Etude du systeme acridine orange - poly(C) et de son interaction avec les complexes du palladium(I1)

ROBERT MENARD ET MIKLOS ZADOR De'portement de Chimie, Universitk de Montre'al, C.P. 6210, Succ. A. Montre'nl (Que'.), Canndcl H3C 3Vl

Requ le 6 dtcernbre 1983

ROBERT MENARD et MIKLOS ZADOR. Can. J . Chern. 62, 168 1 (1 984) Le cornplexe form6 entre l'acridine orange (AO) et I'acide polycytidylique (poly(C)) a CtC Ctudit par spectrophotomCtrie et

spectrofluorimttrie. Le cornplexe a C t t caracttrisC par sa stoechiornttrie, sa structure et les pararnktres therrnodynarniques de sa formation. Les rtsultats sont en accord avec une agrCgation externe des rnolCcules protonCes de colorant le long de la chaine du poly(C) chargCe nigativernent et indiquent qu'environ deux rnolCcules d'AO peuvent se fixer, par unit6 de nucltotide, au poly(C). La cinCtique de la rCaction de ce cornplexe avec un cornplexe de Pd(1l) a CtC ttudite par la rntthode du flux-stoppt. L'addition de (dien)Pd(II) au cornplexe AO-poly(C) conduit a la dissociation de celui-ci, due i la fixation du complexe de Pd(I1) au site N3 de la base cytosine du poly(C). La constante de vitesse de libtration de I'AO, extrapolte h une concentration d'AO nulle, correspond a la constante de vitesse pour la fixation du (dien)Pd(Il) sur le poly(C). Ceci indique que I'AO peut etre utilisC cornrne indicateur lors de cette reaction et perrnet de rtaliser I'Ctude cinttique a des concentrations tres faibles ( 1 5 x M).

ROBERT MENARD and MIKLOS ZADOR. Can. J . Chern. 62, 168 1 (1984). The complex formed between acridine orange (AO) and polycytidylic acid (poly(C)) was studied by spectrophotornetry and

spectrofluorornetry. The complex was characterized by its stoichiornetry, structure, and the thermodynamic parameters of its formation. The results are in agreement with an external aggregation of the protonated dye along the negatively charged poly(C) chain and indicate that approximately two A 0 molecules are bound per nucleotide unit of poly(C). The kinetics of the reaction between this complex and a Pd(I1) complex was studied by the stopped-flow method. The addition of (dien)Pd(II) to the AO-poly(C) complex leads to the dissociation of the latter, due to fixation of the Pd(1I) complex to the N3 site of the cytosine base of poIy(C). The rate constant for the A 0 liberation, extrapolated at zero A 0 concentration, corresponds to the rate constant of Pd(I1) fixation on poly(C). This indicates that A 0 can be used as an indicator for this reaction and allows kinetic studies at very low concentrations ( 1 5 X M).

Introduction L'acridine orange (AO) et la proflavine (PF) sont tous deux

des agents mutagenes (1,2), ce qui est gintralement attribut a leur interaction avec les acides nucltiques. L'activitC biologi- que de ces colorants basiques et le fait que la plupart des d i r iv t s de l'acridine sont fluorescents sont les raisons qui expliquent l'immense intCr&t port6 envers ces molCcules. Plusieurs etudes ont CtC effectuees sur l'interaction entre les acridines et les acides nuclCiques (3-7) ou d'autres polynucleotides et poly- Clectrolytes synthetiques (8- 16).

I1 existe principalement deux types d e liaison entre 1'AO (ou la PF) et les polynucltotides. Le premier type correspond a l'empilement des molecules d e colorant le long de la chaine, mais a l'exterieur des helices (8). Le deuxieme type implique l'intercalation du colorant entre deux paires d e bases d'une double htlice (17). On observe aussi dans certains cas, comme en prtsence d'un polynucleotide 2 simple brin comme 1'ADN denature, une intercalation partielle (18). L'importance relative de ces complexes depend de la structure du polymere (double hilice, simple helice; natif, denature), du rapport [polynuclCo- tide]/[colorant] , de la force ionique, etc.

Ce travail est consacre 2 l ' t tude de l'interaction entre un polynuclCotide a simple brin, l'acide polycytidylique (poly(C)) et l'acridine orange. Cette interaction nous inttresse en vue de l'utilisation de 1'AO comme indicateur lors d e l'etude cinktique de reactions entre des polynuclCotides et divers complexes d'ions mttalliques tels ceux du Pd(I1) et du Pt(I1). La faible solubilitt des polynuclCotides ou des complexes form& est souvent la source de nombreux problemes rencontrts lors de 1'Ctude de ces rtactions. L'utilisation d'un colorant fluorescent permettant de travailler 2 tres faible concentration peut donc possiblement ouvrir la voie a de nombreuses etudes cinetiques quantitatives de ces systemes.

La fluorescence d e 1'AO a d6ja t t t utilisCe avec succes pour ktudier la rtaction entre 1'AO et I'ADN a des concentrations tres basses (19). Dans le cas present, 1'AO est utilist unique- ment comme indicateur pour permettre la determination h e s parametres cinetiques de la reaction entre le poly(C) et des complexes du Pd(l1). Pour vtrifier la validite d'une telle mttho- de , la caractkrisation du complexe AO-poly(C) et de son inte- raction avec le complexe du Pd(I1) est indispensable.

Partie experimentale L'acridine orange (dimtthylamino-3,6 acridine) a t t t obtenu sous

forrne de I'hydrochlorure de Eastman Kodak Co. et la proflavine (diamino-3,6 acridine) de Sigma Chemical Co. sous forme d'htrnisul- fate. L'AO et la PF ont t t t recristallists plusieurs fois de rnClanges mtthanol-tther (- 1 : 3) et ethanol-eau ( 1 : I) respectivernent.

L'acide polycytidylique (poly(C)) provenait de chez Sigma Chemi- cal Co. et l'acide polyadtnylique (poly(A)) de Miles Laboratories Inc. Tous deux sont des produits de haute purett et furent utilists sans purification supplCrnentaire. Le [(dien)PdCl]Cl (dien: diCthyltne- triamine) a CtC synthttisC selon une rntthode Itgerement rnodifiee de celle dtcrite dans la litttrature (20). Le cornplexe [(dien)Pd(H20)]- (NO& a ttC prCparC en precipitant les chlorures d'une solution de [(dien)PdCI]CI sous forme de AgCl par addition de AgN03. Le prt- cipitt est retirt par filtration et la solution arnente a un volume connu.

L'AO et la PF sont photosensibles et peuvent en plus s'adsorber sur le verre et le quartz. Pour ces raisons, des prCcautions particulieres ont CtC prises pour s'assurer de la fiabilitt de nos rCsultats. Les solutions meres de colorant ont CtC conservCes dans des bouteilles opaques en Teflon noir a 6°C. Dans ces conditions, les colorants ttaient stables pendant plusieurs sernaines. Les solutions diluCes ont t t t fraichernent prtpartes et gardCes a l'abri de la lumiere. La verrerie normalement utilisCe a CtC rernplacke par du mattriel de plastique. Les ballons jaugts, bCchers et pipettes ttaient en polypropyl6ne et les cuvettes pour la spectrophotomttrie en polystyrene transparent (Sarstedt Canada Inc.). Le seul contact avec du verre se produisait lors de

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I'ajustement du pH oh des Clectrodes en verre furent utilisCes. Les spectres d'absorption ont CtC enregistrCs i l'aide d'un spectro-

photomktre Perkin-Elmer modkle 552 tandis qu'un fluorimktre Fluo- rispec modkle SF-I de Baird-Atomic Inc. a CtC utilisC pour les mesures de fluorescence. La cinktique des rCactions entre le complexe AO-poly(C) et (dien)Pd(lI) a CtC suivie par spectrophotomCtrie a flux-stoppC au moyen d'un Dionex modkle D-130 combine a un sys- tkme d'acquisition des donnCes construit dans notre laboratoire (21). Les constantes de vitesse d'ordre deux ont CtC obtenues par traitement de moindres carrCs de 1'Cquation intCgrCe correspondante.

Toutes les mesures ont CtC effectukes 21 pH 7 et 25°C sauf lorsque spCcifiC autrement. Dans ces conditions, I'acridine orange est proton6 (pK, = 10,2) et les groupements phosphate des polynuclCotides sont chargCs nCgativement (pK, = 1 (22)).

Resultats L'Ctude spectrophotometrique montre que, comme pour la

dimerisation, la fixation de I'AO sur le poly(C) s'accompagne de variations dans les spectres d'absorption et de fluorescence. Les spectres d'absorption pour I'AO seul et un prCsence de concentrations croissantes de poly(C) sont illustrCs a la figure l(a). On remarque l'absence de point d'isoabsorbance (isosbes- tique), ce qui indique la prCsence de plus de deux espkces en solution.

Dans le cas de I'AO seul (courbe 1) on observe deux maxi- mums dans la rCgion du visible: un premier ?i 492 nm attribuC au monomkre libre en solution et un deuxikme. sous forme d'un kpaulement ?i environ 465 nm, qui prtdomine dans les solutions d'AO ?i concentration ClevCe, attribue au dimkre (AO)? (5, 8, 23). Lors de l'addition de poly(C), ces bandes diminuent d'in- tensitk (courbes 2-4), indiquant I'interaction avec le poly(C). A concentration en poly(C) ClevCe (courbe 4) on distingue clairement I'apparition d'une nouvelle bande vers 438 nm et on l'attribue a I'agrCgation de 1'AO sur la chaine du poly(C) (5, 8). La position de cette bande exclue I'intercalation pour laquelle le maximum devrait se situer, d'aprks la littkrature, vers 502 nm (7). L'addition du poly(C) a 1'AO entraine aussi une dC- sactivation de fluorescence a 530 nm sans dCplacement du maximum (Fig. l(b)). L'intercalation conduirait plut6t ?i une augmentation de fluorescence ( 19).

Les variations d'absorbance ont Ctt CtudiCes en fonction du rapport p = [poly(C)]/[AO] ([poly(C)] exprimCe en mol L-' d'unitC de mononucltotide), de I'aciditC et de la force ionique pour caracteriser le complexe forme, notamment sa stoechio- mCtrie, sa structure et les paramktres thermodynamiques de sa formation.

Premikrement, on remarque que le complexe AO-poly(C) est fortement influencC par la force ionique de la solution. L'absorbance a 492 nm de la solution contenant le complexe AO-poly(C), a un rapport p = 1,0, augmente considerable- ment lors de l'addition de NaN03 (ou de NaC1) (Fig. 2(a)). Ceci indique I'apparition d'AO libre provenant de la dissocia- tion du complexe. Ce comportement est caracteristique aux complexes de type externe dont la formation est due aux inte- ractions Clectrostatiques des ions positifs avec les sites phos- phate de la chaine chargts nkgativement (5, 8).

Un effet spCcifique apparait lors de I'addition d'ions Mg2+ ?i force ionique constante. Dans ce cas, la dissociation du com- plexe AO-poly(C) apparait pour de petites quantitks de MgClz ajoutC (-0,01 M) malgre une force ionique relativement ClevCe de 0 , l M (Fig. 2(b)). Cet effet est attribuk i la fixation prkfe- rentielle (compare aux ions Na'.) d'ions Mg" par les sites phosphate.

Comme on peut le voir sur la figure 2(c), l'addition du

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FIG. 1. Spectres d'absorption (a) et de fluorescence (b) de l'acri- dine orange diverses concentrations de poly(C) ajoutC. Conditions: (a) A 0 5,O x 10-'M, NaNO, 0,009 M, NaCl0,OOI M, pH 7, poly(C) ajoutt: (1) 0 , (2) 1,5 X lo-' M, (3) 2,5 X M, (4) 5,O X M; (b) A 0 1,O x lo-' M, A,,, = 490 nm, pH 7, poly(C) ajoutt: (1) o, (2) 5 ,o x I O - ~ M, (3) I ,O x M.

complexe (dien)Pd(H20)'+ entraine Cgalement la dissociation du AO-poly(C) et ceci i des concentrations beaucoup plus faibles M). Cependant, dans ce dernier cas l'effet est indirect et provient de la fixation de (dien)Pd(II) sur le site N3 de la base cytosine. I1 est connu que la fixation du (dien)Pd(II) se fait sur le site N3 dans le cas de la cytidine (24). Lors de cette reaction la bande ?i X = 268 nm, correspondant au groupe cytosine, subit une augmentation d'intensitC et un lCger dtpla- cement vers le rouge. Les mCmes phCnomknes sont observes dans le cas du poly(C) et il est permis de supposer que le mCme site N3 soit implique. La fixation du (dien)Pd2+ conduit ?i la diminution du champ Clectrique de la chaine phosphate chargCe nkgativement et entraine la liberation de 1'AO. Le m&me effet a CtC observk en fluorescence. Dans les deux cas, I'addition de concentrations suffisantes de (dien)Pd(H20)2+ conduit au spec- tre de 1'AO libre. Des tests effectuCs montrent que l'addition de (dien)Pd(II) n'influence pas les spectres d'absorption et de fluorescence de 1'AO en absence de poly(C), ce qui indique

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[(d ien) P~(H,o)~*] ( ~ o - ~ M )

FIG. 2. Variations de I'absorbance A 492 nrn du systkrne AO- poly(C) lors de l'addition de NaN03 (a), MgCI, (b) et [(dien)Pd- (H20)](N03)2 (c). Conditions: (a) A 0 = poly(C) = 1,O X M, pH 7 ; (b) A 0 = poly(C) = 1 ,O X M, force ionique constante (0,l M, ajustCe avec NaN03), pH 7; (c) A 0 = poly(C) = 2,O X M, force ionique constante (0,l M NaN03), pH 7.

l'absence d'interaction Pd(I1) - A 0 L'augrnentation de l'aciditC du milieu s'accornpagne de

I'augmentation de l'absorbance a 492 nm. A pH bas (<2) le spectre et I'absorbance correspondent a ceux de 1'AO libre. La protonation du poly(C) au site N3 de la cytosine conduit donc, de la m&me f a ~ o n que lors de la fixation du (dien)Pd(II), a la dissociation du cornplexe AO-poly(C). La courbe de titrage spectrophotomCtrique ne correspond pas un tquilibre acide-base simple. Les Ccarts se situent surtout entre pH 4 a 6 et peuvent &tre attribuCs la formation de la double htlice du poly(C) semi-protont.

Les variations d'absorbance en fonction du rapport p sont prCsentCes a la figure 3. On observe une diminution graduelle d'absorbance jusqu'a p = 1, ensuite l'absorbance ne varie pratiquernent plus. L'allure de la courbe rnontre qu'h l'addition des prernikres quantitCs de poly(C) (p 5 0,4), la diminution d'absorbance est plus rapide que celle prtvue pour un com- plexe, m&me trks stable, de stoechiornttrie 1 : 1. Par exemple,

FIG. 3. Titrage spectrophotornttrique a 492 nrn de 1'AO par le poly(C). Les points representent les rtsultats exptrimentaux et la ligne continue, la valeur calculte (voir texte). Conditions: A0 2,00 x M, NaCl O , 1 M, pH 7.

pour p = 0,381 I'absorbance est abaissCe de 0,845 2 0,455 alors que pour le complexe 1 : 1 stable on calcule une valeur de 0,603. Ce phtnornkne est aussi visible sur les spectres de la figure l(a). Ceci rnontre clairernent qu'il y a plus d'une mole- cule d'AO fixCe par unit6 de nuclCotide dans ces conditions (excks de 1'AO).

Les paramktres therrnodynarniques de l'interaction AO- poly(C) ont CtC dCterminCs en utilisant le rnodkle de Schwarz (25) qui a Ctt appliquC avec succks a l'interaction de colorants acridines avec l'acide L-glutarnique (1 1, 12) et d'autres poly- anions IinCaires prtsentant des sites de liaison Cquivalents (14, 15).

D'aprks ce rnodkle, on reprCsente par g le nornbre de sites de liaison d'AO par unit6 de nuclkotide du poly(C). Deux cons- tantes d'Cquilibre sont utilistes, K+ pour le processus de nuclkation c.-a-d. fixation d'une molCcule d'AO sur la chaine et K pour le processus de croissance d'agrkgat impliquant l'em- pilernent de molCcules d'AO sur des sites adjacents de f a ~ o n coopCrative. Le facteur de coopCrativite q est defini par q = K/KSI. Cette coopCrativitC est due a I'interaction de molCcules d'AO voisines, stabilise l'agrCgat et favorise sa croissance. Ce phCnornkne est important dans le cas de 1'AO tel que rnontrC par sa constante de dimkrisation ClevCe en solution aqueuse (12, 23).

Le titrage spectrophotomCtrique a CtC effectuC pour des rap- ports [poly(C)]/[AO] assez petits (p 5 2). Dans ces condi- tions, le systkme peut &tre dtcrit convenablement en utilisant seulement K et g. Les variations d'absorptivitt molaire a A = 492 nrn sont dues a des variations des fractions de chaque espkce en solution lors de l'addition du poly(C). L'additivite de l'absorbance et les bilans de rnatikre des espkces en solution conduisent, d'aprks Schwartz et al. (1 l ) , a I'Cquation [I]:

ou E, E,, ed, E,,: absorptivitis molaire expirimentale, du mono- rnkre libre, du dimkre libre et du complexe AO-poly(C) res- pectivement; Kd: constante de dimkrisation de 1'AO; c;: concentration totale d' AO; Fa: concentration de monornkre libre a 1'Cquilibre; 7, = T,/C;: fraction des rnolCcules d'AO sous forme de monomkre a 17Cquilibre.

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La f a ~ o n de dCterminer les divers parametres de cette Cqua- tion ainsi que la valeur de g est 1Cgerement differente des methodes graphiques utilisCes par Schwarz. En Ctudiant la di- miirisation de 1'AO en fonction de sa concentration, e,, ed et K d peuvent Ctre CvaluCs. Des valeurs de E, = 57 900 L mol-' cm-I, ed = 5000 L mol-' cm-' et K d = 1,5 X lo4 M-I ont CtC obtenues. La valeur de E,, est dCterminCe sur la figure 3 en prenant E,, = E pour p -, m, soit 10 400 L mol-' cm-'. Connaissant K d et les valeurs des diverses absorptivitks molaire on peut calculer y,, par llCquation [ l ] , pour diverses valeurs de p en utilisant les risultats expCrimentaux.

On doit ensuite dCterminer le parametre g dont la connaissan- ce est nCcessaire pour l'obtention de la constante d'tauilibre K. On peut obtenir g a partir de la variation de y$en fonction du rapport p. yz reprCsente la fraction totale d'AO non-lie au polymkre (monomkre ou dimere libres) et est donne par l'equa- tion [2]:

La loi de la conservation de la matiere relie y$ a p par I'Cquation 131:

oh 8: fraction des sites de liaison occupes par I'AO a l'kquili- bre. Comme en presence d'un grand excks d'AO (valeurs de p faibles) on tend vers 8 = 1, on peut obtenir g comme la pente de la droite y$ vs. p passant par les premiers points. Les rCsul- tats conduisent 2 g = 2,05 pour le systkme AO-poly(C). Cette valeur implique qu'il y a plus d'un A 0 qui se lie par unite de nuclCotide sur le poly(C).

La determination de la constante d'kquilibre K a CtC effectuie par simulation B l'ordinateur. Cette constante est definie par l'equation [4].

oh F,,: concentration du complexe AO-poly(C) a l'equilibre; Zp: concentration du poly(C) libre a l'equilibre. En rempla~ant I?,, et F, par leurs valeurs en termes de F, et en rearrangeant 1'Cquation resultante, on obtient:

oh cg concentration totale de poly(C). La mCthode de simulation consiste B rCsoudre cette equation

du troisikme degre pour une valeur de K 2 diverses valeurs de c:. Les valeurs de I? , et donc de 7, ainsi obtenues sont introdui- tes dans 1'Cquation [ l ] ce qui conduit a la courbe calculee de 6 vs. p. ~ e l l e l c i est ensuite comparie B l'ensemble des rksultats expbimentaux. DiffCrentes valeurs de K conduisent i d e s cour- bes diffkrentes. Tel que montre par la figure 3, l'accord entre la courbe calculee et les points expkrimentaux est excellent pour K = 1,3 X lo6 M-I. Des accords nettement moins bons sont obtenus pour des valeurs de K de 1 X lo6 M-' et 2 X lo6 M-' ce qui montre la sensibilitC de la mCthode.

L'interaction du poly(C) avec la proflavine a CtC CtudiCe de facon similaire. Comme l'interaction n'est pas suffisamment fohe a une force ionique de 0 , l M, ces expeiiences ont du Ctre effectuCes a force ionique beaucoup plus basse (0,001 M). Les rCsultats sont donnes au tableau 1. Les valeurs de ed et Kd pour la proflavine ont etC tirCes de la IittCrature (11). 11 n'est pas nicessaire de connaitre avec prkcision ces deux parametres B

TABLEAU I. Pararnktres therrnodynarniques de divers systkrnes colorant - polynuclCotide

CL g K Systkrne ( M I (M- ' )

cause de la trks faible quantite de dimere present dans le cas de la PF dans ces conditions, dC B la faible valeur de K d (-525 M-I). A titre de comparaison, le complexe AO-poly(A) a aussi Cte CtudiC. Les resultats sont rCsumCs au tableau 1.

La cinCtique de la rCaction entre AO-poly(C) et le complexe de Pd(I1) a ensuite Cte CtudiCe et comparee B la reaction entre le poly(C) et (dien)Pd(II) en absence d'AO. Dans ce deuxieme cas, la reaction a CtC suivie en Ctudiant l'augmentation d'absor- bance de la bande a h = 268 nm du poly(C) lors de la fixation du complexe de Pd(I1). Les concentrations de poly(C) et de (dien)Pd(II) Ctaient de 5 X M et 2,5 X M respective- ment en absence d'AO et de 5 x M et 2,5 x M en presence de 1'AO. I1 est a noter que I'utilisation de 1'AO permet de travailler a des concentrations 10 fois plus faibles qu'en absence de colorant. Ces mesures ont CtC faites en absorbance pour des raisons pratiques. On peut prevoir cependant qu'en utilisant la fluorescence de 1'AO on pourrait descendre a concentration encore plus basse.

Ces rCactions ont CtC CtudiCes a force ionique constante (p = 0, I M) , pH 7 et B deux concentrations en ion chlomre diffkren- tes (0,001 M et 0,01 M). Le complexe de palladium est sous forme de (dien)Pd(H20)If B trks faible concentration en chloru- re et sous forme de (dien)PdClf en presence de concentrations en chlorure plus Clevees. L'espkce (dien)pd(H2O)'' est plus rkactive que le (dien)PdClf . Aucune reaction n'a CtC dCtectCe entre les complexes de Pd(I1) et 1'AO. Les rCactions sont reprG sentees par les equations [6] et [7]:

Les valeurs de kAo obtenues sont legkrement plus faibles que les valeurs de k correspondantes et diminuent avec l'augmenta- tion de la concentration de 1'AO. Ceci est attribuable au fait que 1'AO est chargC positivement et sa fixation sur le poly(C) neutralise les charges negatives du poly(C). L'interaction favo- rable entre le poly(C) nCgatif et le (dien)Pd(II) positif perd donc de l'importance lorsque la quantite d'AO fix6 sur le poly(C) augmente ce qui conduit a une diminution de la vitesse de reaction. Cependant, une extrapolation lineaire a [AO] = 0 donne des valeurs de constante de vitesse tres prks de celles obtenues en absence d'AO. Ces valeurs sont donnCes au ta- bleau 2.

La constante de vitesse de la rCaction entre (dien)Pd(II) et le poly(C) a pH 4,5 ne peut &tre determinee 2 cause de la faible solubilitC du produit a ce pH. Cependant, avec 1'AO comme indicateur, la reaction a pu Ctre Ctudiee. La constante de vitesse ainsi obtenue 2 pH 4,5 est environ 12 fois plus faible que pour la mCme rCaction a pH 7 (900 M-' s-' a pH 4,5 vs. 1 1 000 M-' s- ' ?i pH 7). Ceci est attribuable a deux facteurs principalement: ( i ) l'influence defavorable de la protonation sur les sites N3 et (ii) la structure secondaire particuliere, B pH 4,5 (26), impli- quant une double helice due a la formation de ponts hydrogkne

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TABLEAU 2. Constantes de vitesse des reactions avec et sans indicateur

[Cl-l k:o k ( M ) (M- ' s-I) (M-' S - I )

0,001 2,2(+0,4)x 10' 2,3(+0,2)X 10" 0,010 i , i ( + o , i ) ~ 104 I ,o(+o, 1 ) ~ 10'

*Les valeurs de kAn sont extrapolees, cornrne dtcrit dans le texte.

entre les sites N3 protonCs d'un brin et les sites non-protonCs de l'autre.

Discussion L'interaction du poly(C) avec I'acridine orange se decrit trks

bien en considkrant uniquernent la formation de complexes externes impliquant l'interaction Clectrostatique du colorant proton6 avec les sites phosphate. La possibilitC de contact Ctroit entre 1'AO et les bases cytosine est 5 toute fin pratique a Clirniner si on considkre, d'une part, l'absence de la bande caractkristique de ce type d'interaction a A = 502 nrn dans le spectre d'absorbance et, d'autre part, l'absence d'exaltation de fluorescence 530 nrn caract~rist i~ue de l'intercalation. La dksactivation de fluorescence observCe a CtC, en gCnCral, relike a la formation du complexe externe comme le sont l'hypochro- micitC et l'effet hypsochrome (blue shift) observCs pour les mesures d'absorbance.

Ces phknornknes sont dus a la structure secondaire du poly- (C), qui est simple hClice et, en partie, au fait que les bases pyrirnidiques, telle la cytosine, offrent un recouvrernent moins favorable avec le colorant polyarornatique que les bases puri- aues.

L'influence de divers facteurs expkrirnentaux tels la force ionique, la presence d'ions Mg2+ et de complexes de Pd(II), indique que l'interaction est due, au rnoins en partie, a des forces de-type Clectrostatique entre la chaine cha rg~e negative- rnent et I'AO proton6 charge positivernent.

Toutefois la valeur ClevCe des constantes d'kquilibre, corn- parCe a celles d'ions rnktalliques, montre qu'il -y a un terme important dans 1'Cnergie libre totale dd a l'interaction entre rnolCcules de colorant voisines. Ceci produit un effet coopCratif contribuant i renforcer l'interaction. Cette stabilisation supplC- mentaire est particulihernent irnportante dans le cas de 1'AO qui posskde une forte tendance former des agrCgats en solu- tion. Ceci explique, par exernple, qu'il faut une concentration ClevCe d'ion Mg2+ (-0,01 M ) pour dCplacer significativement des sites phosphate 1'AO qui est a une concentration de loin infkrieure M) mEme si, i cause de sa charge +2, le Mg2+ devrait avoir une interaction Clectrostatique plus forte que 1'AO.

L'importance de l'interaction entre molCcules de colorant sur la stabilitC du complexe colorant-polynuclCotide est aussi mi- se en Cvidence lors de 1'Ctude du systkme PF-poly(C). La proflavine est un colorant qui a une constante dlCquilibre de dirntrisation beaucoup plus faible que 1'AO. En condquence, l'interaction de cycles voisins sur le poly(C) apporte peu de stabilitC supplCrnentaire au cornplexe formC. Ceci explique qu' i une force ionique de 0 , l M, le cornplexe PF-poly(C) ne se forme pas tandis que dans le cas de 1'AO il se forrne facile- rnent. Pour avoir un cornplexe PF-poly(C), il faut descendre B force ionique beaucoup plus faible (0,001 M) afin d'accroitre la force de la liaison Clectrostatique et stabiliser ainsi le

complexe. La tendance a l'agrkgation de 1'AO se reflkte aussi dans la

valeur de g obtenue pour le systkme AO-poly(C). En effet, celle-ci indique qu'il y a environ deux molecules d'AO fixCes par unit6 de nuclCotide sur le poly(C). Cependant, pour le systkrne AO-poly(A), a la m&me force ionique, une valeur de g = 1,40 a CtC obtenue. Ceci est dC1 au fait que la structure des polymkres irnpliquks influence beaucoup la stoechiomCtrie des complexes form&.

Bradley et Wolf (8) ont dCjh proposC que l'agregation serait plus irnportante pour les polyrneres pouvant assurner des posi- tions optirnales, permettant une meilleure interaction entre les cycles de colorant voisins. La distance entre deux bases ~onsC- cutives dans la direction de l'axe, a pH 7, est de 3.98 A pour le poly(C) (27) et 3.5 A pour le poly(A) (28). Ceci est une consCquence du fait que l'interaction d'empilernent entre deux bases adenine est supkrieure a celle entre deux cytosines a cause de la plus grande surface des bases puriques. Pour la mEme raison, le poly(C) est probablernent aussi plus flexible que le poly(A) et peut, a cause de ces caracteristiques, accorn- moder un plus grand nombre de rnolCcules d'AO le long de sa chaine que le poly(A). En fait, les spectres visible sont aussi diffkrents et la bande a 438 nrn est absente dans le cas du poly(A) ou seule la bande a A = 465 nm apparait. Ceci indique un mode de recouvrement diffkrent, probablement moins im- portant, dans le cas du poly(A).

I1 est 5 noter que d'autres chercheurs ont obtenu une valeur de g = 1 pour le sy steme A 0 - poly(A) en absence d'Clectroly te ajoutC, ce qui peut Etre expliquC par la rCpulsion trop irnpor- tante de rnolCcules voisines dans ces conditions. Nos rCsultats a force ionique ClevCe (0,I M) ne peuvent pas Etre dCcrits en considkrant une valeur de g = 1.

L'AO posskde donc les propriCtCs recherchCes au dCpart pour son utilisation cornrne indicateur. L'absorbance de ce colorant est assez ClevCe pour nous perrnettre de travailler a faible concentration ce qui est encore plus vrai lorsqu'on utilise la fluorescence. I1 se lie au poly(C) avec un spectre d'absorban- ce et de fluorescence diffkrents de ceux de 1'AO libre en solu- tion. En plus, le colorant proton6 est inerte envers le palladium.

Lors de 1'Ctude de la cinttique de la rtaction entre le poly(C) et le complexe de Pd(II), par l'entremise de l'indicateur, on peut suivre les variations dans le spectre de 1'AO en fonction du temps dues a sa libkration. Cependant, 1'Ctape lente du processus doit Etre la rCaction du Pd(1l) sur le poly(C) et non la dissociation du complexe AO-poly(C), ce qui a CtC dCrnon- trC, Ctant donnC que la valeur de la constante de vitesse extra- polCe i [AO] = 0 ( k A O ) est en accord avec celle obtenue sans indicateur. La formation et la dissociation du cornplexe AO-poly(C) sont trop rapides pour Etre observables par flux- stoppe et on peut prkvoir que la fixation du (dien)Pd2+ sur le site N3 de la cytosine accClkre encore la dissociation. Les polynuclCotides a plusieurs brins, tels l'ADN, perrnettent l'in- tercalation de plusieurs colorants. Dans le cas du brornure d'kthidiurn, un colorant souvent utilisC, la formation du com- plexe intercalk est inhibee par les complexes du Pt(I1) (29), ce qui est attribuC a l'interaction de ceux-ci avec les sites azotCs. Ce colorant peut Cgalement servir a 1'Ctude de compCtition avec des ions mktalliques (30). Cependant, l'intercalation produit une perturbation des sites basiques de la double-hClice. Pour cette raison l'AO, formant un cornplexe externe, le seul observC dans le cas du poly(C) 2 simple brin, est un indicateur plus avantageux pour l'etude de la fixation d'ions mktalliques sur les polynuclCotides.

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La prCcision de cette mCthode faisant appel a 1'AO (-10-20%) est suffisante pour Ctudier des variations impor- tantes de rCactivitC tel qu'illustri par le changement dO 2 la protonation des sites N3 2 pH 4.5. La mCthode peut avoir des applications intkressantes dans la caracterisation cinCtique de riactions impliquant des molecules peu solubles ou de celles se dCroulant sans variation de propriCtC physique facilement mesurable.

Remerciements Nous tenons 2 remercier le Conseil de recherches en sciences

naturelles et en gCnie du Canada et le Fonds F.C.A.C. (QuC- bec) pour l'aide financikre et les bourses dlCtudes suptrieures (R.M.) accordCes.

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