Étude, par diffusion centrale des Rayons X, des polyelectrolytes rigides en solution. Cas des sels de Li, Na et Cs du DNA

BIOPOLYMERS VOL. 5, PP. 491-508 (1967)

Etude, par Diffusion centrale des Rayons X, des Polyelectrolytes rigides en Solution.

Cas des Sels de Li, Na et Cs du DNA

VITTORIO LUZZATI, F. MASSON, A. MATHIS, et P. SALUDJIAN, Laboratoire de Gdndtique Physiologique,

C.N.R.S., Gif-sur-Yvette, et Centre de Recherches sur les Macromoldcules, Strasbourg, France

Synopsis

The study of polyelectrolytes in solution by small-angle x-ray scattering techniques involves special problems, raised by the presence of several species: solvent, macroions, counterions, and possibly the ions of an additional electrolyte. A theoretical treatment of this problem is developed, based upon geometric concepts; the treatment applies to globular and to rodlike particles for the case of x-ray experiments carried out on an absolute scale. The equation obtained involves several parameters: mass and radius of gyration for globular particles; mass per unit length and axial radius of gyration for rodlike particles; partial specific volumes of the neutral macromolecular component of the counterions and of the added electrolyte; solvation of the macromolecular species; fraction of the counterions osmotically free. The equation is used to interpret a series of experiments performed with the Li, Na, and Cs salts of DNA in solution in water containing variable amounts of the chlorides of each cation. The effects of concentration are first eliminated by extrapolating to infinite dilution the experiments carried out a t different concentrations; then the effects of the solvation are eliminated by extrapolating to pure water the results obtained a t different electrolyte concentration. The parameters still involved a t this stage are the mass per unit length, the partial specific volumes of the DNA and of the counterions, and the fraction of the counterions osmotically free. If the partial specific volumes are chosen in agreement with other data of the literature, and if the fraction of the counterions osmotically free is assumed to be 0.30 for the three salts, as suggested by other workers, the structure of the DNA molecules turns out to be the same for three cations, and to agree with the Watson- Crick model. These results are confirmed by the study of the liquid-crystalline gels, obtained at higher concentration, that lead to a direct determination of the mass per unit length of the rods. Moreover the solvation of the DNA molecules is determined as is shown to be different for each of the three cations. These results are in excellent agreement with those obtained by other techniques.

INTRODUCTION

L’6tude des polyblectrolytes en solution, par diffusion des rayons X aux petits angles, pose quelques problhmes inherents BU nombre, A la nature et aux interactions des esp&ces en presence. En plus du solvant et des macroions, il est nQcessaire de tenir compte des contreions; en outre il faut souvent

491

492 LUZZATI, MASSON, MAL’HIS, SALUDJIAN

prendre en consideration la distribution des ions d’un electrolyte ajout6 B la solution afin d’attenuer les interactions entre les macroions.

Nous avons rencontr6 un probkme de ce type dans l’6tude du NaDNA, en solution dans l’eau sal6e;’ pour rendre compte des observations exp6ri- mentales nous avons admis que chaque bhtonnet de DNA est entour6 d’une couche d’eau de solvatation inaccessible au sel.

Nous avions abord6 ce probleme avec I’espoir de mettre en evidence un effet possible de la nature du cation sur la structure du DNA. Or, dans ce cas, l’interpretation des donnees exp6rimentales exige que le probl6me de la distribution des contreions soit clairement pos6. On peut postuler, en effet, que le DNA en solution se comporte comme une molecule neutre, c’est-&-dire qu’B chaque macroion est associ6e la totalit6 des contreions n6cessaires B assurer 1’6lectroneutralite : dans ce cas l’interpretation des donnees experimentales aboutit B la conclusion que lee bhtonnets de DNA s’allongent de 30% environ lorsque le Na est remplacE par le C S . ~ Si on admet, au contraire, que seulement une fraction des contreions est li6e aux macroions et que le reste est libre de se d6placer au sein du solvant, on peut rendre compte des observations experimentales sans faire intervenir une d6formation du DNA. Nous verrons plus loin que l’ensemble des donn6es exp6rimentales s’accorde bien mieux avec cette dernibre hypothese qu’avec la premiere.

Nous developperons dans ce memoire un traitement th6orique du ph6- nomene de la dsusion centrale des rayons X par un systeme B plusieurs composants que nous appliquerons aux systemes de plusieurs esphes ioniques, dans le cas des polyelectrolytes. Nous ddgagerons de ce traitement les differents parambtres qui jouent un r61e dans ce ph6nom&ne, et nous tbcherons de preciser l’int6r&t partique que peut presenter ce genre d’e‘tude.

Nous illustrerons enfin ces r6sultats theoriques par un ensemble d’ex- pkriences effectuees avec les sels de Li, Na et Cs du DNA.

Un cas plus critique s’est present6 lors de l’6tude de CsDNA.

PARTIE THEORIQUE

Notation

Nous adoptons ici la notation habituelle3 avec quelques compl6ments. Les symboles les plus importants sont les suivants.

rest le vecteur qui d6finit la position d’un point de 1’6chantillon: r est son module (A). s = 2 sin O/X oh 28 est l’angle de diffraction; X est la longueur d’onde (A). v = X27.9 X est une constante qui mesure l’6nergie coherente diffus6e par un electron isol6. est le nombre d’6lectrons de 1’6chantillon divis6 par sa surface (6lectrons par cmz). Eo est 1’6ne:gie totale du faisceau in~ iden t .~ V est le volume total de 1‘6chantllon (A3). p(r) represente la distribution de la densit6 6lectronique dans l’echantillon (dlectrons A--3); p est sa valeur moyenne. pa est la densit6 6lectronique du solvant.

DES POLYELECTROLYTES RIGIDES EN soLumoN 493

i(s) = 2 lm r (Jv[p(R + r) - p ] [ p ( R ) - p ]dvR S

oh {j”(R)) est la valeur moyenne de la fonctiori f(R), prise pour toutes les orientations du vecteur R, B module constant. ma est le nombre d’dec- trons d’une mol6cule de solut6. fi, (ou $,,) est le volume sp6cifique partiel en cm3/g (ou A 3 par Blectron). c (ou c,) est la concentration pond6rale, (ou la concentration 6lectronique) solutC/solution.

Dans le cas oh les mol6cules de solute ont la formeode bbtonnets, p a est la masse par unit6 de longueur de bbtonnet (6lectrons/A.).

Si en outre les bbtonnets sorit des polymeres B structure h6licoi’dale, h est la projection sur I’axe de l’hdice de la distance (en 8) entre deux mono- m6res cons6cutifs.

Dans le cas des polyClectrolytes, m,, $a, ce et p a se r6ferent 5 un macroion entierement neutralis6 par les contreions. On utilisera aussi les symboles suivants: y est le nombre de groupes ionisables d’une molecule de solute (lorsque le solut6 est un polym&re, le degr6 de polym6risation est propor- tionnel B y); m, est le nombre d’bleoctrons d’un contreion; $jc est le volume sp6cifique partiel des contreions (A3 par Blectron); @ est la fraction osmotiquement libre des contreions.

Diffusion centrale des Rayons X par les Solutions diluCes

Cas gdniral

Dans les conditions exp6rimentales habi tuelles, le pouvoir de rCsolution associe B la diffusion centrale des rayons X est de I’ordre de 10 Avec cette rBsolution, la densit6 Blectronique d’un liquide ou m6me d’une solution de mol6cules ou d’ions de petite taille, apparatt comme uniforme (sauf, bien entendu, au voisinage de conditions critiques) ; seule la presence de fluctuations de densite dlectronique 5 une Bchelle nettement sup6rieure au pouvoir de r6solution peut Btre la source de diffusion des rayons X aux petits angles.

L’intensit6 diffus6e I ( s ) est une fonction de la distribution des fluctuations de densit6 Qlectronique. En collimation ponctuelle, I ( s ) a la forme (voir notation et r6f. 3) :

I ( s ) = (VlllVP)EOi(S) (1)

( 2 )

En modifiant 1’6quation (1) on obtierit la fonction normee suivante:

i,(s) = I(s)/vqEo = i ( s ) /Vp qui est d’un emploi particulierement commode, car la premiere de ses ex- pressions est purement op6rationnelle, tandis que l’autre est une fonction de la distribution de la densit6 blectronique au sein de l’bchantillon, ind6- pendante des contingences expkrimentales. L’6quation ( 2 ) est valable dam des conditions tr6s g6n6rales.

Nous consid6rons maintenant le cas particulier suivant, auquel nous nous r6f6rerons dans la suite de ce travail: les JEuctuations de densi t i dec-

494 LUZZATI, MASSON, MATHIS, SALUDJIAN

tronique sont limitdes, dans l’espace, l’intdrieur de rdgions discr8tes, dont le uolume est petit devant le volume total de l’dchantillon; la densitd dlectronique est constante e n dehors de ces rdgions. Chacune de ces regions constit,ue une “particule.” Si 1’6chantillon contient N de ces particules, distribudes sans corr6lation en position et en orientation, i,(s) devient :

oc fj2(s) est la fonction i(s) relative B la particule j isolee (voir not,ation). Si, en plus, toutes les particules sont identiques,

i,(s) = Nfj“S)/VP

Lorsque les particules sont globulaires, c’est-&dire qu’aucune de leurs dimensions n’est grande devant (smin)-’ (s,in est la. limite infbrieure du domaine de s explorb), i,(s) a pour expression:

i,(s) = (N/Vp)(Am)2[1 - 4/3?T2R02S2 + * . - 1 (5)

oh Am et Ro sont le contenu total et le rayon de giration du contraste entre la densit6 dectronique d’une particule et celle du solvaiit.

(7)

(le vecteur r, dans 1’Bquation (7), a son origine au centre de gravite de la particule).

Si les particules ont la forme de bdtonnets longs et rigides, ayant tous, et B tout niveau, la meme section perpendiculaire B l’axe, i,(s) a pour expression :3

Ro2 = - j’ r2b(r) - poldz’, Am particule

i,(s) = A ( l - ~ T ~ R ~ ~ s ~ + . * . ) / 2 ~ (8)

A = (L/Vp)(Am/l)’ (9)

oh L est la longueur totale des bdtonnets de l’kchantillon, A?n la valeur de 1’6quation (6) relative B un seul bdtonnet de longueur 1 et R, le rayon de giration, autour de l’axe du bdtonnet, de la difT6rence entre la densit6 Blec- tronique du bAtonnet et celle du milieu exterieur.

Nous avons consid6r6, jusqu’ici, le cas oc la collimation est ponctuelle. En fait nos exp6riences sont effectuhes en collimation IiriBaire. L’Bquation normhe, analogue ?i 1’6quation (2) valable dans ce c ~ s , ~ est:

j ,(s) = I ( S ) / Y ? L E O = j(S>/VP (10)

Oil

DES POLYELECTROLYTES RIGIDES EN SOLUTION 495

Lorsque j n ( s ) est connu, il est possible, en gbnBra1, de d6terminer i,(s). En fait, dans la suite de ce travail, nous nous int6ressoris seulement aux valeurs de i,(O) et de Ro, dans le cas de particules globulaires, et aux valeurs de A et de R,, lorsqu’il s’agit de bbtonnets. Or il est facile de tirer i,(O) et Ro de jn (s ) .3 Pour des bbtonnets il a Bt6 montrB3 que j ( s ) a la forme suivante:

j ,(s) = A 1/2 exp { - T ~ R ~ ~ ~ ~ ] K ~ ( T ~ R ~ ~ ~ ~ ) (12)

I1 est donc facile de determiner A et R, lorsque j,(s) est connu.

Systbmes t~ plusieurs Composants

ConsidBrons le cas d’un 6chantillon qui contierit uii composaiit inacro- mol6culaire et plusieurs composants de petite taille, miscibles eiitre eux (par exemple deux liquides). Admettons, en outre, pour simplifier le traitement, que les macromolCcules sont toutes identiques si elles ont une forme globulaire, ou qu’elles ont toutes la m6me section traiisversale s’il s’agit de bbtonnets. La diffusion centrale des rayons X par un systcme de ce type dependra B la fois de la structure des macromol6cules et de la distribution des petites mol6cules autour des macromolhles.

Sous traitons ce cas en faisant l’hypothcse que l’khantillon contient encore des particules discr&tes, a u sens prk i sb ci-dessus. Nous admettons en outre que la densit6 6lectronique po, dans les rkgions exterieures aux particules, est 6gale B celle du systcme en absence de composants niacro- mol6culaires, approximation d’autant meilleure que la concentration en macromol6cules est plus faible.

Chaque particule, ou zone de densit6 Blectroriique perturbee, coiltierit une macromol6cule et une certaine quantit6 de chacun des autres composants qui lui est associBe. On mesurera le nombre m3 d’klectrons de ces derniers en fractions aj du nombre d’klectrons d’une macromol6cule

nz, = ajma (13)

Le nombre total d’klectrons. du contraste entre particule et solvant est [voir Bquation (6) ] :

Ant = %[(l - PO#,) -t h , ( l - PO#^)] = nz,P (14)

Si on remplace, dans 1’6quation (5 ) , Am par sa valeur t ide de I’kquation (14) et si on tient conipte du fait que c, mesure, par d6finitioi1, la conceii- tration en composant macromol6culaire, on obtient :

C , = Nln,/Vp (13

i,(O) = c,m,B2 (16)

Puisque in(0), c, et po sont ddterminBs, l’equation (16) permet de calculer la valeur de ma lorsque #a et les diff6rents a3 et #3 sont connus.


Au cas oh il s’agit de bAtonnets [voir Bquation (9)].

Cas d’un PoEySEectrolyte

Lorsque le composant macromol6culaire est un poly6lectrolyte qui se dissocie en solution en macroions et contreions de petite taille, il est n6ces- saire de tenir compte de la distribution des contreions autour du macroion. D’autre part, on Ctudie souvent les poly6lectrolytes en presence d’un 6lectrolyte afin d’attbnuer les corr6lations entre les macroions: il faut prendre en consid6ration’ dans ce cas, la distribution des ions de 1’6lectrolyte.

Envisageons d’abord le cas oh la solution ne contient que le polyhlec- trolyte et l’eau. En ce qui concerne la diffusion centrale des rayons X le problbme de la distribution des contreions peut &re pose dans les termes suivants: on cherche B limiter, autour de chaque macroion, la region B l’int6rieur de laquelle la densit6 6lectronique est differente de PO, valeur qu’elle prend partout ailleurs dans le solvant. En admettarit que des regions ainsi definies existent et que, B des concentrations en macroions suffisamment faibles, leur volume total est petit devant le volume total de 1’6chantillon, on peut encore se demander si elles contiennent la totalit6 des contreions necessaires pour neutraliser les charges des macroions, ou bieri seulement une fraction, le reste &ant distribu6 uniformement dans le volume exterieur B ces r6gions.

Analysons l’expression de i,(O) relative au deuxibme cas, le plus g6n6ra1, oh une fraction Q des contreions n’est pas li6e aux macroions. Formelle- merit le problbme est analogue B celui d’un systbme B trois composants et peut &re rbsolu B l’aide de 1’Cquation (16)’ m, et +, &ant des parambtres relatifs aux macromolecules neutres, m, et GC &ant le nombre d’6lectrons et le volume spCcifique partiel (voir plus loin) d’un contreion:

Si les macroions ont une forme de bbtonnets:

Admettons maintenant qu’en plus du polyklectrolyte et de l’eau, le systkme contient un Slectrolyte de petite taille e t supposons, comme dans les cas pr6c6dents) que’ les perturbations de la densit6 6lectronique sont limitees B l’int6rieur de particules discrbtes. Chaque particule oontient ici un macroion, une fraction ( 1 - @) des eontreions, et une quantit6 de solvant qu’on imagine impenetrable B 1’Clectrolyte et dont le nombre d’6lec- trons est m, = ama(a > 0). (Si, au contraire, le macroion manifeste une affinite pour 1’6lectrolyte, a est n6gatif.) Formellement le probkme est alors celui d’un systbme B plusieurs composants, et peut &re trait6 B l’aide


de 1’6quation (16). cette couche de solvant pur dont J., est le volume sp6cifique partiel:

I1 suffit d’ajouter b 1’6quation (1s) le terme relatif b

i,(O) = cema[(l - p 0 J . A - (@vw’ma>( l - ~o9J + ~l(1 - ~ o J . s > l ~

= cem&2 (20)

en se rappelant que po est dans ce cas la densit6 6lectronique du m6lange solvant pur-6lectrolyte.

Pour un macroion en forme de bktonnet :

A = ~ , / . 4 2 ~ (21)

I1 convient d’examiner les diff &rents param&tres qui figurent dans les Bquations ci-dessus. Les volumes sp6cifiques partiels des macromol6cules neutres (J.J ou du solvant (J.J peuvent &tre d6termin6s par des mesures picnom6triques. I1 n’en est pas de m&me pour les volumes specifiques partiels des contreions ( J . J : nous verrons plus loin comment on peut pallier B cette difficult6.

Diffraction des Rayons X par les Gels mQsomorphes En pr6sence de solvant, B des concentrations suffisamnient 6lev6es,

les mol6cules en forme de bAtonnets ont tendance ii former des gels m6so- morphes dans lesquels ces bbtonnets peuvent s’organiser selon un r6seau hexagonal B deux dimensions.’ Dam ce cas, les diagrammes de diffraction des rayons X contiennent, dans leur r6gion centrale, quelques raies fines dorit les positions permettent de determiner les dimensions de la maillr.

La surface de la maille Blementaire est :

(22) z

u = __ s ~ - ~ x 10-lG em2 v5 oh s1 est l’espacement de la premibre raie du r6seau hexagonal.

Si on suppose que les volumes sp6cifiques partiels des diff6rents composants sont indhpendants, la concentration en solut6 peut &re exprimhe par la relation suivante:

c = m/Z[m/Z + (u - V m / Z ) S ] - ’ (23)

oh in/Z est la masse par unit6 de longueur de la quantit6 de solut6 contenue dans une maille Qlementaire, 6 est la densit6 du solvant (en unites c.g.s.).

En Bliminant u entre les Bquations (22) et (23) on obtient 1’6quation suivante :

SI-’ X = 63/2(m/Z)( l /6) (c - ’ - 1 + 6V) (24)

qui est celle d’une droite ( S I - ~ en fonction de c-l) qui coupe l’axe des ab- scisses au point c-l = 1 - 6V, dont la pente est dsl-2/dc-1 = 4 3 / 2

I1 est clair que le choix du “solute” et du “solvant” est ici arbitraire, dam En

(mil> ( 1 /6).

la mesure oh les valeurs de m/Z, c, V , et p sont cohBrentes avec ce choix.


consequence 1’6tude des gels mesomorphes permet de determiner la valeur de m/l relative aux bdtonnents m&me dans le cas d’u polyelectrolyte, sans que la distribution des contreions perturbe les resultats: la presence d’electrolytes se manifeste seulement en modifiant la densite 6 du solvant.

APPLICATION AUX SELS DE Li, Na ET Cs DU DNA

Technique ExpQrimen tale

Les Echantillons

Les DNA de thymus de veau et d’erythrocytes de poulet nous ont 6th fournis par R4. J. Pouyet.

Les sels de Li et de Cs du DNA ont Bt6 prepares en dialysant des solutions de NaDNA contre des solutions de LiCl et de CsCl. Les sels obtenus sont precipites par l’alc001.~

Les Bchantillons destines % 1’Btude aux rayons X, qu’il s’agisse de gels mesomorphes ou de solutions isotropes, sont prepares en melangeant des quantites connues de fibres de DNA et d’eau sal6e. Les concentrations sont v6rifi6es par analyse de phosphore sur les Bchantillons recueillis aprZIs l’experience de diffraction des rayons X.

Dans tous les calculs ulterieurs nous admettons que le nombre d’electrons d’un monomBre du NaDNA, c’est-%-dire d’un residu nucl6otidique moyen, est 170 et que sa masse molaire est 330,9.

Les Volumes Spbccifiques partiels

Les volume specifique partiel du DNA n’est pas connu avec precision. Les donnees experimentales de &%DNA se placent autour de la valeur 0,55 ~m.~/g.’s~ Dans l’analyse des donnees expbrimentales nous accepterons ce fait: nous calculerons les valeurs des differents param8tres en faisant varier ~ ) N ~ D N A dans un petit intervalle autour de 0’55 cm3/g.

Pour chaque valeur de G N ~ D N A on peut ddterminer les valeurs de V L ~ D N A et Z)C~DNA correspondantes, si on admet que les cations occupent le m&me volume quel que soit l’anion.

Le volume qu’occupe une paire cation-anion peut &tre determine A partir de la densite des solutions du sel dans l’eau, extrapolee % concentra-

TSRLFAU la ~~

H Li Na cs VXCI, $3 31 ,0 30,7 27,5 67,O VX+, A3 0 - 0 , 3 - 3 , 5 36,O

~~

a VXCI = volume qu’occupe uiie paire cations (X+) anion (Cl-), en solution dans l’eau; v x + = volume qu’occupe un cation, dans I’hypothese qiie VH+ = 0.

DES POLYELECTROLYTES RIGIDES EN S o L u m o N 499

tion nulle. bleau I.

Les valeurs relatives aux chlorures sont portees dans le Ta- De ces valeurs on tire les relations suivantes:

k D N A = 1’055iNaDNA + 0,006

2)CsDNA = 0 , 7 5 2 i N a D N A + 0,051

(25)

(26)

LiDNA: # = 3,23V (27)

KaDNA: # = 3,24G (2s)

CsDNA: # = 3,42U (29)

Les relations qui lient V et # sont les suivantes:

Les volumes spgcifiques des ions ne peuvent pas &re determines directe- ment. On les calcule, en general, par la difference entre le volume occupb par une molecule du chlorure du cation et le volume occupe par une molecule de HCl, en faisant l’hypothhse que le volume specifique de l’ion hy- droghne est nul. Les valeurs ainsi obtenues sont portbes dans le Tableau I ; on retrouve sensiblement les valeurs adoptees par d’autres au teu r~ .~J

Di$usion centrale par les Solutions isotropes

Les experiences ont 6th eff ectuees sur un appareil B collimation lineaire, qui a 6th deerit ailleurs.8 Les intensites sont mesurees B une Bchelle ab- solue, ce qui permet d’obtenir la fonction normbe j,(s) [eq. (lo)]. Dans le cas, qui est celui des experiences decrites ici, oh les particules de solute sont des blitonnets, la forme de j ,(s) est celle donnee par 1’6quation (12). Nous avons montre a i l l e ~ r s l ~ ~ comment on peut tirer les valeurs de A [Cq. (9) 3 et de R, de chaque courbe j ,(s), en utilisant une representation doublement logarithmique.

Diffraction par les Gels Mesomorphes

Les diagrammes de diffraction des rayons X des gels mesomorphes ont Bt6 enregistres au moyen d’une chambre de diffraction mise au point au lab~ra to i re .~ Les Bchantillons sont montes dans des euves Btanches, ce gui permet d’effectuer les experiences sous vide, sans qu’il y ait Bvapora- tion du solvant.

Rbultats Exp6rimentaux

Solutions isotropes

Les differents sels du DNA sont Btudies en solution dans l’eau salee, en fonction de la teneur en sel et de la concentration en DNA. Chaque experience de diffusion centrale des rayons X fournit une courbe j,(s) qui, lorsque le solute est un bbtonnet rigide, ne depend que des parametres A et R, [voir l’equation (12)]. Nous interpretons ces courbes en utilisant une reprbsentation doublement l~garithmique.’~~ Nous avons pu verifier ainsi que pour toutes les experiences la forme des courbes j ,(s) est en bon

500 LUZZATI, MASSON, MATIIIS, SALUDJIAN

TABLEAU I1

Molar- Solution it4

LiDNA dans 0,30 l’eau + 0,30 LiCl 0,30

0,30 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,58 0,58 0,58 1,00 1 , 00 1,oo 1,oo 1,oo I, 00 1,40 1,40 1,40 1,40 1,40 1,80 1,80 1,80 2,oo 2,oo 2,oo 2,00

PO, 61 ;is 0,3358 0,3358 0,3358 0,3358 0,3369 0,3369 0,3369 0,3369 0,3369

0,3374 0,3374 0,3397 0,3397 0,3397 0,3397 0,3397 0,3397 0,3420 0,3420 0,3420 0,3420 0,3420 0,3443 0,3443 0,3443 0,3454 0,3454 0,3454 0,3454

0,3374

c %

1,87 2,46 3,15 3,76 1,84 1,99 2,49 2,73 3,34 1,79 2,32 2,54 2,25 2,26 2,76 2,99 3,23 3,55 2,02 2,46 2,83 3,44 3,33 1,88 2,94 3,46 1,92 2,60 2,97 3,78

c e % Rc

1,72 8,4 2,27 8,4 2,90 8,4 3,47 8,4 1,69 8,2 1,83 8,2 2,29 8,2 2,51 8,2 3,07 8,2 1,64 8 , l 2,13 8,l 2,33 8,l 2,05 8,O 2,06 8 ,0 2,52 8,0 2,72 8,O 2,95 8,0 3,24 8,0 1,83 7,s 2,23 7,8 2,56 7,8 3,11 7,s 3,01 7,8 1,69 7,8 2,65 7,8 3,11 7,s 1,72 7,8 2,32 7,8 2,66 7,8 3,39 7,s

A a / c ,

0,208 12,11 0.253 11,15 0,363 12,53 0,444 12,80 0,190 11,27 0,222 12,14 0,290 12,65 0,312 12,45 0,363 11,84 0,202 12,28 0,247 11,59 0.285 12,26 0,208 10,16 0,208 10,Il 0,272 10,81 0,294 10,81 0,322 10,92 0,374 11,56 0,219 12,OO 0,250 11,21 0,298 11,66 0,345 11,08 0,317 10,54 0,166 9,86 0,290 10,93 0,333 10,72 0,188 10,97 0,227 9,7.5 0,259 9,76 0,370 10,93

12.14

12,07

12,05

10,73

11,29

10,50

10,35

(continu)

accord avec I’hyuation (12), ce qui nous a permis de determiner les valeurs de A et de R,. Les resultats numeriques relatifs au NaDNA ont Bte donnds ailleurs.l~10 Les valeurs obtenues avec le LiDNA et le CsDNA sont porthes clans le Tableau 11.

L’interprhtation des donnees experimentales peut se d6composer en une sdrie d’etapes.

Extrapolation a Concentration en DNA nulle. On se trouve en presence d’un ensemble de valeurs de A / c , et de R,, chacune relative B une teneur en sel et B une concentration en DNA donnees. On peut Qliminer le dernier de ces param6tres en extrapolant vers c, = 0 les valeurs de A/c, correspondant B diffhrentes concentrations en DNA, B une teneur en sel determinhe. Nous avons montre ailleurs‘ qu’il est possible, par un pro- chd6 graphique, d’obtenir des valeurs de A/c , qui dependent peu de la

DES P o L Y m E c m o L w E s KIGIDES EN SOLUTION 501

TABLEAU I1 (continu)

Molar- __ Solution it6 61 A3 c % C e % R, A A / C , A / C ,

CsDNA dans 0,02 I’eau + 0,02 CsCl 0,02

0,02 0,02 0,05 (! ,05 0,05 0,05 0 , O i 0,07 0,07 0,07 0,15 0,15 0,15 0,15 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,30 0,33 0,33

0,3346 0,3346 0,3346 0,3346 0,3346 0,3355 0,3355 0,3355 0,3355 0,3362 0,3362 0,3362 0,3362 0,3385 0,3385 0,3385 0,3385 0,3400 0,3400 0,3400 0,3400 0,3400 0,3433 0,3442 0,3442

1,05 2,03 3,19 3,85 4,73 1,53 2,31 2,17 2,52 2,27 2,79 3,24 3,85 1,15 2,34 3,59 4,61 1,89 2,05 3,37 3,49 4,97 2,98 1,60 2,72

0,92 1,78 2,79

4,14 1,33 2,02 1,89 2,20 1,9i 2,43 2,82 3,35 0.99 2,02 3,lO 3,99 1,63 l , i 7 2,91 3,01 4729 2,54 1,36 2,31

3,37

10,8 0,172 10,s 0,367 10,8 0,505 10,8 0,724 10,s 0,877 10,6 0,266 10,6 0,392 10,6 0,425 10,6 0,460 10,4 0,416 10,4 0,444 10,4 0,510 10,4 0,575 10,4 0,166 10,4 0,354 10,4 0,588 10,4 0,781 10,O 0,294 10,O 0,312 10,O 0,500 1 0 , O 0,568 1 0 , O 0,769 9,7 0,454 9,7 0,256 9 , i 0,392

18.74 20,65 18,lO 21,50 21,18 20,03 20,00 19,41 22,51 20,94 20,71 21,15 18,% 18,09 17,15 18,67 16,83 17,55 18,97 19’58 18,23 18,04 17,65 17,18

17,93 17,93 17,89 17,89 18,85 16,97 17,91

18,237

concentration: la moyenne (Alc , ) (Tableau 11) tient lieu de valeur ex- trapol6e B c, = 0, du moins en premiere approximat,ion.

Elimination des Effets de I’glectrolyte. A ce stade les donnees ex- p6rimentales sont reduites B une s6rie de valeurs (Alc,), chacune relative B une teneur en sel diffdrente. Pour interprbter ces donnees il est utile d’bliminer les effets de 1’6lectrolyte, en extrapolant vers l’eau pure les (Alc , ) obtenues B differentes teneurs en sel. Pour cela il convient d’utiliser la reprhsentation [ ( A / C , ) ] ~ , ~ en fonction de po, car les points s’alignent sur une droite (pour des raisons qui sont donnees plus loin).

D6termination de h. Les valeurs de ( A / c , ) ainsi extrapol6es peuvent &re introduites dans I’hquation (2l), oh ps (0.333 61ectrons/A3) est la densit6 6lectronique de l’eau B 25OC:

( A l c e ) p s = ~ a [ ( l - ~ s # a ) - ( + ~ 7 4 7 7 z a ) ( 1 - ps#c)I2 (30) Puisque nous aurons B comparer les structures de differents sels du DNA,

il est preferable de remplacer pa par le parametre h (voir notation) :

h = 2n~J14 ,y (31)

502

m (i 5

2.5

2.0

---I

1.5

LUZZATI, MASSON, MATHIS, SALUDJIAN

I I I i

-

0.50 0.55 0.60 Na DNA

I I I 0.50 0.55 0.60 ti DNA

I I

ii ( c m 3 4.')

vli I I 1

1.0 - - 0.50 0.55 0.60 MI. D N A

0.40 0.45 0.50 Cs . O N A

I I

I I I

- V

Fig. 1. See caption, p. 503.

En outre il convierit de modifier 1'6quation (30), pour obtenir une relation doublement lin6aire en GQ et

DES POLYELECTROLYTES RIGIDES E N SOLUTION 503

K

2.0

I I I I

Fig. 1. Representation des r6sultats finaux. E n trait interrompu les donnees relatives La flkche

Les points entour& aux gels m&omorphes, en trait plein celles relatives ails solut,ions diluees. indique la valeur de h correspondant au modhle de Watson et Crick. de cercles sont ceux du Tableau 111.

Si on adniet que $c est connu (Tableau I), 1’6quation (32) Btablit une relation entre les trois parametres h, $u et CP. Nous avons repr6sent6 dam la Figure 1 les droites h11z7 en fonction de (ou plus exactement de GU), pour diffdrentes valeurs de a. Nous avons port6 sur la m&me figure les courbes relatives aux gels m6somorphes.

Determination du T a u de Solvatation. Pour discuter la distribution des ions de 1’6lectrolyte autour des macroions, nous nous r6f6rons au modhle discut6 plus haut : chaque bbtonnet de DNA est entour6, en solution, par une gaine d’eau imp6n6trable aux ions de 1’6lectrolyte. On mesure le nombre d’6lectrons de cette gaine d’eau en fraction a du nonibre d’6lectrons d’une molbcule neutre de DNA. Si on admet que le volume sp6cifique partiel de l’eau est independant de la concentration en Blectrolyte, on peut modifier 1’6quation (21), et on obtient :

L’Bquation (33) repr6sente une droite [(9/~,)]’/~ en fonction de pa. Le fait que les points experimentaux s’alignent bien sur des droites (voir Figure 2) est une confirmation du bien fond6 du niodde, et senible indiquer que h, La pente de la droite permet de determiner la valeur de a, lorsque h , a,

et a sont inddpendants de la teneur en sel. et t+bc soiit connus.

504

JA/Ce

4.5

4.0

3.5

3.0

LUZZATI, MASSON, MATHIS, SALUDJIAN

1 I I

\. - P H,O 0.34 0.35 0.36 p, ( e l par i.';

Fig. 2. Representation des donnees exgrimentales relatives aux solutions diluees: (+) LiDNA (thymus de veau), en presence de LEI ; (+) NaDNA (thymus de veau), en presence de NaC1;' (m) NaDNA (thymus de veau), en presence de NaBr;' (0) NaDNA (erythrocytes de poulet), en presence de NaC1;' (A) NaDNA (E. coEi), en pr6sence de NaC1;1° ( X ) NaDNA ( E . coli), en presence de Nal3r;lo ( + ) CsDNA (thymus de veau), en presence de CsCI.

Gels Misomorphes

Nous avons port6 sur la Figure 3 les donn6es exp6rimentales relatives B trois series d'exphriences, effectu6es avec le LiDNA, le NaDNA et le CsDNA. Nous avons d6jB d6critl les exp6riences faites avec le NaDNA, en prdsence de quantit6s variables d'6lectrolyte. Les points s'alignent assez bien sur des droites, en bon accord avec 1'6quation (24).

En priricipe 011 devrait tirer de chaque droite la valeur de V et de m/Z: en fait la dispersion des points expbrimentaux est trop grande pour qu'on puisse d6terminer G avec pr6cision. I1 nous a paru pref6rable de fixer A priori la valeur de V, et de tracer la droite qui passe par le centre de gravit6 des points exp6rimentaux et par le point c-l = 1 - 6; sur l'axe des ab- scisses. On obtient ainsi une valeur de m/Z (et de h, voir notation) pour chaque valeur de V . Les r6sultats sont port% sur la Figure 1 ; on constate que nz/Z est fort peu sensible aux variations de V .


s;

(10”’

2.0

1.5

1 .o

0.5

I I I

I I I I 2 4 6 8 C-I

Fig. 3. lteprbsentation des donnCes exPCrimentales relatives aux gels mbsomorphes [voir eq. (24)]: (0) points expbrimentaux et droite relative a LiDNA; (0) points expbrimentaux et droite relative a CsDNA; (-) droite relative au NaDNA.1 Les droites passent par le cent,re de gravitC des points exp6rimentaux (indiqubs par line croix) e t par le point c-l = 1 - 60, sur l’axe des abscises ( B N ~ D N A = 0,56).

CONCLUSIONS

Interpr6tation des R6sultats

La premiere conclusion que l’on tire des r6sultats exp6rimentaux est que les propridt6s des trois sels de DNA sont celles d’un systeme de bbtoririets rigides. Ceci est vrai dans les gels mdsomorphes et dans les solutions isotropes, c’est-&dire dans une gamme de concentration allant de 1% 2,

La valeur de h que fournit 1’Ctude des gels m6somorphes est serisiblement la m6me pour les trois sels du DNA (Fig. 1)’ et se trouve 6tre en excellent accord avec le modele de Watson et Crick (h = 3.36 8). I1 importe d’in- sister sur le fait que la valeur de h ainsi obtenue est inddpendante de la distribution des contreions et de la teneur en sel, et qu’elle est peu sensible aux 6carts de v (Fig. 1).

La situation est plus complexe lorsqu’on analyse les r6sultats obtenus avec les solutions isotropes. Si on neglige la fraction de coritreions libres,

60%.


c’est-A-dire si on admet que CP est nul, on trouve, pour = 0.560 les valeurs de h portees dans la derni6re colonne du Tableau 111. Si les valeurs relatives au Li DNA et au Na DNA sont peu diffkrentes et en bon accord avec les valeurs de h des trois sels dans les gels m&omorphes, il n’en est pas de m&me pour le CsDNA : h est ici plus Bleve que pour les autres cas. I1 est clair, par ailleurs (Fig. l), que ce d6saccord ne peut pas &re efface par un choix opportun de 5. C‘est sur la base de ces resultats que l’un de nous2 a Bmis l’hypoth6se que les molecules de Cs DXA, en solution isotrope, a,dopteraient une conformation differente de celle de LiDNA et de NaDNA.

TABLEAU I11 RCcapitulation des R6sultats

Cas oh @ = 0,3

Cas oh @ molCcules = ,, H20par -

S [ ( A I C ~ ) ~ ~ . ” ~ cm3/g hseb A his,,tr., A nuclhotide hisotr., A

a:

Cation CXDNA,

Li 3,50 0,593 3,35 3,35 (1) 3,45 Ka 4 , O O 0,560 3,20 3,Ol 13 3,35 c s 4,52 0,474 3,46 3,35 (10) 4,35

En fait Cohen et Eisenberg“ ont montr6 recemment, par des mesures de viscosit6 et de diffusion de la lumiBre sur du DNA fragment6 par ultra- son, que la masse par unit6 de longueur est la m&me lorsque le cation est le Na+ ou le Cs+. Par ailleurs on sait, B la suite de nonibreuses etudes re- centes, (voir plus loin), que la fraction des contreions libres n’est pas n6g- ligeable dans le cas des polydectrolytes en solution dans l’eau. I1 est clair, dans ces conditions, que 1’hypothBse qui convient le mieux B l’interpretation de nos donnees experimentales est d’admettre que la structure du DNA est independante de la nature du cation. On peut alors rechercher, B l’aide des graphiques de la Figure 1, les valeurs de CP et de V pour lesquelles l’accord entre les diffbentes valeurs de h est le plus satisfaisant. En fait, il n’y a que le h du CsDNA qui depende beaucoup de CP. C’est donc avec CsDNA, pour V (NaDNA) = 0,56 cm3/g que nous dbterminons CP = 0’3. Nous adoptons cette valeur pour les deux autres sels du DNA. Les resultats num6riques qui decoulent du choix de ces parambtres sont port& dans le Tableau 111.

Discussion

Le probl6nie des solutions B plusieurs composants a B t B discutd par d’autres auteurs, qui en ont donne un traitement thermodynamique tout-8- fait g6n6ral (voir mise au point recente par Casassa et EisenbergI2). Nous avons limit,6 la portee de notre travail B quelques cas particuliers: notre but Btait de fournir un cadre A l’interpretation des experiences de diffusion

DES POLY ELECTROLYTES RIGIDES EK SOLUTION 507

centrale des rayons X. Ainsi il nous a paru opportun d’adopter un traitement th6orique de type geometrique, en faisant appel SL la notion de par ticule .

I1 convient de remarquer que les volumes specifiques partiels de l’espbce macromol6culaire. et des cations, qui interviennent dans les applications pratiques, sont B concentration nulle, puisque les donnees experimentales sont extrapoKes B concentration nulle en macromolecules e t en electrolyte. Pour determiner le taux d’hydration nous avons admis que le volume sp6ci- fique partiel de l’eau est independant de la concentration en electrolyte, hypothhse qui est justifiee dans les conditions de nos exp6riences. Par ailleurs on peut noter que la diffusion ceritrale des rayons X pourrait en principe fournir un nioyen pour mesurer le volume specifique des ions: en effet si la structure et le volume specifique des macroins etaient connus [valeurs de h et de +a dansl ’6quation ( 3 2 ) ] , ainsi que la fraction 9 des contreions libres (voir cidessous), la seule inconnue de 1’6quation (32) serait +e.

L’hypothhse qu’une fraction des contreions reste osmotiquement libre en solution est en parfait accord avec tout ce que l’on sait sur les propri6tes des poly6lectrolytes (voir mise au point dans r6f. 13). La valeur nuni6rique de cette fraction et 1’hypothPse qu’elle reste la m&me pour les trois cations se trouvent justifi6es par d’autres travaux theoriques et exphrimentaux. Ilatchalski et Alexandro~icz’~ pr6voient en effet par le calcul que 9 est de 0.1 B 0.2 et qu’elle ne depend que peu de la force ionique. Ross et Scrugg’j ont determine la valeur de pour le LiDNA et le NaDNA, par des mesures d’6lectrophorbse: ils ont obtenu 9 z 0.35 dans les deux cas, pour les concentrations en sel comprises entre 0.05 et 0.4 14.

La solvatation, telle que nous l’avons d6finie ici, est equivalente B celle qui intervient dans 1’6quilibre de dialyse. Ce parametre peut 6tre mesure egalement par des exp6riences de vitesse de sedimentation dam des solvants de densit6 ~a r i ab le , ’~ , ’~ dans la mesure, toutefois, oh les propri6t6s hydrodynamiques des macromolecules restent les m6mes dans les diff Brents solvants. La d6termination de la solvatation que nous utilisons iei d6pend de la pente des droites de la Figure 2 : il est clair que la determination n’est precise que dans le cas du NaDNA, oh les mesures exp6rinientales couvrent une r6gion assez 6tendue de pa. Par ailleurs l’interprgtation des r6sultats obtenus en presence de NaBr semble indiquer que la solvatation est independante de la nature de l’anion.’

I1 convierit de discuter brihvement la pr6cision des r6sultats exp6ri- mentaux obtenus par la diffusion centrale des rayons X. I1 faut noter d’abord que les conclusions de ce travail sont fond6es sur la coniparaison de resultats d’exp6riences differentes, toutes eff ectuees e t interprBt6es de manibre identique: dans ces conditions les effets de bien des erreurs tendent A s’annuler. Ainsi l’incertitude qui porte sur la valeur du volume sp6ci- fique, qui est la source des erreurs les plus importantes, ne gene que fort peu la comparaison entre les sels des differents cations. D’autre part, puisque des observations r6centes1* indiquent que l’extrapolation vers c, = 0 peut 6tre la cause d’erreurs assez iniportantes, nous avons effectue avec le DNA quelques series d’exp6riences sur une gamnie de concentration


assez Btendue ce qui nous a permis d‘extrapoler avec soin; les rBsultats ne different pas de ceux obtenus par le procBd6 utilisB prBc6demment.l

Nous d6sirons exprimer notre reconnaissance aux Professeurs H. Benoit et M. Daune pour l’int6rht qu’ils ont port6 % notre travail et pour de nombreuses discussions. Nous devons ?i la gen6rosit6 de M. J. Pouyet les Bchantillons de DNA dont nous nous sommes servis. Ce travail a b6nCfici6 c’une subvention de la DB16gation G6nBrale pour la Recherche Scientifique et Technique, Cornit6 de Biologie molBculaire.

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Received August 1, 1966 Revised November 29, 1966 Prod. No. B282

Documents

Étude, par diffusion centrale des Rayons X, des polyelectrolytes rigides en solution. Cas des sels de Li, Na et Cs du DNA