Concours CAPET Externe Section Biotechnologies Option Biochimie Génie Biologique Session 2010

ANALYSES BACTÉRIOLOGIQUES D’EAU MINÉRALE NATURELLE ET

D’EAU DE SOURCE EMBOUTEILLÉES

Candidat n°07

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SOMMAIRE

ABRÉVIATIONS ...................................................................................................................... 3

INTRODUCTION ...................................................................................................................... 4

ETUDE TECHNIQUE ............................................................................................................... 5

1. L’eau embouteillée ............................................................................................................. 6

1.1. Flore naturelle de l’eau .................................................................................................... 6

1.2. Les différentes sortes d’eau embouteillée ....................................................................... 6

1.2.1. Les eaux de source ................................................................................................... 6

1.2.2. Les eaux minérales naturelles .................................................................................. 7

1.2.3. Les eaux rendues potables par traitement................................................................. 7

1.3. Les normes françaises actuelles ...................................................................................... 7

1.3.1. Les normes microbiologiques .................................................................................. 7

1.3.2. Les autres critères ..................................................................................................... 8

1.4. Les biocontaminations en industrie agroalimentaire ....................................................... 8

1.4.1. Les origines .............................................................................................................. 8

1.4.2. Les pathogènes et leurs effets ................................................................................. 10

2. Les analyses effectuées .................................................................................................... 11

2.1. Le site de production ..................................................................................................... 11

2.2. Les points de contrôle ................................................................................................... 13

2.3. Les techniques d’analyse ............................................................................................... 14

2.3.1. Types d'analyse ...................................................................................................... 14

2.3.2. Prélèvement des échantillons ................................................................................. 15

2.3.3. Analyse microbiologique des échantillons ............................................................. 15

2.3.4. Analyse physico-chimique des échantillons .......................................................... 18

2.4. Exemples de résultats et conséquences sur l’exploitation ............................................. 19

ÉTUDE PÉDAGOGIQUE ....................................................................................................... 21

1. Introduction ...................................................................................................................... 22

2. Présentation des différents niveaux d’exploitation possibles ........................................... 22

2.1 Application en enseignement d’exploration en classe de seconde ............................ 22

2.2 Application en biochimie en classe de première STL-BGB ...................................... 23

2.3 Application en microbiologie en classe de terminale STL-BGB .............................. 23

2.4 Application en microbiologie en STS ....................................................................... 23

3. Présentation de la séquence détaillée ............................................................................... 24

3.1 Modalités d’enseignement ......................................................................................... 24

2

3.2 Contenu du programme concerné .............................................................................. 24

3.3 Objectifs de la séquence et prérequis ........................................................................ 25

3.4 Préparation préalable ................................................................................................. 26

3.4.1 Par le professeur ................................................................................................. 26

Protocole……………………………………………………………………………………...27

Fiche technique Filtration………………………………………………………………..…...29

Fiche technique Milieux……………………………………………………………………...30

3.4.2 Par le personnel technique .................................................................................. 31

3.5 Organisation détaillée de la séquence : ...................................................................... 32

3.5.1 Supports et consignes ......................................................................................... 32

3.5.2 Déroulement détaillé de la séquence .................................................................. 32

3.6 Modalités d’évaluation .............................................................................................. 34

BIBLIOGRAPHIE……………………………………………………………………………36

Annexe 1 : critères de qualité microbiologique du décret du 14 mars 2007 ............................ 37

Annexe 2 : Normes actuelles d’échantillonnage et méthodes d’analyse à la source et aux points critiques de contrôle ...................................................................................................... 38

Annexe 3 : Normes actuelles d’échantillonnage et méthodes d’analyse du produit fini et en cours de commercialisation ...................................................................................................... 39

Annexe 4 : Formules des milieux de culture40Annexe 5 : fiche technique du Dosage des ions ammonium ................................................................................................................................ 41

Annexe 6 : fiche technique du Dosage du fer ........................................................................ 402

Annexe 7 : fiche technique du Dosage des ions manganèse .................................................. 413

Annexe 8: fiche technique du dosage des nitrites…………………………………………….44

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ABRÉVIATIONS

BAC : bioanalyses et contrôles

BEA : bile esculine azide

BGB : biochimie génie biologique

BLP : biologie de laboratoire et paramédicale

DLUO : date limite d’utilisation optimale

EMB : éosine bleu de méthylène

EPEC : Escherichia coli entéropathogènes

NPP : nombre le plus probable

PCA : plate count agar

PET : polyéthylène tétraphtalate

QIABI : qualité dans les industries agroalimentaires et les bioindustries

STL : sciences et techniques de laboratoire

STS : section de technicien supérieur

Tergitol 7 : heptadécylsulfate de sodium

TTC : Triphényl-2,3,5-Tétrazolium Chlorure

UFC : unités formant colonies

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INTRODUCTION

L’eau constitue 60% de notre organisme et une consommation de 1,5 litre par jour est conseillée pour compenser les pertes hydriques. En raison de son caractère vital, l’eau consommée doit être de bonne qualité sanitaire, afin d’éviter la survenue de pathologies d’origine hydrique. Le consommateur a aujourd’hui le choix entre l’eau du réseau de distribution, qui provient majoritairement de captages d’eaux superficielles (rivières, lacs, canaux) et d’eau embouteillée provenant de ressources profondes (nappes souterraines). Dans tous les cas, ces eaux brutes doivent subir des traitements plus ou moins complexes selon leur qualité initiale. Le produit distribué au consommateur doit répondre à des exigences de qualité microbiologique et physico-chimique. Il subit donc un grand nombre de contrôles lors de sa production. Le travail présenté ici a été effectué dans une usine d’embouteillage lors d’une mission d’intérim en tant que technicienne de laboratoire. J’ai pendant quatre mois réalisé les analyses de qualité de l’usine : analyses microbiologiques sur le produit fini (eau minérale gazéifiée ou non et eau de source embouteillées), qualité microbiologique de l’environnement, analyse de l’eau aux différentes étapes de la mise en bouteilles. Ce travail est plus un contrôle qualité de la production en routine qu’une analyse poussée du produit fini, cette dernière étant réalisée par un laboratoire mieux équipé centralisant les analyses complètes des produits de toutes les usines du groupe. Il s’agissait plus de contrôler certains points critiques afin de pouvoir réagir rapidement en cas de problème. Ainsi les analyses qui sont effectuées doivent répondre à une triple contrainte : elles doivent avoir un coût réduit, être réalisables facilement et donner des résultats rapidement. Dans l’étude technique, quelques rappels sur la réglementation et sur les précautions sanitaires en agroalimentaire seront présentés. Ensuite, le fonctionnement de l’usine et les principaux points de contrôle ainsi que les protocoles d’analyses seront décrits. Dans l’application pédagogique, ce travail a été adapté pour être proposé en travaux pratiques de microbiologie à une classe de terminale STL-BGB. Le but est à la fois de présenter une nouvelle technique (la filtration de l’eau) et de donner une vision intégrée des analyses microbiologiques dans une situation de travail, ici dans une usine agroalimentaire.

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ÉTUDE TECHNIQUE

ÉTUDE TECHNIQUE

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1. L’eau embouteillée

L’eau est un produit alimentaire particulier à bien des égards. C’est un milieu pauvre qui ne permet pas le développement des micro-organismes, et s’il est sensible à des contaminations microbiennes au même titre que les autres aliments, les conséquences sont plus limitées car ces contaminants ne pourront pas se multiplier. L’eau de source et l’eau minérale ne nécessitent pas de stérilisation, mais doivent répondre à des critères de qualité comme les autres aliments. Si le producteur a une obligation de résultats, il n’a cependant pas d’obligation de moyens. Le producteur peut donc effectuer les analyses qu’il décide avec les milieux de culture de son choix, afin de s’adapter au mieux aux risques réels de la production dans son usine.

1.1. Flore naturelle de l’eau L’eau, quelque soit son origine (souterraine ou superficielle), constitue un écosystème. Elle contient des sels minéraux, des molécules organiques, des particules colloïdales, et des organismes vivants qui utilisent ces composés pour leur métabolisme afin de se multiplier. Les bactéries rencontrées dans l’eau peuvent avoir trois origines différentes :

- une origine purement aquatique : germes aquicoles adaptés aux conditions de température et à la disponibilité des substrats minéraux et organiques de ce milieu,

- une origine terrestre : leurs propriétés d’adaptation leur permettent de survivre et éventuellement de se développer,

- une origine humaine ou animale : germes de contamination appelés germes fécaux, dont la température normale de développement est de 37°C. Ils survivent dans ce milieu mais ne peuvent pas y croître.

Les eaux souterraines ont pour origine l’eau de pluie ou les eaux de ruissellement qui s’infiltrent dans le sol. Lors de cette infiltration, l’eau se charge en polluants, particules de matière organique et microorganismes. Le passage dans le sol s’apparente à une filtration à travers un milieu poreux dont les pores seraient de très petite taille. La matière organique particulaire ainsi que les bactéries qui y sont fixées sont ainsi majoritairement éliminées. En parallèle, l'eau se charge en composants des sols et des roches mères et peut acquérir des sels minéraux en grande quantité (calcium, magnésium, sulfates...). L’eau des nappes profondes ne contient pas de microorganismes phototrophes du fait de l’obscurité qui y règne, pas de microorganismes aérobies du fait de l’absence d’oxygène et la pauvreté en matière organique rend ce milieu très défavorable au développement des autres microorganismes. De fait, l’autoépuration de l’eau profonde est presque complète, et ce d’autant plus que la percolation aura été longue. La population bactérienne des eaux profondes est donc extrêmement réduite aussi bien en nombre d’espèces qu’en quantité de microorganismes. Cette eau est naturellement d’une qualité hygiénique excellente et sa consommation a toujours été préférée à celle des eaux de surface quand cela était possible.

1.2. Les différentes sortes d’eau embouteillée

1.2.1. Les eaux de source Les eaux de source sont d’origine souterraine, microbiologiquement saines et protégées contre les risques de pollution, elles sont naturellement propres à la consommation humaine. Les

ÉTUDE TECHNIQUE

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seuls traitements autorisés sont la décantation ou filtration et l’incorporation de dioxyde de carbone. L’eau de source commercialisée sous un même nom peut provenir de sources différentes. L’exploitation d’une source nécessite une autorisation préfectorale et un avis favorable du Conseil Départemental d’Hygiène. Les mentions obligatoires de l’étiquetage sont le nom de la source, son lieu d’exploitation et les traitements de séparation des composés instables, tels le fer ou le manganèse, par décantation ou filtration ; en mention facultative, l’utilisation pour l’alimentation des nourrissons peut être signalée (c’est la seule allégation nutritionnelle autorisée pouvant apparaître sur l’étiquette).

1.2.2. Les eaux minérales naturelles Les eaux minérales naturelles sont d’origine souterraine. En France, une eau ne peut être qualifiée de minérale que si elle a une composition en minéraux stable dans le temps. Sa composition est donc garantie, ainsi que la constance de l’ensemble des critères de qualité. Elle est naturellement propre à la consommation humaine. Elle est commercialisée sous un seul nom et ne peut provenir que d’une seule source. L’exploitation d’une source nécessite une autorisation préfectorale et un avis favorable du Conseil Départemental d’Hygiène. L'eau minérale gazeuse ne doit subir aucun traitement chimique. La loi française autorise uniquement deux types de traitement : le retrait du fer et la regazéification. Les valeurs thérapeutiques de certaines eaux minérales sont utilisées en cure thermale, elles nécessitent une Autorisation du Ministère chargé de la Santé après avis de l'Académie Nationale de Médecine.

1.2.3. Les eaux rendues potables par traitement. Elles respectent les limites applicables aux eaux du robinet. Elles peuvent être traitées suivant tous les traitements autorisés pour l'eau du robinet, y compris la désinfection. Elles sont peu commercialisées en France.

1.3. Les normes françaises actuelles Les critères de qualité des eaux conditionnées (eau minérale naturelle, eau de source et eau rendue potable par traitement), leurs traitements et les mentions d’étiquetage sont précisés dans le décret du 14 mars 2007.

1.3.1. Les normes microbiologiques Pour éviter les intoxications alimentaires, l'eau destinée à la consommation humaine ne doit contenir aucun microorganisme pathogène. Pour s’en assurer, on recherche essentiellement deux types de bactéries :

- La flore aérobie mésophile totale (à 20°C, en 72 heures). Ce sont principalement des bactéries naturelles de l’eau. Ce dénombrement permet de mesurer le degré de pollution de l’eau.

- La flore fécale (à 37°C, en 24 heures). La présence de ces bactéries reflète une contamination par des matières fécales et une possible présence de bactéries pathogènes (en particulier Shigella). Dans ce cas, des mesures doivent être prises pour interdire la consommation de l'eau qui ne répond plus aux normes sanitaires des eaux conditionnées (voir tableau 1).

ÉTUDE TECHNIQUE

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Tableau 1 : critères de qualité microbiologique des eaux conditionnées

Paramètres Limites de

qualité Unités Notes

Escherichia coli 0 250 mL A l’émergence et au cours de la

commercialisation

Entérocoques 0 250 mL A l’émergence et au cours de la

commercialisation Bactéries sulfito-réductrices y

compris les spores 0 50 mL

A l’émergence et au cours de la commercialisation

Pseudomonas aeruginosa 0 250 mL A l’émergence et au cours de la

commercialisation

Coliformes totaux 0 250 mL A l’émergence et au cours de la

commercialisation

Numération de germes aérobies revivifiables à 22°C

0 Par mL A l’émergence

100 Par mL Dans le produit fini 12 heures

maximum après l’embouteillage

Numération de germes aérobies revivifiables à 37°C

0 Par mL A l’émergence

20 Par mL Dans le produit fini 12 heures

maximum après l’embouteillage

Microorganismes pathogènes : Cryptosporidium, Gardia,

Legionella 0

Variable selon les souches

A l’émergence et au cours de la commercialisation

Recherche uniquement en cas de contamination.

1.3.2. Les autres critères Les eaux destinées à la consommation humaine doivent, outre la qualité microbiologique, répondre à d’autres paramètres de qualité :

- des paramètres organoleptiques (incolore, limpide, inodore, sans saveur), - des paramètres physico-chimiques (température, pH, teneurs en minéraux, quantité de

résidus secs, radioactivité), - le taux de certains produits chimiques potentiellement toxiques comme les pesticides est

limité.

1.4. Les biocontaminations en industrie agroalimentaire

1.4.1. Les origines La matière première alimentaire est toujours porteuse d’une flore spécifique. Les contaminations de la matière première sont appelées contaminations primaires. Lors de la préparation de l’aliment, des contaminants sont apportés qui peuvent accroître la charge microbienne globale. Ce sont des contaminations secondaires, apportées par l’air, le matériel au contact de l’aliment, et par les manipulateurs. Dans le pire des cas, l’introduction de bactéries pathogènes est également possible. Cette flore prolifère dans l’aliment, causant éventuellement sa dégradation et risquant de causer une toxi-infection alimentaire lors de son ingestion (figure 1).

ÉTUDE TECHNIQUE

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Figure 1 : origines diverses de la flore d’un aliment transformé

L’eau d’origine profonde est un cas particulier car c’est un milieu nutritif très pauvre, la plupart des bactéries ne peuvent s’y multiplier. L’absence de matière organique implique également qu’elle ne peut être altérée par les micro-organismes, une contamination importante sera donc moins facilement détectable par le consommateur. Enfin, l’eau profonde est quasiment exempte de microorganismes lorsqu’elle est pompée dans le sous-sol, la flore retrouvée dans le produit fini provient donc exclusivement des opérations technologiques réalisées lors de l’embouteillage (contaminations secondaires). Toutes les précautions d’hygiène sont prises pour limiter ces biocontaminations (voir tableau 2). Tableau 2 : possibilités de biocontaminations de l’eau lors de l’embouteillage et moyens de prévention

Origine des biocontaminations Moyens de prévention Flore humaine

Flore oropharyngée Port de masque à usage unique Flore intestinale

manuportée Lavage des mains, formation du personnel

Flore des cheveux Port de la charlotte à usage unique Flore de l’air

Atmosphère des salles Salle à empoussièrement contrôlé (filtration de l’air

entrant, légère surpression, sas à l’entrée)

Machines et matériel Désinfection après chaque cycle de production de toute la salle et du matériel, élimination des premières bouteilles produites (rinçage des canalisations par l’eau circulante)

Flore de l’eau

Eau technique pour le lavage

Chloration

Flore du sol

Chaussures du personnel

Pédiluves à l’entrée des salles, surchaussures à usage unique

Toutes les flores

Contrôle microbiologique des produits, du matériel, et de

l’air ambiant des zones critiques

ÉTUDE TECHNIQUE

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1.4.2. Les pathogènes et leurs effets Dans le Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire de l’institut de veille sanitaire n° 51-52 du 26 décembre 2006, seulement 58 cas d’infections alimentaires collectives entre 1996 et 2005 ont pu être attribuées à la consommation de boissons, le plus souvent (33 cas) l’eau de distribution en est la cause. Le plus souvent, la contamination de cette eau résulte d’un bref dysfonctionnement du système de traitement ou d’une désinfection insuffisante (par exemple par saturation des installations lors de fortes pluies). Aucun cas dû à la contamination d’eau embouteillée n’est cité depuis plusieurs décennies en Europe. Les microorganismes pathogènes responsables d’infections d’origine hydrique sont très nombreux et de nature variée : on trouve des bactéries, des virus mais aussi des protozoaires. Nous nous limiterons à citer les plus courants :

● Parmi les bactéries : les Salmonelles, Yersinia enterocolitica, les Shigella, les Vibrio, EPEC.

● Parmi les virus : le virus de l’hépatite A, les rotavirus, les adenovirus, et le virus de Norwalk.

● Parmi les parasites : les cryptosporidies, les Giardia et des helminthes. Tableau 3 : caractéristiques de quelques pathogènes responsables de gastro-entérites d’origine hydrique Micro-organismes

Salmonella

spp

EPEC Hépatite A Rotavirus Giardia

intestinalis

Type de micro-organisme

bactérie bactérie Virus virus protozoaire

Dose infectieuse

100-1 000 organismes

109 bactéries chez l’adulte

10-100 virions inconnue 1 à 10 kystes

Résistance dans l’eau

Plusieurs mois Plusieurs mois Plusieurs mois Plusieurs mois 3 mois

Réservoir Humain, animaux sauvages et domestiques

Humain et autres mammifères

Humain humain Humain, animaux sauvages et domestiques

Incubation moyenne

12 à 36 H 12-72 H 28 à 30 jours 24 à 72 H 7 à 10 jours

Public touché nourrissons et jeunes enfants

Nourrissons de moins de 1 an

nourrissons et jeunes enfants

Nourrissons de moins de 1 an

nourrissons et jeunes enfants

Pathogénicité gastro-entérite aiguë : douleurs abdominales, diarrhée, nausées et vomissements; la déshydratation peut être grave chez les nourrissons et les personnes âgées

affection intestinale accompagnée de diarrhée liquide, de fièvre, de crampes et de vomissements, selles sanguinolentes dans certains cas, maladie grave chez les nourrissons

fièvre, sensation de malaise, d'anorexie, de nausées et de gêne abdominale suivies après quelques jours d'un ictère

fièvre et vomissements, suivis d'une diarrhée aqueuse, parfois associée à une déshydratation sévère et létale chez l'enfant

apparition subite de diarrhées nauséabondes, graisseuses accompagnées de crampes abdominales, de ballonnements, anorexie et nausées. Pas de fièvre.

ÉTUDE TECHNIQUE

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Malgré leur nature extrêmement différente, les agents pathogènes partagent (ainsi que les infections qu’ils causent) plusieurs caractéristiques (voir tableau 3). Ils sont résistants et peuvent survivre plusieurs mois dans l’eau et conserver leur potentiel pathogène. Ils induisent après ingestion des symptômes gastro-intestinaux tels que diarrhées et/ou vomissements. La gravité de l’infection est variable selon la quantité de pathogènes ingérée, selon sa virulence, et selon l’état physiologique de la personne infectée. La plupart sont des pathogènes opportunistes ou causent des infections asymptomatiques ou sans gravité. Cependant, chez les personnes âgées, immunodéprimées et les jeunes enfants la maladie peut être grave, voire fatale. Quelques uns sont aussi des pathogènes stricts, comme Salmonella ou Vibrio. Leur mode de transmission (oro-fécal) est le même : les aliments ou l'eau sont contaminés par les matières fécales de personnes ou d’animaux infectés ou porteurs sains (les porteurs sains de Salmonella peuvent éliminer de l’ordre de 107 Salmonelles/g de selles toute leur vie). Si l’homme est le seul réservoir, la prévention est plus simple. Le traitement de l’eau pour éliminer les microorganismes et l’hygiène individuelle (lavage des mains avant toute manipulation d’aliments, lavage des fruits et légumes crus, …) peuvent permettre d’éradiquer le pathogène. Par exemple, le choléra et la dysenterie bactérienne ne causent plus d’épidémies en Europe et en Amérique du nord depuis la mise en place des systèmes de traitement de l’eau de distribution. Le problème est plus délicat si le pathogène est présent chez des animaux domestiques ou sauvages. L’éradication est alors impossible et le risque de contamination fécale par ces réservoirs est plus fréquent. Cependant, grâce aux mesures préventives, les cas d’intoxications alimentaires d’origine hydrique sont extrêmement rares (58 cas en 10 ans en France).

2. Les analyses effectuées

2.1. Le site de production Le forage permet de pomper l’eau directement dans la nappe (50 ou 70m de profondeur) et cela avec un débit fixé par les autorités afin de ne pas dépasser la capacité de renouvellement de la source. Cette eau est riche en minéraux et nécessite une filtration pour éliminer le fer et le manganèse qui donnent un goût ferrugineux très prononcé à l’eau et peuvent être toxiques aux concentrations initiales. L’eau pompée est stockée dans une première cuve, permettant le fonctionnement des chaînes d’embouteillage même si le pompage doit être arrêté pour des opérations de maintenance. Cette eau est ensuite traitée. De l’ozone y est injectée pour oxyder le fer et le manganèse qui forment des particules de décantation, ces particules sont ensuite éliminées par filtration. L’eau déferrisée est stockée dans une deuxième cuve permettant aussi de faire une réserve d’eau prête à être embouteillée. En parallèle, les bouteilles sont préparées dans la salle de soufflage. Des préformes en PET passent dans une machine où elles sont chauffées puis soufflées dans un moule afin d’obtenir la forme de la bouteille. Le soufflage est effectué dans une salle blanche, car les bouteilles doivent être exemptes de microorganismes. Les accès sont tous équipés d’un pédiluve et d’un poste de lavage des mains. Le personnel ne peut entrer que s’il porte une charlotte et des surchaussures. L’intervention dans les machines nécessite en plus le port d’un masque. Les bouteilles sont ensuite transportées jusqu’à la salle de soutirage par un rail protégé par un flux laminaire.

ÉTUDE TECHNIQUE

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Figure 2 : organisation schématique de la chaîne d’embouteillage

La salle d’embouteillage est également une salle blanche. L’eau y est distribuée dans les bouteilles qui sont immédiatement bouchées. Cette étape peut être précédée d’une adjonction de CO2 pour obtenir de l’eau gazeuse. La soutireuse est un point sensible car c’est le seul endroit où l’eau sort des canalisations et peut donc être contaminée par les opérateurs, l’air ambiant ou les machines. Ces machines sont dans une enceinte close et sous flux laminaire (voir figure 3). Les bouteilles sont ensuite étiquetées et le code produit, la date et l’heure d’embouteillage, ainsi que la DLUO y sont gravés. Le produit fini quitte ensuite les salles blanches pour une zone moins critique où les bouteilles sont assemblées en pack, puis en palettes, avant d’être déplacées dans une zone de stockage. Le site comprend deux forages et trois lignes d’embouteillage (le schéma a été simplifié et ne comporte qu’un forage et une ligne d’embouteillage) qui peuvent fonctionner en parallèle de manière continue pendant toute la semaine, grâce à des équipes d’opérateurs travaillant en 3x8H. Lorsque les lignes fonctionnent au maximum de leur capacité, elles produisent environ 20000 bouteilles de 1,5 L ou 2L par heure pour les deux premières lignes et environ 60000 bouteilles de 0,5L par heure pour la troisième. A la fin de chaque semaine de production, l’usine est intégralement nettoyée, en particulier les salles blanches dont les machines sont désinfectées au canon à mousse.

ÉTUDE TECHNIQUE

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Figure 3 : Schéma de la zone d’embouteillage

2.2. Les points de contrôle Des contrôles sont réalisés quotidiennement à tous les niveaux de la chaîne de production, de la sortie de l'eau au forage, jusqu'au produit fini embouteillé. L'objectif de ces tests est de s'assurer de la qualité de l'eau. Deux types de tests sont pratiqués sur l'eau : - le contrôle bactériologique : teste la présence de micro-organismes et vérifie l'absence de contaminants ; - le contrôle physico-chimique : analyse la composition de l'eau en certains minéraux au niveau du forage et après filtration. Il faut aussi vérifier les matières premières, soit l'ensemble des éléments qui entrent dans la composition de la bouteille comme les matériaux en contact avec l'eau (bouchons, plastique…) ainsi que la qualité du produit final : niveau de remplissage, étiquette bien collée, DLUO lisible, couple de vissage des bouchons, pression de CO2, …. Le produit fini est contrôlé lors du démarrage de la ligne de production, puis à chaque changement d’équipe soit toutes les 8 heures. Des prélèvements de surface sont effectués dans la soutireuse pour vérifier si la désinfection a été efficace. Sur la figure 2, les points de prélèvement de l’eau sont marqués par les flèches rouges (analyses microbiologiques) et violettes (analyses physico-chimiques). Sur la figure 3, les prélèvements de matières premières et les prélèvements de surface sont indiqués respectivement par les flèches vertes et oranges.

ÉTUDE TECHNIQUE

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2.3. Les techniques d’analyse

2.3.1. Types d'analyse Trois niveaux d’analyses bactériologiques de l’eau sont définis : analyse réduite, analyse sommaire et analyse complète (voir tableau ci-dessous). Tableau 4 : les 3 types d’analyses microbiologiques effectuées sur l’eau potable

Analyses bactériologiques Réduite (type B1) Sommaire (type B2) Complète (B3) Coliformes thermotolérants Coliformes thermotolérants Coliformes thermotolérants Entérocoques Entérocoques Entérocoques Dénombrement des bactéries

aérobies revivifiables à 22°C et à 37°C

Dénombrement des bactéries aérobies revivifiables à 22°C et à 37°C

Spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices

En suivi de production d’eau embouteillée, seule l’analyse sommaire est requise. Le produit fini devrait subir une analyse complète. Dans l’usine, une analyse de type B2, une recherche de Pseudomonas aeruginosa ainsi qu’un dénombrement des moisissures et levures sont réalisés quotidiennement sur les produits finis et dans les cuves de stockage de l’eau après traitement. Ces deux dernières analyses ne sont pas obligatoires mais sont réalisées car l’usine est très ancienne (elle date des années cinnquante) et quelques défauts de conception induisent des contaminations récurrentes par les moisissures. De même, la recherche de Pseudomonas

aeruginosa est réalisée quotidiennement car cette bactérie peut former des biofilms dans les canalisations. La recherche des spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices n’est pas réalisée car le laboratoire ne dispose pas d’étuve anaérobie pour les analyses par filtration et la technique d’ensemencement en tubes demande beaucoup plus de temps. De plus, les anaérobies sulfito-réducteurs sont des indicateurs de contamination fécale ancienne. Or la source est pure, donc toute contamination fécale sera récente et sera très bien détectée par une recherche des autres bactéries de la flore fécale (coliformes et entérocoques). Une analyse microbiologique plus complète (prenant en compte tous les pathogènes et les indicateurs de contamination fécale comme les spores de bactéries sulfito-réductrices, les légionelles, …) et les analyses biochimiques complètes sont réalisées par un laboratoire gérant toutes les sources du groupe une fois par mois. Une analyse trimestrielle est également réalisée par un laboratoire indépendant agréé par l’état. La recherche de contaminants dans l’atmosphère, sur les contenants (bouteilles et bouchons), sur les machines dans les salles blanches (écouvillons), et sur les mains des opérateurs sont réalisées une fois par semaine. En parallèle, chaque jour l’eau est analysée pour mesurer la concentration de quatre ions dont la teneur est règlementée : fer, manganèse, ammonium et nitrites. Ce travail a été réalisé en 2006, les normes d’analyse ont évolué depuis et les méthodes d’échantillonnage et de contrôle microbiologique sont aujourd’hui fixées par le codex alimentarius (CODEX STAN 108-1981) et dans le code d’usage international pour l’exploitation et la commercialisation des eaux minérales naturelles (CCAC/RCP 33-1985). Elles sont identiques pour l’eau de source. Elles sont présentées dans les annexes 2 et 3.

ÉTUDE TECHNIQUE

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2.3.2. Prélèvement des échantillons Pour tous les prélèvements destinés à une analyse microbiologique, le port du masque et de la charlotte est requis, un lavage des mains est également nécessaire. Les échantillons sont prélevés le matin et analysés l’après midi. Les prélèvements d’eau se font en flacon de plastique stérile de 1 L. Le prélèvement doit être réalisé en conditions stériles également pour ne pas fausser les résultats. Un certain nombre de robinets de prélèvement sont répartis sur les canalisations de l’usine pour contrôler la qualité de l’eau tout au long de son trajet (voir figure 2). Le robinet est aspergé d’éthanol, flambé, puis porté au rouge à l’aide d’un chalumeau portable. Le chalumeau allumé est maintenu à côté du robinet pour créer une zone de stérilité. Le robinet est ouvert, il faut laisser couler l’eau quelques secondes pour refroidir le robinet. Le flacon stérile est ouvert, rempli, puis refermé toujours dans la zone de stérilité. Pour les prélèvements de surface, on utilise des écouvillons en tube contenant un milieu de culture stérile. Le dispositif d’écouvillonnage est ouvert rapidement, frotté sur la surface à analyser et refermé immédiatement. Le prélèvement n’est pas réalisé en conditions de stérilité, mais les machines sont toutes sous flux laminaire et l’atmosphère doit y être très peu contaminée. Chaque prélèvement est réalisé en double. L’analyse de l’ambiance consiste à rechercher la présence de levures et moisissures dans l’atmosphère des salles d’embouteillage, de soufflage et dans la salle des bouchons. Une boîte de Pétri de 12,5 cm de diamètre est ouverte et disposée en hauteur dans la salle pendant une heure. Elle est ensuite fermée, retournée et incubée 48 heures à 22°C. Le contrôle de l’hygiène des mains du personnel est réalisé par apposition des doigts sur le milieu de culture en boîtes de Pétri. Sur une main sont recherchés les entérocoques et sur l’autre les coliformes thermotolérants.

2.3.3. Analyse microbiologique des échantillons

Filtration sur membrane Un volume important d'eau est aseptiquement filtré sur une membrane qui retient les germes contenus dans l'eau. La membrane est ensuite aseptiquement transférée sur une boîte de Pétri contenant un milieu nutritif sur lequel cultivent les germes retenus sur la membrane. Après incubation, les UFC (unités formants colonies) sont comptées pour évaluer la qualité microbiologique de l'eau. Selon le milieu de culture (sélectif) où est déposé le filtre, on met en évidence la présence de différents microorganismes. C’est de plus une méthode avantageuse car rapide et peu coûteuse.

Matériel Figure 4 : appareillage de filtration de l’eau (photo matériel Sartorius)

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La filtration est réalisée sur une rampe de filtration sous vide contenant trois systèmes de filtration afin de gagner du temps lors de la réalisation des analyses (trois échantillons sont filtrés en même temps). Voir figure 4

Mode opératoire 1) Stériliser le dispositif, en versant de l’éthanol dans l’entonnoir, flamber au bec bunsen. Rincer à l’eau distillée stérile pour enlever les dernières traces d’éthanol et refroidir le dispositif. 2) Enlever l’entonnoir, placer la membrane stérile (Sartorius, acétate de cellulose) quadrillage vers le haut bien centrée sur le fritté grâce à une pince préalablement flambée puis refroidie, remettre l’entonnoir. 3) Verser l’échantillon à analyser jusqu’au repère (graduation de volume). Ouvrir la vanne à vide. Quand le filtre paraît sec, casser le vide et enlever l’entonnoir. 4) Enlever la membrane et la déposer sur une boîte de Pétri de 5 cm de diamètre contenant le milieu de culture adéquat, quadrillage vers le haut. Faire attention à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air pour que toute la membrane soit au contact du milieu de culture. Les boîtes sont retournées et incubées le temps nécessaire (voir tableau 5). L’analyse d’un même échantillon (six boîtes de Pétri sont réalisées) ne nécessite pas de stériliser le dispositif de filtration entre chaque filtration. Tableau 5 : Milieux de culture et incubation pour les analyses microbiologiques réalisées dans l’usine Micro-organismes recherchés

Méthode utilisée Volume d’eau filtré

Milieu de culture

Incubation

Coliformes thermotolérants

Filtration sur membrane (0,45µm de porosité)

250 mL Tergitol TTC 48H à 44°C

Entérocoques Filtration sur membrane (0,45µm de porosité)

250 mL Slanetz TTC 48H à 37°C

Pseudomonas

aeruginosa

Filtration sur membrane (0,45µm de porosité)

250 mL Cétrimide 48H à 37°C

Micro-organismes revivifiables (l) à 22°C

Filtration sur membrane (0,45µm de porosité)

100 mL PCA 72H à 22°C

Micro-organismes revivifiables (l) à 37°C

Filtration sur membrane (0,45µm de porosité)

100 mL PCA 48H à 37°C

Moisissures et levures

Filtration sur membrane (0,8µm de porosité)

100 mL Sabouraud 72H à 22°C

(1) Bactéries, levures et moisissures se développant en aérobiose dans les conditions opératoires. Le produit fini et les échantillons d’eau prélevés en différents points de la production subissent toutes les analyses présentées dans le tableau 5. L’analyse des consommables (bouteilles et bouchons) est réalisée de la façon suivante. Pour les bouteilles, on les remplit avec environ 250 mL d’eau distillée stérile, on les bouche avec des bouchons préalablement stérilisés dans de l’éthanol puis séchés. La bouteille est bien agitée, puis l’eau est filtrée. Pour les bouchons, on en dispose cinq dans un pot de plastique stérile, on ajoute 100 mL d’eau

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stérile environ. Le flacon est bien agité puis l’eau est filtrée. Pour le contrôle de l’hygiène des mains du personnel et les prélèvements de surface, seuls les flores indicatrices de la présence de pathogènes sont recherchées (entérocoques et coliformes thermotolérants). Dans ce dernier cas, le milieu de culture contenu dans le tube de l’écouvillon est bien homogénéisé, puis versé sur le filtre avec le même mode opératoire.

Milieux de culture La composition des milieux de culture est présentée en annexe 4. PCA : Principe : La gélose P.C.A. Standard dénombrement, encore appelée « Plate Count Agar », est utilisée pour le dénombrement des germes aérobies totaux dans le lait, les eaux, les viandes, les produits à base de viande, les autres produits alimentaires, ainsi que pour l'analyse des produits pharmaceutiques, des produits cosmétiques et de leur matière premières. Lecture : Chaque colonie est considérée comme ayant été engendrée par une bactérie. Dénombrer sur les boîtes de Pétri présentant entre 30 et 300 UFC. Pour l’analyse de l’eau, la flore se développant à 20°C doit être plus importante que la flore se développant à 37°C. Tergitol 7 TTC : Principe : la gélose lactosée au T.T.C. et Tergitol 7 est utilisée pour les recherches et dénombrements des coliformes et coliformes thermotolérants des eaux par la méthode des membranes filtrantes. Le Tergitol 7 inhibe la pousse des germes à gram positif, réduit l'envahissement du milieu par les Protéus et favorise le recouvrement des coliformes. Autre additif, le T.T.C est réduit très rapidement par la majorité des bactéries coliformes et forme un formazan de couleur rose ou rouge. Enfin, les micro-organismes capables de fermenter le lactose présent dans le milieu, donnent des colonies cernées de halos jaunes, coloration due au virage de l'indicateur de pH, le bleu de bromothymol. Lecture : colonies bleues ou vertes : lactose -, colonies jaunes : lactose +. La réduction du TTC en composé rouge est faible avec Escherichia coli et Enterobacter aerogenes qui donnent donc des colonies jaunes alors que celles des autres coliformes seront rose-rouges et entourées d'un halo jaune. Une colonie avec un halo jaune est identifiée par galerie Api 20E. Slanetz et Bartley : Principe : la gélose de Slanetz est un milieu solide qui permet la recherche et le dénombrement des entérocoques dans les eaux par la méthode des membranes filtrantes. Lecture : Les Enterococcus donnent des colonies moyennes roses ou rouges. Une confirmation d’identification est réalisée par ensemencement d’une gélose BEA incubée 4H à 44°C. Cétrimide : Principe : la gélose au cétrimide est utilisée pour l’isolement sélectif et l’identification présomptive de Pseudomonas aeruginosa. Sur ce milieu de très nombreuses bactéries sont inhibées de par la présence de l'antiseptique cétrimide (bromure de N-cétyl-N, N, N-triméthylammonium), ainsi que par la présence de l'antibiotique acide nalidixique (inhibiteur de nombreuses bactéries à Gram négatif). Ce milieu, proche du milieu King A, favorise aussi la production de pigments par P. aeruginosa.

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Lecture : l'obtention de colonies présentant une pigmentation caractéristique bleue ou bleue-verte et une fluorescence sous rayonnements ultra-violet à 254 nm oriente vers Pseudomonas

aeruginosa. Les colonies suspectes sont identifiées par une galerie Api 20NE. Sabouraud : Principe : La gélose Sabouraud est un milieu d'utilisation générale, permettant la croissance et l’isolement d'une grande variété de levures et moisissures. Il est additionné de chloramphénicol pour inhiber la croissance des bactéries Gram positif et Gram négatif. Il permet l’isolement sélectif des levures et moisissures dans un produit contenant des bactéries. Lecture : Chaque colonie ou thalle est considéré comme ayant été engendré par une levure ou une moisissure.

2.3.4. Analyse physico-chimique des échantillons Le dosage des ions ammonium, nitrites, fer et manganèse se font par colorimétrie grâce à des kits. La réalisation nécessite peu de matériel et est rapide de mise en œuvre pour un coût relativement réduit. Dosage des ions ammonium (annexe 5) Le principe est la réaction de Berthelot. L’ammonium est déplacé en ammoniaque en milieu alcalin. Il réagit ensuite avec de l’hypochlorite pour former une monochloramine. Cette dernière se condense avec deux molécules de thymol pour donner le bleu d’indophénol. La réaction nécessite un catalyseur pour accroître la sensibilité du dosage. L’absorbance est mesurée à 625nm. La concentration maximale autorisée est de 0,1 mg d’ammonium par litre. NH3 + 3ClO

- + 2C6H5O

- → O=C6H4=N-C6H4O

- + 2H2O + OH

- + 3Cl

- Dosage du fer (annexe 6) On utilise la méthode à l’acide thioglycolique. En milieu alcalin, le fer ferreux se complexe avec le thioglycolate et donne une coloration rouge. L’absorbance est mesurée à 530nm contre un témoin réalisé avec de l’eau distillée. La concentration maximale autorisée est de 0,2 mg de fer par litre.

Fe2+

+ 2 SH-CH2-COOH → Fe (S-CH2-COOH)2

Dosages des ions manganèse (annexe 7) On utilise la méthode à la Formaldoxime. L’addition d’une solution de Formaldoxime à une prise d’essai puis la mesure spectrométrique du complexe rouge orangé obtenu à une longueur d’onde d’environ 450 nm contre un témoin réalisé avec de l’eau distillée permet d’estimer la concentration en manganèse de l’eau. La concentration maximale autorisée est de 0,5 mg de manganèse par litre. Dosage des nitrites, méthode de Shinn normalisée ISO 6777 (annexe 8) Les nitrites réagissent avec le Sulfanilamide en milieu acide pour former un composé diazoïque. Ce composé est ensuite couplé à une amine aromatique (N1 Naphtyléthylènediamine) pour donner un colorant azoïque rose. L’absorbance est mesurée à 543nm contre un témoin réalisé avec de l’eau distillée. La concentration maximale autorisée est de 0,1 mg de nitrites par litre.

1) NH2SO2C6H4-NH2 + NO2- + 2 H

+ → (NH2SO2C6H4-N≡N)

+ + 2 H2O

2) (NH2SO2C6H4-N≡N)+ + C10H7-NH-(CH2)2-NH2 →

NH2SO2C6H4-N=N-C10H6-NH-(CH2)2-NH2 + H+

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2.4. Exemples de résultats et conséquences sur l’exploitation Le suivi journalier des paramètres microbiologiques et biochimiques permet de produire une eau répondant à tous les critères de qualité, en adaptant certaines opérations (nettoyage, maintenance) aux besoins de la production. Par exemple, dans le tableau 6, on voit les résultats obtenus pour une production normale. Tableau 6 : exemples de résultats d’une journée de production

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lyse

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22°C

M

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vivi

fiab

les

à 37

°C

Moi

siss

ures

et

levu

res

Fer

Forage

0/250mL 0/250mL 0/250mL 0/100mL 0/100mL 0/100mL 0,5 mg/L

Cuve de stockage

0/250mL 0/250mL 0/250mL 110/100

mL 40/100m

L 1/100mL

0,05 mg/L

Produit fini au démarrage

0/250mL 0/250mL 0/250mL INC 200/100

mL 15/100m

L -

Produit fini en cours de production

0/250mL 0/250mL 0/250mL 200/100

mL 120/100

mL 3/100mL -

Soutireuse

0 0 - - - - -

Bouchons Bouteilles

0 0 - - - - -

Ambiance

- - - - - 12

colonies -

Mains du personnel

2 0 - - - - -

● On ne détecte pas de micro-organismes dans la matière première. L’eau prélevée au forage est exempte de micro-organismes ce qui répond aux normes imposées par la réglementation actuelle. ● Les concentrations en fer et manganèse sont suivies chaque jour. Dans le cas présenté, on atteint la valeur limite de 0,05 mg/L, le nettoyage des filtres doit être programmé à la fin de la semaine de production, ● Lors du passage dans les canalisations de l’usine, l’eau se charge en microorganismes aérobies (110 UFC/100mL à 22°C dans la cuve de stockage puis plus de 300 UFC/100 mL à 22°C dans une bouteille en début de production). Elle acquiert une flore principalement constituée de bactéries psychrophiles car l’eau circulante est à une dizaine de degrés maximum. La flore revivifiable à 22°C est donc toujours supérieure à la flore revivifiable à

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37°C. Si ce n’est pas le cas, ce peut être le signe d’une contamination fécale. Les résultats obtenus pour la flore fécale et les pathogènes doivent toujours être négatifs. ● Au cours de la production, les canalisations sont rincées par l’eau et la contamination diminue (200 UFC/100 mL). Lors du démarrage de la chaîne de production, le niveau de contamination est toujours un peu élevé, car la flore se développe dans l’eau qui stagne dans les canalisations. Les premières bouteilles fabriquées sont donc éliminées à chaque démarrage, ce qui équivaut à un rinçage de la ligne. Comme l’usine fonctionne toute la semaine (3x8H) et qu’on prélève l’eau à chaque changement d’équipe, on suit la décroissance progressive de la flore aérobie totale. On peut noter que la flore aérobie totale dénombrée est très en dessous de la valeur maximale autorisée (par exemple ici 200 UFC/100mL quand il en faut moins de 100/mL). Une augmentation de la flore aérobie peut donc être détectée sans pour autant atteindre les limites réglementaires, et le nettoyage de la cuve ou de la canalisation peut être rapidement entrepris sans nécessiter un arrêt de production qui est toujours coûteux. Par exemple, au cours des quatre mois, une augmentation importante de la flore aérobie totale a été détectée dans une cuve de stockage. L’eau a été dérivée vers une autre cuve temporairement, et en fin de semaine, lors du nettoyage de fin de production, cette cuve a été désinfectée ce qui a permis de retrouver des valeurs plus acceptables la semaine suivante. ● Le contrôle de l’atmosphère donne 12 levures ou moisissures dénombrées après une exposition d’une heure. Ce résultat est correct, c’est le signe que le nettoyage précédent a été bien effectué. ● Les contrôles de surface dans les machines ne doivent montrer aucune UFC. Si c’était le cas, la production serait immédiatement arrêtée pour lancer une désinfection complète car le risque de contamination du produit serait bien trop élevé. ● L’analyse de la flore sur les mains du personnel permet de vérifier le respect des consignes d’hygiène. Le résultat obtenu ici est correct, c’est aussi l’occasion de faire un rappel des consignes au personnel intervenant aux points critiques de l’embouteillage. En conclusion, on peut noter que toutes les précautions prises lors de la production portent leurs fruits puisqu’aucun incident n’a eu lieu dans l’usine depuis plusieurs années. Le contrôle aux différentes étapes de l’embouteillage assure une réaction rapide en cas de problème et permet d’améliorer les procédés de fabrication en identifiant les éventuels points critiques.

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ÉTUDE PÉDAGOGIQUE

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1. Introduction

Les techniques utilisées principalement lors de cette expérience professionnelle sont d’une part l’analyse microbiologique d’eau par filtration, et d’autre part l’analyse de l’environnement de production par des prélèvements de surface. Elles correspondent parfaitement aux enseignements en lycée technologique et ne nécessitent pas de matériel particulier ou coûteux que les lycées ne pourraient se fournir. Elle est de plus au programme de plusieurs cursus. Cette séquence est donc parfaitement adaptable à plusieurs niveaux aussi bien en seconde en enseignement d’exploration de biotechnologies qu’en terminale STL-BGB ou dans certaines sections de technicien supérieur. La transposition de cette expérience professionnelle peut être utilisée pour susciter un intérêt particulier de l’élève en lui montrant une application réelle dans la vie professionnelle de ses apprentissages en travaux pratiques. De plus, cette activité permet d’intégrer l’analyse d’un produit alimentaire et les prélèvements de surface en montrant leurs liens dans la pratique industrielle. Cela permet également aux élèves d’appréhender le travail en industries agroalimentaires et les aider à faire leur choix d’orientation post-baccalauréat puisqu’ils voient lors des travaux pratiques des applications correspondant aux différents métiers qu’ils seront susceptibles d’exercer par la suite.

2. Présentation des différents niveaux d’exploitation possibles

2.1 Application en enseignement d’exploration en classe de seconde

Les anciens programmes de l’option BLP en seconde générale sont actuellement modifiés dans le cadre de la réforme du Lycée. Il est mis en place pour la rentrée 2010 un enseignement technologique d’exploration en biotechnologies dont le programme est paru au BO n°4 du 29 avril 2010. La vocation de cet enseignement est de permettre aux élèves de tester leurs goûts et leurs aptitudes en vue de l'orientation vers une série de première déterminée. Il s’agit donc de leur montrer les domaines d’application dans la vie professionnelle des activités qu’ils réalisent. On peut par exemple envisager d’adapter ce travail à la partie environnement du programme sur trois points différents. Tout d’abord on peut décrire les contrôles de surface en utilisant deux techniques (écouvillon et gélose contact). Cela permet d’aborder les notions de flores de l’environnement et de visualiser directement leur diversité par des observations microscopiques et macroscopiques après isolement. Il est également possible de réaliser un contrôle microbiologique sur une eau de rivière en recherchant la flore témoin de contamination fécale. On pourra alors aborder les conséquences de cette pollution sur la santé. Enfin on peut utiliser un échantillon d’eau pour ensemencer différents milieux de culture sélectifs et non sélectifs. Dans ce cas, on peut réaliser un dénombrement de la flore totale et de la flore potentiellement pathogène en utilisant plusieurs milieux de culture différents : une gélose ordinaire non sélective, une gélose BEA et une gélose EMB. Les micro-organismes isolés sur ces milieux peuvent ensuite être observés au microscope à l’état frais et après coloration de Gram pour les préidentifier. Un dénombrement est ensuite réalisé puis comparé à une valeur de référence pour aborder la notion de norme. Dans tous les cas, l’utilisation de

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ce travail en seconde demande une adaptation importante des techniques et des milieux utilisés.

2.2 Application en biochimie en classe de première STL-BGB Lors de ce travail, des analyses biochimiques sur l’eau ont également été réalisées. L’analyse biochimique de l’eau est au programme de travaux pratiques de biochimie en terminale STL. Les élèves doivent réaliser le dosage du phosphore, des nitrates et des nitrites. Le dosage des nitrites est réalisé par la méthode utilisée au laboratoire, c’est un dosage colorimétrique par le sulfanilamide. L’analyse d’une eau peut être réalisée avec préparation en parallèle d’une gamme étalon à partir d’une solution de concentration connue. Cette application correspond bien au programme mais elle ne représente qu’une partie minime du travail réalisé pendant ces quatre mois, j’ai préféré adapter l’analyse microbiologique.

2.3 Application en microbiologie en classe de terminale STL-BGB La correspondance est plus importante avec les attendus de la formation en microbiologie en terminale STL-BGB, c’est pourquoi ce niveau a été choisi pour développer une séance de TP. Elle sera présentée en détail dans la partie 3.

2.4 Application en microbiologie en STS L’analyse microbiologique telle qu’elle est développée pour les terminales STL peut également être proposée à différentes classes de STS, par exemple en BAC. Les élèves ne doivent pas réaliser l’analyse complète de tous les aliments, le but est qu’ils aient un aperçu de toutes les techniques d’analyse. Une application un peu différente pourrait être proposée en STS QIABI. Le BTS obtenu permet d’occuper des fonctions qui concourent à la réalisation de l’objectif qualité : assistant qualité, responsable qualité, technicien dans des entreprises agroalimentaires, cosmétiques, et dans les laboratoires de contrôle. Il vérifie les matières premières, les éléments de conditionnement, contrôle l’application des procédés, propose des actions correctrices après avoir identifié les causes de non-conformité, vérifie le niveau de qualité des produits, défini

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les mesures à effectuer et leur fréquence. Dans le programme de techniques microbiologiques, deux points correspondent au travail d’analyse effectué en usine.

4. Contrôles microbiologiques de bioproduits selon les normes en vigueur - Prélèvement, échantillonnage, préparation de l’échantillon, étude des dilutions limites, discussion des milieux sélectifs, analyse et interprétation des résultats 5. Hygiène des milieux de travail et du personnel - Contrôle de pollution des locaux et du matériel - Hygiène du personnel

- Les études méthodologiques conduites précédemment seront appliquées à l’analyse complète d’un produit solide homogène et hétérogène et d’un produit liquide : flore totale, coliformes, streptocoques fécaux, anaérobies sulfito-réducteurs, Salmonella, Staphylocoques et autres recherches particulières aux produits choisis. Différentes techniques seront mises en œuvre : cellophane adhésive test, boîtes contact, technique Pétrifilm, écouvillonnage. On pourra pratiquer une analyse de l’air des locaux. On mettra en évidence l’importance du lavage des mains par l’analyse comparée de la flore cutanée avant et après lavage des mains selon les procédures définies. On soulignera l’importance de la recherche de porteurs asymptomatiques (Staphylocoques, Salmonella)

Dans ce cas, les élèves doivent réaliser une analyse complète du produit, c'est-à-dire rechercher l’ensemble des bactéries pour lesquelles une valeur limite est donnée dans la réglementation, ce qui peut être réalisé lors d’une séance de travaux pratiques. L’analyse de la pollution de l’environnement par les différentes techniques utilisées en laboratoire peut être l’objet d’une autre séance de TP, en y ajoutant la recherche de la flore cutanée avant et après lavage des mains (simple, antiseptique, chirurgical).

3. Présentation de la séquence détaillée

3.1 Modalités d’enseignement Les travaux pratiques de microbiologie en terminale sont organisés en deux séances de deux heures par semaine, à un ou deux jours d’intervalle pour permettre la croissance des micro-organismes étudiés. Le premier jour permet de présenter le sujet étudié, les nouvelles techniques, et de réaliser les ensemencements. Le deuxième jour est consacré à la lecture des milieux de culture et à l’interprétation des résultats et à la rédaction d’un compte-rendu. Les élèves sont en groupe d’atelier de 15 élèves au maximum.

3.2 Contenu du programme concerné Le programme de TP microbiologie en terminale STL BGB se découpe en 4 parties principales : la mycologie (3 semaines), les techniques d’analyse en microbiologie médicale (12 semaines), les techniques d’analyses et de contrôle dans les industries alimentaires et pharmaceutiques (12 semaines), et les techniques de production industrielle (3 semaines). La troisième partie qui nous concerne plus particulièrement dans le cadre de ce travail est présentée comme suit :

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2.2 Dans les industries agro-alimentaires: contrôles d'hygiène 2.2.1 Méthodologie générale: techniques de dénombrement, choix des milieux, expression et interprétation des résultats. 2.2.2 Contrôles au niveau de la production: Contrôles alimentaires analyse bactériologique des eaux, et/ou du lait, et produit laitier, et/ou de plats cuisinés à l'avance 2.2.3 Contrôles au niveau des locaux- dénombrement des micro-organismes totaux sur une surface inerte

Réaliser tout ou partie de l'analyse bactériologique d'une eau, et/ou du lait, et/ou d'un produit laitier, et/ou d'un plat cuisiné à l'avance selon les protocoles imposés par la réglementation Réaliser par une technique d'écouvillonnage ou avec une boîte contact, un dénombrement de la microflore totale d'une surface Justifier les temps opératoires, les modes de calcul et d'expression des résultats.

L’analyse de l’eau par filtration peut être facilement réalisée en lycée technologique. Le matériel est présent dans tous les lycées. De même, la recherche de la flore de surface par différentes techniques est au programme des terminales STL-BGB, ainsi que les différentes techniques de dénombrement dans les aliments.

3.3 Objectifs de la séquence et prérequis L’objectif principal de la séquence est l’apprentissage d’une nouvelle technique d’analyse microbiologique utilisée en industries agroalimentaires et pharmaceutiques. Cette technique est l’analyse de liquides par la méthode de la filtration. Les élèves doivent avoir intégré les quatre principaux aspects de cette méthode à la fin de la séance : la réalisation technique, la principale différence avec les autres méthodes de dénombrement déjà vues, les applications possibles (types d’échantillon analysés), et l’expression du résultat et sa comparaison à une norme. Cette séquence permet également de consolider les acquis en réalisant plusieurs rappels sur :

- les autres méthodes de dénombrement qui ont déjà été utilisées, - la nature des flores recherchées dans les aliments, en particulier la flore fécale et la

flore totale qui sont des témoins de contamination, - les moyens de sélectionner ces populations par les conditions opératoires et les

milieux de culture, - l’utilisation des prélèvements de surface, - le calcul et l’expression des résultats d’un dénombrement, - la vérification qu’un produit répond aux normes demandées.

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L’intégration de toutes ces données doit leur permettre d’analyser correctement les résultats obtenus. En conséquence, ce TP doit être réalisé après plusieurs autres consacrés à l’analyse en agro-alimentaire : - numération par la méthode NPP des coliformes totaux en milieu liquide, et réalisation de test complémentaire d’identification d’E. coli par le test de Mackensie, - numération des coliformes totaux d’un lait par technique de la double couche sur gélose au désoxycholates, - recherche de spores de Clostridium sulfito-réducteurs dans une eau contaminée (type eau de mare), - recherche de Staphylococcus aureus dans un lait sur le milieu de Baird Parker, confirmation par une agglutination, - utilisation des différentes techniques d’analyse de la flore de surface (écouvillonnage, boîte contact). Il sera donc réalisé vers la fin de l’année scolaire.

3.4 Préparation préalable

3.4.1 Par le professeur Ce travail datant de 2006, son utilisation a nécessité la recherche de plusieurs documents. Il m’a fallu en particulier remettre à jour les connaissances sur les normes actuelles en agroalimentaire de l’analyse de l’eau, les procédés utilisés, les plans d’échantillonnage car il est précisé dans le programme que les analyses sont réalisées selon les protocoles imposés par la réglementation. Ensuite, j’ai recherché les ressources disponibles sur le site internet Éducnet dans la base de données ÉDU’bases Biotechnologies et ST2S. Un document est disponible sur la technique de filtration, un diaporama présentant la technique (fiche n°161, http://www.ac-montpellier.fr/Pedagogie/Disciplines/sti/biotechn/microbio.html). Un lycée de Montpellier met également à disposition deux petits films montrant un élève réalisant la dépose de la membrane sur le dispositif de filtration puis la dépose de la membrane sur le milieu de culture (http://www.lyc-lacroix-narbonne.ac-montpellier.fr/dossiers/dossiers.php?val=291_analyse+ microbiologique+eau). Il m’a finalement semblé qu’il était plus parlant de faire une démonstration devant les élèves plutôt que de montrer un diaporama et un film dans lesquels toutes les étapes ne sont pas présentées (stérilisation du dispositif, filtration). La préparation des documents élèves a ensuite été réalisée. Les documents techniques fournis aux élèves sont utilisés lors des TP suivants et leur permettent de garder une trace du travail réalisé puisqu’ils n’ont pas de manuel scolaire disponible pour leur section. Trois documents élèves leur seront fournis : un protocole (pages 27 et 28) pour diriger le travail de la séance et deux fiches techniques, une sur la technique de filtration (page 29) et une sur les milieux de culture utilisés (page 30). Ces documents sont présentés sur les pages suivantes. Sur les fiches techniques, ce qui est à remplir avec les élèves est noté en rouge.

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TP : Contrôle de l’embouteillage d’une eau minérale Une usine d’embouteillage d’eau minérale vous demande de contrôler son produit à deux stades de la production :

- eau à l’émergence : échantillon 1 - produit fini : échantillon 2

Vous devez également contrôler les surfaces en différents points de l’usine :

- P1 : prélèvement dans le bac à bouchons - P2 : prélèvement dans les bouteilles vides - P3 : prélèvement sur les becs de la soutireuse - P4 : prélèvement sur la visseuse

Limites de qualité des eaux embouteillées

Paramètre Limites de

qualité Méthode de recherche Notes

Coliformes thermotolérants

0 / 250 mL Iso 9308/1 A l’émergence et au cours de la

commercialisation

Entérocoques 0 / 250 mL Iso 7899/2 A l’émergence et au cours de la

commercialisation Méthodes de recherche imposées par la réglementation : Iso 9308/1 : Filtration sur membrane et culture sur gélose lactosée au tergitol et TTC Iso 7899/2 : Filtration sur membrane et culture sur gélose de Slanetz et Bartley

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1er jour :

• Étude des échantillons d’eau Vous disposez par binôme de 2 échantillons de 500 mL d’eau à analyser par la technique de filtration sur membrane (voir fiche technique). Pour chacun, vous devez rechercher les entérocoques sur gélose Slanetz et les coliformes thermotolérants sur gélose lactosée au tergitol 7 et TTC (voir fiche milieux).

• Étude des prélèvements de surface Vous disposez par binôme de 4 prélèvements réalisés par écouvillonnage sur 10 cm2 de 4 surfaces différentes de la zone de production (2 mL d’eau peptonée). Vous devez les analyser par la technique d’étalement en surface avec une pipette râteau sur une gélose ordinaire (étaler 0,1 mL). 2ème jour :

• Étude des échantillons d’eau Lire les résultats obtenus. Présenter les résultats du binôme dans un tableau en exprimant les résultats du dénombrement de manière adéquate.

• Étude des prélèvements de surface Réaliser un état frais et une coloration de Gram à partir des colonies obtenues sur la GNO. Réaliser le test d’orientation. Conclure. Présenter les résultats du binôme dans un tableau. Exprimer les résultats du dénombrement de surface en nombre de bactéries par cm2. Conclure. Compte rendu 1er jour : Réaliser un schéma récapitulatif des analyses réalisées. 2ème jour : Proposer une hypothèse sur la provenance des contaminants. Quelles seront les conséquences sur la production ? Quelles mesures allez-vous prendre pour corriger ce problème ? Par quels moyens peut-on éviter cette contamination ?

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Fiche technique : la filtration sur membrane Utilisation Analyse de produits liquides peu concentrés en microorganismes : l’eau Principe Concentration des microorganismes par filtration sur une membrane Méthode 1- brancher la trompe à vide et ouvrir l’eau. 2- Verser un peu d’éthanol sur le support. Ouvrir la vanne pour évacuer l’excès d’éthanol. 3- Refroidir avec un peu d’eau stérile. Sécher en ouvrant la vanne à vide. 4- déposer la membrane de filtration de 0,45µm. 5- réaliser la filtration de la totalité de l’échantillon. 6- rincer avec 20 mL d’eau stérile. Sécher la membrane. 7- déposer la membrane sur le milieu sans faire de bulles.

Points critiques

- Réaliser la filtration en zone de stérilité

- Ne pas déchirer la membrane qui est fragile

- Penser à stériliser le dispositif entre chaque échantillon filtré

- Attention au sens de la membrane lors du dépôt sur la boîte de Pétri

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Gélose de SLANETZ

Formule : en g.L-1 Rôle des composants Peptone 20 source de N de C et d’énergie Extrait de levure 5 éléments nutritifs et facteurs de croissance Glucose 2 source de C et d’énergie Hydrogénophosphate de sodium 4 source complémentaire de sels minéraux Azide de sodium 0,4 inhibiteur des Gram – et de nombreux Gram + Agar 10 gélifiant pH final : 7,2 Quand le milieu est refroidi à 45°C, ajouter coloration rouge ou rose des colonies (réduction 10 mg de TTC avant de couler les boîtes. en un composé coloré)

Utilisation : la gélose de Slanetz est un milieu solide sélectif qui permet la recherche et le dénombrement des entérocoques dans les eaux par la méthode des membranes filtrantes.

Lecture des résultats Les Enterococcus donnent des colonies moyennes roses ou rouges. Les Bacillus peuvent aussi pousser sur ce milieu mais donnent des colonies un peu plus grandes. Staphylococcus peut également pousser sur ce milieu.

Gélose lactosée au Tergitol 7 et TTC

Formule : en g.L-1 Rôle des composants Peptone de viande 10 source de N de C et d’énergie Extrait de levure 6 éléments nutritifs et facteurs de croissance Extrait de viande 5 éléments nutritifs et facteurs de croissance Lactose 20 source de C et d’énergie Tergitol 7 0,01 inhibe la pousse des germes à gram positif et limite l’envahissement par Proteus Bleu de bromothymol 0,05 indicateur coloré de pH Agar.............. 13 gélifiant pH final : 7,2 Quand le milieu est refroidi à 45°C, ajouter coloration rouge ou rose des colonies (réduction 25 mg de TTC avant de couler les boîtes. en un composé coloré)

Utilisation : la gélose lactosée au Tergitol 7 et TTC est un milieu solide sélectif qui permet la recherche et le dénombrement des coliformes dans les eaux par la méthode des membranes filtrantes.

Lecture des résultats colonies bleues ou vertes : lactose – colonies jaunes : lactose + (coliformes)

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3.4.2 Par le personnel technique Une feuille de préparation est fournie aux agents de laboratoire plusieurs semaines avant le TP car on utilise des milieux de culture spécifiques et des membranes de filtration qui devront être commandés suffisamment à l’avance.

TP analyse de l’eau par filtration

Matériel nécessaire à la séance par binôme pour 28 élèves

Flacon de 500 mL d’eau distillée stérile (noté E1) 1 14

Flacon de 500 mL d’eau distillée contenant avec 102 à 103

Enterococcus faecalis et E.coli /L (noté E2) 1 14

2 Tubes de 2 mL d’eau peptonée stérile (noté P2 ou P3) 1 28

2 Tubes de 2 mL d’eau peptonée contenant avec 103 à 104

Enterococcus faecalis et E.coli/mL (noté P1 ou P4) 1 28

Gélose en petite boîte Slanetz 2 28 (210 mL)

Gélose lactosée Tergitol 7 TTC 2 28 (210 mL)

Filtres stériles de porosité 0,45 µm 2 28

Gélose ordinaire 4 56

Dispositif de filtration stérilisé, un pour deux binômes.

Réaliser une dilution de bouillons de 18 heures d’Enterococcus faecalis et E.coli pour obtenir une suspension à l’étalon n°0,5 de Mac Farland. Réaliser une dilution au 1/10000ème des suspensions (104 UFC/mL). Ajouter les tubes de 2 mL d’eau peptonée avec une goutte de pipette pasteur (50µL) de chaque dilution. A réaliser juste avant le TP ou à stocker au frigo. Réaliser une dilution supplémentaire des suspensions au 1/10ème (103 UFC/mL). Ajouter les flacons de 500 mL d’eau distillée stérile avec 2 gouttes de ces dilutions. Coût de l’ensemble Matériel nécessaire à la séance pour 28 élèves prix TTC

Gélose Slanetz 210 mL 1,00 €

Gélose lactosée Tergitol 7 TTC 210 mL 5,62 €

Boïtes de pétri Ø 55mm 56 2,52 €

Filtres stériles de porosité 0,45 µm 56 37,84 €

Le prix total est de 46,98 € ce qui revient à 1,68 € par élève.

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3.5 Organisation détaillée de la séquence :

3.5.1 Supports et consignes prévus Trois documents seront distribués aux élèves :

- le protocole du TP - une fiche à compléter sur la technique de filtration sur membrane - une fiche sur la composition des milieux de Slanetz et Tergitol + TTC

D’autres supports seront utilisés : - un transparent reprenant le schéma de l’usine qui est également sur le protocole pour

expliquer les différentes analyses effectuées sur le site de production, - le tableau pour noter les consignes ou pour faire certains rappels de cours. Par exemple, la

répartition des analyses par binôme y sera indiquée (voir tableau ci-dessous).

Analyses par binôme Élève 1 Élève 2

Analyse de l’eau Échantillon 1, filtration, sur

Slanetz et Tergitol+TTC Échantillon 2, filtration, sur

Slanetz et Tergitol+TTC

Analyse des surfaces P1 et P2, étalement de 0,1 mL,

sur GNO P3 et P4, étalement de 0,1 mL,

sur GNO

Chaque élève travaillera sur un des deux échantillons d’eau (contaminée ou stérile) mais le déposera sur les deux milieux de culture. De même, chaque élève travaillera sur deux prélèvements de surface, un stérile et un contaminé. Pour pouvoir conclure, les élèves devront donc mettre en commun leurs résultats par binôme. Chaque élève obtiendra une gélose ordinaire comportant deux types de colonies. Ils pourront déterminer quel type de colonie correspond à quel contaminant en effectuant la préorientation à partir de chacune d’entre elles (état frais, gram et test d’orientation).

3.5.2 Déroulement détaillé de la séquence Le premier jour, les élèves doivent réaliser la filtration. Le temps sera donc principalement dédié à l’explication et à la réalisation de cette nouvelle technique afin d’atteindre l’objectif principal. Dans un premier temps, on rappellera les différentes techniques de dénombrement en analyse agroalimentaire. A partir des connaissances des élèves, un diagramme sera construit au tableau (figure 5). De ce tableau, les élèves devront déduire une méthode d’étude de solutions peu concentrées en bactéries. Figure 5 : diagramme sur les techniques de dénombrement

ÉTUDE PÉDAGOGIQUE

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Ensuite, les conditions de réalisation de la filtration seront bien expliquées à l’aide de la fiche de synthèse et de la démonstration. Enfin, les élèves réaliseront la filtration sous la surveillance du professeur qui corrigera éventuellement les manquements ou les erreurs. Le mode d’expression des résultats sera souligné lors de la lecture du protocole.

Première séance

Temps Supports Activités professeur Activités élèves

10 minutes

Diapo sur le site de

production

Protocole distribué aux

élèves

Explications sur le déroulement de la production, travail attendu (analyse de la matière première,

du produit fini et analyses de surface), normes d’analyse.

Noter sur le schéma du protocole les différents types de

prélèvements et leur lieu.

15 minutes

Réalisation d’un

diagramme au tableau

(figure 5)

Rappels sur les techniques de dénombrement déjà vues par questionnement des élèves,

Essayer de faire trouver aux élèves le point commun des

techniques de dénombrement connues (dilutions) et en déduire une méthode pour analyser des

produits peu concentré en micro-organismes.

Participation orale pour construire le diagramme à partir des acquis

15 minutes

Fiche de synthèse sur la filtration,

matériel utilisé

Description de la technique de la filtration sur membrane, présentation du matériel,

démonstration.

Remplir une fiche de synthèse

10 minutes

Tableau

Lecture du protocole, explication des consignes de réalisation,

mode d’expression du résultat des dénombrements.

Répartition des échantillons par binôme

55 minutes

Observation de la filtration (évaluation formative)

Mise en œuvre par les élèves, début de la rédaction du compte-

rendu

Le deuxième jour, les élèves analysent les résultats obtenus. Pour cela, la composition des milieux utilisés est analysée. Le TP étant réalisé en fin d’année, les élèves sont autonomes pour la lecture des milieux, la réalisation des observations microscopiques et leur interprétation.

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Deuxième séance

Temps Supports Activités professeur Activités élèves

10 minutes

Protocole du TP

Retour sur le travail de la séance précédente. Questionnement des

élèves sur : - le travail réalisé

- les lectures à faire - les tests à réaliser.

Participation orale

20 minutes

Fiche milieu Etude de la composition des

milieux utilisés Remplir la fiche milieu

10 minutes

Tableau Explication des consignes

1 heure

Tableau Observation des états frais et des

colorations de Gram

Lecture des milieux.

Réalisation d’un état frais, d’une coloration de Gram et du test d’orientation sur les souches obtenues sur les milieux non

sélectifs.

Mise en commun des résultats du binôme.

Rédaction du compte rendu

10 minutes

Discussion des résultats

Analyse des résultats du groupe, conclusion

Selon l’avancement des élèves au cours des séances, on pourra moduler la durée de certaines activités. Par exemple, si les élèves ont terminé leur manipulation le premier jour, on peut leur demander de commencer à remplir la fiche des milieux avec les connaissances qu’ils ont déjà sur certains composants. Le deuxième jour, si les élèves sont en retard, ils pourront par binôme se répartir les tests de pré-orientation, chaque élève analysant un type de colonie. L’analyse des résultats du groupe et les conclusions peuvent être corrigées à la séance suivante.

3.6 Modalités d’évaluation Le but de l’évaluation est de vérifier que tous les élèves ont acquis la technique de la filtration. Ils doivent en avoir compris l’intérêt, en connaître l’utilisation principale et savoir exprimer le résultat correctement. Il est difficile de noter le TP sur la réalisation pratique de la filtration car c’est la première fois que les élèves la réalisent. Une évaluation formative peut par contre être réalisée. En surveillant la réalisation, le professeur peut corriger les gestes des élèves ou poser des questions aux élèves pour vérifier qu’ils ont compris le but des différentes étapes.

ÉTUDE PÉDAGOGIQUE

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La compréhension du travail réalisé par les élèves sera jugée sur le compte-rendu. Une partie du compte rendu est libre, mais quelques questions posées à la fin du protocole permettent de diriger la réflexion de l’élève. La schématisation des analyses réalisées permet à l’élève de visualiser et de clarifier ce qu’il a accompli (figure 6). On regardera si les élèves savent exprimer correctement leurs résultats de dénombrement et les comparer à la norme fournie pour conclure sur la qualité du produit analysé. Figure 6 : schéma récapitulatif des analyses réalisées

Au delà de la lecture et de l’expression du résultat, l’élève doit utiliser les conclusions précédentes pour se mettre dans une situation professionnelle de technicien de laboratoire en agroalimentaire. La réponse aux questions du protocole doit l’y aider. Les conclusions précédentes sont que le produit (échantillon 2) n’est pas satisfaisant alors que l’eau à l’émergence est conforme. De plus, les prélèvements P1 (bac à bouchons) et P4 (visseuse) sont également contaminés. Les réponses attendues sont les suivantes : Proposer une hypothèse sur la provenance des contaminants : L’eau n’est pas contaminée à l’émergence, mais le produit fini oui. La contamination a lieu pendant la mise en bouteille. Les machines ont été contaminées par le personnel porteur de germes. Quelles seront les conséquences sur la production ? La production doit être arrêtée, et les produits non conformes retirés du circuit de distribution. Quelles mesures allez-vous prendre pour corriger ce problème ? Il faut décontaminer puis désinfecter le bac à bouchons et la visseuse avant de relancer la production. Par quels moyens peut-on éviter cette contamination ? Les bactéries trouvées sont des indicateurs de contamination fécale, ce sont les personnels qui les ont apportés. Il faut donc leur rappeler les bonnes pratiques d’hygiène : lavage des mains, port de tenue appropriée.

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BIBLIOGRAPHIE

Aliments et boissons, filières et produits, 1999. Elisabeth VIERLING. Collection Biosciences et techniques, Centre régional de documentation pédagogique d’Aquitaine. Analyse des eaux, aspects réglementaires et techniques, 2002. Franck REJSEK. Collection Biologie technique environnement, Centre régional de documentation pédagogique d’Aquitaine. Bulletin Officiel n°4 du 29 avril 2010. Enseignement d'exploration : Programme d'enseignement de biotechnologies en classe de seconde générale et technologique. Code d’usages international recommandé en matière d’hygiène pour le captage, l’exploitation et la commercialisation des eaux minérales naturelles (CCAC/RCP 33-1985). Codex alimentarius (CODEX STAN 108-1981) Hydrologie des écosystèmes marins : paramètres et analyses. 2005. Aminot A. et Kérouel R. Collection méthodes d’analyses du milieu marin, IFREMER. Les toxi-infections alimentaires collectives en France entre 1996 et 2005. G. DELMAS, A. GALLAY, E. ESPIE, S. HAEGHEBAERT, N. PIHIER, FX. WEILL, H;DE VALK, V. VAILLANT, JC. DESENCLOS. Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire du 26 Décembre 2006. Institut de Veille Sanitaire Microbiologie alimentaire 5e édition, 2003. Christiane JOFFIN et Jean-Noël JOFFIN. Collection Biologie technique, Centre régional de documentation pédagogique d’Aquitaine. Microbiologie des eaux d’alimentation, 1993.C Haslay et H. Leclerc. Collection Technique et Documentaion, LAVOISIER. Microbiologie et qualité dans les industries agroalimentaires, 2002. C. BONNEFOY, F. GUILLET, G . LEYRAL, E. VERNE-BOURDAIS. Collection Biosciences et techniques, Centre régional de documentation pédagogique d’Aquitaine. Microbiologie générale et appliquée. J. FIGARELLA, G. LEYRAL, M. TERRET Microbiologie technique tome 1 dictionnaire des techniques 4ème édition, 2006. Jean-Noël JOFFIN, Guy LEYRAL. Techniques d’analyse et de contrôle dans les industries agroalimentaires, tome 3 Le contrôle microbiologique. C.M. BOURGEOIS, J.Y. LEVEAU

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Annexe 1 : critères de qualité microbiologique du décret du 14 mars 2007

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Annexe 2 : Normes actuelles d’échantillonnage et méthodes d’analyse à la source et aux points critiques de contrôle

Echantillonnage

Méthodes : Iso 9308/1 : Filtration sur membrane et culture à 44°C sur gélose lactosée au tergitol et TTC Iso 7899/2 : Filtration sur membrane et culture à 37°C sur gélose de Slanetz et Bartley Iso 6461/2 : chauffage de l’eau 15 minutes à 75°C puis filtration sur membrane (porosité 0,2µm) et culture à 37°C sur gélose TS Iso 8360/2 : Filtration sur membrane et culture à 37°C sur gélose cétrimide

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Annexe 3 : Normes actuelles d’échantillonnage et méthodes d’analyse du produit fini et en cours de commercialisation

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Annexe 4 : Formules des milieux de culture

PCA : Formule : par litre d'eau distillée Tryptone . 5,0 g Extrait de levure 2,5 g Glucose 4,0 g Agar 9,0 g pH final: 7,0 Tergitol 7 TTC : Formule : par litre d'eau distillée Peptone de viande 10,0 g Extrait de levure 6,0 g Extrait de viande 5,0 g Lactose 20,0 g Tergitol 7 0,01 g Bleu de bromothymol 0,05 g Agar.............. 13,0 g pH final : 7,2 Quand le milieu est refroidi à 45°C, ajouter 25 mg de TTC avant de couler les boîtes. Slanetz et Bartley : Formule : par litre d'eau distillée Peptone 20,0 g Extrait de levure 5,0 g Glucose 2,0 g Hydrogénophosphate de sodium 4,0 g Azide de sodium 0,4 g Agar 10,0 g pH final : 7,2 Quand le milieu est refroidi à 45°C, ajouter 10 mg de TTC avant de couler les boîtes.

Cétrimide : Formule : par litre d'eau distillée Peptone de gélatine 16,0 g Peptone de caséine 10,0 g Sulfate de potassium 10,0 g Chlorure de magnésium 1,4 g Cétrimide 0,2 g Acide nalidixique 15,0 mg Agar 10,0 g pH final : 7,1 Sabouraud : Formule : par litre d'eau distillée Peptone de viande 10,0 g Glucose 20,0 g Chloramphenicol 0,5 g Agar 15,0 g pH final : 6,0

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