die physikalische Aggregati-

on der Zellen, die sonst den Signal empfindlich stören könnte. Die Anregung der

Fluoreszenz erfolgt mit monochromatischen 339 nm Photonen und die Intensität

der Fluoreszenz wird über den Photomultiplier für die Wellenlänge 495-500 nm

gemessen. Fmax

, entsprechend der vollständiger Sättigung der Quin-2-Moleküle

mit Calciumkationen, wird nach der Zugabe eines Detergentes gemessen. Da-

durch kann das bisher intrazelluläre Quin-2 mit Überschuß an Calciumionen aus

dem extrazellulären Medium reagieren. Fmin

wird nach der Zugabe eines Chelators

gemessen, der alle Calciumkationen aus dem Ca2+/Quin-2-Komplex verdrängt und

auf diese Weise die für Quin-2 erreichbare Calciumkonzentration gegen Null zu-

rückführt. Üblicherweise wird EGTA verwendet, da es höhere Affinität für die

Calciumkationen als Quin-2 selbst aufweist. Die Berechnung der [Ca2+] wird mit Kd

von 115 nm vorgenommen. Die effektive Dissoziationskonstante Kd ist von der

Temperatur, Ionenstärke, Konzentration der Magnesiumkationen und pH-Wertes,

wenn dieser unter 6.5-6,8 fällt (da die höchste pKa des Quin-2 ca. 6,5 beträgt),

abhängig. Die Einflüße seitens der Temperaturänderungen können durch das Tem-

perieren der Probe ausgeschaltet werden. In humanen Zellen sind die Ionen-

stärke und totale Konzentration der monovalenten Kationen relativ konstant. Der

Einfluß der Magnesiumkonzentration auf die gemessene Fluoreszenzintensität

ist bei der Absorption mit 339 nm Wellenlänge gering. Durch die Dispersion der

Zellen in Pufferlösungen kann eine weitgehende pH-Stabilität erreicht werden,

zumindest aber ein pH-Wert über 6,8, zumal fast alle Säugetierenzellen ein intra-

zelluläres pH von 6,9-7,4 aufweisen. Diese Annahmen erlauben die Kd-Bestim-

mung in vitro in einem Medium, dessen Zusammensetzung die des Cytosols imi-

tiert. Auf diese Weise bestimmte Kd weist in Anwesenheit von 120 mM K+, 20 mM

Na+, 1 mM Mg2+, pH=7,05 und 37°C ein Wert von 115 nM auf. Diese Ergebnisse

konnten durch in vivo durchgeführte Bestimmungen bestätigt werden, so daß

viele Geräte, wie Jasco CA-261, nur diese Größe akzeptieren. Aufgrung der obi-

gen Ausführungen erscheint

die Annahme der intrazellulären Kd-Konstanz und des K

d-Wertes gerechtfertigt

und durch subtile Verschiebungen der oben genannten Parametern hervorgeru-

fene Änderungen der Kd zu vernachlässigen.

Aufgrund des Wertes für Dissoziationskonstante Kd ist die Sensitivität der

Calciumkonzentrationsmessung für die Werte, die um den Kd-Wert liegen, am größ-

ten. Da die Kd in den vitalen Zellen Wert um 115 nM aufweist, werden [Ca2+]

i der

nicht aktivierten Zellen, die dieser Größeordnung (100-200 nM) entsprechen, am

sensitivsten erfaßt. Die Erhöhung der Calciumkonzentration um eine Größeordnung

der Kd verursacht fast die vollständige Sättigung des Indikators mit Calciumkationen

und daher nur sehr geringe Sensitivität der Messung. Für die humanen Zellen

entspricht dieser Wert der [Ca2+]i von ca. 10-6 M und gleicht der intrazellulären

Calciumkonzentration der stimulierten Zellen.

In Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Bestimmung der Effektivität

des Ladevorganges in Abhängigkeit von der extrazellulären Quin-2/AM, der Dau-

er des Vorgangs. Es folgte die Bestimmung des Einflusses der unterschiedlichen

extrazellulären Quin-2/AM-Konzentrationen auf die Vitalität und Funktion der un-

tersuchten Zellinien. Diese Ergebnisse sind ausführlich im Kapitel 3 dargestellt.

2.2 Zellkultur

Die Zellinien RBL-2H3 und RBL-2H3-m3.7, die das Objekt dieser Arbeit

sind, wurden freundlicherweise von Herrn Dr. Reuben P. Siraganian (Labor für

Klinische Immunologie ,National Institute of Dental Research, National Institutes

of Health, Bethesda, Maryland 20-892, USA) zur Verfügung gestellt. Die RBL-

2H3- bzw. RBL-2H3-m3.7- Zellen (weiter RBL-2H3 bzw. RBL-2H3-m3.7 genannt)

wurden in 175 cm² �Falcon� Zellkulturflaschen (Fa. Becton-Dickinson, Katalog-Nr.

3024) kultiviert. Die Subkultivation folgte der Methodik nach Siraganian et al. (162).

Zum Ablösen der Zellschicht von dem Boden der Flasche führte die Gabe von 10

ml Trypsin-EDTA (Fa. Gibco, Katalog-Nr. 043-053004 a 100 ml) mit anschließen-

der Inkubation über 5 Min. bei 37 °C mit 5%CO2 im Brutschrank. Durch das sanfte

Klopfen der Flasche wurden die Zellen von dem Boden vollständig abgelöst. Dar-

aufhin folgte die Zugabe von 10 ml Zellkulturmedium. Die Zellsuspension


wurde in 50 ml �Falcon� Röhrchen (Becton-Dickinson, Katalog-Nr. :2070) über-

führt. Das Zellkulturmedium wurde mit Minimum Essential Medium (Fa. Gibco

Katalog-Nr. : 041-01090M a 500 ml) unter Zugabe von 15% FCS (Fötales Kalb-

serum Fa. Gibco Katalog-Nr. : 01106290M, Charge-Nr. : 40669126, hitzeinaktiviert,

a 500 ml), 2 mM Glutamin (Fa. Gibco Katalog-Nr. : 043-050-30H, a 100 ml) 1%

Antibiotikum (Penicillin 5000 IE /ml, Streptomycin 5000 µg/ml, Fa. Flow Katalog-

Nr. : 16700-49, a 100 ml) und 100 Mm HEPES (Fa. Serva Katalog-Nr. : 47260,

1M/l, a 50 ml) hergestellt. Darauf folgender Waschvorgang bestand aus: 1. 5 Min.

Zentrifugieren bei 300∗g (1000 U.p.m. in Labo-Fuge 1, Modell 1620, Fa. Heraeus,

Deutschland) 2. Dekantieren des Überstandes und 3. Auflösen der Zellpellets in

20 ml Zellkulturmedium. Dieser Vorgang wurde noch einmal wiederholt und so

gewaschene Zellen konnten in 30 ml Medium überführt und alliquot (a 10 ml) auf

drei 175 cm² �Falcon� Zellkulturflaschen verteilt werden. Abschließend folgte das

Auffüllen der Flaschen mit Medium auf das Endvolumen von 25 ml mit initialer

Zellmenge von ca. 5∗106 Zellen pro Flasche. Die Flaschen lagerten bei 37 °C und

5% CO2 im Brutschrank. Die Subkultiverung wurde nach 48 bis 72 Stunden ab-

hängig von der mikroskopisch festgestellten Zelldichte (Invertoskope Id 03 MT,

Carl Zeiss, Deutschland) wiederholt. Die durchschnittliche Zellmenge betrug nach

48 bis 72 Stunden ca. 30∗106 Zellen pro 175 cm² �Falcon�- Zellkulturflasche.

2.3 Zellstimulation

Die für die Stimulationsversuche bestimmten Zellen wurden wie unter 2.1

beschrieben vom Boden der Zellkulturflaschen abgelöst, unter Zugabe von 5 ml

des Zellkulturmediums in 15 ml �Falcon�-Rörchen (Fa. Becton-Dickinson, Kata-

log-Nr. : 2097) überführt und nachfolgend bei 300∗g zentrifugiert. Nach dem De-

kantieren des Überstandes und Ersetzen dieses durch 10 ml des Zellkulturmediums

folgte das Zentrifugieren bei 300∗g. Dieser Prozedere wurde insgesamt zweimalig

durchgeführt. Die gewaschenen Zellen konnten nachfolgend in der Neubauer-Zähl-

kammer gezählt werden. Durch Zugabe von Kulturmedium erfolgte die Einstellung

der Zellzahl auf 0,5∗106 / ml. Insgesamt 2,5 ∗106 Zellen mit zusätzlich 5 ml Kultur-

medium wurden in eine 75 cm² Zellkulturflasche (Fa. Becton-Dickinson, Katalog-

Zellstimulation 65______________________________________________________________________________


-Nr. : 3024) gegeben und über ca. 16 Stunden bei 37°C und 5% CO2 im Brut-

schrank inkubiert. Da die Stimulationsversuche zum Ermitteln der Serotonin-

freisetzung und des Calciumeinstroms nicht an den gleichen Zellproben durchge-

führt werden konnten (Radioaktivität der Proben für die Serotoninfreisetzung mit

Konsequenz der Kontamination), mußte nach diesem Arbeitsschritt die getrennte

Inkubation vor den nachfolgenden Stimulationsversuchen unternommen werden.

Die Zellen der Zellinie RBL-2H3 wurden mit monoklonalem anti-DNP-IgE

(anti-2,4-dinitro-phenyl-IgE aus dem Mausaszites) (163) in der Suspension vom

Kulturmedium in den 75 cm² Kulturflaschen über 120 Min. inkubiert. Die Verdün-

nung von anti-DNP-IgE betrug in der Kulturflasche 1:10000). Nach dem

Abpippetieren des Mediums, um das überschüssiges, nicht an FcεRI gebundenes

anti-DNP-IgE entfernen zu können, wurden die 75 cm² Zellkulturflaschen entspre-

chend den vorgesehenen Stimulationsversuchenreihen (Messung der Serotonin-

freisetzung in An- und Abwesenheit von mAb AA4, Messung des Calciumeinstroms

in An- und Abwesenheit von mAb AA4) beschichtet. Die Konzentration von mAb

AA4, die bei der den eigentlichen Stimulationsversuchen vorausgehenden Inku-

bation verwendet wurde, wurde den Arbeiten von Stephan et al. (164) entnom-

men.

Für die Serotoninfreisetzungmessungen bestimmten 75 cm²-Zellkultur-

flaschen wurden in zwei Versuchsreihen aufgeteilt: 1. in Abwesenheit von mAb

AA4 2. in Anwesenheit von mAb AA4 (Inkubation mit 60 µg/ml von mAb AA4). Bei

den 75 cm²-Zellkulturflaschen der beiden Versuchsreihen folgte die Beschichtung

mit Zellkulturmedium in Volumen von 10 ml pro Flasche unter Zugabe von 1 µl

anti-DNP-IgE und 5 µl von 5-Hydroxy [³H]Tryptaminkreatininsulphat (Fa. Amersham

Katalog -Nr.: TRK233, 1mCi/ml, Aktivität in 75 cm²-Zellkulturflasche 5nCi). An die-

sem Arbeitsschritt schloß sich die 16 stündliche Inkubation bei 37°C und 5% CO2

im Brutschrank an.

Für die Calciumeinstrommessung vorgesehene 75 cm²-Zellkulturflaschen

wurden ebenso in zwei Versuchsreihen aufgeteilt (mit und ohne Inkubation mit

mAb AA4). Die Zellen inkubierten ohne Zugabe von 5-Hydroxy [³H] Tryptamin-

kreatininsulphat, die Menge an mAb AA4 betrug für die entsprechende Versuchs-

reihe 60 µg/ml.


Die Zellen der Zellinie RBL-2H3-m3.7 unterlagen außer der Zugabe von

anti-DNP-IgE, da sie mit Carbachol via m3-AChR stimuliert wurden, den gleichen

Arbeitschritten bei den Stimulationsversuchen vorausgehender Inkubation wie

bereits für die Zellinie RBL-2H3 beschrieben. Sie wurden auch anschließend über

16 Stunden bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank inkubiert.

2.3.1 Messung der Serotoninfreisetzung

Die Bestimmung der Serotoninfreisetzung basierte im wesentlichen auf der

erstmalig von Otsuki et al. beschriebenen Methodik (165) modifiziert nach Taurog

et al. (166). In der Inkubationsphase (Kap. 2.3) angebotenes 5-Hydroxy (³H)-

Tryptaminkreatininsulphat wird von den Zellen inkorporiert und zur Synthese von

Serotonin (5-Hydroxy-(³H)tryptamin) verwendet. Durch die Stimulation der RBL-

2H3-Zellen, mit einem bestimmten Antigen (hier an Humanalbumin gekoppelte 35

Moleküle von 2,4-Dinitrophenyl), die vorher mit einem gegen diesem Antigen ge-

richteten spezifischen monoklonalen Antikörper (anti-DNP-IgE) inkubiert wurden,

kommt es über durch das Antigen verursachtes Bridging an den FcεRI gebunde-

nen IgE Moleküle zur nachfolgenden Degranulation und extrazellulären Freiset-

zung von mit ³H radioaktiv markiertem Serotonin. Die Zellen der Sublinie m3.7

wurden mit Carbachol stimuliert. Durch Bindung dessen an den m3-AChR kommt

es über G -Protein zur Degranulation und zur extrazellulären Freisetzung von 5-

Hydroxy(³H)tryptamin. Nach dem Zentrifugieren kann die im Überstand befindli-

che Menge an 5-Hydroxy(³H)tryptamin, die der Menge des von den Zellen freige-

setzten Serotonins entspricht, mit Hilfe von einem Szintillationszähler ermittelt

werden. Die Gesamtmenge des in den Zellen befindlichen 5-Hydroxy-(³H)tryptamins

kann durch die vollständige Zellyse mit Perchlorsäure bestimmt werden. Die

Serotoninfreisetzung wird als freigesetztes 5-Hydroxytryptamin in Prozent der Ge-

samtmenge angegeben.

Nach der unter 2.3 beschriebenen Inkubation der Zellen der Zellinien RBL-

2H3 und RBL-2H3-3M folgte im nächsten Arbeitsschritt die Ablösung der Zellen

vom Boden der Kulturflaschen und zweimaliges Waschen unter Zugabe von 10 ml

Zellkulturmedium (37°C, 300∗g, 5 Min.). Nach der Umsetzung der Zellpellets in

die 50 ml �Falcon�-Röhrchen und Zugabe von 35 ml des Zellkulturmediums

verbrachten die Proben 120 Min. in einem Hybridisationsofen bei 37°C und einge-

schaltetem Rotor. Für die Serotoninfreisetzungmessung bestimmten Zellpopula-

tionen unterlagen nach diesem Arbeitsschritt unter 2.3.2 beschriebenen Lade-

verfahren mit Quin-2. Nach dem Abschluß des Ladevorganges folgte nach dem

letzten Waschen der Zellen, um das von den Zellen nicht inkorporiertes 5-Hydroxy-

Tryptaminkreatininsulphat zu entfernen, das Resuspendieren in 5 ml PBS-Puffer

0,1% BSA (PBS-Puffer: 150 Mm NaCl, 3,7 mM KCl, 3,0 mM Na2HPO

4, 3,5 mM

KH2PO

4, 1 mM CaCl

2, 0,5 mM MgCl

2 in 1000 ml H

2O (in Mili-Q gereinigt, Milipore

Corporation) pH 7,4 mit Zusatz von 0,1 % BSA (Rinderserumalbumin-�bovine

albumin initial fractionation by cold precipitation� der Fa. Sigma Chemicals Kat.

Nr.: A-7638).

Für die Zellen der Zellinie RBL-2H3 wurden insgesamt vier Versuchsreihen

in 6ml �Poly-Q-Vials�-Röhrchen (Fa. Beckmann, Katalog-Nr. : 592928) unter je-

weiliger Zugabe von 500 µl von der Zellsuspension vorbereitet: 1. Gesamtserotonin-

freisetzung mit 500 µl von 10% Perchlorsäure (Endkonzentration 5%) 2.

Spontanserotoninfreisetzung mit 500 µl von 0,1% BSA PBS-Puffer 3.

Serotoninfreisetzung bei der optimalen Stimulation mit DNP35

-HSA (35 Moleküle

von 2,4-Dinitrophenol konjugiert mit einer Moleküle von humanem Serumalbu-

min,Fa. Calbiochem, Kat. Nr.: 324101) in Konzentration von 100 ng/ml mit 500 µl

von DNP35

-HSAaq (Konzentration der Arbeitslösung 20 ng/ml) 4. Serotonin-

freisetzung bei der suboptimaler Stimulation mit DNP35

-HSA in Konzentration von

10 ng/ml mit 500µl von DNP35

-HSAaq (Konzentration der Arbeitslösung 200 ng/

ml). Die Konzentrationen von DNP35

-HSAaq für die optimale und suboptimale

Antigenstimulation wurden in den Vorversuchen ermittelt (s. Kap.3). Für die Mes-

sungen wurden die Zellen verwendet, die wie unter 2.3 beschrieben in An- und

Abwesenheit von mAb AA4 inkubiert wurden. Die so vorbereiteten Proben ver-

brachten nach dem Mischen des Rörcheninhaltes 30 Minuten im Wasserbad bei

37°C. Nach dem Zentrifugieren bei 1500 U.p.m. über 5 Min. wurden jeweils 200 µl

des Überstandes entnommen und zu 10 ml der Szintillationsflüssigkeit (�Ready

Safe� Liquid Scintillation Cocktail, Fa. Beckman, Katalog -Nr.: S203022) in einem

6 ml Counterrörchen zugegeben. Die Messung der β-Aktivität der Proben erfolgte

mit Hilfe von einem Szintillationszähler der Fa. Beckmann. Die Serotoninfreisetzung


der einzelnen Proben wurde aus dem Quotienten zwischen der in dem Supernatant

der Probe gemessenen Szintilationsrate (counts per minute) und der Szintillations-

rate der Probe, in der die Bestimmung der Gesamtmenge des radioaktiv markier-

ten Serotonins, das von den Zellen synthetisiert wurde, durch Lyse der Zellen

durch Perchlorsäure erfolgte, errechnet. Alle Werten für die Serotoninfreisetzung

wurden prozentuell angegeben.

Die Bestimmung der Serotoninfreisetzung für die Zellen der Zellinie RBL-

2H3-m3.7 folgte dem oben beschriebenen Prozedere. Es wurden vier Versuchs-

reihen in An- und Abwesenheit von mAb AA4. Die Stimulation der Zellen erfolgte

durch Inkubation mit Carbachol (Carbamylcholinchlorid, Fa. Sigma, Katalog Nr.:

C-4382) in Endkonzentrationen 3 µM und 1000 µM. Diese Konzentrationen wur-

den in Vorversuchen ermittelt (s. Kap.3). Die Proben für die Gesamt- und

Spontanserotoninfreisetzung wurden analog dem Verfahren für RBL-2H3-Zellen

vorbereitet. Die Auswertung entsprach dem oben aufgeführten Procedere.

2.3.2 Messung der intrazellulären Calciumkonzentration

Für die Messung der intrazellulären Calciumkonzentration vorgesehene

Zellproben wurden gleichzeitig mit den Zellproben für die Serotoninfreisetzung

präpariert. Wie unter 2.3.2 beschrieben wurden die Zellen der RBL-2H3 und RBL-

2H3-m3.7-Zellinie nach der Subkultivierung über 16 Stunden in 75 cm² �Falcon�-

Flaschen einer Präinkubation unter Zugabe von monoklonalen anti-DNP-IgE über

2 Stunden (nur die RBL-2H3-Zellen, die RBL-2H3-m3.7-Zellen wurden über glei-

chen Zeitraum mit Zellmedium inkubiert) unterzogen. Die Zellen wurden in zwei

Versuchsreihen für die Stimulationsversuche in An- und Abwesenheit von mAb

AA4 aufgeteilt. Die Konzentration von mAb AA4 war wie unter 2.3.angegeben. Es

folgte die weitere Inkubation über 16 Stunden bei 37°C und 5% CO2 im Brut-

schrank. Danach konnten die Zellen mit Trypsin-EDTA von Flaschenböden abge-

löst werden und nach zweimaligen Waschen mit dem Zellmedium, um

überschüßiges mAb AA4 zu entfernen, in 50ml �Falcon� Röhrchen unter Zugabe

von 35 ml des Zellkulturmediums überführt werden. Die so erstellten



Zellproben verblieben 120 Min. in einem Hybridisationsofen bei 37°C und

eigeschaltetem Rotor, um der Zellaggregation vorzubeugen. Nach dem darauffol-

genden Zentrifugieren bei 300∗g über 5 Min. wurde der Zellpellet in 10 ml des

Kulturmediums aufgelöst und unter Zugabe von 10 µl von 10mM Quin-2/AM Lö-

sung (in DMSO gelöst, Fa. Sigma Chemicals, Kat. Nr.: Q-4875, Endkonzentration

von Quin-2/AM 10 µM) in ein 10 ml �Falcon� Röhrchen überführt. Der Ladevor-

gang der Zellen mit Quin-2/AM wurde über 45 Min. in dem Hybridisationsofen,

unter Bedinungen wie angegeben, vollgezogen. Die angegebene Konzentration

von Quin-2/AM sowie die Dauer des Ladevorganges wurden in Rahmen der Vor-

versuche (s. Kapitel 3) für optimal für die Vitalität der Zellen gefunden. Nach dem

Abschluß des Ladevorganges wurden die Zellen zwei Mal mit PBS 0,1%-BSA

gewaschen, um verbleibenden von den Zellen nicht aufgenommenen Anteil an

Quin-2/AM zu eliminieren, und anschließend die Zellpellets nach der Einstellung

der Zellzahl auf 1∗106/ml in 10ml PBS 0,1% BSA resuspendiert.

Die Zellproben von 2 ml Volumen verblieben zunächst 3 Min. in der 4 ml

Quarzküvette des Spektrofluorometers (Jasco FP-777, Jasco, Grobzimmern,

Deutschland). Die Zellsuspension wurde unter ständigem Mischen mit einem ma-

gnetischen Rührfisch auf 37°C temperiert. Die Zellproben, die momentan für die

Messungen nicht gebraucht worden sind, verblieben weiterhin im Hybridisations-

ofen. Direkt vor der Messung wurden sie zentrifugiert und in frisches Medium über-

führt, um die extrazelluläre Quin-2-Fraktion zu eliminieren.

Die Stimulation der mit anti-DNP-IgE vorinkubierten RBL-2H3-Zellen er-

folgte durch Zugabe von DNP35

HSA in zwei Konzentrationen: 10ng/ml der

Zellsuspension (suboptimale Stimulation) und 100ng/ml der Zellsuspension (op-

timale Stimulation). Die RBL-2H3-m3.7-Zellen wurden mit Carbachol in

suboptimaler und optimaler Konzentration (3 µM resp. 1 mM) stimuliert. Alle an-

gegebene Konzentrationen beziehen sich auf die Endkonzentration in der Küvette.

Die Messung der intrazellulären Calciumkonzentration folgte der von R.

Tsien etablierten Methodik (167). Die Emissions- und Absorptionswellenlänge be-

trugen 339 nm resp. 492 nm mit Schränkenbreite von jeweils 5-10 nm. Die Inten-

sität der Fluoreszenz wurde alle 2 Sekunden gemessen. In typischem Experiment

folgte in 10-15 s nach der Antigenzugabe der langsame Anstieg der Calcium-


-konzentration bis zum Erreichen der Plateauphase, gefolgt von langsamem Ab-

fall bis zur Ausgangkonzentration. Nach der Zugabe von 80 µl Tris -EGTA

(Endkonzentrationen: TRIS 40 mM, EGTA 10 mM), das eine größere Bindungs-

konstante für Calciumkation als Quin-2 besitzt, konnte die minimale Intensität der

Fluoreszenz (Fmin

) gemessen werden. Die maximale Intensität der Fluoreszenz

(Fmax

) der Probe wurde nach der Beendigung jedes Experiments über die Lyse der

Zellen mit einem nichtionischen Detergent Triton X-100 (10 µl, Endkonzentration

in der Küvette 0,05%) gemessen. Auf diese Weise konnte die vollständige Satu-

ration von Quin-2 mit Calciumkationen erreicht werden. Der verwendete

Spektrofluorometer verfügt über einen Mikroprozessor, der automatisch über ei-

nen EDV-gestützten Algorithmus die alle 2 sec. während des Versuches gemes-

sene Fluoreszenzintensität in die Calciumkonzentration umrechnen kann. Da das

gemessene Fluoreszenzsignal zum Teil nicht unerhebliche Oszillationen aufweist,

die auf die Zellaggeregaten zurückzuführen sind, wurden die Werte für die Calcium-

konzentration der unstimmulierten Zellen und für die maximale Calcium-

konzentration nach der Antigenstimulation als Mittelwerte der allen in der Aus-

gangs- und Plateauphase alle 2 sec. ermittelten Calciumkonzentrationen ange-

geben.

72______________________________________________________________________________

3 Ergebnisse

3.1 Bestimmung der spektralen Eigenschaften von Quin-2

Die Bestimmung der spektralen Eigenschaften von Quin-2/AM, Quin-2 und des

Komplexes Quin-2/Ca2+ diente der Prüfung der Übereinstimmung dieser mit den

Parametern der Literaturangaben und somit der Qualitätskontrolle des verwende-

ten experimentellen Set-up`s. Die Anregungs- und Emissionsspektra wurden nach

der Auflösung des untersuchten Quin-2 Derivates in den Puffern, die keine zellulären

Bestandteile enthielten, vorgenommen. Die Anregungs- und Emissionsspektra für

Quin-2/AM wurden in 100 mM KCl bei 22°C gemessen. Die Anregungs- und

Emissionsspektra für Quin-2 wurden in PBS-Puffer mit 2 mM K2H

2EGTA bei 22°C

gemessen. Die Zugabe von 2 mM K2H

2EGTA sollte die nicht auszuschließende

Kontamination mit Calciumkationen eliminieren. Die Hydrolyse des Tetraacetylesters

des Quin-2 (Quin-2/AM) und somit Übergang in freie Form (Quin-2) erfolgte durch

Zugabe von NaOH. Die Anregungs- und Emissionsspektra für Quin-2/Ca2+ wur-

den in Puffer mit 130 mM KCl, 10 mM MOPS, 1 mM EGTA, 2 mM CaCl2 bei

pH=7,2 (mit KOH bei 20°C eingestellt) und 37°C gemessen. Die Endkonzentration

der Calciumkationen betrug 1 mM. Die Anregungs- und Emissionsspektra wurden

separat für Quin-2/AM, Quin-2 und das Komplex Quin-2/Ca2+ bei kontinuierlichem

Rühren mit einem magnetischen Rührer durchgeführt. Die Ergebnisse der Be-

stimmung der spektralen Eigenschaften der untersuchten Verbindungen werden

in Form der Absorptions- und Emissionsspektra in den folgenden Kapiteln 3.1.1-

3.1.3 graphisch als Originaldaten dargestellt.

3.1.1 Anregungs- und Emissionsspektrum von Quin-2/AM

73______________________________________________________________________________

Die Bestimmung der spektralen Eigenschaften von Quin-2/AM,erbrachte die Er-

gebnisse, die mit Literaturangaben übereinstimmen. Das Absorptionsmaximum

und das Emmisionsmaximum lagen für Quin-2/AM bei λex= 339 nm und λ

em= 430

nm. Die in der Literatur angegebene Maxima für Quin-2/AM, sind λex

= 339 nm und

λem

= 430 nm.

Abbildung 12 Absorptionsspektrum von Quin 2/ AM. 20 µM Quin-2/AM in 100 mM KCl bei 22°C.

Spektrum der Wellenlänge der Anregungsphotonen 300-400 nm. Das Absorptionsmaximum bei

gemessener Emission von 500 nm lag bei 339 nm.

Abbildung 13 Emissionsspektrum von Quin 2/ AM. 20 µM Quin-2/AM in 100 mM KCl bei 22°C.

Spektrum der Wellenlänge der gemessenen emitierten Photonen 425-510 nm. Das

Emissionssmaximum bei gemessener Absorption von 340 nm lag bei 430 nm.

74 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________

Wellenlänge (nm)

Flu

ore

sze

nzin

tensitä

t

Absorptionsmaximum=339 nm

320 340 360 380 400

450 500

Emissionsmaximum=430 nm

Wellenlänge (nm)

Flu

ore

szenzin

tensität

3.1.2 Anregungs- und Emissionsspektrum von Quin-2

Die Bestimmung der spektralen Eigenschaften von Quin-2, erbrachte die Ergeb-

nisse, die mit Literaturangaben weitgehend übereinstimmen. Das Absorptions-

maximum und das Emmisionsmaximum lagen für Quin-2 bei λex= 364 nm und λ

em=

502 nm. Die in der Literatur angegebene Maxima für Quin-2 sind λex= 352 nm und

λem

= 492 nm. Die leichte Verschiebung der beiden Maxima erklärt sich am ehe-

sten dadurch, daß die maximalen Wellenlängen der Anregung und Emission in

Spektren sich über einige Nanometer erstrecken und keinen eindeutig zu erken-

nenden Peak-Wert besitzen.

Abbildung 14 Absorptionsspektrum von Quin 2. Messung in PBS-Puffer mit 2 mM K2H

2EGTA bei

22°C nach der Hydrolyse von 20 µM Quin-2/AM mit NaOH. Spektrum der Wellenlänge der An-

regungsphotonen 300-400 nm. Das Absorptionsmaximum bei gemessener Emission von 500 nm

lag bei 364 nm.

Bestimmung der spektralen Eigenschaften von Quin-2 75______________________________________________________________________________


400380360340320

Wellenlänge (nm)

Flu

ore

szenzin

tensität

Abbildung 15 Emissionsspektrum von Quin 2. Messung in PBS-Puffer mit 2 mM K2H

2EGTA bei

22°C nach der Hydrolyse von 20 µM Quin-2/AM mit NaOH. Spektrum der Wellenlänge der ge-

messenen emitierten Photonen 400-600 nm. Das Emissionssmaximum bei gemessener Absorp-

tion von 350 nm lag bei 502 nm.

3.1.3 Anregungs- und Emissionsspektrum von Quin-2/Ca2+

Die Bestimmung der spektralen Eigenschaften des Komplexes Quin-2/Ca2+, er-

brachte die Ergebnisse, die mit Literaturangaben weitgehend übereinstimmen. Das

Absorptionsmaximum und das Emmisionsmaximum lagen für Quin-2/Ca2+ bei λex

=

331 nm und λem

= 501 nm. Die in der Literatur angegebene Maxima für Quin-2/

Ca2+, sind λex

= 332 nm und λem

= 492 nm. Die leichte Verschiebung der beiden

Maxima erklärt sich am ehesten dadurch, daß die maximalen Wellenlängen der

Anregung und Emission in Spektren sich über einige Nanometer erstrecken und

keinen eindeutig zu erkennenden Peak-Wert besitzen.

76 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________

Flu

ore

szenzin

tensität

450 500 550 600


Wellenlänge (nm)

Abbildung 16 Absorptionsspektrum von Quin 2/Ca2+. Messung in 130 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1

mM EGTA,10 mM MOPS pH=7,2 bei 37°C nach der Hydrolyse von 20 µM Quin-2/AM mit NaOH.

Spektrum der Wellenlänge der Anregungsphotonen 300-450 nm. Das Absorptionsmaximum bei

gemessener Emission von 500 nm lag bei 331 nm.

Abbildung 17 Emissionsspektrum von Quin 2/Ca2+. Messung in 130 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM

EGTA,10 mM MOPS pH=7,2 bei 37°C nach der Hydrolyse von 20 µM Quin-2/AM mit NaOH.

Spektrum der Wellenlänge der gemessenen emitierten Photonen 400-600 nm. Das Absorptions-

maximum bei gemessener Absorption von 330 nm lag bei 501 nm.

Bestimmung der spektralen Eigenschaften von Quin-2 77______________________________________________________________________________

Flu

ore

szenzin

tensität

350 400 450

Wellenlänge (nm)


Flu

ore

szenzin

ten

sität

500 550 600

Wellenlänge (nm)


3.2 Bestimmung der Dissoziationskonstante des Komplexes Quin-2/Ca2+

Die Bestimmung der Dissoziationskonstante des Komplexes Quin-2/Ca2+

diente der Prüfung der Übereinstimmung dieser mit den Literaturangaben und

somit der Qualitätskontrolle des verwendeten experimentellen Set-up`s. Die Be-

stimmung der Dissoziationskonstante Kd folgte der von Tsien et al. (168) für die

Fluoreszenzindikatoren beschriebenen Methodik. 10 µM Quin-2/AM wurde durch

die Zugabe von NaOH hydrolysiert und in freies Quin-2-Anion überführt. Bei

pH=7,04 und Temperatur 37°C und Puffer, der Konstanz an Konzentration der

Calcium- und Magnesiumkationen gewährleistet (115 mM KCl, 20 mM NaCl, 10

mM MOPS, 2,207 mM K2H

2EGTA, 1,207 mM MgCl

2, pH mit KOH auf 7,05 einge-

stellt bei 37°C) wurde die Fluoreszenzintensität der Proben mit steigender Kon-

zentration an freien [Ca2+] gemessen. Es wurde Fmin

und Fmax

für [Ca2+]f =0,0 µM

resp. [Ca2+]f→+∞ gemessen. Die steigende Konzentration an freien Calcium-

kationen wurde durch die Zugabe von konstanten Volumina (5-20 µl) an 0,02 mM

K2CaEGTA in die Küvette des Fluorospektrometers erreicht. So konnten bei kon-

stanten pH und Temperatur die annäherend reellen Calciumkonzentrationen a

posteriori errechnet werden (159) und falsche [Ca2+]f, die durch die nicht vermeid-

baren Pipettierfehler beim Erstellen der a priori gewählten [Ca2+] entstehen, ver-

mieden werden. Die Berechnung der Konzentrationen der freien Calciumkationen

([Ca2+]f) folgte der Formel [Ca2+]

f = [Ca2+-EGTA](K

d/[EGTA]). Die so gewonnenen

Parameter wurden in Form eines sog. �Hill plot��s als Funktion log (F-Fmin

/Fmax

-F)

versus log [Ca2+]f dargestellt und analysiert. Nach der EDV-gestützten Funktions-

analyse folgt die Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der Konzentration

der freien Calciumkationen der Funktion:

[Ca2+]f =a

1((F-F

min/F

max-F) + a

0

,wo a1=1,00 und a

0 =-0,938.

Diese Funktion kann auch als:

log [Ca2+]f =log(F-F

min/F

max-F)+log K

d

anhand der Formel II (Kap.1.2.3) dargestellt werden. Daraus errechnete Kd

log Kd=-0,938 (K

d=10-0,938µM=0,11534µM)

beträgt 115,34 nM bei pH=7,04, 37°C und [Mg2+]=1 nM.

78 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________

1 0-1

1 00

1 01

1 02

1 03

1 00

1 01

1 02

1 03

1 04

log [Ca2+-Konzentration]

log [

(F-F

min

)/(F

max-F

)]Die in vitro durchgeführte Bestimmung der Dissoziationskonstante K

d er-

brachte ein Wert von 115 nM, der allgemein als eine Konstante für diese Substanz

eingesetzt wird.

Abbildung 18 Bestimmung der Dissoziationskonstante des Komplexes Quin 2/Ca2+. Messung

der maximalen (Fmax

) und minimalen (Fmin

) Fluoreszenzintensität bei a posteriori bestimmten

Calciumkonzentrationen zwischen 0,267 µM und 598,7 µM bei 37°C in ionischem Milieu von

115 mM KCl, 20 mM NaCl, 2,207 mM K2H

2EGTA, 1,207 mM MgCl

2 (pH=7,05 mit KOH eingestellt).

10 µM Quin 2/AM wurde mit NaOH hydrolysiert. Die Analyse der Messwerte erfolgte in Form

eines Hill-plots. Daraus errechneter Wert der Dissoziationskonstante des Komplexes Quin 2/

Ca2+ bei [Mg2+]=1 mM und 37°C beträgt 115 nM.

3.3 Bestimmung der Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der Quin-2/

Ca²+-Konzentration

Die Fluoreszenzintensität des Komplexes Quin-2/Ca2+ weist eine lineare

Beziehung zu dessen Konzentration auf und ist somit direkt proportionell zur intra-

zellulären Calciumkonzentration (zumindest unter den physiologischen Bedingun-

gen, wo die intrazelluläre Calciumkonzentration ca. 100 nM bis ca. 1 mM beträgt).

Bestimmung der Dissoziationskonstante des Komplexes Quin-2/Ca2+ 79______________________________________________________________________________

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

1000

2000

3000

r2=0,9992

[Komplex Quin 2/Ca2+

] in µM

Flu

ore

szen

zin

ten

sit

ät

(arb

iträ

reE

inh

eit

en

) Die Bestimmung der Eichkurve der Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von

der Calciumkonzentration kann, wie bereits unter 2.1.4 beschrieben, in einem

zellfreien System erfolgen. Die Messungen wurden mit Suspension von freien Kation

von Quin-2 im PBS-Puffer bei pH=7,4 und 37°C durchgeführt. Die Endkonzentra-

tionen von [Ca2+]f und [Mg2+]

f betrugen 1 mM und 0,5 mM. 100, die minimale F

min

nach der Zugabe von 0,5 mM MnCl2 gemessen. 10 mM Quin-2/AM wurden mit

äquimolarer Menge an NaOH über 5 Min. bei Zimmertemperatur zum freien Tetra-

anion Quin-2 hydrolysiert. Die λex

und λem

betrugen 339 nm resp. 492 nm. Die

maximale Intensität der Fluoreszenz (Fmax

) wurde nach der Zugabe von 0,05%

Triton X, die minimale (Fmin

) nach der Zugabe von 0,5 mM MnCl2 gemessen. Die

Ergebnisse sind in der Abbildung 19 dargestellt.

Abbildung 19 Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der Konzentration des Komplexes

Quin 2/Ca2+. Quin 2/AM wurde mit NaOH hydrolysiert. Die Messung wurde mit Quin 2-Konzentra-

tionen von 0,5 µM bis 10 µM im PBS-Puffer bei 37°C und pH=7,4 vorgenommen. Die

Endkonzentrationen von Calcium- und Magnesiumkationen betrugen [Ca2+]=1 mM und [Mg2+]=0,5

mM. Die Messung der maximalen Fluoreszenzintensität (Fmax

) erfolgte nach Zugabe von 0,05%

Triton-X, der minimalen Fluoreszenzintensität (Fmin

) nach 0,5 mM MnCl2. Die Analyse der

Messdaten ergab ein Korrelationskoeffizient r2=0,992.

80 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________

3.4 Autofluoreszenz der nativen RBL-2H3-Zellen

Da die zellulären Komponenten eine gewisse Autofluoreszenz aufweisen,

die unter Umständen die Messung der intrazellulären Calciumkonzentration alte-

rieren kann, erfolgte die Bestimmung der spektralen Eigenschaften der nativen

RBL-2H3-Zellen, um den Anteil der Autofluoreszenz an der gesamten Fluoreszenz-

intensität der Proben zu bestimmen. Die Bestimmung der Absorptions- und

Emissionsmaxima erfolgte unter Standardbedingungen für die RBL-2H3-Zellen in

PBS 0,1% BSA Puffer bei der Zellzahl von 1∗106 Zellen/ml. Die Absorptionsmaxima

und die Emissionsmaxima der Autofluoreszenz der RBL-2H3-Zellen lagen bei λex

=

328 nm, 352 nm und 365 nm bei der Emission von 500 nm und λem

= 432 nm, 444

nm und 489 nm bei der Absorption von 332 nm, die Amplitude der Fluoreszenz-

ntensität bei der Absorption bei 332 nm betrug nur 13,04% des Signals mit Quin-

2 geladenen Zellen, so daß auf eine Korrektur der in den Stimulationsversuchen

ermittelten Werte der Calciumkonzentration verzichtet werden konnte.

Abbildung 20 Absorptionsspektra der nativen RBL-2H3-Zellen im Vergleich zum Absorptions-

spektrum von Komplex Quin 2/Ca2+.Die RBL-2H3-Zellen (1*106/ml) wurden mit 10 µM Quin 2/AM

über 45 Min. im PBS-Puffer mit 0,1% BSA geladen. 10 µM Quin 2/AM wurden nach der Hydrolyse

mit NaOH im PBS-Puffer mit 0,1% BSA gelöst. Gemessene Maxima für die nativen Zellen waren

328 nm, 352 nm, 365 nm. Im Vergleich zu Fluoreszenzintensität des Komplexes Quin 2/Ca2+

betrug die Fluoreszenzintensität der nativen RBL-2H3-Zellen bei gemessenen Emission von 500

nm ca. 10%.

Autofluoreszenz der nativen RBL-2H3-Zellen 81______________________________________________________________________________


Quin 2-Ca2+

Flu

ore

szenzin

tensität (a

rbiträ

re E

inheite

n)

320 340 360 380 400

Wellenlänge (nm)

Absorptionsmaxima= 328 nm, 352, 365nm

native RBL-2H3-Zellen

Abbildung 21 Emissionsspektra der nativen RBL-2H3-Zellen im Vergleich zum Emissionsspektrum

von Komplex Quin 2/Ca2+.Die RBL-2H3-Zellen (1*106/ml) wurden mit 10 µM Quin 2/AM über 45

Min. im PBS-Puffer mit 0,1% BSA geladen. 10 µM Quin 2/AM wurden nach der Hydrolyse mit

NaOH im PBS-Puffer mit 0,1% BSA gelöst. Gemessene Maxima für die nativen Zellen waren 432

nm, 444 nm und 489 nm. Im Vergleich zu Fluoreszenzintensität des Komplexes Quin 2/Ca2+ be-

trug die Fluoreszenzintensität der nativen RBL-2H3-Zellen bei gemessenen Emission von 500

nm ca. 13,04 %.

82 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________

3.5 Ermittlung der optimalen und suboptimalen Antigenkonzentration für die

Stimulationsversuche

Die Bestimmung der optimalen Konzentration, d.h. der Konzentration von

DNP35

HSA, bei der die maximale Stimulation der RBL-2H3-Zellen erreicht werden

kann, und der suboptimalen Konzentration , d.h. der Konzentration, bei der eine

noch messbare Stimulation bewirkt werden kann, wurde vorgenommen. Die Be-

stimmung erlaubt den sicheren Ausschluß der unzureichenden Stimulation der

Zellen sowie die Bestimmung der niedrigsten Antigenkonzentration, bei der eine

stimulatorische Antwort noch erfolgt. Die RBL-2H3-Zellen wurden bei der Zellzahl

1∗106/ml mit 10 µM Quin-2/AM über 45 Min. geladen. Die Stimulation erfolgte mit

DNP35

HSA in unterschiedlichen Konzentrationen (1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml

und 1000 ng/ml).

Flu

ore

szenzin

tensität (a

rbiträ

re E

inheiten)


Quin 2-Ca2+

native RBL-2H3-Zellen

Wellenlänge (nm)

Emissionsmaxima= 432 nm, 444 nm, 489 nm

450 500

Die Bestimmung der optimalen Antigen-(DNP35

-HSA)-Konzentration zeigte

eine optimale Stimulation der RBL-2H3-Zellen bei 100 ng/ml mit Serotoninfrei-

setzungsrate von 38,86% (Standardabweichung = 5,11%). Dieser Wert entspricht

der gängigen DNP-Konzentration, die in den referierten Stimulationsversuchen

mit RBL-2H3-Zellen eingesetzt wird. Die suboptimale Antigenkonzentration wurde

mit 10 ng/ml DNP35

-HSA ermittelt. Dabei gemessene Rate der Serotoninfreisetzung

betrug 26,44% (Standartabweichung = 4,49%). Der für die optimale und suboptimale

Antigenkonzentration parallel gemessene Anstieg der intrazellulären Calcium-

konzentration war 239 nM (Standartabweichung=109 nM) bzw. 127 nM (Standart-

abweichung=120 nM).

Abbildung 22 Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration der stimulierten RBL-2H3-Zellen

in Abhängigkeit von DNP35

HSA-Konzentration.Die RBL-2H3-Zellen wurden bei der Zellzahl 1*106/

ml mit 10 µM Quin-2/AM über 45 Min. geladen. Die Stimulation erfolgte mit DNP35

HSA in vier

unterschiedlichen Konzentrationen (1ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml und 1000 ng/ml). Die Werte für

den Anstieg der Calciumkonzentration sind Differenz zwischen der Calciumkonzentration nach

der Stimulation und der basalen Calciumkonzentration Die Ergebnisse der Versuche sind als

Mittelwert ± SEM der n=8 Versuche dargestellt.

0

100

200

300

10 -1 10 0 10 1 102 10 3 10 4

DNP BSA-Konzentration in ng/ml 35

An

sti

eg

der

[Ca2+] i

nach

der

Sti

mu

lati

on

in

nM

157,5 11,22±

239,44 10,48±

127,67 10,98±

10,00 5,55±

Optimale und suboptimale Antigen Konzentration 83______________________________________________________________________________

Abbildung 23. Abhängigkeit der Serotoninfreisetzung der RBL-2H3-Zellen von der DNP35

HSA-

Konzentration. Die RBL-2H3-Zellen wurden bei der Zellzahl 1∗106/ml mit 10 µM Quin-2/AM über

45 Min. geladen. Die Stimulation erfolgte mit DNP35

HSA in vier unterschiedlichen Konzentratio-

nen (1ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml und 1000 ng/ml). Die Ergebnisse der Versuche sind als Mittel-

wert ± SEM der n=8 Versuche dargestellt. Die optimale Antigenkonzentration von 100 ng/ml

entspricht der für den Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration bestimmten optimalen

Antigenkonzentration (s. Abb. 22).

3.6 Untersuchung der Effektivität des Ladeverfahrens von RBL-2H3-Zellen mit

Quin-2/ AM

Die verschiedenen Zellpopulationen, abhängig von ihrem Gehalt an unspe-

zifischen Esterasen, zeigen die Konversion von Quin-2/AM zum Quin-2-Anion mit

unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Daher soll ein zeitliches Optimum des Lade-

verfahrens mit Quin-2/AM für jede neu untersuchte Zellpopulation ermittelt wer-

den. Da die Unterschiede in der Empfindlichkeit der unterschiedlichen Zellarten

84 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________

0

10

20

30

40

50

10 -1 100 10 1 10 2 10 3 104

DNP BSA-Konzentration in ng/ml 35

32,86 1,84±

38,86 2,26±

26,44 2,12±

6,8 1,18±

Sero

ton

infr

eis

etz

un

g n

ach

der

Sti

mu

lati

on

in

%

auf die Hydrolyse-Produkte von Quin-2/AM auszumachen sind, soll eine optimale

intrazelluläre Quin-2 Konzentration, die zu der angebotenen extrazellulären Quin-

2/AM Konzentration proportionell ist, determiniert werden. Auf diese Weise kann

bei der noch ausreichend hohen Intensität der Fluoreszenz die geringste Beein-

trächtigung der zellulären Funktionen gewährleistet werden.

3.6.1 Angebotene Quin-2/AM-Konzentration versus intrazelluläre Quin-2-

Konzentration

Effektivität des Ladeverfahrens von RBL-2H3-Zellen mit Quin-2/AM 85______________________________________________________________________________

Abbildung 24. Abhängigkeit der intrazellulären Quin-2 Konzentration in RBL-2H3-Zellen von der

angebotenen extrazellulären Quin-2/AM Konzentration.Die RBL-2H3-Zellen wurden bei der Zellzahl

1∗106/ml mit unterschiedlichen Quin-2/AM -Konzentrationen (2 µM, 5 µM, 7,5 µM, 10 µM, 12,5

µM, 15 µM, 20 µM und 50 µM) über 45 Min. geladen. Die Ergebnisse der Versuche sind als

Mittelwert ± SEM der n=7 Versuche dargestellt. Die intrazelluläre Quin-2 Konzentration erreichte

Plateau bei der extrazellulären Quin-2/AM Konzentration von 15 µM. Die maximale intrazelluläre

Quin-2 Konzentration war bei Quin-2/AM Konzentration von 50 µM zu verzeichnen.

[Quin 2/AM] extrazellulär in µM0,0 10 20 30 40 50

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

[Qu

in 2

] in

trazellu

lär

in µ

M

0,256 0,076±

1,31 0,229±

2,9 0,264±

4,23 0,321±

5,41 0,271±

6,54 0,1±6,24 0,344±

6,15 0,36±

Die RBL-2H3-Zellen wurden bei der Zellzahl von 1∗106/ml mit unterschiedli-

chen Quin-2/AM Konzentrationen (2-50 µM) über 45 Min. geladen. Die Bestim-

mung der optimalen Konzentration von Quin-2/AM zeigte eine maximale Konzen-

tration von intrazellulärem Quin-2 bei angebotener extrazellulären Quin-2/AM Kon-

zentration von 50 µM. Da aber eine hohe intrazelluläre Quin-2 Konzentration die

physiologischen Prozesse negativ beeinflußt, wurde die extrazellulären Quin-2/

AM Konzentration von 10 µM gewählt, die bei noch ausreichend hoher Amplitude

des Signals (Fluoreszenzintensität) am wenigsten die untersuchten Ereignisse

(Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration und die Rate der Serotonin-

freisetzung) beeinträchtigt (s. Kap. 3.7) gewählt.

3.6.2 Ladezeit versus intrazelluläre Quin-2-Konzentration

Abbildung 25. Abhängigkeit der intrazellulären Quin-2 Konzentration in RBL-2H3-Zellen vom

Dauer des Ladevorganges mit Quin-2/AM. Die RBL-2H3-Zellen wurden bei der Zellzahl 1∗106/ml

mit 10 µM Quin-2/AM. über Zeit von 15 bis 120 Minuten geladen. Die Ergebnisse der Versuche

sind als Mittelwert ± SEM der n=4 Versuche dargestellt. Die intrazelluläre Quin-2 Konzentration

erreichte das Maximum bei der Ladezeit von 30 Minuten. Die längere Ladezeit von 45 Minuten

wurde gewählt, um die vollständige intrazelluläre Hydrolyse der Estergruppen von Quin-2/AM zu

gewährleisten.

86 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________

[Qu

in 2

] in

trazellu

lär

in µ

M

Ladezeit in Minuten

0 30 60 90 1200

1

2

3

4

5

1,83 0,68±

1,48 0,51±

1,85 0,6±

2,36 0,6±

2,95 0,5±

3,48 0,4±

4,21 0,26±

3,22 0,3±

1,11 0,07±

RBL-2H3-Zellen wurden bei der Zellzahl von 1∗106/ml mit 10 µM Quin-2/AM gela-

den. Die Werte in der Abbildung 25 geben die intrazelluläre Quin-2-Konzentrati-

on wieder. Die optimale Dauer des Ladeverfahrens lag zwischen 15-45 Min. Es

wurde die längere Zeit von 45 Min. gewählt, um die vollständige Hydrolyse der

Estergruppen von Quin-2/AM zu gewährleisten.

3.7 Untersuchung der Auswirkung der unterschiedlichen Quin-2/AM-Konzen-

trationen auf die Funktion der RBL-2H3-Zellen

Die RBL-2H3-Zellen wurden nach der Inkubation mit anti-DNP-IgE mit Quin-

2/AM in Konzentration zwischen 0,0 -50 µM über 45 Min. geladen und anschlie-

ßend mit 100 ng/ml DNP35

HSA stimuliert. Die Zellzahl betrug 1∗106 Zellen/ml. Die

Serotoninfreisetzungsrate und Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration

wurden in drei unabhängigen Versuche gemessen. Die Ergebnisse sind in der

Abbildungen 26 und 27 dargestellt.

Abbildung 26. Abhängigkeit der Serotoninfreisetzung in RBL-2H3-Zellen von der angebotenen

extrazellulären Quin-2/AM Konzentration.Die RBL-2H3-Zellen wurden bei der Zellzahl 1*106/ml

mit unterschiedlichen Quin-2/AM -Konzentrationen (0 µM, 5 µM, 10 µM, 15 µM, 20 µM und 50

µM) über 45 Min. geladen. Es sind die Ergebnisse der drei unabhängigen Versuche dargestellt.

Quin-2/AM und die Funktion der RBL-2H3-Zellen 87______________________________________________________________________________

88 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________

Abbildung 27. Abhängigkeit des Anstieges der intrazellulären Calciumkonzentration in RBL-

2H3-Zellen von der angebotenen extrazellulären Quin-2/AM Konzentration. Die RBL-2H3-Zellen

wurden bei der Zellzahl 1∗106/ml mit unterschiedlichen Quin-2/AM -Konzentrationen (5 µM, 10

µM, 15 µM, 20 µM und 50 µM) über 45 Min. geladen. Es sind die Ergebnisse der drei unabhängi-

gen Versuche dargestellt.

3.8 Bestimmung der extrazellulären Quin-2-Fraktion bei routinemäßig gelade-

nen RBL-2H3-Proben

Die stark alterierten bzw. sterbende Zellen ermöglichen ein Austritt von

Quin-2 aus der Zelle (�dye leaking�). Auf diese Weise kann die Bestimmung der

intrazellulären Calciumkonzentration verfälscht werden. Um diesem Problem zu

begegnen, wurde im Überstand der routinemäßig mit Quin-2 geladenen Zellproben

(Zellzahl 1∗106Zellen/µl, 10 µM Quin-2/AM, 45 Min.) die extrazelluläre Quin-2-

Fraktion bestimmt. Da die Proben auch nach 120 Minuten, eine Zeitspanne, die

bei den Stimulationsversuchen nicht überschritten werden dürfte, nur einen

geringgradigen Austritt von ca. 5% der Gesamtmenge des geladenen Quin-2 in

den extrazellulären Raum zeigten, konnte auf diesbezügliche Korrektur verzichtet

werden.

[Quin-2/AM] extrazellulär in µM5,0 10 15 20 50

0,0

250

500

[Ca2+] i

-An

sti

eg

in

nM

3.9 Messung der Serotoninfreisetzung und des Calciumeinstroms

Die Aggregation der FcεRI der RBL-2H3-Zellen resultiert im Anstieg der

intrazellulären Calciumkonzentration von ca. 100-200 nM bis auf über 1000 nM,

wenn mit Quin-2 gemessen, und in der Freisetzung von Serotonin. Die Messung

dieser Parameter erlaubt ein Rückschluß auf den Grad der Aktivierung der unter-

suchten Zellen.

Der Mittelwert der Serotoninfreisetzung betrug für die RBL-2H3-Zellen, die

in Abwesenheit von mAb AA4 präinkubiert wurden, 37,69 % bzw. 30,66 %

(DNP35

HSA-Konzentration von 100 ng/ml und 10 ng/ml). Die spontane

Serotoninfreisetzung betrug für diese Zellen 3,24 %. Für die mit 60 µg/ml mAb

AA4 inkubierten RBL-2H3-Zellen betrug der Mittelwert der Serotoninfreisetzung

18,02 % bzw. 9,65 %. Die Rate der spontanen Serotoninfreisetzung betrug 9,18%.

Die Unterschiede der Rate der spontanen Serotoninfreisetzung zwischen den

RBL-2H3-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-Zellen, die

mit mAbAA4 inkubiert wurden, waren statistisch signifikant (p< 0,01; t-Test bei

unabhängigen Stichproben, Abbildung 28). Die Unterschiede der Rate der

Serotoninfreisetzung nach der Stimulation mit DNP35

HSA zwischen den RBL-

2H3-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3- Zellen, die mit

mAb AA4 inkubiert wurden, waren statistisch signifikant (p< 0,001, für 10 und 100

ng/ml in einfaktoriellem ANOVA-Test, nach Bonferroni-Korrektur, Abbildung 29).

Der Mittelwert der Rate der Serotoninfreisetzung betrug für die RBL-2H3-

m3.7-Zellen, die in Abwesenheit von mAb AA4 präinkubiert wurden, 28,16 % bzw.

3,73 % (Konzentration von Carbachol 1mM bzw. 3 µM). Die spontane Serotonin-

freisetzung betrug für diese Zellen 2,36 %. Für die mit 60 µg/ml mAb AA4

inkubierten RBL-2H3-Zellen betrug die Serotoninfreisetzung 32,56 % bzw. 8,92

%. Die Rate der spontanen Serotoninfreisetzung betrug 6,87%. Die Unterschiede

der Rate der spontanen Serotoninfreisetzung zwischen den RBL-2H3-m3.7-Zel-

len, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-m3.7-Zellen, die mit mAb

AA4 inkubiert wurden, waren statistisch signifikant (p< 0,01; t-Test bei unabhängi-

gen Stichproben, Abbildung 28). Die Unterschiede der Rate der Serotoninfrei-

setzung nach der Stimulation mit Carbachol zwischen den RBL-2H3-m3.7-Zellen,

Messung der Serotoninfreisetzung und des Calciumeinstroms 89______________________________________________________________________________

90 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________

Abbildung 28. Spontane Serotoninfreisetzung der RBL-2H3 und RBL-2H3-m3.7-Zellen.

Für die Stimulationsversuche bestimmte Zellen wurden, abhängig von der Stimulationsreihe mit

bzw. ohne des monoklonalen Antikörpers AA4 (60 µg/ml) oder mit dem Maus-Antikörper der IgG1-

Subklasse, über 16 Stunden bei 37°C und 5% CO2 präinkubiert. Nach dem zweimaligen Wasch-

vorgang erfolgte 120 minutige Inkubation im Hybrydysationsofen bei 37°C und 45 minutiger La-

devorgang mit Quin-2/AM. Die Abbildung stellt die Ergebnisse der drei unabhängigen Versuche

dar. Die Unterschiede der Rate der spontanen Serotoninfreisetzung in An- und Abwesenheit von

mAb AA4 sind sowohl für RBL-2H3- wie auch RBL-2H3-m3.7-Zellen statistisch signifikant (p<

0,01; t-Test bei unabhängigen Stichproben)

die ohne mAb AA4 inkubiert wurden und RBL-2H3-m3.7-Zellen, die mit mAb AA4

inkubiert wurden, waren statistisch nicht signifikant (p> 0,05; für beide Konzentra-

tionen in einfaktoriellem ANOVA-Test, nach Bonferroni-Korrektur, Abbildung 29).

sp

on

tan

e S

ero

ton

infr

eis

etz

un

g in

%

0,0

RBL-2H3 Zellen RBL-2H3-m3.7 Zellen

2,5

5,0

7,5

10

12,5

15

ohne mAb AA4 ohne mAb AA4mit mAb AA4 mit mAb AA4mit IgG1

Abbildung 29. Serotoninfreisetzung der RBL-2H3 und RBL-2H3-m3.7-Zellen nach der Stimula-

tion. Für die Stimulationsversuche bestimmte Zellen wurden, abhängig von der Stimulationsreihe

mit bzw. ohne des monoklonalen Antikörpers AA4 (60 µg/ml) oder mit Maus-Antikörper der IgG1-

Subklasse, über 16 Stunden bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank präinkubiert. Nach dem zwei-

maligen Waschvorgang erfolgte 120 minutige Inkubation im Hybrydysationsofen bei 37°C und 45

minutiger Ladevorgang mit Quin-2/AM. Die RBL-2H3-Zellen wurden mit 10 ng/ml DNP35HSA bzw.

mit 100 ng/ml DNP35HSA, die RBL-2H3-m3.7-Zellen mit 3 µM bzw. mit 1mM Carbachol für 30

Minuten bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Die Proben wurden bei 1500 U.p.m. abzentrifugiert

und 200 µl des Überstandes wurden in 10 ml der Szintillationsflüssigkeit gelöst. Abschließend

folgte die Bestimmung der Aktivität der Probe im Szintillationszähler. Die Abbildung stellt die

Ergebnisse drei bzw. zwei unabhängiger Versuche dar. Die Unterschiede der Rate der

Serotoninfreisetzung der RBL-2H3, die in An- bzw. Abwesenheit von mAb AA4 präinkubiert wur-

den, sind für beiden angewandten Konzentrationen von DNP35HSA statistisch signifikant (p <

0,001 im einfaktoriellen ANOVA nach Bonferroni-Korrektur). Die Unterschiede der Rate der

Serotoninfreisetzung für RBL-2H3-m3.7-Zellen waren im Gegensatz nicht statistisch signifikant

(p>0,05; im einfaktoriellen ANOVA nach Bonferroni-Korrektur).


Serotoninfreisetzung in %

0,0 10 20 30 40

Stimulation der RBL-2H3-Zellen mit:

10 ng/ml DNP ohne AA4

10 ng/ml DNP mit AA4



10 ng/ml DNP ohne IgG1

10 ng/ml DNP mit IgG1

100 ng/ml DNP ohne IgG1

100 ng/ml DNP mit IgG1

3 µM Carbachol ohne AA4

3 µM Carbachol mit AA4



Stimulation der RBL-2H3-m3.7-Zellen mit:

Die mittlere intrazelluläre Calciumkonzentration ([Ca2+]i) der nicht stimulier-

ten RBL-2H3-Zellen betrug in Ab- und Anwesenheit von 60 µg/ml von mAb AA4

138 nM bzw. 175 nM. Die Unterschiede der basalen Calciumkonzentration zwi-

schen den RBL-2H3-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-

Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert wurden, waren statistisch signifikant (p < 0,01; t-

Test bei unabhängigen Stichproben, Abbildung 30).

Nach der Stimulation gemessene Werte der maximalen intrazellulären

Calciumkonzentration ([Ca2+]i) betrugen 736 nM für 100 ng/ml DNP

35HSA und 528

nM für 10ng/ml DNP35

HSA für die RBL-2H3-Zellen, die in Abwesenheit von mAb

AA4 präinkubiert wurden den. Für die mit 60 µg/ml von mAb AA4 inkubierten RBL-

2H3-Zellen betrugen diese Parameter 381 nM bzw. 162 nM. Die Unterschiede der

Calciumkonzentration nach der Stimulation mit DNP35

HSA zwischen den RBL-

2H3-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-Zellen, die mit

mAb AA4 inkubiert wurden, waren statistisch signifikant (p< 0.05, für 10 und 100

ng/ml in einfaktoriellem ANOVA-Test nach Bonferroni-Korrektur, Abbildung 31).

Die mittlere intrazelluläre Calciumkonzentration ([Ca2+]i ) der nicht stimu-

lierten RBL-2H3-m3.7-Zellen betrug in Ab- und Anwesenheit von 60 µg/ml von

mAb AA4 109 nM bzw. 165 nM. Die Unterschiede der basalen Calciumkonzentration

zwischen den RBL-2H3-m3.7-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und

RBL-2H3-m3.7-Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert wurden, waren statistisch signi-

fikant (p < 0,001; in t-Test bei unabhängigen Stichproben, Abbildung 30).

Nach der Stimulation mit Carbachol gemessene Mittelwerte der maximalen

intrazellulären Calciumkonzentration ([Ca2+]i) betrugen 891 nM für 1000 µM

Carbachol und 444 nM für 3 µM Carbachol für die RBL-2H3-m3.7-Zellen, die in

Abwesenheit von mAb AA4 präinkubiert wurden. Für die mit 60 µg/ml von mAb

AA4 inkubierten RBL-2H3-m3.7-Zellen betrugen diese Parameter 1736 nM bzw.

556 nM. Die Unterschiede der Calciumkonzentration nach der Stimulation mit

Carbachol zwischen den RBL-2H3-m3.7-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wur-

den, und RBL-2H3-m3.7-Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert wurden, waren für 3

µM statistisch nicht signifikant (p>0,05 in einfaktoriellem ANOVA-Test nach

Bonferroni-Korrektur, Abbildung 31) für 1 mM statistisch signifikant (p<0,001 in

einfaktoriellem ANOVA-Test nach Bonferroni-Korrektur, Abbildung 31).

92 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________

Abbildung 30. Basale intrazellulären Calciumkonzentration in RBL-2H3 und RBL-2H3-m3.7-

Zellen in Abhängigkeit von Präinkubation mit monoklonalem Antikörper AA4.

Für die Versuche bestimmte Zellen wurden, abhängig von der Stimulationsreihe mit bzw. ohne

des monoklonalen Antikörpers AA4 (60 µg/ml) über 16 Stunden bei 37°C und 5% CO2 präinkubiert.

Nach dem zweimaligen Waschvorgang erfolgte 120 minutige Inkubation im Hybrydysationsofen

bei 37°C und 45 minutiger Ladevorgang mit Quin-2/AM. Die intrazelluläre Calciumkonzentration

wurde bei 37°C in der Zellsuspension gemessen. Die Ergebnisse der Versuche sind als Mittel-

wert ± SEM der n=6 Versuche dargestellt. Die Unterschiede der Calciumkonzentration zwischen

den RBL-2H3- und RBL-2H3-m3.7-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-

und RBL-2H3-m3.7-Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert wurden, sind statistisch signifikant (p< 0,05

für RBL-2H3-Zellen und p< 0,001 für RBL-2H3-m3.7-Zellen in t-Test bei unabhängigen Stichpro-

ben).


RBL-2H3 RBL-2H3-m3.7

127,6 6,2±

172,3 9,1±

109,4 6,1±

164,6 9,8±

0,0

50

100

150

200

intr

azellu

läre

Calc

ium

ko

nzen

trati

on

in

nM

ohne AA4 ohne AA4mit AA4 mit AA4

Abbildung 31. Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration in RBL-2H3 und RBL-2H3-m3.7-

Zellen nach der Stimulation.

Für die Stimulationsversuche bestimmte Zellen wurden, abhängig von der Stimulationsreihe mit

bzw. ohne des monoklonalen Antikörpers AA4 (60 µg/ml) über 16 Stunden bei 37°C und 5% CO2

präinkubiert. Nach dem zweimaligen Waschvorgang erfolgte 120 minutige Inkubation im

Hybrydysationsofen bei 37°C und 45 minutiger Ladevorgang mit Quin-2/AM. 10 ng/ml DNP35HSA

wurde für die suboptimale Stimulation bzw. 100 ng/ml DNP35HSA für die optimale Stimulation via

IgE-Rezeptor wurden bei 37°C der Zellsuspension der RBL-2H3-Zellen (PBS-Puffer mit 0,1 %

BSA) in der Küvette des Spectrofluorometers zugegeben. Die RBL-2H3-m3.7-Zellen wurden mit

3 µM Carbachol für die suboptimale bzw. mit 1000 µM Carbachol für die optimale Stimulation

über muskarinischen Acetylcholin-Rezeptor stimuliert. Die Werte der intrazellulären Calcium-

konzentration wurden als Differenz zwischen dem maximalen Wert der intrazellulären Calcium-

konzentration nach der Stimulation mit DNP35HSA für die RBL-2H3 -Zellen bzw. mit Carbachol für

RBL-2H3-m3.7-Zellen und der basalen Calciumkonzentration vor der Stimulation. Die Abbildung

stellt die Ergebnisse drei unabhängiger Versuche dar.

94 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________

Stimulation der RBL-2H3-Zellen









Anstieg der [Ca2+]i nach der Stimulation in mM

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Stimulation der RBL-2H3-m3.7--Zellen

Die Inhibition der Serotoninfreisetzung bzw. des Anstieges der intrazellulären

Calciumkonzentration nach der Stimulation wurde wie folgend berechnet:

(S - Sspontan

) - (SAA4

- Sspontan

) / (S)

wo S, SAA4

, Sspontan

die Serotoninfreisetzung der RBL-2H3-Zellen ohne Präinkubation

mit mAb AA4, nach der Präinkubation mit mAb AA4 und spontan bedeuten.

(∆[Ca2+]i -∆[Ca2+]

i AA4) / (∆[Ca2+]

i)

wo ∆[Ca2+]i und ∆[Ca2+]

i AA4 ein Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration

der RBL-2H3-Zellen in Ab- bzw. Anwesenheit von mAb AA4 bedeuten.

Die Inkubation der RBL-2H3-Zellen mit mAb AA4 führte bei der Stimulation

mit DNP35

HSA zur Inhibition der Serotoninfreisetzung um 74,5 % bzw. 99,94 %

(optimale und suboptimale Konzentration von DNP35

HSA), zur Inhibition des FcεRI-

vermittelten Anstieges der [Ca2+]i um 66,39 % bzw. 98,04 % (optimale und

suboptimale Konzentration von DNP35

HSA) zum Anstieg der [Ca2+]i der ruhenden

Zellen von 26,12 % und zum Anstieg der spontanen Serotoninfreisetzung um 183,33

%. Die Unterschiede der Inhibition des Serotoninfreisetzung zwischen den RBL-

2H3-Zellen, die mit 10 ng/ml DNP35

HSA stimuliert wurden, und RBL-2H3-Zellen,

die mit mit 100 ng/ml DNP35

HSA stimuliert wurden, waren statistisch signifikant (p

< 0,05; t-Test bei unabhängigen Stichproben). Die Unterschiede der Inhibition des

Anstieges der Calciumkonzentration zwischen den RBL-2H3-Zellen, die mit 10

ng/ml DNP35

HSA stimuliert wurden, und RBL-2H3-Zellen, die mit mit 100 ng/ml

DNP35

HSA stimuliert wurden, waren statistisch signifikant (p< 0,001; t-Test bei

unabhängigen Stichproben).

Die Inkubation der RBL-2H3-m3.7-Zellen mit mAb AA4 führte bei der Sti-

mulation mit Carbachol nicht zur Inhibition der Serotoninfreisetzung und nicht zur

Inhibition des Anstieges der [Ca2+]i jedoch zum Anstieg der [Ca2+]

i der ruhenden

Zellen von 50,51 % und zum Anstieg der spontanen Serotoninfreisetzung um 191,1

%.

Die Inkubation der RBL-2H3-Zellen mit Antikörper der Subklasse IgG1 führ-

te weder zur signifikanten Inhibition der Serotoninfreisetzung und des Anstieges

der [Ca2+]i noch zum signifikanten Anstieg der [Ca2+]

i der ruhenden Zellen (p>0,05

in einfaktoriellem ANOVA-Test nach Bonferroni-Korrektur, Abbildung 33).


Abbildung 32. Inhibitorischer Effekt des monoklonalen anti-gangliosidären Antikörpers AA4 auf

die Serotoninfreisetzung und die intrazelluläre Calciumkonzentration in RBL-2H3 und RBL-2H3-

m3.7-Zellen nach der Stimulation. Für die Stimulationsversuche bestimmte Zellen wurden, ab-

hängig von der Stimulationsreihe mit bzw. ohne des monoklonalen Antikörpers AA4 (60 µg/ml)

über 16 Stunden bei 37°C und 5% CO2 präinkubiert. 10 ng/ml DNP35HSA wurde für die suboptimale

Stimulation bzw. 100 ng/ml DNP35HSA für die optimale Stimulation via IgE-Rezeptor verwendet.

Die RBL-2H3-m3.7-Zellen wurden mit 3 µM Carbachol für die suboptimale bzw. mit 1000 µM

Carbachol für die optimale Stimulation über muskarinischen Acetylcholin-Rezeptor stimuliert. Die

Werte der intrazellulären Calciumkonzentration wurden als Differenz zwischen dem maximalen

Wert der intrazellulären Calciumkonzentration nach der Stimulation mit DNP35HSA für die RBL-

2H3 -Zellen bzw. mit Carbachol für RBL-2H3-m3.7-Zellen und der basalen Calciumkonzentration

vor der Stimulation. Die Abbildung stellt die Ergebnisse drei unabhängiger Versuche dar. Die

Ergebnisse der Versuche sind als Mittelwert ± SEM der n=3 Versuche dargestellt.

96 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________

Inhibition in %

-150 100500,0-100 150-50

Stimulation der RBL-2H3-Zellen

10 ng/ml DNP35-BSA

100 ng/ml DNP35-BSA

Stimulation der RBL-2H3-m3.7-Zellen

3 µM Carbachol

1000 µM Carbachol

98,04 0,87±

99,94 4,18±

66,39 2,17±

74,5 6,61±

-17,06 21,11±

-64,8 44,3±

-120,9 50,42±

-0,23 5,38±

Serotoninfreisetzung

[Ca2+]

Abbildung 33. Effekt des Maus-Antikörpers der IgG1-Klasse auf die Serotoninfreisetzung und

die intrazelluläre Calciumkonzentration in RBL-2H3-Zellen nach der Stimulation mit DNP35HSA.

Für die Stimulationsversuche bestimmte Zellen wurden , abhängig von der Stimulationsreihe mit

bzw. ohne des Maus-Antikörpers der IgG1-Klasse (60 µg/ml) über 16 Stunden bei 37°C und 5%

CO2 präinkubiert. 10 ng/ml DNP35HSA wurde für die suboptimale Stimulation bzw. 100 ng/ml

DNP35HSA für die optimale Stimulation via IgE-Rezeptor verwendet. Die Werte der intrazellulä-

ren Calciumkonzentration wurden als Differenz zwischen dem maximalen Wert der intrazellulä-

ren Calciumkonzentration nach der Stimulation mit DNP35HSA für die RBL-2H3 -Zellen und der

basalen Calciumkonzentration vor der Stimulation. Die Abbildung stellt die Ergebnisse zwei un-

abhängiger Versuche dar. Die Ergebnisse der Versuche sind als Mittelwert ± SEM der n=2 Versu-

che dargestellt. Die Unterschiede der Calciumkonzentration und der Serotoninfreisetzung zwi-

schen den RBL-2H3-Zellen , die ohne IgG1 inkubiert wurden, und RBL-2H3-Zellen, die mit IgG1

inkubiert wurden, sind statistisch nicht signifikant (p>0,05 in einfaktoriellem ANOVA -Test unter-

sucht).


0,0 10 20 30

Serotoninfreisetzung in %

0,0 200 400 600

Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration in nM

Stimulation der RBL-2H3-Zellen mit:

10 ng/ml DNP in Abwesenheit von IgG1

10 ng/ml DNP in Anwesenheit von IgG1

100 ng/ml DNP in Abwesenheit von IgG1

100 ng/ml DNP in Anwesenheit von IgG1

13,45 2,86 %±

132 4 nM±

16,12 2,12 %±

128 3 nM±

26,21 1,96 %±

24,35 0,74 %±

540 126 nM±

389 18 nM±Serotoninfreisetung

Anstieg der intrazellulärenCalciumkonzentration

98 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________

4 Diskussion

4.1 Etablierung der Methodik

Die Bestimmung der spektralen Eigenschaften von Quin-2, erbrachte die

Ergebnisse, die mit Literaturangaben weitgehend übereinstimmen. Das Ab-

sorptionsmaximum und das Emmisionsmaximum lagen für Quin-2/AM bei λex

= 339

nm und λem

= 430 nm, für Quin-2 bei λex

= 364 nm und λem

= 502 nm und für das

Komplex Quin-2/Ca2+ bei λex

= 331 nm und λem

= 501 nm, Die in der Literatur

angegebene Maxima für Quin-2/AM sind λex

= 339 nm und λem

= 430 nm, für Quin-

2 λex= 352 nm und λ

em= 492 nm und für das Komplex Quin-2/Ca2+ λ

ex= 332 nm

und λem

= 492 nm.

Die leichten Verschiebungen der λex

und λem

für Quin-2 und Quin-2/Ca2+

erklären sich am ehesten dadurch, daß die maximalen Wellenlängen der Anre-

gung und Emission in Spektren sich über einige Nanometer erstrecken und kei-

nen eindeutig zu erkennenden Peak-Wert besitzen. Nach der Fokussierung durch

die geometrische Anordnung des Ausgangschlitzes des Spektrofluorometers kann

theoretisch ein monochromatischer Strahl der vorgewählten Wellenlänge erzeugt

werden. Durch die technischen Begebenheiten beträgt die Breite des Wellen-

spektrums der Photonen zumindest 5 nm (bis 10 nm), um die ausreichende Inten-

sität der exzitatorischen Photonen zu gewährleisten, so daß die registrierten

geringgradigen Unterschiede der Wellenlänge der Absorptionsmaxima (λex

) für

Quin-2 und Quin-2/Ca2+ ohne Einfluß auf die Qualität der Messung bleiben dürfen.

Die Fluoreszenz der Probe, d.h. Emissionsphotonen, wird mit einem toroidalen

und flachen Spiegel auf den planen Eigangschlitz des Emissionsmonochromators

des Fluorospektrometers fokussiert. Der Emmisionsmonochromator bedingt , ähn-

lich wie im Fall der Anregungsphotonen, Wellenspektrums der emitierten Photo-

nen mit einer Breite von zumindest 5 nm (bis 10 nm), so daß die geringgradigen

Unterschiede der Wellenlänge der Absorptionsmaxima (λem

) für Quin-2 und Quin-

2/Ca2+ die Messung nicht beeinflußen dürften. Die in vitro durchgeführte Bestim-

mung des Wertes der Dissoziationskonstante Kd erbrachte ein Wert von 115 nM,

der allgemein als eine Konstante für diese Substanz eingesetzt wird.

99______________________________________________________________________________

Die Bestimmung der optimalen Konzentration von Quin-2/AM zeigte eine

maximale Konzentration von intrazellulärem Quin-2 bei angebotenen extrazellulären

Quin-2 Konzentration von 50 µM. Da aber die hohe intrazelluläre Quin-2 Konzen-

tration die physiologischen Prozesse negativ beeinflußt, wurde die extrazelluläre

Quin-2/AM Konzentration von 10 µM, die bei noch ausreichend hoher Amplitude

des Signals (Fluoreszenzintensität) am wenigsten die untersuchten Ereignisse (An-

stieg der intrazellulären Calciumkonzentration und die Rate der Serotonin-

freisetzung) beeinträchtigt (siehe unten), gewählt. Die optimale Dauer des Lade-

verfahrens lag zwischen 15-45 Min. Es wurde die längere Zeit von 45 Min. ge-

wählt, um die vollständige Hydrolyse der Estergruppen von Quin-2/AM zu gewähr-

leisten. Die Untersuchung der Auswirkung der unterschiedlichen Quin-2/AM-Kon-

zentrationen auf die Funktion der RBL-2H3-Zellen zeigte die progrediente Minde-

rung der Rate der Serotoninfreisetzung und des Anstieges der intrazellulären

Calciumkonzentration mit steigender Quin-2/AM Konzentration. Bei der gewähl-

ten Quin-2/AM Konzentration von 10 µM war die Rate der Serotoninfreisetzung,

im Vergleich zu 0 µM Quin-2/AM, nur um 11,24 % gemindert (29,84% versus

33,62%). Die Quin-2/AM Konzentration von 5 µM bedingt die Minderung der Rate

der Serotoninfreisetzung um 9,4% (30,46% versus 33,62%). Im Vergleich verur-

sacht die extrazelluläre Quin-2/AM Konzentration von 50 µM die Minderung der

Serotoninfreisetzung um 37,9% (20,85% versus 33,62%). Die beim Ladevorgang

mit 5 µM Quin-2/AM erreichte intrazelluläre Quin-2 Konzentration lag bei nur 1,31

µM Quin-2 intrazellulär . Bei der extrazellulären Quin-2/AM Konzentration von 10µM

lag die intrazelluläre Quin-2 Konzentration bei 4,23 µM, bei 50 µM Quin -2/AM bei

6,54 µM. Da die Unterschiede in der Auswirkung der 5 µM und 10 µM Quin-2/AM

auf die funktionellen Parameter der RBL-2H3-Zellen sich nur geringgradig unter-

scheiden, die intrazelluläre Quin-2 Konzentration jedoch bei 10 µM um über das

Dreifache höher liegt, wurde die Konzentration von 10 µM Quin-2/AM für die wei-

teren Versuche gewählt.

In der Literaturangaben liegen die angewandten, für die suffiziente Intensität der

Fluoreszenz ausreichenden Konzentrationen von Quin-2/AM zwischen 1 bis 100

µM. Dabei gemessene intrazelluläre Quin-2 Konzentrationen betragen 0,1-5 mM.

Diese Konzentrationen beziehen sich auf den geschätzten bzw. gemessenen

100 4 Diskussion______________________________________________________________________________

mittleren Volumen der untersuchten Zellen. In den vorliegenden Versuchen er-

reichte intrazelluläre Quin-2 Konzentrationen liegen beinah drei Größeordnung

niedriger. Diese wurden jedoch, aufgrund der fehlenden technischen Vorrausset-

zungen für eine Messung, nicht auf den tatsächlichen intrazellulären Volumen be-

zogen, so daß die Angaben der Quin-2 Konzentration sich auf den Gesamtvolu-

men der Proben (2 ml) beziehen. Die tatsächliche intrazelluläre Quin-2 Konzentra-

tion dürfte nach der Zellvolumenkorrektur in der Größeordnung der Literaturanga-

ben (0,1-5 mM) liegen.

Die optimale Konzentration an DNP35

HSA, mit dem die direkte Stimulation

der RBL-2H3- und RBL-2H3-m3.7-Zellen herbeigebracht wurde, betrug 100 ng/

ml. Bei dieser Konzentration konnte eine maximale Serotoninfreisetzung und der

maximale Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration registriert werden. Eine

weitere Steigerung der DNP35

HSA Konzentration auf 1 µg/ml erbrachte im Ver-

gleich zu 100 ng/ml weder eine Erhöhung der Rate der Serotoninfreisetzung

(38,86% versus 32,86%) noch eine Erhöhung des Anstieges der intrazellulären

Calciumkonzentration (239 nM versus 157 nM). Als suboptimale Konzentration

d.h. die Konzentration von DNP35

HSA, bei der noch signifikante Serotonin-

freisetzung und einen messbarer Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration

gemessen wurden, wurde 1 ng/ml gewählt. Bei dieser DNP35

HSA Konzentration

gemessene Rate der Serotoninfreisetzung und der Anstieg der intrazellulären

Calciumkonzentration lagen im Vergleich zu Stimulation mit 100 ng/ml DNP35

HSA

bei 6,8% versus 38,86% bzw. 10 nM versus 239 nM. Die Stimulation mit darunter

liegenden DNP35

HSA-Konzentrationen erbrachte keine nennenswerten Änderun-

gen dieser Parameter. Diese Ergebnisse sind mit den Ergebnissen, die in der

Literatur zu finden sind, kongruent.

4.2 Effekt des anti-gangliosidären monoklonalen Antikörpers AA4 auf die intrazel-

luläre Calciumkonzentration und Serotoninfreisetzung in RBL-2H3- und RBL-2H3-

m3.7-Zellen

Das Mittelwert der Serotoninfreisetzung betrug für die RBL-2H3-Zellen, die

in Abwesenheit von mAb AA4 präinkubiert wurden 37,69 % bzw. 30,66 %

Effekt des anti-gangliosidären monoklonalen Antikörpers AA4 101______________________________________________________________________________

(DNP35

HSA-Konzentration von 100 ng/ml und 10 ng/ml). Die spontane

Serotoninfreisetzung betrug für diese Zellen 3,24 %. Für die mit 60 µg/ml von mAb

AA4 inkubierten RBL-2H3-Zellen betrug der Mittelwert der Serotoninfreisetzung

18,02 % bzw. 9,65 %. Die Rate der spontanen Serotoninfreisetzung betrug 9,18

%. Die Unterschiede der Rate der spontanen Serotoninfreisetzung zwischen den

RBL-2H3-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-Zellen, die

mit mAbAA4 inkubiert waren statistisch signifikant. Der Mittelwert der Rate der

Serotoninfreisetzung betrug für die RBL-2H3-m3.7-Zellen, die in Abwesenheit von

mAb AA4 präinkubiert wurden 28,16 % bzw. 3,73 % (Konzentration von Carbachol

1mM bzw. 3 µM). Die spontane Serotoninfreisetzungbetrug für diese Zellen 2,36

%. Für die mit 60 µg/ml von mAb AA4 inkubierten RBL-2H3-Zellen betrug die

Serotoninfreisetzung 32,56 % bzw. 8,92 %. Die Rate der spontanen

Serotoninfreisetzung betrug 6,87%. Die Unterschiede der Rate der spontanen

Serotoninfreisetzung zwischen den RBL-2H3-m3.7-Zellen, die ohne mAb AA4

inkubiert wurden, und RBL-2H3-m3.7-Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert waren

statistisch signifikant . Die Unterschiede der Rate der Serotoninfreisetzung nach

der Stimulation mit Carbachol zwischen den RBL-2H3-m3.7-Zellen, die ohne mAb

AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-m3.7-Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert wa-

ren statistisch nicht signifikant. Die mittlere [Ca2+]i der nicht stimulierten RBL-2H3-

Zellen betrug in Ab- und Anwesenheit von 60 µg/ml von mAb AA4 138 nM bzw.

175 nM. Die Unterschiede der basalen Calciumkonzentration zwischen den RBL-

2H3-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-Zellen, die mit

mAb AA4 inkubiert wurden, waren statistisch signifikant . Nach der Stimulation

gemessene Werte der maximalen [Ca2+]i betrugen 736 nM für 100 ng/ml DNP

35HSA

und 528 nM für 10ng/ml DNP35

HSA für die RBL-2H3-Zellen, die in Abwesenheit

von mAb AA4 präinkubiert wurden den. Für die mit 60 µg/ml von mAb AA4

inkubierten RBL-2H3-Zellen betrugen diese Parameter 381 nM bzw. 162 nM. Die

Unterschiede der Calciumkonzentration nach der Stimulation mit DNP35

HSA zwi-

schen den RBL-2H3-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-

Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert wurden, waren statistisch signifikant . Die mitt-

lere [Ca2+]i der nicht stimulierten RBL-2H3-m3.7-Zellen betrug in Ab- und Anwe-

senheit von 60 µg/ml von mAb AA4 109 nM bzw. 165 nM. Die Unterschiede der

102 4 Diskussion______________________________________________________________________________

basalen Calciumkonzentration zwischen den RBL-2H3-m3.7-Zellen, die ohne mAb

AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-m3.7-Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert wur-

den, waren statistisch signifikant . Nach der Stimulation mit Carbachol gemesse-

ne Mittelwerte der maximalen [Ca2+]i betrugen 891 nM für 1000 µM Carbachol und

444 nM für 3 µM Carbachol für die RBL-2H3-m3.7-Zellen, die in Abwesenheit von

mAb AA4 präinkubiert wurden. Für die mit 60 µg/ml von mAb AA4 inkubierten

RBL-2H3-m3.7-Zellen betrugen diese Parameter 1736 nM bzw. 556 nM. Die

Unterschiede der Calciumkonzentration nach der Stimulation mit Carbachol zwi-

schen den RBL-2H3-m3.7-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-

2H3-m3.7-Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert wurden, waren statistisch nicht signi-

fikant.

Die hier vorliegenden Ergebnisse der experimentellen Untersuchungen

zeigen eine signifikante Inhibition des FcεRI-vermittelten Anstieges der [Ca2+]i und

der Serotoninfreisetzung nach der Inkubation der RBL-2H3-Zellen mit

monoklonalem Antikörper AA4. Bei der optimalen Antigenkonzentration von 100

ng/ml DNP35

HSA betrug die Inhibition 66,39 % bzw. 74,5 %. Für die suboptimale

Antigenkonzentration von 10 ng/ml DNP35

HSA konnte die Inhibitionsrate von 98,04

% bzw. 99,94 % ermittelt werden. Die Inkubation der RBL-2H3-m3.7-Zellen mit

monoklonalem Antikörper AA4 zeigte bei der Stimulation mit der optimalen und

suboptimalen Konzentration von 1000 µM bzw. 3 µM Carbachol keine signifikante

Inhibition. Im Gegensatz dazu konnten nach der Präinkubation der RBL-2H3-m3.7-

Zellen mit mAb AA4 und darauffolgender Stimulation mit Carbachol eine Erhö-

hung der Serotoninfreisetzung (0,23 % bzw. 64,78 % für 1 mM und 3 µM Carbachol)

und die Erhöhung des Anstieges der intrazellulären Calciumkonzentration (in der

Plateauphase, nach der Stimulation mit Carbachol, 120,92 % bzw. 18,4 %) de-

monstriert werden. Die Stimulation der mit mAb AA4 präinkubierten RBL-2H3-

m3.7-Zellen mit DNP35

HSA zeigte ähnlich wie bei den RBL-2H3-Zellen Inhibition

des FcεRI-vermittelten Anstieges der [Ca2+]i und der Serotoninfreisetzung. Da die

Inhibition des Anstieges der [Ca2+]i und der Serotoninfreisetzung für die RBL-2H3-

m3.7-Zellen nur die FcεRI-vermittelte nicht jedoch mAChR-vermittelte Stimulation

betraf , sprechen diese Ergebnisse für die Spezifität der Inhibition nur für die FcεRI-

vermittelte Stimulation. Die Unterschiede der Rate der Serotoninfreisetzung nach


der Stimulation mit DNP35

HSA zwischen den RBL-2H3-Zellen, die ohne mAb AA4

inkubiert wurden, und RBL-2H3- Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert waren stati-

stisch signifikant (p< 0,001, einfaktorieller ANOVA-Test).

Eine inhibitorische Wirkung des der gleichen Subklasse IgG1 wie mAb AA4

angehörenden monoklonalen Antikörpers konnte nicht gezeigt werden. Die Ago-

nisten der niedrigaffinen IgG-Rezeptoren (FcγRIIB1 und FcγRIIB2) wie IgG1 verur-

sachen eine Inhibition der Signalübertragungsmechanismen und der Aktivierung

der murinen Mastzellen (169) wie auch der RBL-2H3-Zellen (170). Nach der

Koaggregation mit einem eine ITAM-Sequenz beinhaltendem Rezeptor wie z.B.

FcεRI werden die Tyrosinresiduen der ITIM-Sequenz phosphoryliert, was zum

Entstehen der temporären Bindungsstellen für die SH2-Domäne beinhaltenden

Proteinen, wie die Phosphatasen wie Proteintyrosinphosphatasen SHP-1 und SHP-

2 sowie SHIP (Inositolpolyphosphat-5-Phosphatase), führt. Diese Proteintyrosin-

phosphatasen dephosphorylieren die ITAM-Sequenzen, was in der Inhibition der

Signalübertragungsmechanismen resultiert. Es wird angenommen, daß die FcγRIIB-

Rezeptoren einen inhibitorischen Korezeptor für alle die ITAM-Sequenzen bein-

haltenden Rezeptoren der hämatopoetischen Zellen darstellen können (171). Die

ruhenden RBL-2H3-Zellen exprimieren die Subform FcγRIIB2, die stimulierten RBL-

2H3-Zellen die beiden Subformen der niedrigaffinen IgG-Rezeptoren (FcγRIIB1

und FcγRIIB2). Entgegen der Erwartungen konnte in Rahmen der vorliegenden

Arbeit eine Inhibition der Serotoninfreisetzung und des Anstieges der intrazellulä-

ren Calciumkonzentration für die RBL-2H3-Zellen, die mit IgG1 und anti-DNP-IgE

präinkubiert und anschließend mit DNP35

HSA stimuliert wurden, nicht demonstriert

werden. Da zum Zeitpunkt des Durchführen des experimentellen Teils der Arbeit

die inhibitorische Funktion der ITIM-Sequenzen der niedrigaffinen IgG-Rezepto-

ren noch nicht gesichert war, wurde diese Tatsache nicht weiter experimentell

verfolgt. Als mögliche Erklärung der ausgebliebenen Inhibition bittet sich die feh-

lende bzw. sehr geringe Affinität des benutzten monoklonalen Maus-IgG1-Antikör-

pers zu den hochaffinen IgE-Rezeptoren der RBL-2H3-Zellen und somit die feh-

lende Kreuzvernetzung zwischen den hochaffinen IgE-Rezeptoren (FcεRI) und

den niedrigaffinen Rezeptoren für Immunoglobulin G (FcγRII). Diese hypotheti-

sche Annahme wird durch die Tatsache unterstützt, daß die inhibitorische

104 4 Diskussion______________________________________________________________________________

Wirkung der FcγRIIB1 und FcγRIIB2 vom Bocek et al. (172) mit dem monoklonalen

Ratte-IgG2a

Antikörper demonstriert werden konnte. Für Ratte-IgG2a

Antikörper

konnte, im Gegensatz zu den anderen IgG-Immunkomplexen bzw. den anderen

Subklassen der Immunkoplexe, eine Kreuzreaktivität mit FcεRI demonstriert wer-

den (173). Diese stellt eine �conditio sine qua non� der ITIM-vermittelten Inhibition

der Signalübertragungsmechanismen. Die fehlende Inhibition der Serotoninfrei-

setzung und des Anstieges der intrazellulären Calciumkonzentration für die RBL-

2H3-Zellen durch die Präinkubation mit dem monoklonalen IgG1-Antikörper, der

der gleichen Spezies entstammt und mit mAb AA4 isotypisch ist, unterstreicht die

Spezifität der mAb AA4-vermittelten Inhibition der Aktivierung der RBL-2H3-Zel-

len und läßt die Annahme einer unspezifischen, für die IgG1-Antikörper typischen

Interaktion als unberechtigt erscheinen. Auf dieser Weise konnte die spezifische,

inhibitorische Wirkung der Bindung des mAb AA4 an die α-Galaktosyl Derivate

des Gangliosids GD1b

für die FcεRI-vermittelte Signalübertragungsmechanismen

demonstriert werden.

Darüber hinaus konnten bereits von Basciano et al. (150) demonstrierter

Anstieg der spontanen Serotoninfreisetzung und der Anstieg der basalen, intra-

zellulären Calciumkonzentration der nicht-stimulierten RBL-2H3-Zellen durch die

Präinkubation mit mAb AA4 erneut gezeigt werden. Der Anstieg der basalen, in-

trazellulären Calciumkonzentration der nicht-stimulierten RBL-2H3-Zellen betrug

26,12 % bei dem Anstieg der spontanen Serotoninfreisetzung um 183,3 %. Erwar-

tungsgemäß wurden mit 50,51 % und 191,1 % die ähnlichen Parameter auch für

die Zellinie RBL-2H3-m3.7 erhoben.

Die bereits demonstrierte Assoziation des Gangliosids GD1b

mit der

Proteintyrosinkinase p53/56lyn und dem FcεRI könnte die inhibitorische Wirkung

von mAb AA4 erklären. Die Inkubation der RBL-2H3-Zellen mit dem Antigen

(DNP35

HSA) und mAb AA4 verursacht nach der Stimulation mit dem spezifischen

IgE (anti-DNP-IgE) eine signifikante Reduktion der Rate der Tyrosinphosphorylation

der Rezeptoreinheit FcRβ (164), die als eine Bindungsstelle für die Proteintyrosin-

kinase p53/56lyn fungiert. Die Bindung von p53/56lyn an FcRβ verursacht die ver-

stärkte Aktivierung der Proteintyrosinkinase p72syk und dadurch ca. 5-7 malige

Verstärkung der Signalamplitude, die als ein Anstieg der [Ca2+]i und Ansieg der


p72syk-Aktivität gemessen werden können. Die Proteintyrosinkinase p72syk spielt

eine Schlüsselrolle in der Aktivierung der weiteren Proteine, die weiterführende

Pfade der Signalübertragung eröffnen. Die durch mAb AA4 bedingte

Minderphosphorylation der Tyrosingruppen der FcRβ und daraus resultierende

verminderte Bindung von p53/56lyn an FcRβ könnte zur verminderten Aktivierung

der Proteintyrosinkinase p72syk führen, was in der Inhibition der Signalübertragungs-

mechanismen mündet und in dem vermindertem Anstieg der [Ca2+]i und der Rate

der Serotoninfreisetzung in RBL-2H3-Zellen resultiert. Der genaue Mechanismus

der über Gangliosid GD1b

vermittelten Minderphosphorylierung der FcRβ bleibt

zur Zeit unklar und bedarf der weiteren Untersuchungen.

Die Funktion der p125Fak, einer fokalen Adhäsionsprotein, die zentrale Rol-

le in Integrin-vermittelten Signalübertragungsmechanismen der RBL-2H3-Zellen

spielt und der eine Schlüsselrolle in der FcεRI-vermittelten Degranulation der RBL-

2H3-Zellen zugeschrieben wird (119), bleibt zur Zeit noch unklar. Interessanter-

weise wird die der FcεRI-vermittelten Stimulation der RBL-2H3-Zellen folgende

Phosphorylation von p125Fak durch die Bindung von mAb AA4 inhibiert. Da über

eine Phosphorylation der p125Fak durch die Proteintyrosinkinase p72syk spekuliert

wird, könnte eine über das Gangliosid GD1b

vermittelte Minderphosphorylierung

der FcRβ eine Erklärung für dieses Ereignis bitten. Eine anderweitige Inhibition

der Phosphorylation der p125Fak kann jedoch zum jetzigen Zeitpunkt nicht ausge-

schlossen werden. Zusammenfassend könnte p125Fak einen weiteren Eingriffs-

punkt für die Wirkung des mAb AA4 darstellen, was zum vermindertem Anstieg

der [Ca2+]i und der verminderten Rate der Serotoninfreisetzung in RBL-2H3-Zellen

führen könnte.

Die weitere Eigenschaft des Gangliosids GD1b

an das Calmodulin, einem

wichtigem regulatorischen Protein zu binden und dadurch die katalytische Aktivi-

tät der cytosolischen Proteine zu modulieren wie Inhibition der Calmodulin-abhän-

gigen Phosphodiesterase (152, 153), erlaubt die hypothetische Annahme eines

möglichen, durch eine Interaktion zwischen dem Gangliosid GD1b

und Calmodulin

regulierten, Einflusses auf die Mechanismen der Signalübertragung und

Zellaktivierung. Da jedoch die Aktivierung der Calmodulin im Vergleich zur

Tyrosinphosphorylierung des FcRβ ein spätes Ereignis im Verlauf der FcεRI-ver-

mittelten Signalübertragung darstellt, erscheint die hypothetische Calmodulin-ver-

mittelte Inhibition des Anstieges der [Ca2+]i und der Rate der Serotoninfreisetzung

in RBL-2H3-Zellen eher unwahrscheinlich.

106 4 Diskussion______________________________________________________________________________

Die vorliegende Arbeit demonstriert die regulatorische Funktion des

Gangliosids GD1b

in den FcεRI-vermittelten Signalübertragungsmechanismen. Die

hypothetischen Mechanismen der Inhibition bedürfen noch einer weitergehenden

experimentellen Klärung, die genauer die Funktion des Gangliosids GD1b

definie-

ren könnte. Zur Zeit erscheint die Minderphosphorylierung der Rezeptoreinheit

FcRβ eine Schlüsselrolle in diesem Prozeß zu spielen.


108______________________________________________________________________________

5. Zusammenfassung

Die Immunglobulin E-Rezeptor (FcεRI) exprimierenden Zellen des huma-

nen Immunsystems (Mastzellen, basophile Granulozyten) spielen eine Schlüssel-

rolle in Rahmen der allergischen Reaktion vom Soforttyp. Die �rat basophilic

leukemia�-Zellinie (RBL-2H3) exprimiert den FcεRI und dient als Model bei der

Erforschung der FcεRI-vermittelten Signalübertragungsmechanismen. Das

Gangliosid GD1b

ist mit dem FcεRI und mit der Proteintyrosinkinase p53/56lyn

sterisch assoziiert. Der monoklonale Antikörper AA4 ist gegen die Epitope des

Gangliosids GD1b

gerichtet. Die vorliegende Arbeit untersucht den Einfluß des

Antikörpers AA4 auf den FcεRI-vermittelten Anstieg der intrazellulären Calcium-

konzentration (∆[Ca2+]i) und die Rate der Serotonin-freisetzung in den RBL-2H3-

Zellen.

Die RBL-2H3-Zellen wurden mit monoklonalem anti-2,4-dinitrophenyl-

Immunoglobulin E (anti-DNP-IgE) inkubiert. Die Messungen der Serotonin-

freisetzung und der ∆[Ca2+]i folgten unmittelbar der Zugabe von 2,4-Dinitrophenyl

in zwei unterschiedlichen Konzentrationen (100 ng/ml und 10 ng/ml). Für die Mes-

sung der ∆[Ca2+]i wurden Zellen mit 10 µM Quin-2/AM (Fluoreszenzindikator für

die intrazelluläre Calciumkonzentration) über 45 Minuten bei 37°C geladen. Als

Kontrollgruppe diente die RBL-2H3-m3.7-Zellinie, die eine mit dem humanen Gen

für den muskarinergen M3-Rezeptor stabil transfizierte RBL-2H3-Zellinie präsen-

tiert. Die Messung der Serotoninfreisetzung und der ∆[Ca2+]i folgte unmittelbar

nach Zugabe von Carbachol in zwei unterschiedlichen Konzentrationen (1 mM

und 3 µM). Die Rate der Serotoninfreisetzung und ∆[Ca2+]i wurden für beide Zellinien

in An- und Abwesenheit von 60 µg/ml AA4 gemessen.

Die Bestimmung der spektralen Eigenschaften erbrachte folgende Ergeb-

nisse: Quin-2/AM λex

= 339 nm und λem

= 430 nm; Quin-2 λex

= 364 nm und λem

= 502

nm; Komplex Quin-2/Ca2+ λex

= 331 nm und λem

= 501nm; die Dissoziationskonstante

Kd des Komplexes Quin-2/Ca2+ lag bei 115 nM. Die optimale Stimulation der RBL-

2H3-Zellen wurde für 100 ng/ml DNP35

-HSA ( Serotonin-freisetzung 38,86%, ∆[Ca2+]i

239 nM) gezeigt. Die maximale intrazelluläre Quin-2 Konzentration wurde bei an-

gebotener extrazellulärer Quin-2/AM Konzentration von 50 µM gemessen.

109______________________________________________________________________________

110 5 Zusammenfassung______________________________________________________________________________

Die extrazelluläre Quin-2 /AM Konzentration von 10 µM, die bei noch ausreichend

hoher Amplitude des Signals (Fluoreszenzintensität) am wenigsten die untersuch-

ten Ereignisse beeinträchtigt hat, wurde angewandt. Die optimale Dauer des Lade-

verfahrens lag zwischen 15-45 Min.

Die Rate der Serotoninfreisetzung war nach der vorausgegangenen Inku-

bation der RBL-2H3-Zellen mit monoklonalem Antikörper AA4 (Inhibition um 66,4

% bei 100 ng/ml DNP, um 98,04 % bei 10 ng/ml) im Gegensatz zu den RBL-2H3-

m3.7-Zellen inhibiert. Der Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration war

nach der vorausgegangenen Inkubation der RBL-2H3-Zellen mit monoklonalem

Antikörper AA4 (Inhibition um 74,5% bei 100 ng/ml DNP, um 99,9 % bei 10 ng/ml)

im Gegensatz zu den RBL-2H3-m3.7-Zellen inhibiert. Die Inkubation der RBL-

2H3-Zellen in Anwesenheit des polyklonalen Antikörper der IgG1 Klasse (60 µg/

ml) zeigte keine inhibitorische Wirkung weder auf die Serotoninfreisetzung noch

auf den Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration.

Eine Inhibition der FcεRI-vermittelten Serotoninfreisetzung und des FcεRI-

vermittelten Anstieges der intrazellulären Calciumkonzentration durch den anti-

gangliosidären monoklonalen Antikörper AA4 in RBL-2H3-Zellen konnte demon-

striert werden. Eine derartige Inhibition konnte für RBL-2H3-m3.7-Zellen nicht

demonstriert werden, was die Spezifität dieses Prozesses für die FcεRI-vermittel-

te Signalübertragung belegt. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchungen

lassen eine mögliche regulatorische Funktion des Gangliosids GD1b

auf die FcεRI-

vermittelte Signaltransduktionsereignisse vermuten. Diese Funktion könnte durch

die Assoziation des Gangliosids GD1b

mit der Proteintyrosinkinase p53/56lyn be-

dingt sein.

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Danksagung

Herrn Professor Dr. med. H. G. Lenard danke ich für die Möglichkeit,

diese Arbeit an seiner Klinik durchführen zu dürfen.

Herrn Professor Dr. med. V. Wahn danke ich für die Überlassung des Themas.

Herrn Privatdozent Dr. med. V. Stephan gilt mein besonders herzlicher Dank für

die in freundschaftlicher Atmosphäre erfolgte fachliche Betreuung bei der Pla-

nung, Durchführung und Diskussion der Versuche.

Frau Anette Seibt möchte ich für die geduldige fachliche Einarbeitung und die

jederzeitige Hilfsbereitschaft bei der Bewältigung der auftretenden Probleme

danken.

130 Danksagung______________________________________________________________________________

Lebenslauf

Marius Skasa

27.11.1968 geboren in Falkenberg (Polen)

Sept. 1975-Juni 1983 Grundschule Karthaus (Polen)

Sept. 1983-Juni 1987 Lyzeum Karthaus (Polen)

02.06.1987 Abitur

Okt. 1987-Juni 1989 Vorklinisches Studium der Medizin an der

Medizinischen Akademie in Danzig (Polen)

Okt. 1990-Feb. 1994 Klinisches Studium der Medizin an der

H. Heine Universität in Düsseldorf

Apr. 1995-Feb. 1996 Praktisches Jahr in St. Josef Krankenhaus

in Wuppertal

Juli 1996-Dez. 1997 Arzt im Praktikum in der Medizinischen Klinik

des St. Marien Hospitals in Hamm/Westfalen

02.01.1998 Vollapprobation als Arzt

Okt. 1998-Sept. 2000 wissenschaftlicher Mitarbeiter an der RWTH

in Aachen (Physiologie / Kardiologie)

Okt. 2000-bis dato Assistenzarzt an der Medizinischen Klinik 2

Klinikum Wuppertal

Lebenslauf 131______________________________________________________________________________

132______________________________________________________________________________

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Effekt des anti-gangliosidären monoklonalen Antikörpers ... · ganglioside monoclonal antibody AA4 selectively inhibits IgE-induced signal transduction pathways in rat basophilic