BIOCHIMIE, 1973, 55, 823-824. Br ves communications

Electrophor se prdparative en plaque de gel d'acrylamide-agarose

F r a n k BELLON.

Seroice d ' l m m u n o c h i m i e des Protdines, I n s t i t u t Pasteur, 75015 Paris. (12-~-1973)

Les m~thodes d '~leetrophor6se prepara t ive sur divers types de suppor t s sont d ' u n usage courant . C'est a ins i q u ' o n t ~t~ ut i l is~s comme suppor t s : le papier [1], les gels d ' a m i d o n [2, 3] ou de po ly -ac ry lamide [4].

Des gels mix tes d ' ac ry lamide-agarose ont ~t~ uti l is~s comme suppor t d '~lectrophor6se en p laques par Uriel [5]. Ils on t u n g rand pouvoir de r~solut ion et de bonnes propri~t~s m~caniques qui fac i l i ten t l eur m a n i - pula t ion . Le bu t de cette note est d ' ind iquer la mo d a - lit~ que nous avons adopt~e pour r~al iser une ~lectro- phor6se prepara t ive d a n s ees gels d ' ae ry lamide-agarose .

Nous avons uti l is~ les fi lms e o m m e r e i a u x e Indu- biose Pla tes >> fou rn i s par l ' Indus t r i e Biologique F ran -

g a i s e . Ce film, aux concent ra t ions de 5 p. cent en mono- m6re d ' ae ry lamide et 0,8 p. cent en agarose, se pr~- sente sous la fo rme d 'une eouehe de gel d~shydrat6 prot~g6 par deux feui l les de ce l lophane [6]. II doit ~tre r6hydra t~ p e n d a n t que lques heures avan t son u t i - l i sa t ion dans une so lu t ion t ampon . Nous avons uti l is~ la compos i t ion du t a m p o n et les condi t ions d'dlectro- phor6se propos6es par Uriel [5].

Inser t ion de l 'dchantil lon.

Apr6s r6hydra ta t ion , la p laque d ' ae ry lamide-agarose qui a a t t e in t une ~paisseur d ' env i ron 2 m m est so igneusemen t s~eh~e en sur face au m o y e n de papier non pe lueheux type Kleenex, de faqon q u ' u n e fois dispos~e su r la p laque de verre qui lui sert de suppor t , elle y adh6re pa r f a i t emen t . Les ~chant i l lons en solu- t ion peuvent a ins i ~tre in t rodu i t s dans le r~servoir fl la t emp6ra tu re a m b i a n t e sans r i sque de di f fus ion entre la p laque de verre et le gel.

On pra t ique au m o y e n d ' u u scalpel u n r~servoir de 2,5 m m de large et a l l an t au p lus j u s q u ' h 1,5 cm des bords de la plaque, soit d 'une longueur d ' env i ron 8 em. Le gel su r sa p laque est a lors dispos~ entre les deux cuves porte ~leetrodes rempl ies du t a m p o n d'~leetro- phor6se [5]. Le r~servoir est rempl i avee l '~chaut i l lon h la concen t ra t ion de 25 m g / m l . Le vo lume du r~ser- voir 5 taut d ' env i ron 0,4 ml, on peut donc t ra i t e r 10 mg de produi t par plaque. La m i g r a t i o n s 'effectue sous une t ens ion de 10 v / e m . Dans une p remiere phase , l '~lee- t rophor6se est poursu iv ie p e n d a n t une duroc suffi- san te pour que l '~ehant i l lon l~n~tre dans le gel, ee t emps a y a n t 6t~ prdeddemment d~termin~ d 'apr6s la mobil i t6 du eons t i t uan t le p lus lent, au eours d ' une ~leetrophor6se ana ly t ique . Le r6servoir est a lors r id6 du t a m p o n r e s t a n t avee u n e pipet te effil~e puis rempl i avee une so lu t ion d ' agarose - indubiose A 37 h 0,8 p. cent. Le gel est reeouver t d ' une feuil le p las t ique Saran W r a p p pour ~viter l '6vapora t ion au eours de la deuxi6me phase de la migra t ion . La dur~e totale de l '~lectrophor6se est de 3 heures .

Si la durde de la premi6re phase est sup~rienre h 1/2 heure, il est pr6f~rable, pour ~viter une ~vapora- t ion t rop impor tan te , de r empl i r le r~servoir avee

l '~chaut i l lon m~lang~ avec de l ' agarose fondue. Ceel pe rmet de recouvr i r le gel d6s le d~but de la mig ra t i on avec la feui l le de Saran Wrapp .

Rep~rage des bandes.

L'61ectrophor6se termin~e, on dispose la p laque avee son suppor t de verre au -des sus d 'une feui l le de papier mi l l im~t rC En p r e n a n t pour origine le r~servoir, on pra t ique avec u n scapel t o u s l e s cent im~tres une peti te eneoche de 6 m m de long, de par t et d ' au t re de deux l ignes perpendicu la i res h la direct ion du r~servoir et situ~es h 2 m m en deq~t de ses extr~mit~s. On d~coupe alors le gel su ivan t ces deux ]ignes. Toute la par t ie p~riph~rique du gel est mise /~ colorer dans du Coomass ie Br i l lan t Blue [5]. P e n d a n t la colorat ion, la par t ie centrale est ~ nouveau recouverte de la feuil le de Sa ran Wrapp . La colorat ion a t t e in t son m a x i m u m apr6s 3 heures et les extr~mit6s des bandes de migra - t ion de l '~chant i l lon a p p a r a i s s e n t n e t t e m e u t sur u n fond p r a t i q u e m e n t non colorC La par t ie p~riph6rique est alors plac~e au -des sus d 'une feuil le mi l l im~trde dans la pos i t ion qu 'el le oceupait a v a n t d 'avoir ~t5 dS- couple. Le gel n ' a y a n t subi au cours de la colorat ion ni contract ion, ni d i la ta t ion, cette opera t ion est faci- l emen t r~alis~e grace aux encoches qui out ~t~ pra- tiqu~es. I1 suffi t a lors de dess iner su r une feui l le mil l im~tr~e la pos i t ion des bandes et de gl isser eette feuil le sous la par t ie centra le pour pouvoi r d~couper avec prScision les t r anches de gel co r respondan t a chacun des cous t i tuan t s .

Extract ion des cons l i tuants du gel d 'acrylamide.

On peut f ac i l ement ex t ra i re d ' u n gel d 'agarose ou d ' a m i d o n les produi t s qui y sont inelus, soit par diffu- sion en t r e m p a n t le gel dans une so lu t ion i so tonique [7], soit par rup tu re de la t ex ture du gel par congd- la t ion et d~eong~latlon [3]. Ces t echn iques ne sont pas appl icables h l ' ac ry lamide-agarose paree que la d i f fus ion h par t i r du gel d ' ac ry lamide-agarose est t r6s faible et la mai l le du gel r~siste h la eong~lation-d~- congdlat ion. Pour ext ra i re les cons t i tuan t s , nous avons done fair une nouvel le ~leetrophor~se apr~s avoir ine lus ehaque bande de gel d 'aerylarr t ide-agarose dans u n gel d 'agarose h 0,8 p. cent.

Les eons t i t uan t s s~par~s lors de l '~leetrophor6se pr~- e~dente se t rouven t inelus ~t l ' in t~r ieur de bandes d ' ae ry lamide-agarose de 2 m m d '~paisseur , de 7,6 cm de long env i ron et de la rgeur var iable su ivan t l '~tale- m e n t du produi t lors de la premi6re ~lectrophor6se. De l 'agarose, h 0,8 p. cent dans le t a m p o n qui sert h la r6hydra t a t i on des gels mixtes , est coulee su r une ~paisseur de 3 m m sur des p laques de verre de 9 × 12 era. Dans ehaque gel, on d~eoupe avee u n seapel u n r~servoir de d i me n s i o n l~g6rement sup~rieure h eelles de la bande d ' ae ry lamide qu ' i l va reeevoir. On eoule dans le fond du r~servoir une l~g6re touche d 'agarose h 0,8 p. cent puis on y dispose la bande d ' ae ry lamide ;

8 2 4 F r a n k B e l l o n .

on c o m p l g t e e n s u i t e le r e m p l i s s a g e des r 6 s e r v o i r s avec l ' a g a r o s e h 0,8 p. c en t h 40°C. U n e t e n s i o n de 7 v / e m es t app l iquf ie p e n d a n t la dur~e n d e e s s a i r e p o u r f a i r e p a s s e r les p r o d u i t s de l ' a e r y l a m i d e d a n s l ' aga ro se . Ce t e m p s de m i g r a t i o n , de l ' o rd r e de 30 h 45 m i n u t e s , e s t ~ v i d e m m e n t f o n e t i o n de la m o b i l i t d des p r o d u i t s a i n s i que de l a l a r g e u r de la b a n d e d ' a e r y l a m i d e . I1 sn f f i t e n s u i t e de r ep~ re r la p o r t i o n du gel d ' a g a r o s e con te - n a n t les p r o d u i t s en c o l o r a n t u n e b a n d e d ' a g a r o s e pa r a l l~ l e h la m i g r a t i o n . On d~conpe cet te p o r t i o n d u gel e t on la s o u m e t h t r o i s s~r ies de cong61a t ion-d~-

eong~ la t i on p o u r en r o m p r e l a t e x t u r e . L ' e x s u d a t e s t a l o r s e x p r i m ~ d a n s u n e s e r i n g u e m u n i e h sa p a r t i e i n f ~ r i e u r e d ' u n p a p i e r f i l t re D u r i e u x n ° 128.

N o u s a v o n s a i n s i pu r~a l i s e r (figure 1) avec u n r e n d e m e n t de 80 p. cen t la s ~ p a r a t i o n de t r o i s p e p t i d e s o b t e n u s ap rbs r ~ d u c t i o n a u m e r c a p t o ~ t h a n o l et ca rbo - x y m ¢ ! t h y l a t i o n p a r l ' i o d o a c ~ t a m i d e des p o n t s d i s u l f u r e d ' u n f r a g m e n t (FI ) de s 6 r u m a l b u m i n e h n m a i n e de m a s s e m o l ~ c u l a i r e 6.600 [8]. Ces p e p t i d e s n ' a v a i e n t p u ~tre sSpar~s p a r f i l t r a t i on s n r S e p h a d e x , c h r o m a - t o g r a p h i e s u r co lonne 6 c h a n g e u s e d ' i ons ou ~lect ro- p h o r b s e en gel d ' aga ro se .

Ces r ~ s u l t a t s m o n t r e n t que les gels m i x t e s d ' a c r y l - a m i d e - a g a r o s e , h a b i t u e l l e m e n t n t i l i s~s e n 6 l ec t ropho- r~se a n a l y t i q u e , p e u v e n t s e rv i r h la r ~ a l i s a t i o n d '~lec- t r o p h o r b s e p r 6 p a r a t i v e . Grace h s o n g r a n d p o u v o i r de r 6 s o l u t i o n et h la t rbs f a ib l e d i f f u s i o n obse rv6e d a n s ce t y p e de s u p p o r t , ce t te t e c h n i q u e p e r m e t la s 6 p a r a - t i on de pep t i de s de mob i l i tS s v o i s i n e s avec u n r ende - m e n t t rbs s a t i s f a i s a n t .

FIG. 1. - - E l e c t r o p h o r ~ s e en p l a q u e d ' a c r y l a m i d e - a g a r o s e d u f r a g m e n t F1 r 6 d u i t et a lky l~ [1] et de ses c o n s t i t u a n t s [2, 3, 4] i sol~s p a r ~ l ec t rophor~se p r e p a - r a t i ve .

Remerciements.

N o u s r e m e r c i o n s M me P. D a i l l a n p o u r son a ide t ech- n ique .

B I B L I O G R A P H I E .

1. D u r r u m , E. L. (1951) J. Am. Chem. Soc., 73, 4875- 4880.

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3. Be rn fe ld , P. ~ N i s s e l b a u m , J. S. (1956) J. Biol. Chem., 220, 851-860.

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5. Urie l , J. (1966) Bull. Soc. Chim. Biol., 48, 969:981. 6. Dugue , M., Bosche t t i , E., T ix ie r , R., R o u s s e l e t , F. &

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BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 6-7.