Etude du potentiel des bactéries lactiques pour leur ... · Volet 2: La caractérisation de nouvelles souches de bactérie lactique productrices de bactériocines et de développer

République Algérienne Démocratique et Populaire

Université d’Oran Es-sénia

Faculté des sciences

Département de biologie

Laboratoire de Microbiologie Appliquée

Mémoire pour l’obtention du diplôme de magister en microbiologie

Thème :

Etude du potentiel des bactéries lactiques

pour leur utilisation en industrie laitière

Présenté par :

Mlle RABAH noura

Composition de jury :

Président : Pr. HENNI .D.E

Examinateur : Pr. KIHAL .M

: Dr. GUESSAS.B

: Dr. HEDADJI.M

Encadreur : SAIDI. N

2009-2010

Remerciement :

Ce travail a été réalisé au niveau du laboratoire de microbiologie appliquée du

département de biologie, Faculté des Sciences Es-senia.

Je tien a remercier vivement :

Pr. HENNI. D. directeur du laboratoire de phytopharmacie, qui a bien vouloir présider le jury.

Dr. SAIDI. N. pour l’encadrement et les conseils scientifiques qu’il a apporté à mon travail.

Pr. KIHEL. M. le directeur du laboratoire de microbiologie appliquée pour l’attention et l’aide

précieuse qu’il m’a prodigué et d’avoir jugé ce travail.

Dr. GUESSAS. B. et Dr. HADADJI. M. d’avoir accepté d’examiner mon travail.

Tous ceux qui m’ont aidé durant la réalisation de ce travail.

Sommaire :

1. Introduction ..................................................................................................... 1

2. Analyse bibliographique ................................................................................ 4

2.1Les bactéries lactiques .................................................................................... 5

2. 2. Classification des bactéries lactiques ......................................................................5

2.2.1. Streptococcus ........................................................................................................5

2.2.2. Lactococcus .........................................................................................................5

2.2.3. Pediococcus ..........................................................................................................6

2.2.4. Leuconostoc ............................................................................................... 6

2.2.4. Lactobacillus ............................................................................................... 9

3.2. Les bactériocines ........................................................................................... 11

2.3.1. Définition ..................................................................................................... 11

2.3.2. Nomenclature ............................................................................................. 11

2.3.3. Bactériocines et antibiotiques ..................................................................... 12

2.3.4. Classification des bactériocines .................................................................. 14

2.3.5. Génétique des bactériocines .................................................................................16

2.3.6. Biosynthèse et excrétion ........................................................................................19

2.3.7. Mode d’action ........................................................................................................20

2.3.8. Immunité de la bactérie productrice .......................................................................22

2.3.9. Purification des bactériocines ................................................................................22

2.3.10. Rôle écologique des bactériocines ......................................................................24

2.3.11. L’application des bactériocines dans le secteur alimentaire .................................24

3. Matériel et méthodes ...................................................................................... 26

3.1. Matériel biologique et conditions de culture ................................................... 28

3.1.1. Laits ........................................................................................................... 28

3.1.2. Milieux et conditions de culture ................................................................... 28

3.1.3. Conservation des souches ......................................................................... 28

3.2. Méthodes ....................................................................................................... 29

3.2.1. Isolement des lactocoques ......................................................................... 29

3.2.2. Recherche de la catalase ........................................................................... 29

3.2.3. Identification des souches purifiées ............................................................ 30

a- Test de l’arginine dihydrolase (ADH) ................................................................ 30

b- Le type fermentaire........................................................................................... 30

c- Température de croissance .............................................................................. 31

d- Croissance à 0%, 4%, 6,5% de NaCl et à pH 9,6 ............................................ 31

e- Test de lait bleu de Shermann .......................................................................... 31

f- Fermentation des sucres .................................................................................. 31

3.2.4. Cinétique d’acidification .............................................................................. 32

3.2.5. Antagonisme direct sur milieu solide ......................................................... 33

3.2.6. Détection de la substance inhibitrice dans le surnageant de culture .......... 33

3.2.7. Caractérisation de la substance inhibitrice ................................................. 33

a-Action des protéases ......................................................................................... 33

b-Stabilité thermique ............................................................................................. 35

4. Résultat et discussion ............................................................................... 36

4.1. Résultat des tests macroscopiques ............................................................... 36

4.2 . Etude microscopique ................................................................................... 36

4.3. Test de catalase ............................................................................................ 40

4.4. Test de NaCl et de pH ................................................................................. 40

4.5. Test du lait bleu de shermann ....................................................................... 40

4.6. Test du profil fermentaire ............................................................................... 42

4.7. Test de l’arginine déshydrogénase 42

4.8. Test de fermentation des sucres ................................................................... 42

4.9. Cinétique d’acidification ................................................................................. 48

4.10. Test d’antagonisme sur milieu solide ........................................................... 48

4.11. Recherche de l’activité inhibitrice dans le surnageant de culture ................ ..53

4.12. Identification des agents inhibiteurs des souches testées ........................... ...53

5. Discussion ...................................................................................................... …57

Conclusion et perspectives .............................................................................. …61

Références………………………………………………………………………………… 62

Annexe

Résumé :

Les bactéries lactiques jouent un rôle important dans la fermentation des

aliments. Elles peuvent synthétiser des substances antibactériennes nommées

bactériocines qui sont utilisées dans la bioconservation des aliments.

L’objectif de notre travail est l’isolement, la purification et l’identification de

lactocoques qui on un pouvoir antagoniste.

Différentes méthodes basées sur les critères morphologiques, physiologiques

et biochimiques on été utilisées.

Nous avons isolé à partir de lait de chamelle, 30 souches de bactéries

lactiques et de les classer en plusieurs espèces dont Lactococcus lactis est la plus

dominantes.

18 souches ont été retenues après avoir éliminé l’effet de l’acidité, pour leurs

activités bactéricides, notamment vis-à-vis des bactéries pathogènes :

Staphylococcus aureus et Escherichia coli. Cette activité antibactérienne pourrai être

due à une substance excrétée dans le surnagent de culture des isolats. Ces agents

inhibiteurs ont présenté une sensibilité aux traitements thermiques et enzymatiques.

Mots clés : bactéries lactiques, lactocoques, industrie alimentaire, bioconservation,

effet inhibiteur, bactériocines, bactéries pathogènes.

Liste des tableaux :

Tableau 1: principaux caractéristiques des lactocoques. (DeRoissart, 1986)

Tableau 2: principaux caractères des pédiocoques (DeRoissart, 1986)

Tableau 3: principaux caractères des leuconostoques (DeRoissart, 1986)

Tableau 4 : les principaux caractéristiques des trois groupes de Lactobacillus

Tableau 5. différences entre bactériocines et antibiotiques (Cleveland et

al., (2001)

Tableau 6: aspect macroscopique des colonies et l’aspect microscopique des

souches purifiées et leurs caractères biochimiques

Tableau 7: profil fermentaire des isolats

Tableau 8: présentation de l’identification des souches isolées.

Tableau 9: la variation du pH et du degré Dornic des souches 10B, 6C et 2 en

fonction du temps

Tableau 10: diamètre des zones d’inhibition provoqué par les souches actives sur

les souches pathogène en cm

.

Liste des figures :

Figure 1 : séquence et structure de lantibiotiques de type A (Nisine), B (Mersacidine)

et d’un lantibiotique « two-peptides (Lacticine 3147 A1 et A2) respectivement

Figure 2 : représentation schématique des opérons de la coaguline (Le Merrec et al.,

2000) et de la nisine (Siergers et Etian, 1995)

Figure 3 : aspect macroscopique des colonies en surface (A). Aspect d’une culture

pure dans un milieu liquide M17(B)

Figure 4 : aspect microscopique à l’agrandissement G100 après coloration de Gram

de la souche 11B.

Figure 5 : résultat du test de bleu de méthylène

Figure 6 : aspect des souches ADH positives sur milieu M16 BCP, la couleur mauve

représente la présence de l’ADH

Figure 7 : résultat du test des sucres. 1. souche 1B, 2. souche 11A

Figure 8: la variation du pH des souches 10B, 6C et 2 en fonction du temps

Figure 9: variation du D° des souches 10B, 6C et 2 en fonctio n du temps

Figure 10: test d’antagonisme direct sur milieu solide en cm

Figure 11: diamètre des zones d’inhibitions en centimètre des souches testées vis-à-

vis des souches pathogènes

Figure 12 : zones d’inhibitions provoquées par le surnagent de culture des souches

testées

1

1. Introduction

2

La recherche sur les bactéries lactiques et leur caractérisation ont

énormément modifié la fabrication des produits laitiers fermentés. La capacité de

manipuler et de contrôler ces microorganismes a atteint maintenant un tel niveau

qu’il était inimaginable d’y penser il y a quelques années (Eijsink, 2002).

Ces recherches ont permis aux microbiologistes et aux industriels de choisir

les meilleures souches et d'améliorer la productivité, la qualité, et la sûreté des

produits finaux. La caractérisation des bactéries lactiques a favorisé le

développement de souches bactériennes bien définies, maintenant connues sous le

nom de levains lactiques qui jouent un rôle technologique fondamental en

transformation laitière (Saidi et al., 2002).

La grande méfiance des consommateurs vis-à-vis des additifs alimentaires

comme les conservateurs chimiques utilisés pour augmenter la durée de vie de

certains aliments ainsi que l’utilisation de traitement thermique souvent préjudiciable

aux propriétés organoleptiques et nutritionnelles d’aliments sensibles à la chaleur,

sans oublier la résistance qui accompagne l’utilisation massive des antibiotiques, ont

conduit les chercheurs à l'exploitation de nouvelles souches, telle que les bactéries

lactiques, possédant des activités biologiques particulières comme la production de

bactériocines, substances inhibitrices pour des applications de biopréservation

(Deegan et al., 2006; Galvez et al., 2007; Guinane et al., 1989 ; Vermeiren et al.,

2004).

Les bactériocines les plus étudiées sont celles des bactéries à Gram

négatives comme les colicines des entérobactéries (Cleveland et al., 2001), et les

bactériocines des bactéries lactiques (Neetles et barefoot, 1993), seule la nisine est

reconnue généralement comme efficace. Cette substance saine et sans danger

(GRAS : generally reconised as safe) est acceptée par l’organisation mondiale de la

santé comme étant un conservateur alimentaire dans plus de 40 pays incluant les

USA (Cleveland et al., 2001).

De ce fait, les bactéries lactiques sont largement impliquées dans la

fabrication de produits laitiers fermentés (PLF), qui jouent un rôle majeur dans leurs

conservations et elles contribuent à l’inhibition des germes contaminants (Guessas,

2007).

3

Le Laboratoire de Microbiologie Appliquée vise à la caractérisation d’activités

technologiques importantes des bactéries lactiques et leur exploitation dans le

secteur agroalimentaire et par la suite parapharmaceutique.

Etant donné tous ces intérêts, le Laboratoire de Microbiologie Appliquée a

constitué, depuis plusieurs années, une collection de souches locales de bactéries

lactiques provenant de différents laits (Saidi et al., 2002) et ainsi que des souches de

Bifidobacterium (Hadadji et al., 2005).

Cette étude s’inscrit dans le cadre d’un axe de recherche du Laboratoire de

Microbiologie Appliquée du département de Biologie, Faculté des Sciences,

Université d’Oran. Ce mémoire comprend quatre parties:

1. une synthèse bibliographique

2. une partie matériel et méthodes qui décrit toutes les techniques qui se

rapportent aux objectifs de ce thème.

3. les résultats de ce mémoire qui sont répartis en deux volets.

Volet 1: occupe une place centrale et principale au sein de notre laboratoire.

La tache consiste à isoler, identifier, selon des tests phénotypiques, de nouvelles

souches locales de bactéries lactiques isolées à partir de différents laits crus. Les

souches ainsi identifiées sont ensuite caractérisées selon des critères

technologiques. Il a pour objectif de constituer et gérer une banque de souches.

Volet 2: La caractérisation de nouvelles souches de bactérie lactique

productrices de bactériocines et de développer les connaissances nécessaires à leur

exploitation en transformation fromagère et pour la production de bioingrédients à

activité antimicrobienne.

4. Une discussion qui traite les différents résultats obtenus en comparaison

avec d’autres travaux de recherche.

L’objectif de notre travail est :

- L’isolement de lactocoques à partir de lait de chamelle ;

- La recherche des substances antibactérienne ;

- L’identification des bactéries lactiques productrice de bactériocines.

4

2. Analyse bibliographique

5

2.1. Les bactéries lactiques

Les bactéries lactiques regroupent un ensemble d’espèces hétérogènes dont

le trait commun est la production d’acide lactique. Elles appartiennent à divers

genres comme Bifidobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus,

Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Aerococcus, et Carnobacterium.

Elles interviennent dans l’industrie laitière et dans la fermentation de

nombreux autres produits alimentaires : salaison des légumes, boulangerie etc.

(Hugenholtz et Kleerebezem, 1999). Les bactéries lactiques contribuent à la texture,

à la saveur des aliments et à la production de composés aromatiques (Callewaert, et

al., 2000). Leur pouvoir antagoniste résulte aussi d’une compétition vis-à-vis du

substrats et, si les conditions de développement sont favorables pour l’élaboration de

bactériocines comme la nisine (Kleerebezem, 2004; Lubelski, 2008).

2. 2. Classification des bactéries lactiques

2.2.1. Streptococcus

Appartenant à la famille des Streptococcaceae. Les espèces de ce genre sont

des cellules ovoïdes, sphériques ou quelques fois allongées en fuseaux en paires ou

en chainettes. Les streptocoques lactiques se distinguent par leur capacité de croitre

à 45°C (Garvie et Farrow).

2.2.2. Lactococcus

Le groupe de lactocoques correspond aux streptocoques mésophiles de la

flore lactique. Elles sont généralement microaérophiles et se développent à 30°C.

Leur fermentation des sucres est homolactique et donne de l’acide lactique comme

produit final (Tableau1).

Les lactocoques peuvent se trouver dans les aliments comme les produits

laitiers, elles sont utilisées dans l’industrie agroalimentaire, les espèces les plus

importantes sont: Lactococcus lactis et Lactococcus cremoris (Stiles et Holzapfel,

1997).

6

2.2.3. Pediococcus

Les pédiocoques sont des bactéries microaérophiles à besoin nutritifs

complexes. Leurs développements nécessite plusieurs facteurs de croissances,

plusieurs espèces sont acidophiles, elles sont saprophytes et contaminent les

produits végétaux, ce sont des agents de dégradation en brasserie. Elles peuvent

aussi provoquer des altérations (viscosité) dans les produits végétaux (olives).

Parfois, on les utilise comme des levains lactiques pour les charcuteries (Pèrez,

2005). Les différents caractères de ces bactéries sont résumés dans le tableau 2.

2.2.4. Leuconostoc

Les leuconostoc ont de grandes exigences sur le plan nutritionnel vis-à-vis

des vitamines et des acides aminés. Elles sont classées en quatre espèces :

-Ln. mesenteroides.

-Ln. paramesenteroides.

-Ln. lactis.

-Ln. oenos.

Ce genre comporte quelques souches qui ont la faculté de produire, à partir

du saccharose, une capsule polysaccharidique épaisse. Elles sont responsables de

contaminations et d’altérations de divers produits tels que les boissons acides et

sucrés. Elles sont utiles dans certains fromages car elles facilitent leur ouverture par

la production de CO2 (Kihel, 1996).

7

Tableau 1: principaux caractéristiques des lactocoques. (Deroissart, 1986).

1 2 3

ADH + - +

CO2 - - +

Acétoine - - +

culture 10°c + + +

culture 37°c + + +

culture 40°c + - +

culture 45°c - - -

croissance en pH 9,6 + - +

résistance 30 mn à 63°c - - -

culture 4% de NaCl + - +

Fermentation des sucres

Arabinose - - -

Galactose - - -

Glucose + + +

Maltose + + +

Raffinose + - -

Saccharose - - -

Tréhalose + - -

1. Lactococcus lactis subsp. lactis

2. Lactococcus lactis subsp cremoris

3. Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis

8

Tableau 2: principaux caractères des pédiocoques (Deroissart, 1986).

Pc.

Dextrinicus

Pc.

acidilactici

Pc.

halophilus

Pc.

Urinaequi

Morphologie ND ND ND ND

Type d’acide lactique

produit

ND ND ND ND

Croissance à

35°C + + + +

45°C - - + -

pH 4,2 - + - -

pH 8,5 - - + +

Croissance en

NaCl

4% + + + +

6,5% - + + +

18% - - - -

Homofermentation + + + +

Hydrolyse de l’argin ine - + - -

Ribose - + + -

Xylose - + - -

Fructose + + + +

Tableau 3: principaux caractères des leuconostoques (Deroissart, 1986). Ln. msentereoides subsp Ln.

paramesenteroides

Ln.

lactis

Ln.

oenos mesenteroides dextranicum cremoris

Compos ition en GC% 37-41 37-40 38-40 37-38 43-45 37-39

Croissance à

10°C + + + + + +

37°C + + - + + -

39°C - - - - + -

45°C - - - - - -

Hétérofermentation + + + + + +

Réductase - - - - - +

Citratase - - + - - -

Arginine dihydrolase - - - - - -

Form ation de déxtrane + + - - - -

Arabinose + - - + - +

Mannitol + - - - - -

raffinose + + - + + -

9

2.2.5. Lactobacillus

Les bactéries appartenant à ce genre sont des bâtonnets souvent allongés, à

Gram positives, parfois groupés en paires ou en chaines. Elles sont catalase

négatives, microaérophiles. Chez les lactobacilles, le métabolisme des sucres produit

de l’acide lactique comme produit final ou homofermentaires, d’autres produisent, à

coté de l’acide lactique, de l’éthanol, du CO2 et d’acides volatils (Siegumfeldt et al.,

2000). Ce genre est subdivisé en trois groupes (Tableau 4):

- Thermobacterium

Il comprend des bactéries homofermentaires thermophiles qui se développent

à 45°C mais pas à 15°C, les espèces les plus fréque ntes dans l’alimentation (lait,

yaourts, fromages) sont Lb. helveticus, Lb. jugurti, Lb. bulgaricus, Lb. lactis, Lb.

acidophilus, etc. (Hammes et Hertel, 2006).

- Streptobacterium

Il regroupe les lactobacilles homofermentaires mésophiles qui se développent

à 15°C. Il comporte les espèces Lb. curvatus, Lb. sake, Lb. graminis, etc (Bottazzi,

1988).

- Betabacterium

Ce groupe comporte les bacilles hétérofermentaires. Les espèces les plus

fréquentes dans l’alimentation sont : Lb. kefir, Lb. fructivorans, Lb. hilgardii, etc.

Les lactobacilles sont très utilisées en laiteries, fromagerie. Leur rôle est

également important dans les végétaux fermentés. Les caractéristiques des trois

groupes sont résumées dans le tableau 4 (De Roissart et Sharpe, 1994).

10

Tableau 4 : les principaux caractéristiques des trois groupes de Lactobacillus.

Thermobacterium Streptobacterium Betabacterium

ADH - + +

Production de CO 2 - - +

Aldolase + + -

Thiamine - - +

Acide lactique DL ou L D ou L DL

G+C% 34,7-50,8 33-46,4 35-53,4

11

Les bactériocines

2.3.1. Définition

La première définition des bactériocines est celle donnée aux colicines et

stipulait qu’une bactériocine est une substance inhibitrice caractérisée par une

composante active majeure de nature protéique, une activité létale intra spécifique et

elle s’adsorbe à un récepteur spécifique. Cette définition reste non appropriée du

faite du grand nombre de bactériocines pour lesquelles au moins un de ces critères

n’est pas vérifié.

La définition la plus valable est celle donnée par Jack et al., (1995) qui

considèrent les bactériocines comme étant toute molécule de type bactériocine-like

directement produite par synthèse protéique ribosomale sous forme de prépeptide ou

de précurseur de polypeptides générant après clivage le propeptide ou la protéine

active.

2.3.2. Nomenclature

Pour ne pas donner des appellations différentes à la même bactériocine

comme pédiocine PA-1 et pédiocine AcH ou à des variants naturels de la même

bactériocine comme coaguline et pédiocine, les auteurs recommandent de ne pas

attribuer un nom à une bactériocine nouvellement découverte et d’utiliser le terme

BLIS (bacteriocin-like inhibitory substance) suivi de la désignation de la souche

productrice. Quand le séquençage prouve que la nouvelle substance diffère des

bactériocines déjà décrites, l’appellation doit se baser sur le genre ou de préférence

sur l’espèce productrice. Quand la substance présente des différences mineurs avec

une bactériocine connue, et que ces différence ne provoquent pas de grands

changements au niveau de la structure secondaire ou le spectre d’activité, alors elle

doit être considérée comme un variant naturel de la bactériocine déjà connue.

Selon Jack et al., (1995), les trois lettres initiales des bactériocines doivent

être utilisées pour nommer les gènes de l’opéron comme par exemple nis pour les

gènes de la nisine : nis A de la structure, nis I d’immunité, T, E, F et G : gène de

transport ; P gène codant pour la protéase, B, C, D et M : gènes de modification post-

traductionnelle ; R, K et Q : gènes régulateurs.

12

2.3.3. Bactériocines et antibiotiques

La confusion entre bactériocines et antibiotiques dans la littérature, a

contribué à limiter leur utilisation dans les applications alimentaires. Il est donc

critique de les distinguer (Hansen, 1993). Les principes différences sont résumés

dans le tableau suivant :

Tableau 5. Différences entre bactériocines et antibiotiques (Cleveland et

al., (2001).

Caractéristiques bactériocines Antibiotiques

Applications Alimentaire Clinique

Synthèse Ribosomale

Métabolites secondaire

Activité Spectre étroit

Spectre large

Immunité des cellules hôtes Oui

Non

Mode d’action Formation de

pores

Attaque la

membrane cellulaire ou

une cible intracellulaire

13

2.3.4. Classification des bactériocines

Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont réparties en

quatre classes, comme proposé par Klaenhammer (1993). Ces quatre classes sont :

Classe I : Les lantibiotiques : peptides de taille inférieure à 5 kDa, stables à la

chaleur et qui contiennent des acides aminés inhabituels soufrés formés

postraductionnellement, c’est acides aminés sont : la lanthionine, la β-méthyl

lanthionine, la déhydrobutyrine et la déhydroalanine. Ils peuvent être divisés en deux

types :

Sous-Classe Ia : Cette classe comprend des peptides cationiques hydrophobes

allongés contenant jusqu’à 34 acides aminés.

Sous-Classe Ib : Elle comprend les peptides globulaires chargés négativement ou

sans charge nette et contenant jusqu’à 19 acides aminés (Mc Auliffe et al., 2001;

Twomey et al., 2002). Certains lantibiotiques sont par ailleurs constitués de deux

peptides agissant ensemble pour avoir une activité comme la lacticin 3147. Les

séquences et les structures d’un lantibiotique de chaque type se trouvent dans la

figure1.

Classe II : Peptides de taille inférieure à 10 kDa, stables à la chaleur, ne contenant

pas d’acides aminés modifiés. Cette classe est divisée en trois sous-classes :

Sous-Classe IIa : Contient entre 27 et 48 acides aminés et une partie N-terminale

hydrophobe contenant la séquence consensus YGNGV ainsi qu’un pont disulfure. La

partie C-terminale est moins conservée avec un caractère hydrophobe (Fimland et

al., 2000 ; Richard, 2006). Elles ont toutes une activité contre Listeria

monocytogenes. Certaines bactériocines de cette sous-classe contiennent

également un deuxième pont disulfure dans leur domaine C-terminale qui semble

être important dans la stabilisation de la structure tertiaire (Eijsink et al., 1998 ;

Fimland, 2000 ; Drider, 2006 ; Richard, 2006).

Sous-Classe IIb : Comprend les bactériocines ayant besoin de deux peptides pour

avoir une activité.

Sous-Classe IIc : Contient les bactériocines ne pouvant pas être classées dans les

autres sous-classes.

Classe III : Leurs protéines sont de tailles supérieures à 30 kDa et sensibles à la

chaleur. La structure et le mode d’action de ces bactériocines diffèrent complètement

des autres bactériocines produites par les bactéries lactiques. Cette classe ne

regroupe que quatre bactériocines : l’helveticin J produite par Lactobacillus

14

helveticus A, l’enterolysin A produite par Enterococcus faecium, la zoocin A produite

par Spreptococcus zooepidemicus et la millericin B produite par Streptococcus milleri

(Nilsen et al., 2003 ; Papagianni, 2003 ; Nigutova et Paik, 2007).

Classe IV : Peptides requérant une partie carbohydratée ou lipidique pour avoir une

activité. Aucune bactériocine de cette classe n’a été décrite.

Figure 1 : séquence et structure de lantibiotiques de type A (Nisine), B (Mersacidine)

et d’un lantibiotique « two-peptides (Lacticine 3147 A1 et A2) respectivement.

nisine mersacidi ne

Lactacine A1 LactacineA 2

15

2.3.5. Génétique des bactériocines

L’utilité des bactériocines dans les domaines d’application pratique notamment

comme additifs alimentaires a poussé les chercheurs à caractériser les éléments

génétiques impliqués dans leurs synthèses (Jack et al., 1995).

La biosynthèse des bactériocines nécessite plusieurs gènes organisés en

opéron, comportant les gènes de structure, d’immunité, de translocation, de

maturation et de régulation. Cependant le support génétique on diffère.

Le déterminant génétique des bactériocines des bactéries à Gram positives

est fréquemment plasmidique (Klaenhammer, 1993). En effet de nombreux

arguments sont en faveur d’une localisation plasmidique des opérons codant pour

les bactériocines dont on peut citer les études de curage plasmidique et la

comparaison des profils des souches productrices et des souches non productrices

(Stoddard et al., 1992).

Staphylococcus epidermis, productrice de la PeP5, possède au moins cinq

plasmides. Des oligonucléotides spécifique à PeP5 sont capables de s’hybrider au

plasmide PED503 mais pas à l’ADN chromosomique et aux quatre autres plasmides

(Kaletta et Entian, 1989). En plus le séquençage d’une région du plasmide en

question montre qu’il contient le gène de structure PeP5 et les autres gènes liés qui

forment probablement un opéron.

Les études de curage plasmidique réalisées sur Bacillus coagulans I4

génèrent des dérivés non producteurs. Ceci suggère une localisation plasmidique

des gènes de production de la coaguline (Le Merrec et al., 2000). La Lactococcine et

la lactacine 481 sont codées respectivementbpar des plasmides de 55 kb et 70 kb

(Piard et al., 1993 ; Klaenhammer, 1993).

D’autre bactériocines sont codées par des gènes localisés sur l’ADN

chromosomique, comme c’est le cas de la subtiline produite par Bacillus subtilis

(Banerjec et Hansen, 1988). La mersacidine produite par Xanthomonas campresis

(Heu et al., 2001). Toutefois, le déterminant génétique des bactériocines peut être

aussi un transposant c’est le cas de la lactacine F (Muriana et Kklaenhammer, 1991)

et la nisine (Horn et al., 1991) et de la bactériocine produite par Listeria innocua 743

(Klamokoff et al., 2001).

Les déterminants génétiques responsables de la production des bactériocines

sont en général groupés sous forme de plusieurs unités transcriptionnelles arrangées

en opérons. Dans la plupart des cas, le premier gène de cette organisation

16

polycistronique code pour la protéine structurale. Les produits des gènes associés

sont impliqués dans la régulation de la transcription, les modifications post-

traductionnelles, le transport de la protéine vers l’extérieur de la cellule et l’immunité

de la bactérie productrice.

Le nombre de gène dans chaque opéron diffère d’une bactériocine à une

autre. L’opéron de la coaguline comprend quatre gènes :coa A, coa B, coa C et coa

D qui codent respectivement la pré-coaguline et les protéines d’immunités, de

transport et de clivage du précurseur (Le Merrec et al., 2000). L’organisation de la

nisine est plus compliquée, son opéron comprend 11 gènes : nis A de structure, nis B

de maturation post-traductionnelle, nisT, nis C de transport, nis P de clivage du

précurseur et les gènes d’immunité nisI, nisR, nisK, nisF, nisE et nisG (Siergers et

Etian, 1995), Figure 2.

17

Coa A B C D

Opéron coaguline

Nis B A T C I P R K F E G

Opéron nisine

Protéines de structure Modification post-traductionnelle

Clivage du prépeptide

Protéine d’immunité

Transport du prépeptide

Figure 2 : représentation schématique des opérons de la coaguline (Le Merrec et

al., 2000) et de la nisine (Siergers et Etian, 1995).

18

2.3.6. Biosynthèse et excrétion

Bien que les bactériocines sont rébosomiquement synthétisées, le transcrit qui

en résulte doit être modifier pour devenir actif. Les gènes qui codent pour les

enzymes facilitant les modifications sont généralement à proximité des gènes de

structure. La modification la plus importante est connue chez les lantibiotiques

(Cleveland et al., 2001). Lan B, protéines membranaire transcrite par les producteurs

de la nisine, modifie enzymatiquement ces bactériocines après leur transport vers

l’extérieur de la cellule (Engelke et al., 1992). Lan C participe aussi dans la formation

d’un pont thio-ester au niveau de ces lantibiotiques (Kleerebezem et Ouadri, 2001).

La modification post-traductionnelle des lantibiotiques incluse la formation de

nombreux acides aminés inhabituels.

La formation de ces acides aminés ait lieu après l’addition des groupes

cystéines-thiol. En tout, plus d’une douzaine d’acide aminés inhabituels sont fondus

au niveau des lantibiotiques.

Le prépeptide des non lantibiotiques est aussi modifié par clivage de la

séquence leader (Diep et al., 1996 ; Ehrmann et al., 2000). Ces modifications sont

nécessaires pour la sécrétion et le transport à travers la membrane cellulaire.

Les précurseurs peptidiques des non lantibiotiques comme la pediocine AcH

(Bukhtiyarova et al., 1994) et le lantibiotique Pep 5 (Sahl et al., 1987 ; Weil et al.,

1990) sont isolés et détectés sur gel. Ceci supporte la règle générale qui dit que les

bactériocines de faible poids moléculaire des bactéries a gram positives sont

synthétisées ribosomiquement sous forme de précurseur en premier lieu. Ces

précurseur apparaissent non biologiquement actifs et contiennent un propeptide C-

terminal qui, après avoir subit plusieurs modifications post-traductionnelles, est clivé

de la séquence N-terminale pour donner une molécule antimicrobienne mature (de

Vos et al., 1993).

Malgré les détails fournis par les évènements post-traductionnels ayant lieu

durant la maturation des non lantibiotiques, plusieurs phénomènes restent mal

connus. Pour cette raison un modèle pour la pediocine Ach a été proposé

(Bukhtiyarova et al., 1994).

Ce modèle est basé sur des observations de pediocine AcH prédit que

puisque la pédiocine active déstabilise probablement la membrane plasmique, la

translocation doit avoir lieu sous forme de pré-pediocine. L’endopeptidase impliqué

19

dans la séparation du peptide leader du propeptide au niveau d’un cite de clivage

spécifique est désigné peptidase leader (Jack et al., 1995).

Peu d’information concernant les propriétés de ou de(s) enzyme(s)

impliquée(s) dans la transformation de la prépediocine en pediocine AcH. L’enzyme

semble être mieux activée à un pH = 5 ou plus (Biswas et al., 1991 ; Ray et al., 1993)

alors que son activité est inhibée par un inhibiteur acide et par le β-mercaptoethanol

qui rompe les ponts disulfure (Ray et al., 1993).

Des études récentes montre que les fonctions de translocation

transmembranaires et l’activité peptidase sont portées par la même protéine

(Bukhtiyarova et al., 1994). Une étude séparée apporte que cette protéine a

uniquement un rôle de transport et possède une homologie structurale avec des

protéines ATPasiques transporteuses à travers les membranes (MarugG et al.,

1992).

La plupart des protéines de la classe I et II sont secrétées à l’extérieur des

cellules par un système transporteur ABC. Ce transporteur est formé par un domaine

hydrophobe intégré dans la membrane, d’un domaine de fixation d’ATP du coté C-

terminal situé à la face interne de la membrane plasmique et d’un domaine

protéolytique du coté N-terminal responsable du clivage de la séquence leader.

L’unique exception est fournie par une faible proportion de la classe II qui est

externalisée par la voie sec-dépendante (séquence leader N-terminale de type sec)

(Clevelande et al., 2001).

Le substrat Nis A est le prépeptide non biologiquement actif qui sera

déshydraté par Nis B et cyclisé par Nis C avant sa translocation par l’ABC

transporteur Nis T est le responsable de clivage de la séquence signal par la

protéase Nis P. Ces modifications conduiront au peptide biologiquement actif. La

nisine interagira avec l’histidine kinase Nis K, ce qui induira la phosphorylation du

régulateur de réponse Nis R et l’activation de la transcription des gènes nécessaires

à la production de la nisine. La protection de la cellule vis-à-vis de la nisine est

réalisée par deux mécanismes : la lipoprotéine d’immunité Nis I et l’ABC transporteur

formé par Nis G, Nis E et Nis F

2.3.7. Mode d’action

L’étude du mode d’action comporte deux aspects distincts :

-La cinétique des interactions physiques, entre les bactériocines et les cellules

sensibles, caractérisée par l’adsorption de la bactériocines.

20

-L’étude des liaisons biochimiques spécifiques sur les cellules qui se

manifestent par la perte de l’intégrité cellulaire et par conséquence le relargage de

certains composés intracellulaire (Atrich, 1994).

Deux types d’interaction sont connus lors de la fixation de la bactériocine sur

les membranes des cellules cibles (i) une interaction directe dépendante du potentiel

membranaire avec les structures phospholipidiques de la membrane cible. Il en

résulte une désorganisation membranaire. Ce type d’interaction est connu chez les

lantibiotiques comme la nisine (Moll et al., 1999). (ii) une interaction avec des

récepteurs protéiques spécifiques, c’est le cas des non lantibiotiques (Ennahar et al.,

2000). Exemple la pediocine AcH produite par Pediococcus acidilactis H (Bhunia et

al., 1991).

L’activité bactéricide des non lantibiotiques contre les cellules sensibles est

produite principalement par la déstabilisation de la fonction membranaire. Ces

derniers peuvent aussi cibler des composants intracellulaires comme l’ADN, l’ARN et

les enzymes pour tuer leurs cellules sensibles (Martinez et al., 2000).

Les bactériocines sont des molécules chargées positivement, ayant des

portions hydrophobes qui interagissent électrostatiquement avec des groupements

phosphates chargés négativement des membranes des cellules cibles (Chen et al.,

1997).

L’interaction de la nisine avec les composants membranaires des cellules

cibles est considérée comme une étape cruciale dans leur mode d’action, le degré de

cette association dépend du type de lipide en présence. Il a été démontré que

l’activité in vitro de la nisine, qui est de nature cationique, est plus efficace en

présence d’un haut pourcentage de composants lipidiques anionique (Garcia Gacera

et al., 1993).

Les lantibiotiques agissent par la formation de pores au niveau des cellules

cibles provoquant une dissipation des potentiels transmembranaires et/ou du

gradient du pH ce qui résulte une libération du matériel intracellulaire. Des études

ultérieures suggèrent que la formation de pores par la nisine dépend du potentiel

membranaire et du gradient du pH des cellules cibles ( Montville et Bruno, 1994).

La fixation des bactériocines sur les cellules cibles est facilitée par la

présence des molécules ancrées au niveau de la membrane qui augmente l’efficacité

de l’action de la bactériocine. Le lipide II est une molécule ancré au niveau de la

membrane plasmique jouant le rôle de peptidoglycane. La fixation de la mersadicine

21

sur cette molécule inhibe la synthèse des peptidoglycanes (Breukink et al., 1999 ;

Brotz et al., 1998).

Les lantibiotiques et les non lantibiotiques affectent tous les deux la barrière

de la perméabilité membranaire par la formation de canaux ou pores.

2.3.8. Immunité de la bactérie productrice

Les bactéries productrices pouvant être sensibles à leur propre bactériocine,

elles se préimunissent à l'aide d'une protéine qualifiée «d'immunité» (Abee, 1995).

Le seul modèle élaboré pour les bactéries lactiques a été très récemment proposé

par Venema et al (1995).

La protéine d'immunité, une protéine possédant un large domaine

transmembranaire pourrait interagir avec le récepteur potentiel de la bactériocine et

empêcherait ainsi l'insertion de cette dernière dans la membrane. Alternativement ou

de façon complémentaire, la protéine d'immunité pourrait également interagir

directement avec la bactériocine. la protéine d'immunité a été trouvée de façon

largement majoritaire dans le cytoplasme (Ouadri et al., 1995).

2.3.9. Purification des bactériocines

Puisque les bactériocines sont secrétées dans le milieu de culture, la

purification de ces molécules actives est un moyen indispensable à leur

caractérisation. En effet, la plupart des approches de purification commencent par la

concentration de surnageant de culture comme la précipitation aux sels (Holo et al.,

1991 ; Jeorjer et Klaenhammer, 1986), aux acides (Hasting et al., 1991) la

concentration par aspiration ou encore l’extraction par les acides organiques (Oscariz

et Pisabarro, 2000).

Ces produits bien que nécessaire pour la réduction du volume à traiter ne

donne pas en pratique un haut degré de purification. Par conséquent de nombreux

étapes de chromatographies sont nécessaires pour avoir une purification significative

(Vennema et al., 1997).

Certaines méthodes de purification se basent sur la nature hydrophobe de la

bactériocine comme la cereine 7 produite par Bc 7 qui est purifiée par une méthode

d’extraction par le butanol (Oscariz et Bisabarro, 2000).

22

La purification partielle de l’entomocine 9 produite par B thuringiensis ssp.

entomocidus HD9 consiste d’abord a précipiter les protéines au sulfate d’ammonium,

l’échantillon obtenu est en suite soumis à une filtration sur gel de sephacryl suivie

d’une chromatographie échangeuse d’anions (Cherif et al., 2003).

Vennema et ces collaborateurs propose une méthode de purification rapide et

efficace pour les bactériocines de faible poids moléculaire hydrophobes et

cationiques tel que la lactococcin B et la pediocine PA-1. Ces deux bactériocines

sont purifiées par une précipitation par l’éthanol, une dissolution dans l’eau

déminéralisée puis une isoélectrofocalisation suivie d’une ultrafiltration (Vennema et

al., 1997).

L’adsorption puis la désorption des bactériocines sur les bactéries

productrices, en fonction de pH, constituant un moyen rapide de purification initiale

de ces molécules. Cette procédures a été reprise au cours de la purification partielle

de la bacillocine 490 produite par Bacillus licheniformis 490 /5 (Maritirani et al.,

2002).

Malgré la mise en évidence ces derniers années de plusieurs bactériocines,

leur purification complète reste limitée à certains cas. Les difficultés rencontrées lors

des purifications résident dans :

(i) Les milieux de culture des bactéries sont généralement complexes et

comportent une concentration élevée de peptides et des protéines comparées à celle

de bactériocines produites qui ne présentent qu’environ 1mg par litre de culture

(Rammelsberg et al., 1990).

(ii) Les bactériocines forment un groupe chimique qui semble hétérogène

d’où la nécessité de tester plusieurs technique de purification (Van Laak et al., 1992).

Certains détergents utilisés dans les milieux de culture comme le Tween 80

(dans le milieu MRS) interfèrent avec la précipitation de ces molécules en raison de

leur caractère hydrophobe. Ce phénomène a été signalé par Muriana et

Klaenhammer (1991). Ces auteurs ont noté que le film formé à la surface lors de la

précipitation de la lactacin F avec le sulfate d’ammonium, contient 97% de l’activité.

(iii) La tendance des bactériocines à s’associer entre elles ou avec d’autres

protéines nécessite souvent l’utilisation d’agent dissociant tel que l’urée ou le SDS

(Muriana et Klaenhammer, 1991).

23

Il est ainsi recommandé de quantifier l’activité spécifique des bactériocines à

chaque étape de purification et de modifier ou d’éliminer les étapes conduisant à des

pertes excessives (tagg et al., 1988).

2.3.10. Rôle écologique des bactériocines

Les bactériocines sont produites lorsque la densité cellulaire est élevée et les

réserves alimentaires se trouvent rares. Ceci est démontré par Chao et Levin, (1981)

qui ont montré que les conditions d’invasion des souches productrices de colicine

sont plus large dans un environnement structuré ou les réserves alimentaires sont

faibles tel qu’une boite de Pétri que dans un environnement non structuré.

Le spectre d’activité, centré généralement sur des espèces rapprochées

phylogénétiquement, suggère un rôle des bactériocines dans l’écologie microbienne.

Les bactériocines servent comme des « anti-concurrents » permettant

l’invasion des souches productrices au sein d’une communauté microbienne. Elles

ont aussi un rôle défensif en interdisant l’envahissement des autres souches ou

espèces dans leur niche écologique ou encore en limitant l’avancée des souches

voisines (Riley et al., 2002).

La régulation de l’expression des bactériocines peut être enfin incluse dans le

processus de « quorum-sensing ». En effet, toute une panoplie de gènes codant

pour les activités de pathogénicité et autre, est régulée par la densité cellulaire ce qui

représente un avantage écologique.

La cereine 7 produite par la souche Bc7 est représentée en large partie sous

forme d’agrégats dans une solution aqueuse. Ceci indique que les agrégats sont

mieux maintenus par des interactions hydrophobes. Ces agrégats ont pour rôle de

prévenir la diffusion et la perte d’antibiotiques et son maintien tout autour de la

population bactérienne productrice (Oscariz et Pissabarro, 2000).

2.3.11. L’application des bactériocines dans le sec teur alimentaire

Les bactériocines purifiées sont considérée comme un additif alimentaire.

Jusqu’à présent, seule la nisine, un lantibiotique, est acceptée comme additif

alimentaire (E234) (Guinane et al., 2005).

Les bactériocines peuvent également être appliquées sous la forme d’un

concentré obtenu après fermentation par la souche productrice.

24

Cette préparation sera considérée comme un ingrédient fermenté. Elle

contiendra la bactériocine mais également d’autres métabolites microbiens tels que

l’acide lactique. La pédiocine, une bactériocine de la classe IIa, est commercialisée

sous cette forme sous le nom ALTA 2341. Des essais ont été récemment fait avec la

lacticine 3147, un lantibiotique (Deegan et al., 2006 ; Galvez et al., 2007).

Un autre mode d’application des bactériocines consiste en leur immobilisation

sur les cellules productrices, dans des gels ou des films telle que la gélatine, la

cellulose, les protéines de soja, des films de polysaccharides, etc. La bactériocine

sera alors libérée dans le produit au cours de la conservation (Luchansky et al., 2004

; Deegan et al., 2006 ; Ghalfi, 2006 ; Galvez et al., 2007).

27

3. Matériel et méthodes

28

3.1. Matériel biologique et conditions de culture

3.1.1. Laits

L’échantillon de lait de chamelle étudié provient de la région de Béchar. Le

trayon est lavé soigneusement à l’eau tiède. Les premiers jets sont éliminés, puis 100

ml de lait sont recueillis dans des flacons stériles qui sont immédiatement étiquetés et

placés dans la glacière (4°C) pour être rapidement tran sporté au laboratoire pour

l’analyse microbiologique et l’isolement de bactéries lactiques.

Une autre partie des souches étudiées proviennent d’une collection de

bactéries lactiques du laboratoire de microbiologie appliquée. Nous avons utilisé

également des souches pathogènes de références pour évaluer la substance

antibactérienne proviennent du laboratoire central d’analyse du CHU d’Oran.

3.1.2. Milieux et conditions de culture

Les milieux de culture de base utilisés sont des milieux M17 (Terzaghi et

Sandine, 1975) soit liquides, soit solides par addition d’agar (0.7%) pour les géloses

molles et 1.6% pour les milieux solides décrits par la Fédération Internationale du Lait

(FIL, 1981). Le lait écrémé stérile additionné de 1% d’extrait de levure est utilisé pour

les cultures bactériennes. L’incubation des bactéries lactiques se fait à 30° C pendant

48h.

3.2. Méthodes

3.2.1. Isolement des lactocoques

L’échantillon de lait est mis dans un tube à raison de 10 ml puis incubé à 30°C

jusqu’à coagulation par les bactéries lactiques endogènes.

Les ensemencements sont réalisés sur milieu M17 (Terzaghi et Sandine, 1975)

en utilisant les dilutions décimales obtenues à partir de la suspension mère.

100 µl sont ensemencés sur milieu solide pour avoir des colonies bien

séparées. Après incubation (30°C, 24 à 48h), un examen microscopique est effectué,

il permet d’observer la morphologie des cellules, leurs tailles, éventuellement leur

mode de regroupement. Il peut être fais soit à l’état frais ou après coloration simple ou

coloration de Gram sur frottis fixé. La coloration de Gram nous permet une séparation

29

entre deux grands groupes : les bactéries à Gram positives des bactéries à Gram

négatives.

Cette différence de coloration provienne de différences structurales de la paroi

bactérienne. Les bactéries à Gram positives, à paroi rigide gardant la coloration

violette du violet de gentiane après l’action de l’alcool, alors que les bactéries à Gram

négatives, à paroi plus mince, perdent cette coloration après action de l’alcool et sont

recolorées en rose par la fuchsine. Ce critère est l’un des bases de la classification

des bactéries.

Après coloration de Gram. La forme des cellules et leur mode d’association

sont notés.

3.2.2. Recherche de la catalase

Cette méthode est basée sur la réaction suivante :

Catalase

2H2O2 2 H2O2 +1/2O2

La recherche de la catalase est effectuée par addition d’une goutte de

peroxyde d’oxygène à une colonie étalée sur une lame. Le dégagement de bulles

d’air indique que l’isolat est catalase positive; dans le cas contraire, la souche est

catalase négative.

Les isolats à Gram+ et catalase- sont repiqués de façon alternée sur milieu M17

liquide ou solide jusqu’à purification. A chaque fois, 7 ou 10 colonies bien isolées sont

prélevées du milieu M17 solide et transférées sur M17 liquide et vice versa. La pureté

de la souche est vérifiée par une observation microscopique; l’aspect des colonies

(forme, couleur, taille) et l’aspect caractéristique de la culture des bactéries lactiques

en milieu liquide.

3.2.3. Identification des souches purifiées

Afin de classer les isolats en genre, en espèce et en sous espèces, les tests

biochimique s’avère nécessaires pour mener à bien cette tache.

a- Test de l’arginine dihydrolase (ADH)

La mise en évidence de cette enzyme est intéressent pour la caractérisation

des bactéries lactiques. Le rôle de cette enzyme est de libérer l’ammoniac à partir de

30

l’arginine. Pour effectuer ce test on utilise le milieu M16 BCP de Thomas (1973), ce

milieu contient un indicateur de pH, le pourpre de bromocrésol, si la couleur du milieu

vire au jaune puis vers le violet ceci indique la présence de l’enzyme et la dégradation

de l’arginine. Si elle reste jaune cela veut dire que la bactérie est ADH négative.

b- Le type fermentaire

Ce test permet d’apprécier le type de métabolisme par le quel le substrat

carboné est transformé ; Par définition, l’hétérofermentation est la capacité des

bactéries lactiques à produire des molécules différentes du lactate telles que le CO2

l’acétate et l’éthanol à partir de la dégradation des sucres. Il consiste à mettre en

évidence le gaz (CO2) produit.

L’ensemencement des souches à tester s’effectue dans un milieu liquide M17

contenant le glucose comme source de carbone, menu au préalable d’une cloche de

Durham. Le bouillon est, par la suite, mis à incuber à 30°C, les tubes sont observés

dans un délai de 3 ou 5 jours en fonction de l’aspect du milieu (trouble) et la

production du gaz. (Garvie, 1984; Schillinger et Lücke, 1989).

c- Température de croissance

C’est un critère important car il permet de distinguer entre les souches

mésophiles des thermophiles. Après inoculation en milieu M17 liquide avec une

culture pure, les tubes sont incubés pendant sept jours à 10°C et 24 à 48 heures à

45°C.

qLa thermorésistance des souches est testée par leur incubation en bain marie

pendant 30mn à 63-65°C (Stiles et Holtzapfel, 1997; Klein et al., 1998). En suite, les

tubes sont portés à incuber pendant 24 à 48h. Au bout de ces délais, la croissance

est appréciée par l’examen des milieux (présence de trouble).

d- Croissance à 4%, 6,5% de NaCl et à pH 9,6

L’habilité à croître sur milieu M17 en présence de NaCl à différentes

concentrations (4% et 6.5%) et à pH de 9.6 a été observé pendant 2 à 3 jours

d’incubation à 30°C. Les lactocoques ne poussent pas en pr ésence de 6.5% de NaCl;

ce test permet de séparer les lactocoques (streptocoques lactiques), des

entérocoques (Devriese et al., 1993).

31

e- Test de lait bleu de Shermann

Une série de tubes à essais de 7ml de lait stérilisé à 0,1% et à 0,3% de bleu de

méthylène est ensemencé par des cultures pures puis incubés durant une période de

24 à 48 heures à 30°C. Seuls les entérocoques peuvent se développer dans le lait à

0,3% de bleu de méthylène.

f- Fermentation des sucres

La fermentation de 14 sucres a été testée pour l’ensemble des souches qui on

donné un effet inhibiteur sur les souches pathogènes utilisées a fin de les identifier. Le

milieu de base utilisé est le bouillon MRS (sans le glucose et l’extrait de viande)

additionné de pourpre de bromocrésol comme indicateur de pH (MRS-BCP) (Mannu

et al., 2000) supplémenté de 1% des sucres suivants: mannitol(1), saccharose(2),

lévulose(3), sucrose(4), rhamnose(5), galactose(6), xylose(7), esculine(8), sorbitol(9),

arabinose(10), maltose(11), fructose(12), lactose(13) glucose(14) et raffinose(15).

Les solutions de sucres ont été préparées dans 10 ml d’eau distillée contenant

3 g des différents sucres. Ces préparations sont stérilisées par chauffage au bain

Marie à 100°C pendant 10 min puis conservées au réfrigé rateur (Joffin et Leyral,

1996). Ce test est résumé dans les étapes suivantes :

(i) Dans des tubes à hémolyse stériles, on mit 1ml de MRS BCP.

(ii) On récupère les culots après centrifugation des cultures jeunes des

souches étudiées après lavage par le tampon phosphate.

(iii) On ajoute 0,1ml de chaque sucre dans les tubes précédents.

(iv) On ensemence le contenu des tubes avec 0,1ml des souches et en

dernier on y ajoute une goutte d’huile de paraffine stérile pour l’anaérobiose.

(v) L’incubation se fait à 30°C pendant 24 à 48 h.

Le virage de la couleur du milieu vers le jaune indique que la souche a dégradé le

sucre (résultat positif), si non le résultat est négatif.

3.2.3. Conservation des souches

La conservation des souches pures a été faite selon deuxméthodes: à court et

à long terme.

La conservation à court terme des souches pures est effectuée sur milieu M17

solide incliné. Après croissance à la température optimale, les cultures sont

32

maintenues à +4°C et leur renouvellement se fait par repiquage toutes les 4

semaines. A long terme, les souches sont conservées dans une solution contenant

70% de lait écrémé (enrichie par 0.5g/l d'extrait de levure et 0.5g/l de glucose) et 30%

de glycérol à 40% à -20°C (Samelis et al., 1994).

3.2.4. Cinétique d’acidification

L’acide lactique produit par les souches isolées est mesuré à l’aide d’un pH

mètre puis titré par le NaOH N/9 en présence d’un indicateur de pH (la

phénolphtaléine 1%). Cette acidité est exprimée en degré Dornic (D°). Un degré

Dornic correspond à l’acidité apporté par 0,1g d’acide lactique dans un litre de lait.

Chaque souche est ensemencée dans un tube à 10 ml de lait écrémé stérile

puis incubés à 30°C pendant 24h. Dés que le lait coagule , on mesure le pH et on note

la souche la plus acidifiante, la moins acidifiante et qui acidifié le lait moyennement.

Dans 3 flacons contenant 100 ml de lait écrémé stérile, on transfère 3ml de lait

coagulé de chaque tube sélectionnés puis on homogénéise. Chaque flacon est réparti

dans des tubes stériles à raison de 10ml de lait par tube puis en mis dans l’incubateur.

La quantité d’acide lactique est calculée après différents temps (2h, 4h, 6h, 8h, 18h et

24h).

3.2.5. Antagonisme direct sur milieu solide

Il s’agit de détecter des zones d’inhibition après Co-culture entre les souches à

tester avec une souche indicatrice. Le test est effectué selon la méthode directe (Paik

et al ., 1997). Les souches à tester sont ensemencées avec un multipoint sur milieu

M17 tamponné pour éviter l’effet de l’acidité, après incubation à 30°C, 7ml de gélose

molle inoculée par 45 µl de la souche pathogène (E.Coli et Staphylococcus pyogenes

séparément) sont étalés en surcouche puis incubés 24h à 30°C. Les boites sont

examinées s’il ya présence ou non de zones d’inhibition. La présence d’une zone

d’inhibition correspond à un arrêt de la multiplication de la souche indicatrice dans la

partie de la gélose contenant une (des) substance(s) antimicrobienne(s) produite(s)

par la souche testée. Le diamètre des zones d’inhibition est ensuite mesuré.

3.2.6. Détection de la substance inhibitrice dans l e surnageant de culture

La méthode utilisée est celle de la diffusion de surnagent de culture à partir des

puits décrite par Tagg et Mc Given, (1971). Les souches qui on donné des zones

33

d’inhibition sur milieu solide sont cultivées dans le milieu M17 liquide à 30°C. Après

24h, les cultures sont collectées puis centrifugées à 5000 tpm pendant 7 mn pour

récupérer les surnagent. Cinq ml de gélose molle préalablement inoculés par 45 µl de

la souche indicatrice sont ajoutés en surcouche dans une boite de Pétri contenant le

milieu M17 solide. Après solidification, des puits de 10mm de diamètre sont creusés

dans la gélose et leurs fonds scellés par 20 µl de gélose molle liquéfiée à 45°C. Deux

cent µl de chaque surnagent de culture à tester sont placé dans chaque puits.

Les boites sont laissées 30mn dans la température ambiante pour permettre la

diffusion de surnagent dans la gélose molle. Les diamètres des zones d’inhibition sont

mesurés après 24h d’incubation à 30°C.

3.2.7. Caractérisation de la substance inhibitrice

a- Action des protéases

Afin de déterminer la nature chimique de la substance inhibitrice secrétée par

les souches actives, le surnagent de culture de ces souches est traité par les

enzymes suivants : la trypsine et la chymotrypsine à raison de 1mg par ml de

surnagent, puis incubés 1h à 37°C. L’activité résiduelle des surnagent traités est

testée par la méthode de diffusion à partir des puits.

b- Stabilité thermique

L’effet de la température sur l’agent antimicrobien est étudié de la manière

suivante : 1ml de chaque surnagent est placé dans un tube Eppendorfs puis incubés

pendant 30 mn à 120°C. L’activité résiduelle est testé e par la méthode de diffusion à

partir des puits en utilisant le surnagent natif comme témoin.

34

4. Résultats et discussion

35

Etude morphologique

4.1. Résultat des tests macroscopiques

Les observations macroscopiques nous a permis de décrire les colonies

obtenues sur milieu solide (la taille, la couleur, la forme et le contour). Le repiquage

successif sur milieu M17 solide a révélé des colonies rondes avec une couleur

blanchâtre et d’un pourtour régulier (Figure 3(A)). .

En milieu liquide, elle se base sur l’observation du trouble fumeux surmonté

d’une zone claire. Il s’accentue au fur et à mesure de la purification des souches, ceci

traduit le caractère microaerophile des bactéries lactiques (Figure 3(B)). .

4.2 . Etude microscopique

La caractérisation microscopique est basée sur la coloration de Gram. Nous

n’avons gardé que les bactéries à Gram positives et en forme de coque (Figure 5),

leur mode d’association est résumé dans le tableau 6.

36

A B

Figure 3 : aspect macroscopique des colonies en surface (A). Aspect d’une culture

pure dans un milieu liquide M17(B).

Figure 4 : aspect microscopique à l’agrandissement G1000 après coloration de Gram

de la souche 11B.

37

Tableau 6: aspect macroscopique des colonies et l’aspect microscopique des

souches purifiées et leurs caractères biochimiques.

Souches

Aspect de la colonie

Morphologie

cellulaire, arrangement

Type fermentaire

NaCl

pH9, 6 4% 6,5%

1A ronde circulaire

blanchâtre

Cocci en paire Homofermentaire + - -

1B ronde circulaire

blanchâtre

Cocci en diplo Homofermentaire + - -

2A

ronde circulaire

blanchâtre


2B ronde circulaire

blanchâtre


3A ronde circulaire

blanchâtre

Cocci en chaînette

Homofermentaire + - -

4A ronde circulaire

blanchâtre

Cocci en paire, diplo


4B ronde circulaire

blanchâtre


5A ronde circulaire

blanchâtre


5B ronde circulaire


6A ronde circulaire

blanchâtre


6B ronde circulaire

blanchâtre


7A ronde circulaire

blanchâtre


7B ronde circulaire

blanchâtre


38

Tableau 6 (suite).

Souches


Morphologie cellulaire,

arrangement

Type fermentaire NaCl pH9, 6

4% 6,5%

8A

ronde circulaire

blanchâtre

Cocci en chaînette

Homofermentaire + + +

8B ronde circulaire

blanchâtre

Cocci en diplo Homofermentaire + + +

10A ronde circulaire

blanchâtre

Cocci en chênette


10B ronde circulaire

blanchâtre

cocci en paire Homofermentaire + - -


blanchâtre

Cocci en diplo, chainette



blanchâtre



blanchâtre

Cocci en chaînette



blanchâtre

Cocci en paire, diplo



blanchâtre



blanchâtre


13C ronde circulaire

blanchâtre


1 ronde circulaire

blanchâtre


39

Tableau 6 (suite).

Souches


Morphologie cellulaire,

arrangement

Type fermentaire NaCl Ph9,6

4% 6,5%

2

ronde circulaire

blanchâtre


3

ronde circulaire

blanchâtre


4 ronde circulaire

blanchâtre


5

ronde circulaire

blanchâtre


6

ronde

circulaire blanchâtre

Cocci en chaînette

Homofermentaire

+

-

-

40

4.3. Test de catalase

La recherche de la catalase se fait par la mise en contact des colonies avec

quelques gouttes d’eau oxygénée à 10V. Le dégagement gazeux traduit l’activité

positive de cette enzyme. Lorsqu’on a un milieu liquide, on ajoute 1ml d’H2O2 à 3% à

une culture de 18 à 24h. Nous avons éliminé toutes les souches catalase positives.

.

4.4. Test de NaCl et de pH

Ce test est réalisé dans le but de différencier les lactocoques des

entérocoques, Il nécessite l’emploi de deux milieux M17 liquide : l’un contenant

respectivement 6,5% et 4% de NaCl et l’autre à un pH 9,6 ; dans lesquels on a

ensemencé les souches à tester. Après culture, nous avons remarqué que toutes les

souches testées n’ont pas pu pousser en présence de 6,5% de NaCl et dans le milieu

M17 à pH 9,6 sauf la souche 8A et 8B.

4.5. Test du lait bleu de shermann

Nous avons ensemencé les souches isolées dans deux séries de tubes : la

première avec un pourcentage de 1% en bleu de méthylène et l’autre avec 3% de

bleu de méthylène. Le principe de ce test est basé sur le mode respiratoire des

souches ensemencées, si elles sont aérobies (cas des entérocoques) elles vont tirés

leurs oxygène depuis le bleu de méthylène présent dans le lait, donc ce dernier va

perdre sa couleur, si c’est le cas contraire, cas des lactocoques qui sont

microaérophiles, elles vont utiliser une petite quantité d’oxygène qui ne peut pas

changer la couleur du lait donc il reste bleu. La figure 5 montre la souche 8A qui a

réduit le bleu de méthylène 3%, ceci signifie que cette souche est une entérocoque.

La souche 5B a donné une réaction négative (bleu de méthylène à 3%). Les souches

10B, 10A et 7B on donné une réaction négative avec le bleu de méthylène 1%.

41

8A (+) 5B(-) 10B(-) 10A(-) 7B(-)

3% en bleu de méthylène 1% en ble u de méthylène

Figure 5 : résultat du test de bleu de méthylène.

(+) : réduction du bleu de méthylène.

(-) : résultat négatif.

42

4.6. Test du profil fermentaire

Dans des tubes à essais, menus de cloches de Durham et contenant le milieu

M17 pH 7,1, on a ensemencé les souches à tester. Les souches hétérofermentaires

vont produire, en plus de l’acide lactique, l’acide acétique et le CO2. Ce gaz libéré va

être mis en évidence par la poussée de la cloche de Durham vers le haut. Nous avons

remarqué que toutes les souches étudiées sont homofermentaire (Tableau 6).

4.7. Test de l’arginine déshydrogénase

La production de l’acide lactique acidifie le milieu de culture (M16 BCP), qui

contient un indicateur de pH, et la couleur de ce dernier va virer vers le jaune. Les

bactéries possédant l’ADH vont realcalinisé le milieu et sa couleur reviendra mauve,

les souches qui ne possèdent pas cette enzyme leur milieu va rester jaune.

Les souches testées sont ensemencées par un multipoint, après incubation à

30°C, nous avons remarqué que les isolats 6A, 6B et 6 n ’ont pas une arginine

déshydrogénase alors que les autres sont ADH positives (Figure 6).

4.8. Test de fermentation des sucres

La fermentation des sucres est un test utilisé afin d’identifier les espèces.

Seules les souches qui on un effet inhibiteur sont identifiées. Les sucres utilisés sont :

mannitol(1), saccharose(2), lévulose(3), sucrose(4), rhamnose(5), galactose(6),

xylose(7), esculine(8), sorbitol(9), arabinose(10), maltose(11), fructose(12),

lactose(13) glucose(14) et raffinose(15). Les résultats obtenus sont résumés dans le

tableau 7.

43

Figure 6 : aspect des souches ADH positives sur milieu M16 BCP

Présence d’une couleur mauve indique la présence de l’enzyme de l’ADH

Souches ensemencées

en multipoint

44

Tableau 7: Profil fermentaire des isolats.

Souches 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

1B - - + - - + - - - - - - + + -

5B + + + + - + - - - - + + + + +

6A - - + - - + - - - - - - + + +

6B - - + - - + - - - - - - + + +

6C - + + - - + - - - + + + + + -

10A - + + - - + - - - + + + + + -

10B - + + - - + - - - + + + + + -

10C - + + - - + - - - + + + + + -

11A - + + + - + - - - - + + + + -

13A - + + + - + - - - + + + + + -

13B - + + + - + - - - + + + + + -

13C - + + + - + - - - + + + + + -

1 + + + + - - - - + - + + + + -

2 - - - + - - - - + - + + + + -

3 - + + - - + - - - + + + + + -

4 - + + - - + - - - + + + + + -

5 - + + + - + - - - + + + + + -

6 - + + + - + - - - - + + + + -

+ : fermentation du sucre utilisé

- : résultat négatif

Mannitol(1), saccharose(2), lévulose(3), sucrose(4), rhamnose(5),

galactose(6), xylose(7), esculine(8), sorbitol(9), arabinose(10), maltose(11),

fructose(12), lactose(13) glucose(14) et raffinose(15).

45

15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 T

A

15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 T

B

Figure 7 : résultat du test des sucres.

A : souche 1B,

B : souche 11A.

T : témoin (MRS BCP sans sucre)

Mannitol(1), saccharose(2), lévulose(3), sucrose(4), rhamnose(5), galactose(6),

xylose(7), esculine(8), sorbitol(9), arabinose(10), maltose(11), fructose(12),

lactose(13) glucose(14) et raffinose(15).

46

Tableau 8: présentation de l’identification des souches isolées.

Souches Espèce

1B Lc. cremoris

6A Lc. cremoris

6B Lc .cremoris

6C Lc. lactis

10A Lc. lactis

10B Lc. lactis

10C Lc .lactis

11A Lc. hordiniaea

13A Lc. lactis

13B Lc. lactis

13C Lc. lactis

2 Lc. lactis

3 Lc. lactis

4 Lc. lactis

5 Lc. garviaea

6 Lc. cremoris

47

4.9. Cinétique d’acidification

L’acidification est le rôle principal des bactéries utilisées comme ferments.

Celle- ci a différents buts:

- la coagulation du lait en facilitant l’action de l’enzyme de la présure et

l’augmentation de la synérèse du caillé ;

- la participation aux propriétés rhéologiques du produit final ;

- l’inhibition de la croissance des bactéries nuisibles (Weber et Broich, 1986).

La nature du lait a une influence sur la croissance et l’activité acidifiante des

souches (Casalta et al.1995).

La mesure de l’activité acidifiante à 30°C montre que la nature du lait a une

influence sur la vitesse d’acidification de Lactococcus lactis (Casalta et al.1995).

Parmi les bactéries isolées à partir de lait cru de chamelle, on a choisi 3

souches : 10B qui est fortement acidifiante, la souche 13B qui est moyennement

acidifiante et la souche 2 faiblement acidifiante afin de suivre leur cinétique

d’acidification, le pH a diminué progressivement en fonction du temps (Figure 8,

Tableau 9). Par contre le degré Dornic a augmenté à cause de l’augmentation de

l’acide lactique présent dans le milieu de culture (Figure 9).

En effet, Les ferments présentant une capacité d’acidification élevée sont

adaptés à la fabrication de produits laitiers fermentés, les autres ferments, à capacité

acidifiante plus faible, semblent plus adaptés à la fabrication fermière.

4.10. Test d’antagonisme sur milieu solide

Dans le but de détecter les souches productrices de substance(s) inhibitrice(s),

nous avons réalisé une Co-culture sur milieu solide entre chaque souche et les

souches pathogènes (E. coli, Staphylococcus aureus) qui ont été isolés et identifiés à

partir de produits biologiques contaminés au Laboratoire central d’analyses médicales

de CHU d’Oran. Après 24h, nous avons sélectionné que les souches ayant un effet

inhibiteur sur la croissance des souches pathogènes, cet effet est traduit par

l’apparition des zones claires autours des colonies (Figure 10).

48

En général, le diamètre d’inhibition est plus large lorsqu’on utilise Sc. aureus comme

bactérie indicatrice, alors que les isolats 1, 4, 5 et 6 ont donné une activité plus élevé

sur les deux bactéries pathogènes.

49

Tableau 9: la variation du pH et du degré Dornic des souches 10B, 6C et 2 en

fonction du temps.

10B 6C 2

pH V °D pH V °D pH V °D

0h 6,6 2,5 25 6,57 2,4 24 6,5 2,6 26

2h 6,49 3,2 32 6,2 3,8 38 6,56 3,1 31

4h 5,95 3,9 39 5,08 5,5 55 6,46 3,6 36

6h 5,39 4,8 48 4,6 4,3 43 6,1 4 4

8h 5,2 6 60 4,5 6,8 68 5,6 4,9 49

18h 4,5 6,5 65 4,2 6,8 68 4,7 6,3 63

24h 4,4 6,6 66 4 6,9 69 4,6 6,5 65

D° : degré dornic

V : volume du NaOH coulé

50

Figure 8: la variation du pH des souches 10B, 6C et 2 en fonction du temps.

Figure 9: variation du D° des souches 10B, 6C et 2 en fonction d u temps.

0

1

2

3

4

5

6

7

0 2 4 6 8 18 24

13B 10B2 2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 2 4 8 18 24

13B

10B

2

51

zone d’inhibition

Figure 10: test d’antagonisme direct sur milieu solide.

52

Tableau 10: diamètre des zones d’inhibition en cm provoqué par les souches actives

sur les souches pathogène.

Souches S.aureus E.coli

1B 0,8 0,7

6A 1 ,2 0,9

6B 1,4 1,3

6C 1,3 1,1

10A 1, 5 1 ,2

10B 0,9 1

10C 0,9 0,7

11A 1 1,1

13A 1,4 1,2

13B 1,1 0,9

13C 0,9 0,7

5B 1,5 1,3

1 1,8 1,9

2 1,3 1,5

3 0,7 O, 9

4 1,7 1,5

5 1,6 1,7

6 1,8 1,5

Figure 11 :

vis des bactéries

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

S. aureus E. coli

: diamètre des zones d’inhibition en centimètre des souches testées vis

bactéries pathogènes.

coli

d’inhibition en centimètre des souches testées vis

53

d’inhibition en centimètre des souches testées vis-à-

1B

6A

6B

6C

10A

10B

10C

11A

13A

13B

13C

1

2

54

4.11. Recherche de l’activité inhibitrice dans le s urnageant de culture

L’agent inhibiteur a été recherché dans le surnagent de culture. Après 24h,

nous avons collecté les différents milieux de culture puis sont centrifugés et testés par

la méthode de diffusion à partir des puits. Après un délai de 24h on a remarqué que

l’activité inhibitrices des souches est présente dans leur surnagent, ce qui confirme

que la substance inhibitrice est secrétée à l’extérieur de la cellule (Figure 12).

4.12. Identification des agents inhibiteurs des sou ches testées

Pour être sûr que la zone d’inhibition remarquée après le test de diffusion à

partir des puits est due à une bactériocine, nous avons effectué plusieurs tests qui

sont : l’effet de la température, de la trypsine et de la chymotrypsine sur le surnagent

de culture des différents souches. Après incubation nous avons remarqué que

l’activité inhibitrice a disparue, on peut dire que l’activité inhibitrice est due à une

substance de nature protéique et on peut dire que se sont des protéines de type

bactériocine-like.

55

Zones d’inhibitions

Figure 12 : zones d’inhibitions provoqués par le surnagent de culture des souches

testées.

56

5. Discussion et Perspectives

57

Les laits algériens pourraient constituer une source intéressante d’isolement de

bactéries lactiques pourvues de propriétés industrielles importantes et en plus

possédant une biodiversité de l'information génétique.

L’identification phénotipique des bactéries nous permet d’identifier rapidement

et simultanément un nombre élevée des souches bactériennes et d’étudier leurs

propriétés biotechnologiques. Elle présente un pouvoir discriminant qui s’étant du

groupe à l’espèce et dans une moindre mesure à la sous-espèces et à la souche

(Curk et al.,1994).

La caractérisation phénotypique des lactocoques est peu claire (Drouault et

al., 2002), et beaucoup de souches sont mal classifiées aux niveaux du genre et de

l'espèce. Les méthodes standard employées pour la caractérisation du phénotype

donnent des réponses ambiguës avec des souches de lactocoques,

Cette caractérisation peut être erronés par:

la variation du phénotype par la présence ou l’absence d’un plasmide

codant pour des fonctions métaboliques;

la variation de la taille de l’inoculum et la durée d’incubation;

des profils différents entre des souches récemment isolées et celles qui

sont conservées depuis longtemps;

l’expression différente des caractères phénotypiques selon la

température, la composition du milieu de culture, pour cela les chercheurs,utilise la

taxonomie moléculaire.

Dans le présent travail, pour différencier les entérocoques, des lactocoques

(qui est impossibles sur milieu sélectif) nous nous somme basés sur l'incapacité des

souches de Lactococcus de se développer à pH 9,6 et en présence de 6,5% de NaCl.

Il est ainsi possible que les habitats normaux, y compris le lait cru, puissent

héberger de nouvelles souches intéressantes de lactocoques avec l'application

potentielle de produire de nouveaux produits laitiers fermentés (Wouters et al., 2002).

Parmi les lactococcus, deux sous-espèces sont principales: la sous espèce

lactis, et la sous espèce cremoris., Bien qu'elles montrent différentes caractéristiques,

elles ont plusieurs attributs biochimiques en commun (Pritchard, et Coolbear, 1993;

58

Desmazeaud et Cogan, 1996). Des souches de Lactococcus lactis subsp. cremoris

ont été obtenus à partir des échantillons de lait cru algérien (Saidi et al., 2002; Badis

et al., 2003), marocain, chinois, yougoslave et ukrainien (Samaržija et al., 2001).

Certaines substances inhibitrices ont été caractérisées comme étant des

protéines antimicrobiennes et appelées bactériocines. Les bactéries lactiques sont

connues pour leur aptitude à produire des composés antibactériens leur permettant de

se développer préférentiellement dans divers écosystèmes. Parmi les substances

synthétisées, des peptides, dénommés bactériocines qui sont produits puis exportés à

l'extérieur des cellules productrices.

Ces bactériocines font l'objet depuis une dizaine d'années d'un nombre

croissant d'études, ainsi qu'en témoigne l'abondante littérature scientifique s'y

rapportant (Jack et al., 1995). En arrière plan de ces nombreux travaux figurent divers

applications potentielles dans les produits laitiers, carnés et marins.

Chez les bactéries lactiques, touts les genres comportent des souches

productrices de bactériocines. Si jusque vers la fin des années 1980, seuls les

lactobacilles, les lactocoques et les pédiocoques avaient révélé la présence de

bactériocines (Klaenhammer, 1988), dans ces dernières années, la découverte de

nombreuses souches de Leuconostoc et de carnobactéries présentant des activités

antagonistes (Cenatiempo et al., 1995 ; Hastings et al., 1991 ; Héchard et al., 1992 ;

Felix et al., 1994). On peut considérer que la majorité de bactériocines décrites à ce

jour correspond à des Bactériocines de bactéries lactiques (Worobo et al, 1994;

Quadri et al., 1994).

Parmi les 30 souches purifiées, nous avons sélectionné 18 souches qui ont

donné un effet inhibiteur vis-à-vis les bactéries suivantes : Staphylococcus pyogène et

E. coli sur milieu solide, Par la suite, nous avons recherché l’effet inhibiteur des

souches productrice dans leurs surnagent de culture, ceci est réalisé par la méthode

de diffusion à partir des puits. Nous avons remarqué que cette activité inhibitrice est

présente dans le surnagent.

Sherwitz et al., (1986) ont montré qu’on peut s’assuré qu’il s’agit bien d’une

bactériocine si on observe la disparition des zones d’inhibition après action d’une

enzyme protéolytique, donc elles devraient être sensibles à l’action de ces enzymes

59

(Upreti et Hinsdill, 1973; Tagg et Wannamaker, 1978; Barefoot et Klaenhammer,

1983; Mehta et al., 1984; Klaenhammer, 1993).

Le surnagent des différentes souches sont traités par deux enzymes la trypsine

et la chymotrypsine. L’activité inhibitrice a disparue après ces traitements, les

mêmes résultats sont trouvés par Holo, (1991) qui on purifié la Lactococcin A, isolée à

partir de Lactococcus lactis subsp. Cremoris.

L’activités des bactériocines produites par huit souches de bactéries lactiques

isolées à partir de lait fermenté du Burkina Faso ont été perdues après traitement

avec l’α-chymotrypsine, la trypsine, et la pepsine, tandis que traitement avec de la

lipase, catalase, l'amylase n'a pas affecté l'activité de la bactériocine (Kozak et al.,

1978).

La zone d’inhibition est en générale plus large lorsque on utilise

Staphylococcus aureus car les bactéries lactiques sont surtouts actives sur les

bactéries pathogènes à Gram positives (O’sullivan et al., 2002) et que Les bactéries à

Gram positives sont généralement plus sensibles à l’effet bactéricide des bactéries

lactiques (Biswas et al., 1991).

La vitesse d’acidification est un critère important en technologie. On cherche le

plus souvent des souches dites « rapide » c’est-à-dire qui acidifie rapidement le lait.

Dans le cas des lactocoques, il a été démontré que cette propriété est étroitement liée

à la présence de plasmides dans la cellule : Lac+ (souche capable d’utiliser le

lactose), Prt+ (protéolytique) (Mc KAY, 1983 ; Mc KAY et Baldwin, 1975).

En effet, nous avons remarqué que l’activité inhibitrice et l’acidité apparaissent

très variables et sans relation apparente. Les deux souches 10B et 2 (fortement

acidifiante et faiblement acidifiante respectivement) ne présentent pas la même action

vis-à-vis des bactéries pathogènes. Ces résultats sont les même que ceux de (Labioui

et al., 2005).

On fin on peut dire que cet effet inhibiteur est du à une protéine de type

bacteriocin-like.

61

Conclusion

Les bactéries lactiques sont largement utilisées dans l’industrie agro-

alimentaire afin d’exploiter leur pouvoir acidifiant et aromatisant (fabrication de

yaourts et de fromages). Ces bactéries on la capacité de synthétiser des substances

à effet inhibiteur, ce qui a attiré l’attention des chercheurs dans les derniers années

afin de les utiliser comme bioconservateurs et d’augmenter la duré de conservation

des denrées alimentaires.

A partir de lait cru de chamelle, 30 souches sont isolées et identifiées.

L’espèce la plus dominante est Lactococcus lactis. Le test d’antagonisme direct sur

milieu solide nous a permis de mettre en valeur le pouvoir inhibiteurs des isolats

purifiés. 18 souches sont actives a l’encontre de bactéries pathogène (E. coli et de

Staphylococcus aureus), cette activité est présente dans leur surnagent de culture.

Parmis les 18 isolats, 1, 4, 5 et 6 ont présentée une activité inhibitrice plus élevée. La

sensibilité vis-à-vis des traitements thermiques et l’action des enzymes

protéolytiques nous permis de dire que ces substances sont de nature bactériocine-

like.

Des alternatives peuvent être proposées pour terminer ce travail :

- La purification partielle ou complète de ces agents inhibiteurs

- L’analyse de leurs structures chimiques

- L’identification du déterminant génétique

- L’étude de leurs effets sur les cellules cancéreuses ou bien leurs utilisations

dans le domaine de la biotechnologie.

62

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Annexes

Milieux de culture :

Milieux MRS (De man Rogossa et sharp, 1960) : est utilisé pour la culture des

lactobacilles.

ingrédients Piods g/l

Extrait de viande 10g

Extrait de levure 2g

Glucose 20g

Tween 80 1mg

Citrate de sodium 2g

Acétate de sodium 1g

Sulfate de manganèse 0,0g5

Phosphate potassique 2g

Eau distillée 1000ml

Ph 7,2

Autoclavage 120°C pendant 20 min

Milieu MRSBCP (KIHEL, 1996) : utilisé pour l’étude du profil fermentaire.

ingrédients Piods en g/l

Protéose peptone 10g

Extrait de levure 5g

Tween 80 1mg

Citrate de sodium 2g

Acétate de sodium 1g

Sulfate de manganèse 0,0g5

Phosphate potassique 2g


pH 7,2

On ajoute à ce milieu un indicateur de pH qui est le pourpre de bromocrésole a

raison de O,O5 g/l. On ajuste le pH à 6,9 puis on l’autoclave 20min à 120°C.

Milieu M16BCP (Thomas, 1973) : utilisé pour la recherche de l’arginine

déshydrolase.


Extrait de viande 5g

Extrait de levure 2,5g

Peptone papainique de soja 5g

Biopolypeptone 5g

Lactose 2g

Tweene 80 1g

Acide ascorbique 0,5g

Bromocrésol pourpre O,O5g

L-arginine 4g

Eau distillée 1OOOml

Agar-Agar 15g

pH 6,8

Milieu lait écrémé : utilisé pour les cultures bactériennes, l’étude du pouvoir

acidifiant, l’étude de l’activité protéolytique et la conservation des souches.


Lait écrémé 10g

Extrait de levure 0,5g


pH 6,8

Autoclavage 120°C pendant 20min

Documents

Etude du potentiel des bactéries lactiques pour leur ... · Volet 2: La caractérisation de nouvelles souches de bactérie lactique productrices de bactériocines et de développer