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Mémoire
Pour l’obtention du diplôme de :
Magister en Chimie
Option : Chimie Organique
Intitulé :
Etude Phytochimique et Biologique d’Ammodaucus leucotrichus
Présenté par : Melle Sebaa Asjel
Soutenue le : Devant la commission d’examen : Président : Mr O. Yebdri Professeur, Université d’Oran Es-senia
Rapporteur : Mme A. Derdour Professeur, Université d’Oran Es-senia
Co- Rapporteur : Mr A. Maarouf Maître de Conférences, Université d’Oran Es-senia
Examinateurs : Mr O. Adel Professeur, USTO
Mr B. Merah Maître de Conférences, Université d’Oran Es-senia
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Remerciements
Ce travail a été réalisé au laboratoire de Synthèse Organique Appliquée (L.S.O.A) du Département de Chimie et laboratoire de Biochimie Végétale à l’institut des Sciences, Université d’Oran Es-sénia, il entre dans le cadre d’un projet ANDRS de n°05/01/02/04/079.
J’exprime d’abord mes profonds remerciements et ma reconnaissance à Mme A.
Derdour, professeur à l’Université d’Oran Es-sénia pour avoir accepté de m’encadrer, pour sa gentillesse et sa disponibilité. Qu’elle trouve ici mes sentiments de gratitude et de déférence.
J’aimerais également exprimer ma gratitude à Monsieur A. Maarouf, maître de
conférences à l’Université d’Oran Es-sénia de m’avoir accueillie dans son laboratoire de Biochimie Végétale et d’avoir rendu ce mémoire une expérience motivante et enrichissante. Je ne saurais jamais oublier sa disponibilité. Sa compétence et ses recommandations continues, me furent très inestimables.
Je remercie, Mr Yebdri professeur à l’Université d’Oran Es-sénia pour avoir
accepté de présider ce jury. Mes plus vifs remerciements s’adressent à :
Monsieur O. Adel professeur à Université d’Oran (U.S.T.O) Monsieur B. Marah maître de conférences à l’Université d’Oran Es-sénia, pour l’honneur qu’ils me font en examinant ce travail.
Mes sentiments de reconnaissance et mes remerciements vont également à l’encontre de toute personne qui a participé de prés ou de loin, directement ou indirectement à la réalisation de ce travail. Je ne saurais remercier ici les personnes dont la collaboration a été bénéfique pour la réalisation de certaines étapes de ce travail sans citer les noms, en particulier : Mme Mrabet Ghania, Melle Chaïb Faïza, Mme Mehdid Sarah, Melle Hidour Haana.
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DEDICACEDEDICACEDEDICACEDEDICACE
Je remercie Dieu tout puissaJe remercie Dieu tout puissaJe remercie Dieu tout puissaJe remercie Dieu tout puissant de m’avoir donné santé, courage et nt de m’avoir donné santé, courage et nt de m’avoir donné santé, courage et nt de m’avoir donné santé, courage et
patience tout au long de mes études.patience tout au long de mes études.patience tout au long de mes études.patience tout au long de mes études.
C’est avec un infiniment plaisir que je dédie ce mémoire aux êtres qui C’est avec un infiniment plaisir que je dédie ce mémoire aux êtres qui C’est avec un infiniment plaisir que je dédie ce mémoire aux êtres qui C’est avec un infiniment plaisir que je dédie ce mémoire aux êtres qui
me sont très chers dans cette vieme sont très chers dans cette vieme sont très chers dans cette vieme sont très chers dans cette vie
A la mémoire de mon très cher père dont je regrette son absence en ce A la mémoire de mon très cher père dont je regrette son absence en ce A la mémoire de mon très cher père dont je regrette son absence en ce A la mémoire de mon très cher père dont je regrette son absence en ce
joujoujoujour si important pour moi.r si important pour moi.r si important pour moi.r si important pour moi.
A ma très chère mère. En témoignage de l’amour, du respect et de A ma très chère mère. En témoignage de l’amour, du respect et de A ma très chère mère. En témoignage de l’amour, du respect et de A ma très chère mère. En témoignage de l’amour, du respect et de la la la la
gratitude que je lui porte, je ne gratitude que je lui porte, je ne gratitude que je lui porte, je ne gratitude que je lui porte, je ne la remercierai j’aimais assezla remercierai j’aimais assezla remercierai j’aimais assezla remercierai j’aimais assez pour pour pour pour son son son son
soutien, son dévouement, sa soutien, son dévouement, sa soutien, son dévouement, sa soutien, son dévouement, sa compréhension et compréhension et compréhension et compréhension et pour l’attention dont elle pour l’attention dont elle pour l’attention dont elle pour l’attention dont elle
toujours fait prtoujours fait prtoujours fait prtoujours fait preuveeuveeuveeuve. E. E. E. Ellellellelle a a a a fait de moi ce que je suis aujourd’hui. fait de moi ce que je suis aujourd’hui. fait de moi ce que je suis aujourd’hui. fait de moi ce que je suis aujourd’hui.
A mes très chers frères et sœursA mes très chers frères et sœursA mes très chers frères et sœursA mes très chers frères et sœurs, chaleureusement, ainsi qu’à mes , chaleureusement, ainsi qu’à mes , chaleureusement, ainsi qu’à mes , chaleureusement, ainsi qu’à mes
beaux frères,beaux frères,beaux frères,beaux frères, neveux et nièces. neveux et nièces. neveux et nièces. neveux et nièces.
AAAA mes amis mes amis mes amis mes amis pour leur présence de tous les instants, pour le soutien pour leur présence de tous les instants, pour le soutien pour leur présence de tous les instants, pour le soutien pour leur présence de tous les instants, pour le soutien
qu’ils m’ont apporté, avec toutqu’ils m’ont apporté, avec toutqu’ils m’ont apporté, avec toutqu’ils m’ont apporté, avec toute mon affection et ma reconnaissance.e mon affection et ma reconnaissance.e mon affection et ma reconnaissance.e mon affection et ma reconnaissance.
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Abréviations
Acétyl CoA : acétyle Coenzyme A AcOEt : Acétate d’éthyle AcOH : Acide acétique AChase :Acétylcholinesterase AgNO3 : Nitrate d’argent CC : Chromatographie sur colonne ouverte CCM : Chromatographie sur couche mince CHCl3 : Chloroforme CH2Cl2 : Dichlorométhane Cm : Centimétre d20 : Densité DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil EtOH : Ethanol FeCl3 : Chlorure ferrique g: Gramme GC : Chromatographie en phase gazeuse h: Heure HCl : Acide chlorhydrique HCOOH : Acide formique H2SO4: Acide sulfurique H.E : Huile essentielle Kg : Kilogramme IC50 : Concentration d’antioxydant nécessaire pour piéger 50% du radical libre IR : Infra rouge L: Litre nt
D : Indice de réfraction NaOH : Hydroxyde de sodium NH4OH : Ammoniaque nm : Nanomètre m: Masse MeOH: Méthanol mg: Milligramme min: Minute ml: Millilitre mm: Millimètre MS : Spectrométrie de masse µm: Micromètre µl: Micro litre Rdt: Rendement Rf : Facteur de rétention RP : Phase inverse
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PEG: Polyéthylène glycol TFA : Acide trifluoroacétique Tr ; Temps de rétention UV : Ultraviolet V: Volume v/m : Volume par masse v/v : Volume par volume. % : Pourcentage αt
D : Pouvoir rotatoire
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Glossaire
Analgésique : supprime la douleur.
Anesthésique : qui provoque une privation complète ou partielle de la faculté de sentir.
Aromate : tout parfum d’origine végétale utilisé en médecine, en parfumerie ou en cuisine.
Antiallergique : protège contre les allergies.
Antibactérien : inhibe et détruit les bactéries.
Antidiarrhétique : lutte contre la diarrhée.
Antifongique : actif contre les champignons et les levures parasites.
Antioxydant : permet aux aliments de résister à l’oxydation et à une détérioration graduelle.
Antiseptique : détruit les microbes et empêche leur développement.
Antispasmodique : lutte contre les spasmes.
Antitumorale : détruit les tumeurs.
Antivirale : toute substance active contre les virus.
Arbuste : Petit arbre (en générale moins de 5 m à l’âge adulte), dont le tronc est plutôt grêle
Aromatique : plante d’odeur agréable, généralement due à une essence.
Bractée : petites feuille accompagnant les pédoncules ou les fleurs et différentes des autres
feuilles.
Caduc : organe qui se détache et tombe de bonne heure, exemple : poirier.
Capitule : inflorescence à fleurs sessiles ou subsessibles et serrées en tête sur un réceptacle,
exemple : composées.
Condiment : substance dont le parfum prononcé sert à révéler la saveur des aliments.
Digestif : remède concourant à la digestion.
Diurétique : Qui favorise l’élimination de l’urine.
Foliacé : qui a l’apparence d’une feuille.
Expectorant : Qui calme la toux, favorise l’expulsion des sécrétions bronchiques.
Glabre : dépourvu de poils.
Herbacé : Vert ou ayant la consistance molle de l’herbe, par opposition à ligneux.
Hypoglycémiant : provoque la chute du taux de glucose dans le sang.
Involucre : ensemble de bractées, d’organe foliacés situés autour d’une fleur ou d’une
inflorescence, d’une ombelle ou d’un capitule.
Métabolisme : ensemble des échanges qui s’accomplissent au sein de l’organisme.
Ombelle : Inflorescence ou les pédoncules partent du même point.
Ombellule : Petite ombelle portée au sommet des rameaux d’une ombelle composée.
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Ophtalmique : traitement des affections oculaires.
Rameuse : Plante qui a émis ça et là des racines.
Pédoncule : Support d’une ou de plusieurs fleurs.
Sédatif : qui calme l’organisme.
Sépale : Chacune des pièces formant le calice d’une fleur. Moins apparents que les pétales, les
sépales sont généralement de couleur verte ou brune. On les remarque surtout quand la fleur et en
bouton
Vermifuge : qui provoque expulsion des vers intestinaux.
Vulnéraire : qui favorise la cicatrisation et la guérison des plaies et des blessures.
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Liste des figures
• Figure 01. Photo d’Ammodaucus leucotrichus……………………………………………..04
• Figure 02. Photo de Fruit d’Ammodaucus leucotrichus……………………………………06 • Figure 03. Structures chimiques des quatre composés isolées de la plante………………...11 • Figure 04. Structures des principaux squelettes des génines triterpèniques………………..14
• Figure 05. Structures des principaux squelettes des génines stéroïdiques………………….14 • Figure 06. Structures des principaux types de sapogénines stéroïdes alcaloïdiques………..15
• Figure 07. Structures des principaux monosaccharides rencontrés dans les saponines…….15 • Figure 08. Formule structurale de squalène………………………………………………...16 • Figure 09. L’assemblage queue-queue de deux unités des farnésyl disphosphate………….16 • Figure 10. Biosynthèse des différentes saponines…………………………………………..17 • Figure 11. Squelette de base des flavonoïdes……………………………………………….24
• Figure 12. Structures des différents types de flavonoïdes…………………………………..26 • Figure 13. Biosynthèse des différents flavonoïdes………………………………………….27 • Figure 14. Les principaux composés phénoliques naturels…………………………………31
( formule des principaux acides benzoïques) • Figure 15. Les principaux composés phénoliques naturels…………………………………32
• ( formules des principaux acides cinnamiques) • Figure 16. Exemple des Structures des tanins hydrolysables……………………………….34
• Figure 17. Exemple de structure de tanins condensés………………………………………34 • Figure 18. les principaux composés des coumarines………………………………………..36 • Figure 19. les principaux composés des quinones…………………………………………..38
• Figure 20. Quelques exemples des monoterpènes et des sesquiterpènes……………………43 sous forme d’hydrocarbure
• Figure 21. Quelques exemples des monoterpènes et des sesquiterpènes……………………43 sous forme d’alcool
• Figure 22. Quelques exemples des monoterpènes et des sesquiterpènes……………………43 sous forme d’aldéhyde et de phénol
• Figure 23. Quelques exemples des monoterpènes et des sesquiterpènes……………………44 sous forme de cétone
• Figure 24. Quelques exemples des monoterpènes et des sesquiterpènes……………………44 sous forme d’éther et d’ester
• Figure 25. Quelques structures des composés aromatiques………………………………....45 • Figure 26. Schéma d’extraction des Alcaloïdes en milieu alcalin…………………………..48
• Figure 27. Schéma d’extraction des glucosides cardiotoniques……………………………..53 • Figure 28. Schéma d’extraction de fruits d’Ammodaucus…………………………………..56
à l’aide d’un extracteur du type Soxhlet. • Figure 29. Schéma d’extraction des fruits d’Ammodauchus………………………………..62
9
• Figure 30. Schéma de l’hydrolyse acide des produits………………………………….......69
• Figure 31. méthode de dosage des polyphénols au Folin Ciocalteu……………………….72
• Figure 32. méthode de dosage des flavonoïdes……………………………………………74
• Figure 33. Structure chimique du DPPH et sa réaction avec un piégeur de radicaux……..76
(A-H)
• Figure 34. Schéma de fractionnement du produit pur F3………………………………......87
• Figure 35. Schéma de fractionnement du produit pur F4…………………………………..89 • Figure 36. Schéma d’isolation de F5……………………………………………………….91
• Figure 37. Schéma d’isolation de F6……………………………………………………….92 • Figure 38. Spectre IR de F4………………………………………………………………...94 • Figure 39. Structure des constituants identifiés dans l’huile essentielle…………………...99
d’Ammodaucus leucotrichus. • Figure 40. Courbe d'étalonnage des polyphénols totaux…………………………………...100 • Figure 41. Courbe d'étalonnage des flavonoïdes…………………………………………...100 • Figure 42. Dosage de l’activité antioxydante de l’extrait méthanolique par……………….101
spectrophotométrie.
• Figure 43. Pourcentage d’inhibition en fonction de la concentration d’extrait MeOH…….102 • Figure 44. Pourcentage d’inhibition en fonction de la concentration d’HE………………..103 • Figure 45. Pourcentage d’inhibition en fonction de la concentration d’extrait aqueux…….103
• Figure 46. Concentrations inhibitrices de 50% des radicaux DPPH……………………….105
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Liste des tableaux
• Tableau 01. Récapitulatif des structures chimiques…………………………………..10
de quelque terpène isolé du 2éme espèce d’Ammodaucus leucotrichus
• Tableau 02. Récapitulatif des structures chimiques…………………………………..12
de quelque terpène isolé de la 1ère espèce d’Ammodaucus leucotrichus
• Tableau 03. Structure chimique des alcaloïdes……………………………………….24
• Tableau 04. Masses moléculaires des principes alcaloïdes…………………………...25
• Tableau 05. Les différents types de révélateurs des flavonoïdes……………………..33
• Tableau 06. Nomenclature des anthocyanidines 3, 5, 7 hydroxylés…………………..40
• Tableau 07. Récapitulatif des résultats du screening chimique ………………………83
des fruits d’Ammodaucus leucotrichus
• Tableau 08. Propriétés spectrales des produits purs isolés à partir……………………93
des fruits d’Ammodaucus leucotrichus Coss. et Dur.
• Tableau 09. Bandes caractéristiques du spectre IR de F4……………………………..93
• Tableau 10. Les rendements de l’H.E d’Ammodaucus leucotrichus………………….95
et des différentes espèces d’Apiacées.
• Tableau 11. Les rendements de l’H.E des sous espèces……………………………....95
d’Ammodaucus leucotrichus : ssp. nanocarpus (ALN1, ALN2) et ssp. leucotrichus
(ALL1).
• Tableau 12. Caractéristiques organoleptiques d’essence……………………………..95
d’Ammodaucus leucotrichus
• Tableau 13. Caractéristiques physiques de l’huile essentielle des fruits……………...96
d’Ammodaucus leucotrichus et des huiles de quelques plantes appartenant à la famille
des Apiacées.
• Tableau 14. Solubilité de l’huile essentielle des fruits d’Ammodaucus………………96
dans quelques solvants organiques.
• Tableau 15. Facteurs de rétention (Rf) et couleurs……………………………………97
des constituants majoritaires de l’H.E d’Ammodaucus leucotrichus.
• Tableau 16. Pourcentage des constituants de l’H.E …………………………………..98
des fruits d’Ammodaucus leucotrichus des deux pays.
• Tableau 17. Résultats de l’activité anti-radicalaire par la méthode………………….101
11
bioautographique des extraits d’Ammodaucus leucotruchus.
• Tableau 18. Concentrations inhibitrices de 50 % des radicaux DPPH………………104
• Tableau 19. Résultats de l’activité inhibitrice d’AChE par méthode………………..106
bioautographique des extraits d’Ammodaucus leucotruchus.
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Table des matières Introduction……………………………………………………………… …..01
Partie bibliographique
Chapitre 1. Données bibliographiques sur Ammodaucus leucotrichus.
1- Place d’Ammodaucus leucotruchus dans la systématique………………………………...05 2- Description de la famille des Apiacées…………………………………………………....05 3- Description botanique d’Ammodaucus leucotrichus...........................................................05 4- Répartition géographique et habitation…………………………………………………....07 5- Noms de la plante…………………………………………………………………………07 6- Culture des Apiacées……………………………………………………………………...07 7- Sous espèces et variétés …………………………………………………………………..07 8-Utilisation…………………………………………………………………………………..09 9- Etude chimique de la plante…………………………………………………………….....09
Chapitre 2. Les métabolites secondaires des plantes.
1- Les Saponines………………………………………………………………………….....15 1-1 Définition………………………………………………………………………………...15 1-2 Constitution chimique et structure…………………………………………………….....15 1-2 .1 Saponines triterpènes………………………………………………………....16 1-2 .2 Saponines stéroïdiques……………………………………………………......16 1-2 .3 Alcaloïdes stéroïdiques……………………………………………………......16 1-3 Biosynthèse des saponines………………………………………………………………..19 1-4 Propriétés physico-chimiques…………………………………………………………….21 1-4.1 Extraction……………………………………………………………………..21 1-4.2 Séparation……………………………………………………………………..21 1-4.3 Caractérisation………………………………………………………………..21 1-4.4 Dosage………………………………………………………………………..21 1-5 Propriétés biologiques et pharmacologiques……………………………………………..22 1-6 Intérêt des saponines pour la plante……………………………………………………....22 2- Les Alcaloïdes…………………………………………………………………………….23 2-1 Définition………………………………………………………………………………....23 2-2 Classification……………………………………………………………………………..23 2-3 Propriétés physico-chimiques…………………………………………………………….25 2-4 Rôle dans la plante………………………………………………………………………..25 2-5 Intérêt thérapeutique……………………………………………………………………....26 3- Les composés phénoliques………………………………………………………………. 26 3-1 Les flavonoïdes…………………………………………………………………………...27
3-1.1 Définition………………………………………………………………………...27 3-1.2 Dénomination et Nomenclature………………………………………………….27
� Flavones……………………………………………………………………….28 � Flavonols………………………………………………………………………28 � Flavanones…………………………………………………………………….28 � Chalcones……………………………………………………………………...28
3-1.3 Biosynthèse des flavonoïdes…………………………………………………….29
13
3-1.4 Rôle des flavonoïdes dans la coloration des végétaux…………………………..31 3-1.5 Propriétés physico-chimiques……………………………………………………31
� Solubilité et extraction…………………………………………………………31 � Caractérisation…………………………………………………………………32 � Dosage…………………………………………………………………………32
3-1.6 Propriétés pharmacologiques et biologiques…………………………………….32 3-2 Les acides phénoliques……………………………………………………………………34
3-2.1 Les acides phénoliques dérivés des acides benzoïques…………………………..34 3-2.2 Les acides phénoliques dérivés des acides cinnamiques…………………………35
3-3 Les tanins…………………………………………………………………………………...35
3-3.1 Définition…………………………………………………………………………35 3-3.2 Constitution chimique et structure………………………………………………..36
� Tanins hydrolysables……………………………………………………………36 � Tanins condensés ou proanthocyanidols………………………………………..37
3-3.3 Propriétés pharmacologiques et biologiques………………………………………37 3-4 Les coumarines……………………………………………………………………………..38
3-4.1 Définition…………………………………………………………………………38 3-4.2 Constitution chimique et structure………………………………………………..38 3-4.3 Propriétés pharmacologiques et biologiques……………………………………...39
3-5 Les anthocyanes…………………………………………………………………………….39 3-5.1 Définition…………………………………………….............................................39 3-5.2 Constitution chimique et structure………………………………………………....40 3-5.3 Propriétés pharmacologiques et biologiques……………………………………....40
3-6 Les quinones…………………………………………………………………………………41
3-6.1 Définition…………………………………………………………………………...41 3-6.2 Constitution chimique et structure………………………………………………….41 3-6.3 Propriétés pharmacologiques et biologiques……………………………………….42
4- Les huiles essentielles………………………………………………………………………..42 4-1 Définition……………………………………………………………………………………42 4-2 Localisation des huiles essentielles………………………………………………………….43 4-3 Rôle des huiles essentielle…………………………………………………………………...43 4-4 Propriétés chimiques………………………………………………………………………...44 4-5 Propriétés médicinales………………………………………………………………………44 4-6 L’aromathérapie……………………………………………………………………………..44 4-7 Composition chimique………………………………………………………………………45 4-7.1 Les terpènes ou terpènoïdes………………………………………………………..45 4-7.2 Composés aromatiques……………………………………………………………..47 4-7.3 Composés d’origine variée…………………………………………………………48 Chapitre 3. Partie expérimentale (étude de la plante) 1- Matériel végétal utilisé………………………………………………………………………..50 2- Préparation de la poudre végétale…………………………………………………………….50 3- Tests phytochimiques préliminaires…………………………………………………………..50 4- Préparation des échantillons…………………………………………………………………..50
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5- Réactions utilisées……………………………………………………………………………...50 � Recherche des alcaloïdes………………………………………………………………..50 � Recherche des saponines………………………………………………………………..53 � Recherche des polyphénols……………………………………………………………..53
• Les acides phénoliques…………………………………………………………...53 • Les flavonoïdes…………………………………………………………………...53 • Les anthocyanes…………………………………………………………………..54 • Les tanins………………………………………………………………………....54 • Les anthraquinones……………………………………………………………….54 • Les coumarines…………………………………………………………………...55 • Les quinones……………………………………………………………………...55
� Recherche des sesquiterpènes lactones…………………………………………………56 � Recherches des glucosides cardiotoniques……………………………………………...56
6- Extraction solide – liquide……………………………………………………………………...58 6-1 Etude de l’extrait végétal……………………………………………………………………...61
6-1.1 Séparation par chromatographie sur couche mince (CCM)………………………….61 • CCM analytique…………………………………………………………………..61 • CCM préparative………………………………………………………………….61
I 6-1.2 Séparation par chromatographie sur colonne ouverte ……………………………….61 • Chromatographie d’exclusion moléculaire………………………………………...62.
6-1.3 Séparation par chromatographie sous vide…………………………………………..63 6-2 Extraction ……………………………………………………………………………………..64
6-2.1 Extraction des produits ………………………………………………………………64 6-2.2 Extraction des huiles essentielles…………………………………………………….66
• Propriétés physiques ………………………………………………………………66 • Etude chromatographique………………………………………………………….68
� Analyse par chromatographie sur CCM…………………………………...68 � Analyse d’huile essentielle par la C.P.G…………………………………..68
7- Isolement……………………………………………………………………………………….69 7-1 Isolement par chromatographie d’exclusion moléculaire…………………………………….69 7-2 Isolement par chromatographie sur colonne à petite échelle…………………………………69 8- Hydrolyse des produits…………………………………………………………………………70 8-1 Hydrolyse acide……………………………………………………………………………….70 8-2 Hydrolyse alcaline…………………………………………………………………………….70 9- Etude biologique et biochimique……………………………………………………………….72 9-1 Dosage des polyphénols totaux par colorimétrie……………………………………………...72 9-2 Dosage des flavonoïdes par colorimétrie……………………………………………………...73 9-3 Les antioxydants………………………………………………………………………………74
9-3.1 Définition…………………………………………………………………………….74 • Antioxydants naturels…………………………………………………………….74 • Antioxydants synthétiques………………………………………………………..75
9-3.2 Test antioxydant par la méthode du radical stable DPPH par bioautographie………75 9-3.3 Test de l’activité antioxydante par la méthode du β−Carotène par bioautographie…76 9-3.4 Test de l’activité anti-radicalaire du radical stable DPPH…………………………...77 (1,1-diphenyl-2-picrilhydrazyl) 9-3.5 Dosage de l’activité antioxydante par spectrophotométrie ………………………….77
9-4 Test d’inhibition de l’acétylcholinestérase (AChE) par bioautographie……………………...78
15
Chapitre 4.Résultats et discussions 1- Les tests phytochimiques…………………………………………………………………….....80 2- La chromatographie sur couche mince…………………………………………………………85 2-1 CCM analytique…………………………………………………………………………….....85 2-2 CCM préparative………………………………………………………………………………85 3- Chromatographie sur colonne ouverte……………………………………………………….....86 3-1 Chromatographie sur colonne à petite échelle………………………………………………...86 3-2 Chromatographie d’exclusion moléculaire…………………………………………………....86 4- Isolement des produits…………………………………………………………………………..86 4-1 Isolement de F3 (Chromatographie sous vide)………………………………………………...86 4-2 Isolement de F4 (Chromatographie sous vide)………………………………………………...88 4-3 Isolement de F5..........................................................................................................................90 4-4 Isolement de F6 ……………………………………………………………………………….92 4-5 Spectroscopie UV des produits ……………………………………………………………….93 4-6 Spectrométrie Infra-Rouge (IR) du produit F4 ………………………………………………..93 5- Hydrolyse des produits …………………………………………………………………….......94 5-1 Hydrolyse acide……………………………………………………………………………….94 5-2 Hydrolyse alcaline…………………………………………………………………………….94 6- Extraction de l’huile essentielle …………………………………………………………….....95 6-1 Rendement…………………………………………………………………………………….95 6-2 Propriétés physiques ………………………………………………………………………….95 6-3 Etude chromatographique …………………………………………………………………….97
6-3.1 Analyse par chromatographie sur couche mince (CCM)……………………………97 6-3.2 Analyse par chromatographie en phase gazeuse (CG et CG/MS) …………………..97 7- Etude biologique et biochimique ……………………………………………………………...99 7-1 Teneur en polyphénols totaux et flavonoïdes ……………………………………………….99 7-2 Tests de l’activité antioxydante …………………………………………………………….101 7-2.1 Méthode bioautographique…………………………………………………………101 7-2.2 Test de l’activité antioxydante par spectrophotométrie…………………………….101 7-2.3 Test de l’activité anti-radicalaire par la méthode du DPPH ……………………….102 7-3 Tests de l’activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase (AChE) …………………………....106 par la méthode bioautographique Conclusion……………………………………………………………………….108 Références bibliographiques……………………………………………………111 Annexes…………………………………………………………………………..116
16
INTRODUCTION
17
INTRODUCTION
Notre monde renferme une infinité de plantes aux diverses et multiples utilisations.
Chez certaines d’entre elles, les vertus médicinales l’emportent sur les usages alimentaires,
condimentaires ou simplement ornementaux.
Plusieurs études ont montré que l’activité thérapeutique de certaines plantes est liée à la
présence de substances chimiques (huiles essentielles, saponines, flavonoïdes, alcaloïdes,
…etc.). Ces métabolites retiennent l’attention aussi bien pour leurs propriétés biologiques et
pharmacologiques que pour leur exploitation industrielle.
La flore Algérienne avec ses 3000 espèces appartenant à plusieurs familles botaniques
dont 15 % endémiques, reste très peu explorée sur le plan phytochimique comme sur le plan
pharmacologique.
A cet effet, nous avons entrepris l’étude phytochimique d’Ammodaucus leucotrichus ;
espèce qui à notre connaissance n’a fait l’objet d’aucune étude phytochimique.
Ammodaucus leucotrichus (Nessoufa) de la famille des Apiacées (anciennement
Ombellifères) est utilisée en thérapeutique traditionnelle, contre le diabète. L’extraction et
l’identification des principes actifs présents dans Ammodaucus leucotrichus permettraient
d’abord une meilleure connaissance biochimique de cette plante et donneraient une base
préliminaire pour l’usage thérapeutique éventuel de ces substances.
Notre objectif, dans un premier temps, est de mettre en évidence les phytoconstituants
des fruits d’Ammodaucus, de les isoler et les identifier par des méthodes
chromatographiques, spectroscopiques et chimiques.
18
Le second développement qui sera donné à ces résultats préliminaires dans une
perspective appliquée se rapporte à la réalisation de tests biologiques pour fournir un
fondement scientifique aux applications traditionnelles de cette plante.
Nous avons évalué la quantité des polyphénols en adaptant la méthode de Folin-
Ciocalteu, et celle des flavonoïdes en adaptant la méthode de Kim et al; 2003.
Dans un dernier temps, nous nous sommes intéressés à étudier l’activité antioxydante
des extraits d’Ammodaucus leucotrichus et l’activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase.
Notre mémoire est organisé en quatre chapitres :
• Le premier chapitre est consacré aux études antérieures sur la plante
• Dans le deuxième chapitre, les phytoconstituants des fruits d’Ammodaucus
leucotrichus sont mis en évidence.
• Le troisième chapitre est consacré à l’extraction de quelques métabolites secondaires,
puis l’analyse biochimique et biologique.
• L’interprétation et la discussion des résultas obtenus sont présentées dans le quatrième
chapitre.
• Enfin, une conclusion générale qui résume l’ensemble de résultats obtenus.
19
Partie
Bibliographique
20
1- Place d’Ammodaucus dans la systématique [1]:
- Embranchement : Magnoliophyta
- Sous-embranchement : Magnoliophytina
- Classe : Rosopsida
- Sous-classe : Cornidae
- Ordre : Araliales
- Sous-ordre : Aralianae
- Famille : Apiaceae
- Genre : Ammodaucus
- Espèce: leucotrichus.
2- Description de la famille des Apiacées :
Famille de plantes dicotylédones, très importante dans la flore algérienne où elle est
représentée par 55 genres. Ce sont des arbustes, plantes sous-frutescentes ou herbacées, très
variables à feuilles en général très divisées. Inflorescences ombelliformes munies à leur base
de bractées souvent très caduques simples, ou le plus souvent composées d’ombellules.
Fleurs de type 5, sépales en général très petits ou nuls ; avec des pétales libres.
Fruit constitué par un diakène couronné par le bourrelet calycinal [2].
3- Description botanique d’Ammodaucus leucotrichus :
Petite plante annuelle glabre à tiges dressées, rameuses, finement striées, feuilles très
divisées à lanières étroites, un peu charnues, ombelles à 2-4 rayons, involucre à bractées très
divisées [3]; fleurs blanches, toutes égales. Méricarpes allongés 6-9 x 4-5mm, à côtes
secondaires couvertes de longs poils soyeux très denses, crépus, jaune roux à la base, puis
blancs et longs de 8-10 mm.
Cette plante est très appréciée et ramassée, ce qui tend à la raréfier. C’est une plante à
très forte odeur d’anis [4].
21
Figure01 : Photo d Ammodaucus leucotrichus
22
4- Noms de la plante [5]:
Nom français : Cumin chevelu.
Nom anglais : Hairy cumin.
Nom arabe: Kûmun-Sûfi; Akaman.
Nom latin : Ammodaucus leucotrichus.
Nom vernaculaire : Nessoufa-Moudrayga.
5- Répartition géographique et habitat :
La distribution entière est basée au nord de l’Afrique (Algérie, Maroc, Tunisie, Libye,
elle s’étend jusqu'à l’Egypte et l’Afrique tropicale) [6]
Elle est assez commune dans tout le pâturage désertique [7] :
- Secteurs du Sahara septentrional et occidental
- Elle est rare dans le secteur du Sahara central.
6- Culture des Ombellifères :
L’extension des cultures au Sahara étant fonction des possibilités d’irrigation, l’étendue
des surfaces cultivées est nécessairement très réduite.
Les plantes cultivées au Sahara, sont très variées, en dépit de toutes ces difficultés. Une
étude d’ensemble, faite par Chevalier (1932) et Corti (1957), a donné également une liste des
végétaux cultivés au Fezzan, dans la quelle il cite quatre vingt treize espèces où l’on relève
sept Ombellifères utilisées comme condiment, parmi lesquelles on trouve Ammodaucus
leucotrichus.
7- Les sous-espèces d’Ammodaucus leucotrichus :
On distingue deux sous-espèces, qui se trouvent à des endroits différents: Ammodaucus
leucotrichus Cosson & Durieu subsp. leucotrichus, pousse au Sahara et Sub-Sahara de
l’Afrique du nord [8] et Ammodaucus leucotrichus Cosson et Durieu subsp. nanocarpus E.
Beltranpousse dans l’archipel macaronèsien [9].
.
23
Figure02 : Photo des Fruits d’Ammodaucus leucotrichus
24
8- Utilisation :
Les fruits d’Ammodaucus leucotrichus ce croquent et parfument l’haleine, on en
parfume le troisième thé.
En Afrique du nord, les fruits sont utilisés comme condiment et en médecine
traditionnelle marocaine, ils sont employés dans le traitement des coups du froid, fièvre et
troubles digestifs particulièrement pour les enfants [10]. La plante est utilisée aussi, sous
forme de décoction de fruits, pour le traitement du diabète.
9- Etude chimique :
L’étude des deux sous-espèces d’Ammodaucus leucotrichus n’a fait l’objet que d’une
seule étude chimique récente, celle-ci a porté sur la séparation et l’identification des
substances pouvant être obtenues à partir de la plante (fruits) séchée par hydrodistillation. On
y trouve entre autres, les monoterpènes α-pinène, β-pinène, myrcène, limonène et des
sesquiterpènes ainsi que d’autres composants [11].
Leurs structures ont été identifiées par la chromatographie en phase gazeuse et la
chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse.
Deux échantillons de fruits d’Ammodaucus leucotrichus subsp nanocarpus, ALN1 et
ALN2 ont été étudiés : ALN1 récolté à Santa Cruz de Tenerife en Tarajalejo plage (îles de
Canaries, Espagne), le 11 avril 2005 et ALN2 récolté en Chayofita montagne, Los cristianos,
Tenerife (îles de Canaries, Espagne), le17 avril 2005.
L’huile essentielle des fruits de l’espèce d’Ammodaucus leucotrichus subsp.
nanocarpus (ALN1, ALN2) se composent de (94.7-94.9%) de monoterpènes, (4.6-5.0 %) de
sesquiterpènes et (0.3-0.5 %) de différents composants.
La majorité de ces constituants sont le β-pinène (22.2-33.6 %), angelate de bornyle
(20.6-21.8 %), camphre (8.3-11.7 %), α-pinène (5.2-5.5 %), camphéne (3.3-3.8 %), sabinène
(3.7-7.0 %), myrcène (1.8-5.4 %), limonène (3.5-4.86 %), γ-terpène (4.6-5.6 %), acétate de
bornyle (4.7-5.0 %) et δ-cadinène (2.1-1.9 %).
25
Tableau 01: Récapitulatif des structures chimiques de quelques terpènes isolés de
l’ Ammodaucus leucotrichus Cosson & Durieu subsp. nanocarpus E. Beltran.
Nom du
Composé
Structure
Teneur en %
d’ALN1
Teneur en
%d’ALN2
Références
Β-pinène
22.2
33.6
[12, 13]
Camphre
O
11.7
8.3
[13, 14, 15, 16]
α-pinène
5.5
5.2
[12, 13]
Camphène
3.8
3.3
[12, 13]
Myrcène
5.4
1.8
[12, 13]
Limonène
4.0
3.5
[12, 13]
26
γ-terpinène
5.6
4.6
[12, 13]
Acétate de
bornyle
O C
O
CH3
5.0
4.7
[12, 13]
δ-cadinène
H
H
2.1
1.9
[13, 14, 15, 16]
ALN1 : Echantillon 1 de fruits d’Ammodaucus leucotrichus subsp. nanocarpus.
ALN2 : Echantillon 2 de fruits d’Ammodaucus leucotrichus subsp. nanocarpus.
L’échantillon ALL a été récolté en Afrique du nord, Sahara occidental, Dakhla
(Villacisneros), au printemps 2004.
L’huile essentielle des fruits de l’espèce Ammodaucus leucotrichus subsp, leucotrichus
ALL se composent de : 99.6 % de monoterpènes et 0.2 % de sesquiterpènes et plus 0.2 % de
γ–decalactone.
La majorité de ces constituants sont le périllaldéhyde 63.6 %, le limonène 26.8 %, l’α–
pinène 4.7 %, le β–pinène 1.4 %, le 3-hydroxyperillaldehyde 0.4 %, le méthyl perillate 0.5 %
et le périllalcool 0.2 %.
27
Tableau 02:Récapitulatif des structures chimiques de quelques terpènes isolés d’
Ammodaucus leucotrichus Cosson et Durieu subsp. Leucotrichus.
Composé Structure Teneur en % d’ALL Références
Périllaldéhyde
CHO
63.6
[13, 14, 15, 16]
Limonène
26.8
[12, 13]
α- pinène
4.7
[12, 13]
β- pinène
1.4
[12, 13]
3-hydroxy
périllaldéhyde
CHO
OH
0.4
[13, 14, 15, 16]
Périllate de méthyle
C
O
O CH3
0.5
[13, 14, 15, 16]
Périllalcool
CH2OH
0.2
[13, 14, 15, 16]
ALL : Echantillon des fruits d’Ammodaucus leucotrichus subsp. leucotrichus.
28
Une étude chimique effectuée sur la plante Ammodaucus leucotrichus a permis d’isoler
et d’identifier quatre composés[17,18] par des analyses spectroscopiques (RMN, IR, CPG et
CPG/SM), comme étant l’Ammolactone-A (1), l’Ammolactone-B (2), le dihydroxy acide (3),
le 3-Hydroxypérillaldéhyde (4) [19].
1
5
67
8
910
2
3
4
O12
11
H
H
OH
1513
14
O
O
16 17
18 19O
6
5
4
3
2
1
7CHO
8
10 9
OH
(1) (4)
O
OHH
H
OH
O
HO
CO2H
O
H
H O
(2) (3)
Figure03 : Structures chimiques des quatre composés isolés de la plante
essentielle.
29
Chapitre II
Les métabolites secondaires des plantes
30
Les métabolites secondaires des plantes :
Les métabolites secondaires sont des composés organiques qui ne sont pas présents de
façon permanente chez les plantes. Ils constituent les principes actifs des végétaux.
On distingue plusieurs catégories :
1-Les Saponines:
1-1 Définition :
Les saponosides (du latin : sapo = savon) sont une classe d’hétérosides très répandue
chez les plantes et les animaux marins. Ce sont des glycosides stéroïdiques ou triterpéniques
qui ont la propriété de former des solutions moussantes en présence d’eau et de précipiter le
cholestérol [20].
Elles sont aussi caractérisées par un poids moléculaire élevé. Elles contiennent un
aglycone appelé sapogénine ou sapogénol à structure stéroïdique (C27) ou tri terpénique (C30)
relié à une partie glucidique mono ou oligosidique [21].
1-2 Constitution chimique et structure :
L’hydrolyse d’une saponine, par l’action d’un acide ou d’enzymes, produit un sucre ou
plusieurs (dont souvent le glucose) et un aglycone nommé sapogénine selon que cette
dernière étant, soit un triterpène, soit un stéroïde, on distingue les saponines triterpènes et les
saponines stéroïdiques. Certains auteurs distinguent une troisième catégorie des saponines,
celles des amines stéroïdiques qui sont traitées par d’autres comme des alcaloïdes
stéroïdiques.
1-2.1 saponines triterpènes :
La plupart des saponines végétales appartiennent à ce groupe (environ 120 composés),
les plus nombreux existent chez les Angiospermes et pour l’essentiel chez les dicotylédones.
Leurs aglycones possèdent généralement une structure de base pentacyclique, plus rarement
tétracyclique. Les aglycones (sapogénines) du type triterpènes sont l’α-amyrine. β-amyrine,
l’acide ursolique et l’acide oléanolique, lupéol, etc [22]. (fig. 04)
31
1-2.2 Saponines stéroïdiques :
Les composés de ce groupe sont présents presque exclusivement chez les
Angiospermes Monocotylédones, les genres Dioscorea ; Smilax, Agave, Ruscus, Asparagus
et Yucca, sont particulièrement riches en saponines stéroïdiques [22].
1-2.3 Les alcaloïdes stéroïdiques :
Ils sont présents chez certaines plantes, notamment les Solanaceae, ils sont capables
d’incorporer un atone d’azote (issus de l’arginine) dans leur chaîne latérale. Il existe deux
types de sapogénines : les solanidanols et les spirosolanols [23]. (fig. 05)
Ce sont principalement des pentopyranoses (D-glucose, D-galactose) ou des acides
uroniques (acide D-glucuronique ou acide D- galacturonique).
Il existe également d’autres sucres encore plus rares qui font partie de la composition
des saponosides : L-arabinose, D-fructose et le quinovose. Ils sont présents sous la forme
d’oligoholosides de taille et de formes variées.
Tous les saponosides présentent en commun l’attachement d’une ou de plusieurs
chaînes osidique à l’aglycone
Les saponines monodesmosidiques, ont une seule chaîne glucidique attachée en C3. Les
saponines bidesmosidiques ont deux chaînes dont une souvent attachée en C3 par une liaison
éther et une attachée par une liaison ester en C28 (saponines triterpéniques) ou par liaison
éther en C28 (saponines de type furostanol) [24].
32
3 5
101
1312
15
18 22
21
20
19
28
29
2625
23
ho
30
27
24
A B
CD
HO
29 30
Type α –Amyrine Type β –Amyrine
(Ursanes) (Oléananes)
22
2119
HO
20
30
29
Type lupéol (Lupanes)
Figure04 : Structure des principaux squelettes des génines tri terpéniques
19
18
A B
C D
53
10
16
15
17
1
11
O
O
21
26
A B
C D
F
E
25
27
23
2220
Structure de la molécule du Stérane
Structure de la molécule du Spirostane
O
21
26
27
E
DC
BA
20 22
23
2425
Structure de la molécule de furostane
Figure 05 : Structure des principaux squelettes des génines stéroïdiques
33
N
ON
Solinidane Spirosolane
O
O
N
H
Gal3Glc
Rha2
Solasonine
Figure 06 : Principaux types de sapogénines stéroïdes alcaloïdiques
OO OHO
HO
OH
OH
HO
HO
OH
OH
HO
HO
OH
HOOC
OHOHOH
D- glucopyranose D- galactopyranose acide D- glucuronique
OO O
HO
HOOH
OH
HO
OH
HO
HO
OH
H3C
OHOHOH
D-xylopyranose L- arabinopyranose D- fucopyranose
OH3C
HO
HOHO
OH O
OH
OH
OH
HO
L-rhamnopyranose D-apiose
Figure 07 : Principaux monosaccharides rencontrés dans les saponines
34
1-3 Biosynthèse des saponines :
Les deux types structuraux des saponines : saponines stéroïdiques et saponines
tritérpéniques, présentent une étroite parenté, puisqu’ils proviennent de la même origine
biosynthétique : le squalène (figure 8). Ce composé hydrocarboné insaturé (C30 H50) se forme
par l’assemblage queue-queue de deux unités de farnésyl diphosphate en C15 (fig. 9). Il
apparaît tout d’abord le présqualène qui est ensuite transformé en Squalène.
L’acétyle-CoA sert comme un produit initial pour la synthèse d’un isoprène activé.
L’acide mévanolique est son précurseur direct. L’addition successive de trois isoprènes
conduit au farnésyl diphophate, qui représente le produit initial pour la synthèse des
triterpènes : c’est leur précurseur en C15 [25, 26].
H3C CH3
CH3 CH3 CH3 CH3CH3CH3
12'
15'15
1412
14'
Formule linéaire
CH3CH3
H3C CH3
CH3
H3C
CH3H3C
Formule cyclique
Figure 08 : Formule structurale de squaléne
H3C
CH3
CH3 CH3 CH3
CH3CH3CH3
H2C
O
H2C
O
P
P
P
P14
1215
12
1415
Figure 09 : L’assemblage queue-queue de deux unités de farnésyl disphosphate [28]
35
Les principales étapes de biosynthèse du squalène et la formation des sapogénines sont
schématisées dans la Figure 10
Acétyle - CoA (C2) + Acétyle - CoA (C2)
Acétoacétyl - CoA (C4)
Acide mévanolique (C6)
( I.P.P) Isopenthyl diphosphate (C5)( DMAPP ):Diméthylallyle pyrophosphate (C5)
( G.PP): Géranyl pyrophosphate (C10)
( F.PP ): Farnésyl pyrophosphate (C15)
Squaléne
- Sapogénines triterpéninespentacycliques(C30) ( B-Amyrine)-Sapogénines triterpéniques tétracycliques
- Sapogénines stéroidiques (C27) (Noyau spiostane)- Sapogénines stéroïdes alcaloïdes
Duplication
IPP
Isomérisation
Acétyle - CoA
Oxydation Oxydation
Figure10 : Biosynthèse des différentes sapogénines [27]
36
1-4 Propriétés physico-chimiques :
Les saponines se présentent comme des poudres blanches non cristallisées, ayant un
goût et une odeur désagréable lorsqu’elles sont chauffées. Elles sont solubles dans les
solvants polaires, et insolubles dans les solvants apolaires ou peu polaires [28].
1-4.1 Extraction :
Les saponines sont représentées en quantité notable sous forme de mélange complexe notable. Leur extraction passe en général par la délimitation de la drogue par les solvants apolaires.
Une extraction ultérieure au méthanol permet d’obtenir les saponines ainsi que d’autres
substances polaires [29].
1-4.2 Séparation :
L’utilisation de techniques chromatographiques permet d’obtenir des molécules pures :
une succession de séparations sur différents supports, tels que la chromatographie sur
couches minces, chromatographie à basse pression. …..etc. [29].
1-4.3 Caractérisation :
L’activité hémolytique des saponines est un moyen de leur mise en évidence et leur dosage. Cette évaluation se fait par des techniques spectrophotométriques.
La caractérisation des saponines peut se faire aussi par chromatographie sur couche
mince, en utilisant un solvant de migration et des révélateurs, spécifiques aux saponines tels
que le trichlorure d’antimoine, la vanilline, le réactif de Komarowsky…..).
Un autre indice permet de mettre en évidence les saponines, c’est l’indice de mousse. Il
est déterminé sur un décocté, obtenu par ébullition prolongée (30 minutes) de 1g de drogue
dans 100 ml d’eau. L’indice de mousse est donc le degré de dilution de ce décocté [29].
1-4.4 Dosage :
Le dosage peut être colorimétrique ou spectrophotométrique après séparation des
constituants par CCM et élution des taches ou faire appel à l’HPLC [29].
Dans la pratique, cette technique n’est utilisée que pour les saponines qui présentent un
chromophore spécifique ce qui n’est pas la règle générale.
37
1-5 Propriétés biologiques et pharmacologiques :
Les saponines doivent leur nom à leur propriété de baisser la tension superficielle [30].
Les plantes à saponines ont les effets suivants :
- Elles facilitent la pénétration des autres substances au niveau de la peau, de l’intestin
et de toutes les muqueuses.
- Elles dissolvent les graisses et, par voie de conséquence, elles sont irritantes pour les
muqueuses.
- On les emploie dans la fabrication des shampoings et comme expectorants.
- Elles sont utilisées pour supprimer les nausées de la femme enceinte, en cas de
dysménorrhée crampoïde, colique vésiculaire, rhumatisme.
- Elles ont un effet cholagogue, antispasmodique et diaphorétique.
- Les saponosides sont des molécules naturelles complexes ayant des activités
antiallergiques, antivirales, hypoglycémiantes, antifongiques, antitumorales, etc. [31, 32].
1-6 Intérêt des saponines pour la plante :
In vivo, les saponines assurent la défense du végétal contre les attaques microbiennes et
fongiques. Dans le cas du lierre, les feuilles renferment une enzyme qui hydrolyse
l’hédérasaponine C (un bidesmoside inactif) en α-hédérine (un monodesmoside fortement
antibiotique) [33].
Certaines saponines sont également actives sur des virus (glycyrrhizine), c’est la
conséquence de la réaction de ces saponines avec les stérols membranaires du micro-
organisme.
38
2- Les Alcaloïdes :
2-1 Définition :
Les alcaloïdes sont des bases azotées hétérocycliques à caractère alcalin contenus
essentiellement dans les plantes [34].
A forte dose, ils sont toxiques. Ils possèdent une remarquable activité physiologique qui
conduit à l’emploi de certains d’entre eux en thérapeutique : morphine, quinine, atropine,
cocaïne, etc.… [35].
2-2 Classification selon la structure chimique:
Dans le premier cas, on classe les alcaloïdes en fonction de la nature de l’amine
primaire (mescaline), secondaire (éphédrine), tertiaire (hordéine) ou ammonium quaternaire
(muscarine).
Dans le deuxième cas, les alcaloïdes sont classés selon la grandeur et la complexité
croissante de l’hétérocycle azoté [36].
L’énumération suivante peut en donner un aperçu (les formules développées sont
données dans le tableau 03)
Dérivés de la pyrrolidine : hygrine.
- de la pyrrolizidine : retronécine.
- des pyridines et pipéridine : confine, nicotine.
- du tropane : hyoscyamine, cocaïne.
- du lupinane : spartéine.
- de l’indole et ses dérivés : ergobasine, strychnine, yohimbine.
- de la quinoléine : quinine.
- de l’isoquinoléine : émétine, berberine.
- du phénanthréne et de la benzylisoquinoléine, morphine, papavérine.
- de la tropolone : azote extracyclique, colchicine.
- des stéroïdes : solanidine.
On rattache à ce groupe les importantes amines stéroïdiques (holaphyllamine,
kurchessine, conessine) ou terpéniques (aconitine, delphinine, lycoctonine, atisine);
alcaloïdes à structures diverses (maytansine, palustrine, frangufoline).
39
Tableau 03: Structure chimique des alcaloïdes.
Alcaloïdes Dérivés
N
CH3
Pyrrolidine
N
CH3
CH2 CO OCH3
Hygrine
N Pyridine N
CH3
Nicotine
N
H Pipéridine
N
H
CH2 CH2 OCH3
Coniine
N
H3C
Tropane
N
H3C
COOCH3
O C
O
C6H5
Cocaïne
N
N
H Imidazole
N
N
H
CH2 CH2 NH2
Histamine
N
H Indole
NN
H
H3COOC
OH Yohimbine
N
Isoquinoléine
NH3CO
H3CO
H3CO
OCH3
Papavérine
40
2-3 Propriétés physico-chimiques :
Les alcaloïdes ont des masses moléculaires variables, mais relativement faibles
puisqu’elles ne dépassent guère, actuellement 800 [37]. Quelques exemples sont donnés dans
le tableau 4 :
Tableau04: Masses moléculaire des principaux alcaloïdes
Masses moléculaires des principaux alcaloïdes
Coniine C8 H 17 N 127.2
Hygrine C8 H15ON 141.2
Atropine C17 H 23 O 2N 289.3
Emétine C29 H 40 O 4 N 2 480.6
Aconitine C34 H 47 O 11 N 645.7
Nicotine C10H 14N 2 62.2
Pilocarpine C11H16O 2N 2 208.2
Quinine C20H 24O 2N 2 324.4
Réserpine C33H40O9N2 608.7
Protovératrine B C41H63O15N 809.9
Un petit nombre d’entre eux sont liquides à la température ordinaire ; ils sont alors
volatiles et odorants et souvent non oxygénés ; c’est le cas de la coniine, de la nicotine et de
la spartéine, mais ce n’est pas une règle car la tricanthine, la lysergine, la calycanthine,
libogamine sont solides et non oxygénés.
Au contraire il est assez exceptionnel qu’un alcaloïde oxygéné soit liquide, on peut citer
l’hygrine, cuscohygrine, la pilocarpine, la mescaline, l’arécoline [38].
2-4 Rôle dans la plante :
Il n’est pas encore bien compris. On continue à considérer les alcaloïdes comme des
substances de déchet que la plante cherche à éliminer ; leur localisation périphérique semble
justifier ce point de vue.
Il est remarquable aussi de constater que la fonction acide n’est jamais libre, mais
estérifiée en général par l’alcool méthylique ou sous forme d’amine CO–NH- qu’il en est de
même pour la fonction phénol qui est estérifiée sous la forme méthoxyde OCH3 alors que
l’atome d’azote est souvent méthylé. Tous ces processus renforcent la thèse d’un mécanisme
de détoxification et d’élimination [39].
41
2-5 Intérêts thérapeutiques :
Certains alcaloïdes sont toxiques mais conservent encore une place importante en
thérapeutique [40, 41].
• La morphine : demeure un sédatif incomparable de la phase terminale
des affections cancéreuses.
• La codéine : est un spécifique de la toux.
• La cocaïne : anesthésique local.
• La réserpine : a été très longuement utilisée dans le traitement de
longue durée de l’hypertension et aussi comme neuroleptique dans les psychoses
avec agitation.
• La pilocarpine : qui est un parasympathomimétique muscarinique est
utilisée de longue date
• L’eserine : est aussi un parasympathomimétique employé en
ophtalmologie sous forme de collyres huileux ou aqueux
• La papavérine et la quinidine : sont employées dans les maladies du
cœur : angine de poitrine, tachycardie, arythmie en général.
• L’éphédrine : est utilisée dans le traitement de l’asthme, du coryza et
des rhinites allergiques.
• La colchicine : n’a pas été détrônée dans le traitement de la goutte.
3- Les Polyphénols :
Les composés phénoliques sont largement répandus dans la nature, notamment dans les
végétaux, avec plus de 6000 molécules, où ils contribuent à développer l’arôme et les
couleurs [42]. Les polyphénols permettent aux végétaux de se défendre contre les ultraviolets
et de lutter contre les pathogènes. Ce sont des substances organiques qui se reconnaissent par
la présence d’un ou de plusieurs groupes hydroxyles modifiés ou pas, attachés à une structure
aromatique ; ces composés contiennent du carbone, de l’hydrogène et de l’oxygène.
Les deux principaux groupes présents dans l’alimentation sont les flavonoïdes et les
acides phénoliques.
42
3-1 Flavonoïdes
3-1.1 Définition :
Le terme flavonoïde rassemble une large gamme de composés appartenant à la famille
des polyphénols [43]. Plus de 4000 types de flavonoïdes ont été identifiés dans les aliments
végétaux.
Les flavonoïdes sont des pigments quasiment universels des végétaux, presque toujours
hydrosolubles [44]. Ils sont responsables de la coloration des fleurs, des fruits et parfois des
feuilles. Quand ils ne sont pas directement visibles, ils contribuent à la coloration par leur
rôle de co-pigments ; ils sont également présents dans la cuticule foliaire et dans les cellules
épidermiques des feuilles, assurant ainsi la protection des tissus contre les effets nocifs du
rayonnement ultraviolet [45].
Les flavonoïdes possèdent un squelette de base à quinze atomes de carbone constitué de
deux cycles en C6 (A et B) reliés par une chaîne en C3 [46].
A
B
C6C3 C6
Figure 11 : Squelette de base des flavonoïdes
3-1.2 Dénomination et Nomenclature :
Le mot « flavone » provient du latin flavus qui signifie jaune.
L’expression «flavonoïde » a été introduite en 1952 par GEISSMAN et HINREINER,
pour désigner tous les pigments ayant un squelette C6-C3-C6 analogue à celui des flavones
(y compris les anthocyanes). Selon la structure des aglycones, on distingue plusieurs groupes
de flavonoïdes [45].
43
� Les Flavones : (Lutéoline, apigénine) :
Elles sont particulièrement abondantes chez les légumineuses et elles dérivent des
flavonones par une oxydation qui introduit une seconde double liaison dans l’hétérocycle.
� Les Flavonols: (Quercétine, myricétine, Kaempférol) :
Ils se différencient des flavones par la présence d’un OH en C3
� Les Flavanones: (Naringenine, hesperetine) :
Dérivent des chalcones par une cyclisation au centre du squelette d’où un hétérocycle ;
elle est réalisée par la chalcone isomérase (CHI)
� Les Chalcones :
Le mot « chalcone » provient du mot grec chalcos (cuivre). Elles gardent la structure du
tétra ou trihydroxychalcone.
On peut signaler deux autres types de composés dont la distribution dans les plantes est
plus restreinte.
• Isoflavones :
Dérivent aussi des flavanones, mais outre une oxydation centrale ; il y’a transposition
du cycle latéral du C2 au C3 de l’hétérocycle.
• Aurones :
Le mot «aurone» provient du latin aurun (Or).
Ce sont des homologues des flavones, mais à hétérocycle pentagonal.
Les quatre classes de flavonoïdes se trouvent à l’état naturel sous forme d’aglycones,
mais surtout sous forme de glycosides [47].
44
O
OH
HO OHO
OH
OH
OO
C
O
OH
OH
HO
O
R
OH
1'
2' 4'
5'
6'
3
2
45
6
7
8
R
OH
O
OH
HO
O
R
OH
1'
3'
2' 4'
5'
6'
345
6
7
8
H
2
C
HO
OH O
R
OH
4
56
1
3
2
5'
6'
3'
4'
2'
1'
OHO
OH O OH
Flavone
ChalconeFlavanone
Flavonol
Isoflavone Aurone
3'
Figure 12 : Structures des différents types de flavonoïdes
3-1.3 Biosynthèse des flavonoïdes :
La biosynthèse des flavonoïdes présente un intermédiaire commun, une tétrahydroxy-
chalcone à partir de laquelle se différencient plusieurs types de composés dont les plus
importants sont les anthocyanes et les flavones précurseurs des tanins condensés.
Les flavonoïdes sont synthétisés au niveau du chloroplaste à partir des cinnamoyles-
CoA provenant du réticulum endoplasmique ; combinés ou sous forme d’hétérosides. Ils
quittent le chloroplaste et s’accumulent dans la vacuole [48].
45
C CH3
S CoA
CH
NH2COOHCH2
SC CoA
O
H2CCOOH
Phényl Alanine
Voie de shikimate
Enythrose- -phosphate (pentose phosphate)
Phosphoénol pyruvate (glycolyse)
Acétyl - CoA
Voie de l'Acétate malonate
4 - Coumaroyl - CoA
3
Malonyl- -CoA
Chalcone synthase reductaseChalcone synthase
4',2',4'- Trihydroxychalcone
4',2',4',6'- Tetrahydroxychalcone
O
O
R1R2
R3
B
OH
O
O
HO
OH
R1R2
R3
B
OHO
R1
R2
R3
A
A
A
B
OHO
OHOH
O
Flavonol
Flavonesynthase
Flavanone3- -hydroxylase
Flavonol
Flavonolsynthase
Isoflavones
5- Desoxyflavanone(liquiritigénine)
5- OH Flavanone (naringénine)
Dihydroflavonol
Dihydroflavonolréductase
Anthocyanidines
Flavon 3 - 4 diol et flavon - 3 - ol
Proanthocyanidines Catéchines
Tanins condensés
Chalcone isomérase
Figure 13 : Biosynthèses des différences flavonoïdes [49].
3-1.4 Rôle des flavonoïdes dans la coloration des végétaux :
46
Les flavonoïdes (pigments hydrosolubles), sont avec les chlorophylles et les
caroténoïdes (pigments liposolubles), les principaux facteurs de la coloration des plantes.
Ces substances sont responsables des colorations rouge, bleue et violette des organes
végétaux. Ils participent aussi aux colorations jaunes dans quatre cas [50] :
-Intervention des chalcones et aurones qui sont d’un jaune foncé (dahlia) ; la couleur
des pétales, exposé à des vapeurs d’ammoniaque, vire au rouge.
-Intervention d’anthocyanidines non hydroxylées en position 3 (Apigénidine et
lutérolinidine).
-Intervention des flavonols, en particulier : quercétagétine et gossypétine hydroxylée,
qui se rencontrent dans certaines variétés de primevères et rhododendrons.
-Intervention des bétaxanthines (pigments jaune azote). Les fleurs crème ivoire ou
blanches contiennent pratiquement toutes les flavonoïdes incolores (flavones et flavonols) qui
ne sont pas responsables de la coloration, mais peuvent la modifier.
3-1.5 Propriétés physico-chimiques :
� Solubilité et extraction :
En général les hétérosides sont hydrosolubles et solubles dans les alcools, lorsqu’ils ont au moins un groupe phénolique libre.
Ils se dissolvent dans les solutions d’hydroxyles alcalines.
Les flavonoïdes lipophiles des tissus superficiels des feuilles sont directement extraits
par des solvants moyennement polaires.
Les hétérosides sont extraits généralement à chaud par l’acétone ou par des alcools
(éthanol-méthanol) additionnés d’eau (20 % à 50 %). Il est possible de mettre en œuvre une
série d’extractions liquide-liquide par des solvants non miscibles, par l’éther de pétrole ou
l’hexane qui éliminent la chlorophylle. Le diethyl-éther extrait des génines libres.
L’acétate d’éthyle entraîne la majorité des hétérosides.
Les sucres libres restent dans la phase aqueuse avec les hétérosides les plus polaires.
La séparation et la purification des différents flavonoïdes s’effectuent par
chromatographie (sur polyamide, cellulose, ou gel de Sephadex) [51].
� Caractérisation :
Plusieurs réactions colorées permettent de mettre en évidence les génines et
hétérosides, dans les extraits bruts. L’étude de ces extraits est dominée par une analyse en
CCM.
47
L’étude du chromatogramme peut se faire :
- Directement : chalcones et aurones sont directement visibles sur les
chromatogrammes. En présence de vapeur d’ammoniac ; les taches passent à l’orange et au
rouge.
- Par un examen en lumière ultraviolette (UV) avant et après pulvérisation par des
révélateurs spécifiques. L’observation est spécifique selon le type de révélateur (tableau 5).
- La spectrométrie de masse et la RMN (résonance magnétique nucléaire) restent les
méthodes finales pour l’identification définitive de la molécule [58].
� Dosage :
Les méthodes de dosage sont le plus souvent colorimétriques ou spectrophotométriques
[51].
3-1.6 Propriétés pharmacologiques et biologiques des flavonoïdes :
Les flavonoïdes sont connus depuis de longues années pour leurs diverses propriétés
pharmacologiques :
Les flavonoïdes ont un effet hypoglycémiant, hypocholestérolémiant.
Ils favorisent la relaxation vasculaire et empêchent l’agglutination des plaquettes
sanguines. Par conséquent, ils réduisent la coagulation du sang et le rendent plus fluide. De
plus, ils agissent comme antioxydant.
Les flavonoïdes peuvent être anti-allergiques, hépatoprotecteurs antispasmodiques,
antibactériens, antiviraux in vitro (3-hydroxy et 3-méthoxyflavones non hétérosidiques).
Un petit nombre d’entre eux sont anticancérigènes et inhibiteurs de la croissance des
cellules tumorales [51].
48
Tableau 05 : Les différents types de révélateurs des flavonoïdes [59].
Coloration Révélateur particulier Nature de
l’aglycone
Coloration en
lumière visible U.V U.V +
NH3 Nature Coloration
Acide
cinnamique
bleue Bleue ou
bleue-
vert
Acide
coumarique
Bleue Bleue
Anthocyanidine Rouge
Flavane Vanilline
chlorhydrique
(*)
Rouge
Flavone Jaune- pâle Brun-
noir
Jaune-
brillant
Neu (**) Brun- noir
Flavonol Jaune- pâle Jaune-
brillant
Jaune-
brillant
Neu (**) Jaune
Isoflavone Pourpre
pâle
Pourpre
pâle
AlCl3 en U.V
(**)
Fluorescence
jaune
Flavanone Jaune-
pâle
AlCl3 en U.V
(***)
Fluorescence
verte
Aurone Jaune- pâle Jaune-
brillant
Rouge
brillant
Chalcone Jaune Brun-
noir
Rouge
foncé
(*) 1 g de vanilline dissous dans 10 cm3 d’HCl concentré.
(**) 2-Aminoéthyle diphénylborinate (1%) dans le méthanol + PEG 4000 (5%) dans
l’éthanol.
(***) Solution de chlorure d’aluminium à 5% dans l’alcool éthylique à 95%. Toutes les
classes de flavonoïdes réagissent.
.
49
3-2Les acides phénoliques :
3-2.1 Définition
Les acides phénoliques sont tous des composés organiques possédant au moins une
fonction carboxylique et un hydroxyle phénolique, dérivés des acides benzoïques (C6 – C1)
ou des acides cinnamiques (C6 – C3).
3-2.2 Les acides phénoliques dérivés des acides benzoïques :
Les formules des principaux acides benzoïques (acides p-hydroxybenzoïque,
protocatéchique, vanillique, gallique et syringique) ainsi que les acides salicyliques et
gentisique qui possèdent un OH en ortho par rapport à la fonction acide [53].
COOH COOHHO
Acide benzoïque Acide p-hydroxybenzoïque
COOHHO
RO
RO
RO
HO COOH
R=H, acide protocatéchique R=H, acide gallique
R=CH3, acide vanillique R= CH3, acide syringique
OH
R
COOH
R=H, acide salicylique
R=OH, acide gentisique
Figure14 : Les principaux composés phénoliques naturels (formules des
principaux acides benzoïques)
50
3-2.3 Les acides phénoliques dérivés des acides cinnamiques :
Les acides cinnamiques sont au nombre de quatre ; pratiquement tous les organes
végétaux contiennent au moins l’un d’eux. Tous les acides phénols se rencontrent dans la
nature sous forme de combinaisons, généralement de type ester. Ces combinaisons sont
actuellement assez bien connues dans le cas des acides cinnamiques (combinaisons avec
l’acide quinique, les sucres, l’acide tartrique) ; l’acide chlorogénique, ester de l’acide
caféique et de l’acide quinique, est la combinaison la plus classique.
HC
HCHO
HC
CH COOH
COOH
Acide cinnamique Acide p-coumarique
RO
HOHC
H3CO
HO
H3CO
HC
HC
HC COOH COOH
R=H, acide caféique Acide sinapique
R= CH3, acide férulique
Figure15 : Structures des principaux acides cinnamiques.
3-3 Les Tanins :
3-3.1 Définition :
Le mot tanin est largement utilisé en chimie végétale pour désigner un grand nombre de
substances répandues dans les plantes.
Ce sont des composés phénoliques complexes d’origine végétale, ayant une masse
moléculaire comprise entre 500 et 3000. En plus des réactions classiques des phénols, ils ont
la propriété de précipiter les alcaloïdes, la gélatine et de rendre la peau imputrescible en se
fixant sur les protéines [54, 55].
51
3-3.2 Constitution chimique et structure :
Chez les végétaux supérieurs, il existe deux groupes de tanins différents par leur
structure aussi bien que par leur origine biosynthétique :
� Les tanins hydrolysables sont caractéristiques des dicotylédones, rencontrés
notamment chez les Rosidae, dans tous les organes (racine, tige, feuille, fruit avant maturité).
� Les tanins condensés rencontrés chez l’ensemble de végétaux, des fougères aux
plantes à fleurs [53].
� Tanins hydrolysables :
Les tanins hydrolysables donnent par hydrolyse un ose et un nombre variable de molécules d’acide phénolique, d’acide gallique ou d’acide ellagique [55].
• Les tanins galliques sont constitués d’un noyau central, de glucose et
de chaînes latérales (en position 1, 2, 3, 4 ou 6 du glucose) comprenant 1 à n
monomères d’acide gallique.
• Les tanins ellagiques sont des molécules complexes et rigides,
constituées par des liaisons carbone-carbone entre les noyaux benzéniques de
l’acide gallique et une molécule de glucose [55].
R=H, Pédunculagine
OHHO
HO
HO
HOOH
HO
HO OH HO OH
OH
O OO O
O
OO
O OOR
52
HO
HO
HO
COOH
O
O
HO
HO OH
OH
O
O Acide gallique Acide ellagique
Figure16 : Exemples de structures de tanins hydrolysables
� Tanins condensés ou proanthocyanidols :
Les tanins condensés sont des polymères constitués par des unités de flavan-3-ols (catéchol, épicatéchol,….) liées entre elles par des liaisons carbone–carbone [53].
OHO
OH OHO
OH
OHOH
OHOH
OH
OH
A C
B
Figure17 : Exemple de structure de tanins condensés
3-3.3 Propriétés pharmacologiques et biologiques des tanins :
Les tanins sont des corps utilisés en tannerie en raison de leur propriété de transformer
les peaux animales fraîches en cuir imputrescible et peu perméable et de coaguler les
protéines du derme d’où leur utilisation dans le tannage des peaux. Les tanins précipitent les
protéines de la salive, ceci rend les tissus riches en tannins peu consommables par les
herbivores.
Les tanins exercent un effet antidiarrhétique, antiseptique. Ils favorisent la régénération des tissus en cas de blessures superficielles ou de brûlures.
Les procyanidols sont utilisés en pharmacie dans l’insuffisance veineuse. Ce sont des inhibiteurs enzymatiques [53].
On peut en outre les utiliser en cas d’empoisonnement par les alcaloïdes car ils les précipitent et les rendent inoffensifs (sauf pour la cocaïne, la morphine et la nicotine).
53
De même la teneur élevée en tanins rencontrée chez les plantes parasitées joue un rôle
de défense contre les bactéries et les champignons en précipitant les enzymes extracellulaires
sécrétées par les microorganismes [53].
3-4 Les coumarines:
3-4.1 Définition:
L’origine du nom coumarine est « coumarou », nom vernaculaire de la Fève Tonka
(Coumarouna odorata) d’où fut isolée, en 1820, la coumarine.
Les coumarines sont des composés phénoliques ayant un squelette de base en C6-C3.
O1 O
3
5 46
7
8
2
3-4.2 Constitution chimique et structure :
On peut considérer que les différentes coumarines dérivent des acides cinnamiques
ortho-hydroxylés, de même que la coumarine elle- même dérive de l’acide ortho-coumarique.
De nombreuses coumarines sont connues mais leur répartition dans la nature est assez
limitée ; les plus fréquentes sont l’umbelliférone, l’aesculétine et la scopolétine, dont les
substitutions correspondent, respectivement, aux acides p-coumarique, caféique et férulique
[56].
54
OH
HC CH COOH CH
CH
O O
Acide O - Coumarique Coumarine
O1
CH
HC
OHO
R
CH
CH
O
R'
HO
R
O
R=H ; UmbelliféroneR=OH ; AesculétineR=OCH3 ; Scopolétine
R=OCH3 , R'=H ; FraxétineR=H , R'=OH ; Daphnétine
Figure18 : les principaux composés des coumarines
3-4.3 Propriétés pharmacologiques et biologiques des coumarines :
Comme les autres composés phénoliques, les coumarines se rencontrent dans la nature
sous forme de combinaisons, qui sont des hétérosides.
Les coumarines sont solubles dans les solvants organiques tels que l’éther, les solvants
chlorés et les alcools. Leurs formes hétérosidiques sont plus ou moins solubles dans l’eau.
Elles ont une absorption caractéristique en UV.
Elles sont toxiques par leur propriété cancérigène et mutagène, mais certaines d’entre
elles telles que les furanocoumarines comme le bergaptène sont employées en cosmétologie,
en pharmacie comme des photosensibiliseurs du bronzage [57].
3-5 Les anthocyanes :
3-5.1 Définition :
Le mot « anthocyane » est certainement le plus ancien puis qu’il a été introduit par Marquart des 1835 : il provient des mots grecs anthos (fleur) et kyanos (bleu) [58].
A l’état naturel, elles existent comme les autres classes de flavonoïdes sous forme de glycosides dont 300 environ ont été identifiées. Elles se trouvent en quantité importante dans certains fruits en particulier dans les baies de fruits rouges. Leur teneur augmente avec la maturation des fruits.
3-5.2 Constitution chimique et structure :
55
Les anthocyanes ont une structure de base commune, le cation flavylium ou le 2-phényl-1-benzopyrilium [59]. Les formules de quelques anthocyanidines sont données dans le tableau suivant :
+OHO
OH
OH
7
6
5
3
2
1
6'
5'
4'
3'
2'
4
8
Tableau 06 : Nomenclature des anthocyanidines 3, 5, 7 hydroxylés.
Anthocyanidines 3’ 4’ 5’
Pélargonidine H OH H
Cyanidine OH OH H
Delphinidine OH H OH
Malvidine OCH3 OH OCH3
Pétunidine OH OH OCH3
3-5.3 Propriétés pharmacologiques et biologiques des anthocyanes :
Les anthocyanes à dose modeste dans une plante donnent des vertus antiseptiques à
celle-ci, mais à forte dose, elles sont des poisons.
Elles sont peu utilisées dans l’industrie alimentaire et cosmétique, et ceci du fait de leur
instabilité vis à vis des facteurs physico-chimiques incontournables (lumière, température et
pH), ainsi que par leur sensibilité aux sulfites (souvent utilisés comme conservateurs), aux
métaux (présents dans les boites de conserves) [59].
Comme tous les flavonoïdes, les anthocyanes augmentent la solidité des capillaires.
Elles inhibent les enzymes protéolytiques de dégradation. Elles sont proposées en
ophtalmologie en cas de troubles occulaires et pour l’amélioration de la vision crépusculaire.
3-6 Les quinones :
3-6.1 Définition:
56
Les quinones sont des composés du benzène dans lequel deux atomes d’hydrogène du
noyau sont remplacés par deux atomes d’oxygène [60].
Ce sont des pigments jaunes à rouges violets que l’on rencontre dans les règnes animal
et végétal ; leur existence est cependant souvent masquée par d’autres pigments, ou bien
encore par leur situation à l’intérieur des organismes.
3-6.2 Constitution chimique et structure :
Les quinones sont des composés oxygénés, caractérisés par le motif 1,4-
dicétocyclohexa-2,5-diénique (p-quinone) ou par celui du 1,2-dicétocyclohexa 3,5-diénique
(o-quinone).
Elles sont répandues dans les fleurs, les champignons et les algues à l’état libre ou sous
forme d’hétérosides. Les quinones sont classées en benzoquinones, naphtoquinones,
anthraquinones, anthracyclinones, selon le noyau présent dans la molécule [59].
O
O
3
6
5
4
2
1
O
O2
3
4
5
6
1
p-Quinone o-Quinone
O
O
R2
R1
R3
R1 =OH, R2=H, R3=CH3 : PlumbagoneR1 =OH, R2= R3=H : JugloneR1 = R2=H, R3=OH : Lawsone
Figure19 : les principaux composés des quinones
57
3-6.3 Propriétés pharmacologiques et biologiques des quinones :
Les quinones libres sont solubles dans les solvants organiques et insolubles dans l’eau.
Leurs hétérosides sont solubles dans l’eau et les solutions hydro-alcooliques. Elles absorbent
dans le domaine UV.
Ces substances sont souvent très réactives ; elles peuvent colorer la peau par suite de
combinaisons avec les groupes amines (NH2) libres des protéines ; certaines, en particulier les
hydroquinones, sont utilisées comme teintures pour fibres textiles (formation de laques) [61].
4- Les huiles essentielles :
4-1 Définition :
Les huiles essentielles sont des « principes volatiles » ou « essences végétales »
contenus dans les végétaux et que l’on peut extraire en utilisant plusieurs procédés [62].
Le plus souvent :
• Par distillation simple à la vapeur d’eau des plantes ou de certains de leurs organes
On mélange les plantes, parfois broyées, avec de l’eau que l’on porte à ébullition dans
un alambic et on recueille le distillat ; l’huile essentielle est entraînée par la vapeur d’eau
mais elle se sépare très vite de l’eau. Etant insoluble dans celle-ci ; selon sa densité, elle
surnage (le plus souvent) ou coule au fond du récipient.
Il existe d’autres procédés : distillation à vapeur saturée avec surpression (la
température est plus élevée) et distillation par hydrodiffusion (la vapeur d’eau chaude passe à
travers la masse de la plante aromatique) [63].
• Par expression (pressage) le plus souvent après dilacération mécanique : cette
technique est essentiellement utilisée pour recueillir l’huile essentielle des peaux (épicarpes)
de Citrus (citrons, oranges, mandarines, pamplemousses) [64].
Plus accessoirement :
• Par dissolution dans un corps gras ; c’est la technique de l’enfleurage que l’on
peut pratiquer à chaud ou à froid [65].
• Par extraction à l’aide d’un solvant (exemples : éther, hexane).
• Par extraction par le gaz carbonique « supercritique » [66].
58
Ces trois dernières techniques permettent d’obtenir des extraits de plantes qui
théoriquement ne s’appellent plus huiles essentielles bien que très proches du point de vue
chimique ; ce sont les essences concrètes, les résinoïdes, et les absolues (ces dernières sont
des produits d’extraction des concrètes et des résinoïdes par l’alcool éthylique (éthanol), la
solution éthanolique est filtrée puis distillée, le résidu c’est l’absolu).
4-2 Localisation des huiles essentielles :
Toutes les parties des plantes aromatiques, tous leurs organes végétaux, peuvent contenir de l’huile essentielle.
• Les fleurs bien sur, exemples : oranger, rose, lavande ; le bouton floral (girofle) ou les
bractées (ylang-ylang).
• Les feuilles très souvent, exemples : eucalyptus, menthe, thym, laurier, sarriette,
sauge, aiguilles de pin et sapin.
• Les organes souterrains, exemples : racines (vétiver), rhizomes (gingembre, acore).
• Les fruits, exemples : fenouil, anis, épicarpes des Citrus.
• Les graines : noix de muscade.
• Le bois et les écorces, exemples : cannelle, santal, bois de rose [67].
4-3 Rôle des huiles essentielles :
Les huiles essentielles sont stockées dans des structures cellulaires spécialisées (cellules
à huile essentielle, cellules à poils sécréteurs (comme dans la menthe), canaux sécréteurs et
ont vraisemblablement un rôle défensif : protection du bois contre les insectes et les
champignons, action répulsive contre les animaux herbivores [67, 68].
Les spécialistes considèrent les huiles essentielles comme des sources de signaux
chimiques permettant à la plante de contrôler ou réguler son environnement (rôle
écologique) : attraction des insectes pollinisateurs, action répulsive sur les prédateurs,
inhibition de la germination des graines, voire communication entre les végétaux (émission
de signaux chimiques signalant la présence d’animaux herbivores par exemple) [69].
La concentration dans les plantes est en général faible, aux alentours de 1 à 2 % voire
moins, mais il y a des exceptions comme le clou de girofle avec 15 % d’huile essentielle ou la
noix de muscade, 5-15 %.
59
Parmi les familles végétales les plus productrices d’huiles essentielles, on distingue les
Lamiaceae (famille du thym, de la lavande, de la menthe, du basilic etc.….), les Asteraceae
(camomille, absinthe….), les Myrtaceae (Eucalyptus, melaleuca, myrte, girofle…..), les
Lauraceae (cannelle, laurier…..).
Beaucoup de végétaux contiennent des huiles essentielles ou des substances voisines
mais, en pratique, peu d’espèces sont utilisées [68].
4-4 Propriétés chimiques :
A la température ambiante, les huiles essentielles sont généralement liquides incolores
ou jaune pâle, sauf quelques exceptions (les H.E à azulène de couleur bleue).
Elles sont peu solubles dans l’eau et solubles dans les solvants organiques (éther,
alcools, hexane, pentane,….). Ce sont des substances odorantes et volatiles [70].
Une huile essentielle n’a rien à voir avec une huile végétale obtenue par pression. Une
huile essentielle ne contient en effet pas de corps gras.
Une huile essentielle contient de nombreuses molécules chimiques différentes. La
chromatographie en phase gazeuse est une technique qui permet d’étudier la composition des
huiles essentielles.
4-5 Propriétés médicinales :
Beaucoup d’huiles essentielles ont des propriétés médicinales qui ont été utilisées en
médicine traditionnelle depuis des temps très anciens et qui sont largement répandues
toujours aujourd’hui ; par exemple :
• L’huile essentielle de clou de girofle : est un analgésique puissant, comme
antiseptique, et pour un certain nombre d’usages médicinaux [71].
• L’huile essentielle d’arbre à thé : est un antiseptique à large spectre.
• L’huile essentielle de menthe poivrée : utilisée contre les maux de tête.
60
4-6 L’aromathérapie :
La pratique de l’aromathérapie en tant que science de la santé était pratiquement
tombée dans l’oubli jusqu’à ce qu’elle renaisse graduellement au cours du XVI et XVII
siècles. Actuellement en Europe, l’aromathérapie (la science de l’application des huiles
essentielles) est pratiquée et enseignée. La production des huiles essentielles est un secteur
très actif en raison du développement de l’industrie du parfum.
De nos jours, on commence à identifier de nombreux constituants de ces huiles
essentielles extraites des feuilles, des fleurs et des écorces de plantes. Les huiles essentielles
sont de véritables concentrés d’une large gamme de substances aromatiques et de principes
actifs. La majorité des ces huiles possèdent des propriétés antiseptiques, bactéricides,
fongicides et antivirales.
4-7 Composition chimique :
La composition chimique de ces essences est complexe et peut varier selon l’organe, les
facteurs climatiques, la nature du sol, les pratiques culturales et le mode d’extraction .Les
huiles essentielles sont un mélange de constituants qui appartiennent à trois catégories de
composés.
4-7.1 Les terpènes ou terpénoïdes :
Les terpènes sont des hydrocarbures formés par assemblage de deux ou plusieurs unités
isopréniques [72]. Ce sont des polymères de l’isoprène de formule brute (C5H8) n. Selon le
nombre d’unités associées, on distingue : les mono-(C10), les sesqui-(C15), les di-(C20), les tri-
(C30), les tétra-(C40) terpènes et poly terpènes.
3
2
1
4
Isoprène (2méthyl buta-1, 3diène)
Les huiles essentielles contiennent surtout des monoterpènes (C10), sesquiterpènes (C15)
et rarement des diterpènes (C20).
Ils se présentent sous forme de carbures (myrcène, ocimène, caryophyllène…..),
d’alcools (géraniol, menthol, terpinéol….), d’aldéhydes (géranial, santalal, citronellal….),
61
diphénols (thymol, carvacrol….), de cétones (menthone, thuyone, pulégone, vétivone……),
d’esters (acétate de linalyle, acétate de menthyle, abétate de cédryle….), d’éther (cinéole).
H H
Ocimène Bisabolène B-Caryophyllène (girofle)
Myrcène
Figure20 : Quelques exemples de monoterpènes et de sesquiterpènes sous forme d’hydrocarbures.
OH
OH
CH2OH
OH Géraniol Menthol Terpinéol Trans farnesol (Tilleul)
Figure21 : Quelques exemples de monoterpènes et de sesquiterpènes sous forme d’alcools.
C
C
O
H
O
H OH
C
HO Géranial Santalal Citronellal Thymol
Figure22 : Quelques exemples de monoterpènes et de sesquiterpènes sous forme d’aldéhydes et de phénols.
62
OO
O
O
Menthone Thuyone α –Vétivone β -Vétivone
Figure23: Quelques exemples de monoterpènes et des sesquiterpènes sous forme de cétones.
OCOCH3O
Acétate de cédryle Cinéole
Figure24: Quelques exemples de monoterpènes et de sesquiterpènes sous forme d’éthers et d’esters.
4-7.2 Composés aromatiques:
Les composés aromatiques sont moins fréquents mais, néanmoins, très importants .Ce sont des composés qui dérivent du phénylpropane (C6-C3). Ils sont moins fréquents que les terpènes. Ils se distinguent entre eux par :
� Le nombre et la position des groupements hydroxyles et méthoxyles.
� La position de la double liaison de la chaîne latérale, allylique ou
propénylique.
� Le degré d’oxydation de la chaîne aliphatique (alcool, aldéhyde ou
cétone, acide….).
63
OH
H3CO
OCH3
O
Eugénol E- anéthol (+) fenchone
OCH3
H3CO H3CO
O
O
O
O
Apiole Myristicine
Figure 25: Quelques structures de composés aromatiques.
4-8.3 Composés d’origine variée:
En général, ce sont des hydrocarbures aliphatiques à chaîne linéaire ou ramifiée et
portant différentes fonctions. On peut citer :
-L’heptane et la paraffine dans l’essence de camomille
-Des esters acycliques principalement présents dans les fruits : acétate de butyle
(pomme), acétate d’isoamyle (banane).
-Des alcools comme le 1-octèn-3-ol de l’essence de lavande,……etc.
64
Chapitre III
Matériel et méthodes
65
1-Travaux personnels
1- Matériel végétal utilisé :
La plante entière Ammodaucus est connue sous le nom de (Moudrayga) ou
(Nessoufa). Elle a été récoltée dans la région de Béchar.
2- Préparation de la poudre végétale :
La plante est séchée à l’ombre. Les fruits sont nettoyés des impuretés et finement broyés à l’aide d’un broyeur à couteaux. La poudre obtenue est conservée à l’abri de l’humidité jusqu'à utilisation.
3- Tests phytochimiques préliminaires :
Ces tests effectués sur des extraits de plante, obtenus dans diverses conditions, sont
habituellement réalisés sur une plante de composition inconnue. Ces premiers essais sont
nécessaires dans la mesure où ils permettent d’orienter les études chimiques ultérieures par la
mise en évidence de certains principes, actifs ou non, mais caractéristiques de l’espèce.
4- Préparation des échantillons :
La recherche de composés organiques est réalisée, sur différents extraits préparés à
partir des fruits, par des tests chimiques et/ou par des examens chromatographiques par CCM
sur silice 60F254 après révélation par des réactifs spécifiques des composés recherchés et
examen des résultats à la lumière visible et/ou sous UV. Les techniques utilisées s’inspirent
de celles décrites par Paris et Nothis (1969), Dubois-Lacaille (1983) et Wagner et Bladt
(1996) [73].
5- Réactions utilisées :
� Recherche des alcaloïdes :
En général, on utilise les propriétés basiques des alcaloïdes, soit qu’on les combine à
un acide fort et il se forme alors un sel soluble dans l’eau, soit qu’on les déplace par une base
assez forte, et l’alcaloïde libéré est dans ce cas insoluble dans l’eau.
66
� Extraction en milieu alcalin (alcaloïdes bases) :
2,5 g de fruits séchés et pulvérisés en poudre fine sont humectés par 2,5 ml
d’ammoniaque (NH4OH) à 10 %, puis additionnés de 12,5 ml de méthanol et extraits au bain-
marie pendant 10 min sous reflux. Le mélange est filtré puis concentré sous pression réduite,
puis lixivié par l’éther éthylique (10 fois). Les solutions organiques sont épuisées par l’acide
chlorhydrique HCl 1N (une dizaine de fois).
Les solutions aqueuses acides sont réunies, alcalinisées par l’ammoniaque et épuisées
par l’éther éthylique (10 fois), puis par le dichlorométhane (8 à 10 fois), puis par le méthanol
(8 à10 fois). Les solutions organiques séchées sur sulfate de sodium anhydre (NaSO4) et
filtrées, sont distillées. Enfin les résidus bruts d’alcaloïdes totaux obtenus par épuisement par
l’éther, le dichlorométhane et par le méthanol sont gardés séparément.
L’alcalinisation de la phase aqueuse et son passage aux phases organiques apolaires
permet de purifier la solution d’alcaloïdes en éliminant les impuretés tant hydrosolubles
(sucres, sels minéraux et organiques) que lipophiles (graisses, terpènes, stérols, résines,
chlorophylle).
• CCM :
Le contrôle de ces extraits est fait sur gel de silice 60 F254 (pour la majorité des
alcaloïdes), dans les solvants suivants :
Système Al -1: Toluène-AcOEt-Diéthylamide (70 :20 :10).
Système Al -2 : AcOEt–MeOH–H2O (100 :13.5 :10).
Système Al -3 : Cyclohexane–EtOH–Diéthylamide (80 :10 :10).
Système Al -4 : CH2Cl2–MeOH–NH4OH (95 : 5 : 0.5).
Système Al -5 : n-butanol–AcOH-H2O (40 : 10 : 10).
• Détection
La détection des alcaloïdes est faite avant par observation sous UV et après révélation
par pulvérisation du réactif de Dragendorff.
La fixation et l’intensification de la coloration peuvent être réalisées par pulvérisation
d’une solution de nitrite de sodium à 10 % ou d’une solution d’acide sulfurique éthanoïque à
10 %.
67
2,5 g de poudre
+ 2,5 ml de NH4OH à 10%
+ 12,5 ml MeOH
Sous reflux (10mn)
Extrait
Filtration et évaporation
+ 20 ml d’éther éthylique (10fois)
Ф aqueuse Ф organique
+ HCl 1N (10 fois)
Ф organique Ф aqueuse
+NH4OH (quelques gouttes)
+ 20ml éther éthylique (10fois)
Ф organique (1) Ф aqueuse
+ 20 ml de CH2Cl2 (8fois)
Ф organique (2) Ф aqueuse
+20 ml
MeOH (8fois)
Ф organique (3) Φaqueuse
Figure 26: Schéma d’extraction des alcaloïdes en milieu alcalin.
� Extraction en milieu acide :
2,5 g des fruits séchés et pulvérisés sont additionnés de 12,5 ml de HCl dilué au 1 /20.
Après 24h de macération avec agitation de temps en temps, le mélange est filtré. Un précipité
rouge orangé se forme après l’ajout du réactif de Dragendorff au filtrat, qui indique la
présence d’alcaloïdes (formation d’iodobismutate).
68
� Recherche des saponines :
Cinq systèmes de migration des saponines ont été utilisés en vue de choisir le système le
mieux adapté à leur séparation.
Système S-1: n-butanol–acide acétique–eau (80 :20 :100), phase inférieure.
Système S-2: acétate d’éthyle–acide acétique–acide formique–eau (100 :11 :11 :26).
Système S-3: chloroforme–méthanol–acide acétique–eau (75 :40 :15 :10).
Système S-4: chloroforme–méthanol–eau (64 :40 :8).
Système S-5: CHCl3–MeOH–H2O (65: 35: 10) phase inférieure.
Après migration, les plaques sont révélées par la pulvérisation du réactif (Vanilline –
H2SO4), ou par le réactif de Komarowski.
� Recherche des polyphénols :
� Recherche des acides phénoliques libres [94]:
L’extrait méthanolique, obtenu par extraction liquide solide dans un appareil de soxhlet,
est utilisé pour la CCM avec 3 témoins (acide cinnamique, acide férulique, acide sinapique).
• CCM
Le système de migration est constitué de Benzène–AcOH (9 : 1).
La migration se fait sous exposition UV 365 nm pour provoquer l’isomérisation des formes
trans en forme cis et éviter ainsi l’apparition de doubles spots pour chaque composé.
• Révélation : réactif de Folin Ciocalteu.
Pulvériser, attendre 1–2 min et noter les taches. Mettre la plaque dans une cuve
contenant un bêcher rempli d’une solution d’ammoniaque concentrée jusqu’à ce que le fond
jaune se décolore. Noter toute tache apparaissant.
� Recherche des flavonoïdes :
Deux systèmes de migration des flavonoïdes sont utilisés :
Système F-1: chloroforme–méthanol–acide acétique–eau (60 :32 :12 :8).
Système F-2 : AcOEt - acide acétique–acide formique–eau (100 :11 :11 :26).
Après migration, les plaques sont retirées séchées et révélées par le réactif du NEU.
69
� Recherche des anthocyanes :
L’apparition d’une coloration rouge en milieu acide et bleu–violacée en milieu alcalin
indique l’existence d’anthocyanes.
2 ml d’extrait méthanolique à 10 % sont ajoutés à quelques gouttes :
- de HCl 2N (coloration rose à rouge). Si la réaction est positive.
- de NH4OH (coloration bleu – violacée).
� Recherche des tanins :
La présence de tanins (galliques et ellagiques) est mise en évidence par l’apparition
d’une coloration bleue–noire ou bleue–verte, après addition d’une solution de FeCl3.
- Quelques gouttes d’une solution de FeCl3 à 5 % dans l’éthanol (solution préparée
extemporanément) sont ajoutées à quelques millilitres de décocté aqueux à 5 %.
Les tanins catéchiques sont indiqués par la coloration bleue–verte et les tanins galliques
pas la coloration bleue-noire.
- 15 ml de décocté aqueux sont additionnés de 7 ml de réactif de Stiasny et portés
30 min au bain–marie à température inférieure à l’ébullition ; un précipité orange à
rouge se forme en présence de tanins condensés. Après filtration du précipité, le filtrat
est saturé d’acétate de sodium ; puis additionné de quelques gouttes d’une solution de
FeCl3 à 2 % ; une coloration bleu foncée se développe en présence de tanins
hydrolysables.
� Recherche des anthraquinones
Trois systèmes de migration sont utilisés
Système An-1 : AcOEt–MeOH–H2O (100 :13.5 :10).
Système An-2 : Ether de pétrole–AcOEt–HCOOH (75 :25 : 1).
Système An-3 : n-propanol-AcOEt–H2O–AcOH (40 :40 :29 : 1).
• Détection :
Sous UV 254 et 365 nm et pulvérisation avec le réactif KOH ou NEU.
UV- 256 : Tous les dérivés anthraquinoniques présentent une extinction.
UV- 365 : Tous les dérivés anthraquinoniques présentent une fluorescence jaune ou
rouge- brunâtre.
70
KOH 5 ou 10 % dans l’éthanol : les dérivés anthraquinoniques apparaissent rouges au
visible et fluorescents en rouge sous UV 365 nm.
NEU : les anthrones et anthranols donnent une fluorescence jaune intense sous UV 365
nm.
� Recherche des coumarines :
Les extraits (hexane, dichlorométhane, acétate d’éthyle et méthanol) sont dilués et
additionnés de quelques gouttes de NaOH concentré, puis examinés sous UV à 365 nm, une
fluorescence bleue oriente vers la présence de coumarines.
Après ces tests, on confirme avec la chromatographie sur couche mince dans différents
systèmes de migration.
Système C-1 : Toluène–éther (1 : 1, saturé avec AcOH 10 %)
50 ml toluène + 50 ml éther sont agités pendant 5 min avec 50 ml AcOH dans une ampoule à
décanter, la phase supérieure est utilisée.
Système C-2 : Toluène–AcOEt (8 : 1).
Système C-3 : Hexane–AcOEt (8 : 1).
• Révélation :
Elle se fait sous UV à 254 nm et par les réactifs de pulvérisation.
1– KOH 5 à 10 % dans l’éthanol
2– NEU Chauffer avec le sèche cheveux.
� Recherche des dérivés quinoniques :
Les quinones existent dans le végétal à l’état libre ou combiné (hétérosides)
� Quinones libres :
La réaction de Bornträger sur la drogue nous indique la présence des quinones libres.
• Extraction
1g de drogue pulvérisée est humecté par 1 ml de HCl N, puis 10 ml de CHCl3 sont
ajoutés. Après quelques heures de contact, le mélange est filtré.
• Caractérisation:
5 ml d’une solution NH4OH diluée au ½ sont ajoutés au filtrat. En présence de quinones
libres, la phase aqueuse se colore en rouge.
71
� Quinones combinées:
Ils sont caractérisés par la réaction de Bornträger effectuée après hydrolyse.
• Extraction
1g de drogue pulvérisée et 25 ml de H2SO4 2 N sont portés à ébullition sous réfrigérant
au reflux pendant 2 h. Après filtration, la solution est épuisée par 10 ml de CHCl3.
• Caractérisation
Après l’évaporation à sec de la phase chloroformique, le résidu est repris par quelques
gouttes de NH4OH diluée au ½. Après agitation, une coloration rouge se développe en
présence de quinones libérées par l’acide et extraites par CHCl3.
� Recherche de sesquiterpènes lactones :
• Extraction:
2,5 g de poudre végétale sont ajoutés à 30 ml d’eau bouillante, le mélange est filtré
après 5 mn puis lavé par 10 ml d’eau. Après l’ajout de 15 ml de chloroforme à l’extrait
aqueux, la phase chloroformique est récupérée et séchée après plusieurs agitations.
• CCM:
0,5 ml de CHCl3 sont ajoutés au résidu pour faire la CCM. Quatre systèmes de
migration sont utilisés :
Système Sq-1: AcOEt–HCOOH–AcOH–H2O (100:11:11:26).
Système Sq-2: Toluène–AcOEt (92:8).
Système Sq-3: Acétone–Hexane (4: 1).
Système Sq-4: AcOEt–MeOH–H2O (77:15: 8).
• Détection :
UV 254 : Extinction pour les composés à doubles liaisons conjuguées.
UV 365 : Pas de fluorescence.
� Recherche des glycosides cardiotoniques :
2 g de poudre de fruits d’Ammodaucus sont soumis à une extraction sous reflux pendant
15 min avec 7,5 ml d’éthanol 50 % + 2,5 ml d’acétate de plomb (II) à 10 %.
Après refroidissement et filtration, la solution est extraite par agitation douce avec
(3x15) ml de dichlorométhane/Isopropanol (3: 2).
72
Après la filtration à travers du Na2SO4 anhydre, les phases inférieures sont combinées et
évaporées à sec. Le résidu est dissous dans 1 ml de CH2Cl2/Isopropanol (3 : 2) et utilisé pour
la CCM d’après la figure 27.
2g de poudre
+ 7,5 ml EtOH à 50%
+ 2,5 ml d’acétate de plomb (II) à 10%
Sous reflux (15mn), filtration
Filtrat
+ 3 x 15 ml de CH2Cl2 / isopropanol (3 :2)
Ф SUP Ф INF
à jeter
Evaporation +1 ml de
CH2Cl2/ isopropanol (3 :2)
CCM
Figure 27: Schéma de l’extraction des glycosides cardiotoniques.
• CCM :
Trois systèmes de migration sont utilisés :
Système G-1: AcOEt–MeOH–H2O (100:13.5:10).
Système G-2: AcOEt–EtOH–MeOH–H2O (81:11: 4 : 8).
Système G-3: CHCl3–MeOH–H2O (35:25:10) phase inférieure.
• Détection :
UV 254 : Légère extinction pour tous les glycosides cardiotoniques.
UV 365 : Pas de fluorescence.
73
• Révélation :
1- Pulvérisation des plaques avec 15 – 20 ml de chlorure d’antimoine (III) 20 % dans
chloroforme ou éthanol.
2- Pulvérisation des plaques avec du H2SO4 50 % dans l’éthanol.
3- Pulvérisation des plaques avec du H2SO4 concentré.
Chauffage 8-10 min à 110 °C à l’aide d’un pistolet thermique.
6-Extraction solide-liquide :
Les extraits de la plante sont réalisés par une extraction solide-liquide. Cette méthode
consiste à extraire les constituants d’un solide par simple contact avec un solvant à l’aide
d’un extracteur du type Soxhlet (figure 28). L’extracteur proprement dit est fixé à la partie
supérieure d’un ballon et il est surmonté par un réfrigérant. Le solvant vaporisé du ballon est
condensé puis traverse par percolation, le lit de solide pour donner une solution qui s’écoule
périodiquement dans le ballon par un siphon. La solution contenue dans le ballon s’enrichit
de plus en plus en solutés au fur à mesure que l’extraction progresse.
A cet effet, 636 g de poudre végétale sont déposés dans la cartouche du Soxhlet. Le
ballon est rempli de 3 L de solvant organique.
L’extraction au Soxhlet est faite par l’utilisation de différents solvants de polarité
croissante. L’hexane (solvant apolaire), le dichlorométhane (solvant faiblement polaire),
l’acétate d’éthyle (solvant moyennement polaire) et le méthanol (solvant très polaire).
Quatre extraits végétaux en fonction du solvant utilisé sont ainsi obtenus : l’extrait
hexanique, l’extrait dichlorométhanique, l’extrait d’acétate d’éthyle et l’extrait méthanolique.
Les extraits sont concentrés à l’aide d’un évaporateur rotatif sous pression réduite
(Figure 29).
74
Figure 28 : Extracteur de type Soxhlet
Figure 29 : Evaporateur rotatif.
75
Extraction de fruits d’Ammodaucus
636 g de poudre de fruits
Hexane (3 L)
Extrait hexanique Résidu
Dichlorométhane (3 L)
Extrait de dichlorométhane Résidu
(18.5 g)
Acétate d’éthyle (3 L)
Extrait d’acétate d’éthyle Résidu
(7 g )
Méthanol (3 L)
Extrait méthanolique
(71.5 g)
Figure 30 : Schéma de l’extraction des fruits d’Ammodaucus à l’aide d’un extracteur
du type Soxhlet.
76
6-1 Etude de l’extrait végétal
6-1.1 Séparation par chromatographie sur couche mince (CCM)
� CCM analytique :
Nous avons utilisé pour l’extrait dichlorométhane deux systèmes de migration :
Système1 : Toluène-AcOEt (93 :7)
Système2 : Chloroforme-acide !cétique (90 :10)
Les plaques sont examinées sous UV à 254 et 365 nm puis révélées par un révélateur
spécifique.
� CCM préparative :
La chromatographie sur couches minces préparative est une méthode de purification
complémentaire qui permet d’obtenir des composés purs.
Nous utilisons des plaques en verre couvertes de gel de silice 60F254, 20 x 20cm, 0,5 mm
d’épaisseur (Merck), lavées préalablement au dichlorométhane pur.
Le dépôt de l’échantillon se fait sur toute la longueur de la plaque et le système de
migration utilisé est chloroforme-acide acétique (90 :10).
La révélation des taches se fait à l’aide de :
a- L’UV, b- Le réactif du NEU, c- KOH 5-10 % dans EtOH.
6-1.2 Séparation par chromatographie sur colonne ouverte :
• 1er essai :
Adsorbant : gel de silice
Type de colonne : cartouche Isolute® Si 50 mg, 1 ml
Eluant : hexane 100%, hexane-CHCl3 (75 :25) (50 :50) (25 :75)
CHCl3 100%, CHCl3-AcOEt (75 :25) (50 :50) (25 :75)
AcOEt 100%, AcOEt-MeOH (75:25) (50:50) (25:75), MeOH 100%.
L’échantillon : extrait méthanolique (résidu sirupeux).
Solvant d’élution : AcOEt–AcOH–HCOOH–H2O (100 :11 :11 :26).
Révélateur : UV à 254 nm et pulvérisation avec
- Le NEU (pour les flavonoïdes)
- La Vanilline /H 2SO4 (pour les saponosides)
• 2émeessai :
Mêmes conditions opératoires (adsorbant, échantillon, dimension de colonne,
révélateurs), sauf pour le gradient d’élution :
Hexane–CH2Cl2 (90:10) 100% CH2Cl2
CH2Cl2 –AcOEt (90:10) 100% AcOEt
AcOEt–MeOH (90 :10) 100% MeOH
77
� Chromatographie d’exclusion moléculaire :
Les molécules sont séparées d’après leur taille par le tamis moléculaire. Celles de
dimensions supérieures aux plus gros pores du granulé gonflé, ne peuvent pas pénétrer dans
les grains du gel et passent donc, par la phase liquide à l’extérieur de ces grains, elles sont
ainsi éluées les premières de la colonne. Par contre, les molécules plus petites pénètrent plus
on moins profondément dans le gel suivant leurs dimensions et leurs formes. Elles sont donc,
éluées du gel dans l’ordre des masses moléculaires décroissantes.
La chromatographie liquide d’exclusion sur colonne : un premier fractionnement est
souvent nécessaire sur une colonne de gel de Sephadex LH–20.
- Phase stationnaire : gel de Sephadex LH-20 (100g de Sephadex préalablement lavé par
800 ml de méthanol).
- Phase mobile : l’élution est faite à l’aide du solvant ternaire CH2Cl2–MeOH–H2O (60 :
20 : 4)……. (1)
La colonne est enfin lavée avec du méthanol pur.
Dimension de la colonne : 56 cm x 3cm.
L’échantillon : 15 g de l’extrait méthanolique dissous dans 25 ml du solvant de départ
(1).
Système de migration : AcOEt–AcOH–HCO2H–H2O (100:11:11:26) Flavonoïdes
CHCl3–MeOH–AcOH–H2O (60:32:12:8) Saponosides
Le lavage du gel et le dépôt de l’échantillon sur la colonne puis l’addition de l’éluant
entraîne le début de séparation. La récupération de l’éluat se fait dans des tubes à essais à
l’aide d’un collecteur de fractions fonctionnant selon le comptage de gouttes (100 gouttes/
tube).
Les fractions ainsi obtenues sont à nouveau analysées par CCM dans le but :
- De réunir des fractions identiques
-De déterminer le nouveau couple support chromatographique/solvant, susceptible de
séparer les composés et ainsi de suite.
Révélation :
- Examen en lumière UV à 254 nm et 365 nm avant et après pulvérisation
- Pulvérisation avec le NEU (révélateur spécifique des flavonoïdes)
-Pulvérisation avec la vanilline/H2SO4 (révélateur spécifique des saponosides et
triterpènes).
78
6-1.3 Séparation par chromatographie sous vide :
• 1er essai :
L’extrait méthanolique est évaporé à sec sous pression réduite, 5 g de cet échantillon
sont repris dans un mélange de chloroforme–méthanol (90 :10) puis filtré sous vide sur un
creuset à verre fritté de porosité 4, de diamètre 70 mm et 55 mm de hauteur, rempli avec 100
g de silice 60 (0,040–0,063mm, Merck), éluée par un gradient de chloroforme–méthanol (80 :
20) jusqu’au méthanol pur et méthanol pur additionné d’une goutte d’acide acétique.
Le contrôle des fractions éluées se fait par CCM sur plaques de gel de silice 60 F254
(Merck), le système de migration utilisé est : acétate d’éthyle–acide formique–acide
acétique–eau (100 :11 :11 :26). Cinq fractions ont été obtenues.
La fraction (I) est filtrée sous vide, éluée par un gradient de CHCl3–MeOH (95 : 5)
(75 :25).
• 2émeessai :
5 g d’extrait méthanolique sont repris dans le chloroforme pur, puis filtré sous vide sur
un creuset à verre fritté de porosité 4, de diamètre 10 cm et 9 cm de hauteur, rempli de 500 g
de gel de silice 60(0,040–0,063 mm), élué par un gradient de :
Chloroforme – acétate d’éthyle (90 :10) acétate d’éthyle pur.
Acétate d’éthyle – méthanol (90 :10) jusqu’au méthanol pur plus une goutte d’acide
acétique.
Le contrôle des fractions éluées se fait par CCM sur plaques de gel de silice 60 F254
(Merck).
Le système de migration utilisé est acétate d’éthyle – acide formique – acide acétique –
eau (100 :11 :11 :26)
79
6-2 Extraction
6-2.1 Extraction des produits [75] :
L’extrait éthanolique est obtenu par ébullition de 5g de poudre végétale dans 75 ml
d’éthanol à 40 % sous reflux pendant 1 heure puis filtré. Il est réduit par évaporation à 20 ml.
Le résidu est repris par 30 ml de CH2Cl2 et 2 ml d’éthanol.
La phase supérieure reprise par le dichlorométhane (2 x 20 ml) est évaporée à 10 ml
puis additionnée de 5g de MN polyamide-SC6, pour remplir une colonne en verre (1cm x 15
cm).
L’élution se fait en 3 étapes :
Fraction1 : élution par 250ml d’éthanol
Fraction2 : élution par 100ml d’éthanol – acétone – eau (80 :16 : 4)
Fraction3 : élution par 120ml d’acétone – eau (7 :3)
Chaque fraction est évaporée à sec puis dissoute dans 5 ml d’éthanol, le système de
solvant utilisé est : acétate d’éthyle–acide acétique-acide formique–eau (100 :11 :11 :26).
Révélateur :
Détection sous UV à 365 nm et 254 nm, pulvérisation avec le réactif de NEU.
80
5g poudre végétale
EtOH 40%,75ml
Sous reflux, 1h
Extrait EtOH
Filtration
Evaporation
Ampoule à décanter
+30ml CH2Cl2 +2ml EtOH
Agiter 5 min
Ф INF Ф SUP
à jeter +20 ml CH2Cl2 agiter
Ф INF Ф SUP
à jeter +20 ml CH2Cl2 agiter
Ф INF Ф SUP
à jeter Évaporation à 10ml
+5g polyamide
Mélanger, remplir
Une colonne
(F) Fraction mère
Fraction1 Fraction2 Fraction3
Élution par 250 ml EtOH - élution par 100ml - élution par 120ml
EtOH-acétone-eau Acétone-H2O (7 :3)
(80 :16 :4)
Figure31: Schéma d’extraction des fruits d’Ammodauchus
81
Fraction1 :
- Contient principalement des flavonoïdes
Fraction2 :
- Contient les Procyanidines dimériques et oligomériques
Fraction3 :
- Contient les acides polymériques.
6-2.2 Extraction des huiles essentielles :
Principe
Les huiles essentielles des fruits d’Ammodaucus leucotrichus ont été extraites par
hydrodistillation.
Cent grammes de matière végétale, 2 L d’eau distillée et quelques pierres ponce sont
mis dans un ballon de 3 L relié à l’aide d’un raccord à un réfrigérant permettant la
condensation des vapeurs d’eau chargées d’huile essentielle.
Le contenu du ballon est porté à ébullition durant 8h, à la température de 100 °C. Le
distillat recueilli est mélangé avec le diéthyl-éther et transvasé dans une ampoule à décanter
pour séparer l’huile essentielle de la phase aqueuse.
La phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre (Na2SO4) et l’essence
obtenue après évaporation du solvant est conservée dans des flacons bien clos à l’abri de la
lumière et à basse température pour éviter toute dégradation de l’essence.
� Propriétés physiques :
• Caractéristiques organoleptiques :
Les propriétés organoleptiques des huiles essentielles sont l’aspect, la couleur et l’odeur.
• Densité relative :
La densité de l’huile essentielle est déterminée par le rapport qui existe entre la masse
d’un certain volume de cette essence et la masse du même volume d’eau distillée pris à la
même température
La densité relative d20 est calculée à partir de la relation suivante :
m2 - m0
d20 =
m1- m0
82
Dans laquelle :
m0 : La masse en gramme de seringue vide
m1 : La masse engramme de seringue remplie d’eau distillée
m2 : La masse en gramme de seringue remplie d’essence.
Protocole expérimental La détermination de la densité d’essence d’Ammodaucus est réalisée à l’aide d’une
seringue hamiltonienne d’une capacité de 1 ml au lieu du pycnomètre. Le volume prélevé est
de 1ml pour l’huile, ainsi que pour l’eau.
• Pouvoir rotatoire :
Le pouvoir rotatoire [α]tD est la propriété que possèdent certains corps de faire tourner le
plan de polarisation de la lumière polarisée, ce qui signifie la présence d’un atome de carbone
asymétrique.
Le pouvoir rotatoire spécifique est exprimé par la loi de Biot :
α [α] t
D = L. c Dans laquelle :
α : Valeur de l’angle de déviation de la lumière polarisée lue sur le polarimètre.
L : Longueur de la cellule exprimée en décimètres.
c : Concentration de la solution à examiner en g/100 ml.
Protocole expérimental
On a utilisé un polarimètre de marque : KARL KOLB, avec une lampe de sodium et
une cellule de 1 dcm de longueur remplie d’une solution éthanolique d’H.E à raison de 0.2g
dans 100 ml de solvant.
L’angle de rotation observé est lu directement sur l’appareil permettant la détermination de la
valeur du pouvoir rotatoire de notre essence, la valeur de [α] tD est calculée à l’aide de
l’équation précédente.
83
• Indice de réfraction :
L’indice de réfraction ntλ se définit comme étant le rapport entre le sinus de l’angle de
réfraction du rayon réfracté dans le milieu considéré.
Cet indice est mesuré à 16°C et rapporté à la raie D du sodium (λ=589 nm)
Protocole expérimental
L’indice de réfraction de l’huile essentielle a été déterminé par la lecture directe à
l’aide d’un réfractomètre classique.
Nous avons opéré comme suit :
- Nettoyer les surfaces des prismes avec du papier doux imbibé d’eau, puis
sécher sans frotter.
- Etalonner l’appareil et déposer deux gouttes d’huile essentielle entre les deux
faces des prismes.
- Regarder dans l’oculaire et tourner le bouton de réglage de l’indice de
réfraction pour amener les zones sombres et éclairées au centre du réticule.
- Noter la valeur de l’indice par l’échelle de lecture puis la température indiquée
� Etude chromatographique :
• Analyse par chromatographie sur couche mince (CCM) :
La CCM est la première analyse effectuée pour la séparation et l’identification des
constituants de l’huile essentielle des fruits d’Ammodaucus leucotrichus.
Trois systèmes de migration sont utilisés :
Système 1 : Toluène
Système 2 : Toluène -AcOEt (93 :07)
Système 3 : Toluène – AcOEt (90 :10)
Après la migration, les substances séparées sont détectées à l’aide de différents
révélateurs, afin d’avoir une identification précise du nombre de constituants présents.
La révélation des taches est effectuée par :
• La lumière ultraviolette
• Une solution de vanilline sulfurique à 2 %
• Une solution d’aldéhyde anisique
• Une solution d’acide phosphomolybdique
84
• Analyse de l’huile essentielle par la CPG-SM :
Cette analyse a été réalisée à l’aide d’un chromatographe TURBOMATRIX 40 équipé
d’un détecteur à ionisation de flamme et d’une colonne remplie (30 m x 0.32mm, 1.2 µm
d’épaisseur). L’hélium a été utilisé comme gaz vecteur au débit de 1 ml/min. L’échantillon (2
µl) est injecté en mode split on. Les températures de l’injecteur et du détecteur sont maintenues
à 200 °C et 250 °C, respectivement. La température du four est programmée de 90 °C (2 min) à
250 °C (2 min) puis de 200 à 350 °C par incrément de 4 °C min-1. La température finale a été
maintenue constante pendant 2 minutes. Les surfaces des pics et les temps de rétention ont été
mesurés par intégration électronique.
Les constituants de l’huile ont été identifiés par comparaison de leurs spectres de masse
obtenus par ionisation d’électrons (EI+) et de leurs indices de rétention avec ceux des bases de
données spectrales de Willey et de NIST intégrées à l’appareil.
7- Isolement :
7-1 Isolement par chromatographie d’exclusion moléculaire :
L’isolement des différents constituants de la fraction 3 se fait par chromatographie sur
colonne ouverte de (2 x 15 cm) sur gel de Sephadex LH-20 avec le méthanol pur comme
éluant.
Le contrôle des fractions éluées se fait par CCM dans le système de solvant : acétate
d’éthyle–acide formique–acide acétique–eau (100 :11 :11 :26).
Cinq fractions ont été obtenues : fraction 3.1, fraction 3.2, fraction 3.3, fraction 3.4,
fraction 3.5.
7-2 Isolement par chromatographie sur colonne à petite échelle :
• 1er essai : La fraction 3.4 contient deux bandes, une de fluorescence bleue et l’autre
orange à 365 nm. La séparation des deux produits, se fait par une chromatographie en phase
inverse sur colonne à petite échelle.
Adsorbant : gel de silice RP-18.
Dimension de la colonne : cartouche Isolute® Si, 50 mg, 1 ml.
Eluant : H2O 100%, H2O-MeOH (75 :25), H2O-MeOH (50:50), H2O-MeOH (25 :75),
MeOH 100%
Echantillon : fraction 3.4.
Solvant d’élution : AcOEt – AcOH – HCOOH -H2O (100 :11 :11 :26)
Acétate d’éthyle-acide acétique–eau (100 :20 :30)
Révélateur : UV à 254 nm et à 365 nm
85
• 2émeessai :
Adsorbant, échantillon, dimension de colonne sont les mêmes, mais le gradient
d’élution change.
L’éluant : Acétonitrile–H2O (50 :50) (90 :10)
Acétonitrile 100%
Acétonitrile–acétone (50 :50)
Acétone 100%
8- Hydrolyse des produits :
8-1 Hydrolyse acide des quatre produits (F1, F2, F3, F4):
L’hydrolyse acide est réalisée sur quelque mg de produit, à l’aide de HCl 2N-MeOH
(1 :1) dans des tubes en verre scellés pendant 1 h à l’étuve à 100 °C. Après refroidissement,
la génine est ensuite séparée de la fraction osidique par une extraction liquide-liquide avec du
dichlorométhane (CH2Cl2).
La phase organique résultante est ensuite évaporée à sec puis reprise par quelques
millilitres de méthanol. Les génines libérées, entraînées par le dichlorométhane, sont ensuite
identifiées par CCM. La phase aqueuse contenant les composés polaires, en l’occurrence, les
monosaccharides, neutralisée par évaporations successives (3 fois) en présence de méthanol,
servira à l’analyse des sucres.
� Identification des aglycones :
Les génines obtenues sont composées par CCM (sur silice 60 F254) comparative à des
témoins de référence dans le solvant toluène-AcOEt-HCOOH (50 :40 :10) et révélées par le
réactif de NEU suivi d’un chauffage. La CCM est réalisée en présence de quatre témoins
d’acides phénoliques : Acide cinnamique (Cin), acide sinapique (sin), acide férulique (Fér) et
acide p-hydroxybenzaldéhyde (Benz).
� Identification des glucides :
L’identification des sucres obtenus par l’hydrolyse est réalisée par CCM comparative
sur silice normale dans le système de solvant CHCl3-MeOH-H2O (64 :40 :8) puis révélation
par pulvérisation d’une solution de DPAP suivi d’un chauffage. La CCM est réalisée en
présence de trois monosaccharides témoins : D-glucose, L-rhamnose, L-arabinose.
8-2 Hydrolyse alcaline :
On procède de la façon suivante :
Quelques mg de produit F4 sont mis dans un tube en verre scellé en présence de KOH 5%
dans H2O, à 120°C pendant 1h 30mn. Après refroidissement, la solution est neutralisée par
86
HCl 10%. La génine est ensuite séparée de la fraction glucidique par une extraction
liquide-liquide avec du n-butanol saturé d’eau.
� Identification des génines :
Les génines obtenues sont comparées par CCM (sur silice 60 F254) à des témoins de
référence dans le solvant binaire toluène-acétone (8 : 2) et révélées par le réactif de
Komarowsky, suivi d’un chauffage.
� Identification des sucres :
L’identification des sucres obtenus par hydrolyse est réalisée par CCM comparative
sur silice normale dans le système de solvant CHCl3-MeOH-H2O (64 :40 :8) puis révélation
par pulvérisation d’une solution de DPAP suivi d’un chauffage.
Produit (F1, F2, F3, F4)
HCl 2N-MeOH (1:1)
100°C, 1 h
Hydrolyse
Ampoule à décanter
Evaporer (MeOH)
+ CH2Cl2 (3 x 5 ml)
+ H2O (5 ml)
Réunion des Фorg Фaqueuse
Evaporation à sec
Aglycones Résidu sec contenant des glucosides
Reprise dans 1 petit Lavage x fois avec MeOH
Vol de MeOH évaporation à sec
Reprise dans 1 petit
vol de MeOH
CCM : CCM :
Toluène- AcOEt- HCOOH CHCl3-MeOH-H2O
(50 :40 :10) (64 :40 : 8)
Figure 32 : Schéma de l’hydrolyse acide des produits (F1, F2, F3, F4)
87
9- Etude biologique et biochimique :
9-1 Dosage des polyphénols totaux par colorimétrie [76] :
En milieu alcalin, les polyphénols réduisent l’acide phosphomolybdique du réactif Folin
Ciocalteu [77], cette réduction se traduit par l’apparition d’une coloration bleu foncée. Ainsi
une lecture de la densité optique à 730 nm permet de déterminer la concentration des
polyphénols en se référant à une courbe étalon dressée à partir d’une série de solutions
standard de l’acide gallique.
Courbe d’étalonnage :
Préparation de la solution gallique à différentes concentrations d’une solution mère de
50 mg/l puis faire des dilutions. On aura cinq échantillons : 0.01g/l, 0.02g/l, 0.03g/l, 0.04g/l
,0.05g/l. Dans des tubes à essai prendre :
100µl acide gallique
Ajouter 2ml de la solution de
Carbonate de sodium à 2%
2 min
100µl du réactif de Folin
Ciocalteu à 50 %
Laisser le tout agir pendant
30 min à l’obscurité
Lecture au spectrophotomètre
(λ 730nm)
Figure 33: méthode de dosage des polyphénols totaux au Folin Ciocalteu
A l’extrait concentré en polyphénols, obtenu par extraction liquide – solide, on procède
aux étapes suivantes :
100µl d’extrait méthanolique préalablement préparé, 2ml d’une solution aqueuse de
carbonate de sodium, sont additionnées, après 2 min, à 100µl du réactif Folin Ciocalteu.
Après 30 min d’incubation, les densités optiques sont lues au spectrophotomètre à 730 nm.
88
Les teneurs en polyphénols des différents extraits sont déterminés par interpolation à
l’aide d’une courbe étalon réalisée par des solutions à concentration croissante en acide
gallique.
9-2 Dosage des Flavonoïdes par colorimétrie:
L’analyse quantitative des flavonoïdes est réalisée par dosage spectrophotométrique
selon la méthode décrite par Kim et al. (2003) [78]. La lecture de la densité optique à 510 nm
permet de déterminer le concentration des flavonoïdes, en se référant à une courbe étalon
dressée à partir d’une série de solutions standard de catéchine ayant les concentrations
suivantes : 10µg/ml, 20µg/ml, 30µg/ml, 40µg/ml, 50µg/ml.
Courbe d’étalonnage :
Dans des tubes à essai, on met 500µl de chaque dilution de solution catéchine ou de
l’extrait méthanolique, on ajoute 1500µl d’eau distillée, puis 150µl de nitrate de sodium
NaNO2 à 5% (m/v) dans l’eau et après 5 minutes, on ajoute 150µl de trichlorure d’aluminium
AlCl 3 à 10% (m/v) dans l’eau. On remarque que les flavonoïdes réagissent avec lui pour
former un complexe jaune. 11 min après, on additionne 500µl de soude NaOH 1M et on
constate le changement de coloration du jaune vers le rose qui absorbe dans le visible à 510
nm. Les solutions sont mélangées au vortex puis l’absorbance est lue au spectrophotomètre à
510 nm.A partir des valeurs des absorbances obtenues, une courbe d’étalonnage de la
catéchine est tracée.
500µl de cette solution
+1500µl d’eau distillée
à t = o
+150µl de NaNO2 à 5%
à t = 5 min
150µl d’AlCl3 à 10%
à t = 11 min
500µl de NaOH 1M
mélanger au vortex
La lecture au spectrophotomètre
(λ 510nm)
Figure 34: méthode de dosage des flavonoïdes
89
9-3 Les antioxydants :
9-3.1 Définition :
Ce sont des composés réducteurs capables d’interrompre la réaction de péroxydation.
En effet, les antioxydants doivent protéger de l’oxydation due à l’air, mais aussi des
dégradations photo-induites, ne pas altérer l’aspect, l’odeur ou la couleur du produit, ne pas
être toxiques ou allergisants [79].
� Antioxydants naturels :
Dans la nature et en particulier dans le monde végétal, de nombreuses autres
substances présentent des propriétés antioxydantes : polyphénols de l’olivier, du chêne,
sésamol des graines de sésame, flavonoïdes des plantes (quercétine, myricétine, etc.), huiles
essentielles extraites d’épices et d’herbes : thym, carvi, cumin, clou de girofle, romarin, sauge
[80].
� Antioxydants synthétiques :
Il s’agit du butylhydroxytoluène ou BHT, du butylhydroxyanisole ou BHA et des
esters de l’acide gallique : gallate de propyle, gallate d’octyle et de dodécyle [81].
BHT
Le butylhydroxytoluène (2.6-ditertiobutyl 4-méthyl phénol) est un solide blanc,
soluble dans les graisses et insoluble dans l’eau. C’est un antioxydant de rupture de chaîne,
très efficace et peu coûteux, mais il n’est pas très apprécié en cosmétique, car il peut être
responsable de problèmes de coloration jaune en surface.
BHA
Le butylhydroxyanisole est un mélange de deux isomères de position, le 2-tertiobutyl
4-hydroxyanisole et le 3-tertiobutyl 4-hydroxyanisole, dont l’efficacité est un peu inférieure à
celle du BHT.
90
9-3.2 Test de l’activité antioxydante par la méthode du radical stable DPPH par
bioautographie
Principe:
Le DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazile) figure 35, est un radical stable qui présente en
solution une absorption caractéristique à 517 nm qui lui confère une coloration violette. Cette
couleur disparaît lorsque le DPPH est réduit en diphenylpicrylhydrazine par un capteur de radicaux
libres. Ainsi, en chromatographie sur couche mince (CCM), les composés actifs sont visualisables
sous la forme de taches jaunes sur fond violet. La réaction peut être résumée sous la forme de
l’équation :
DPPH + (AH)n � DPPH-H + (A)n,
Où (AH)n représente un composé capable de céder un hydrogène au radical DPPH (violet)
pour le transformer en molécule DPPH-H.
N N.
O2N
NO2
O2N
A-H
NHN
O2N
NO2
O2N
+ A.
Figure35 : Structure chimique du DPPH et sa réaction avec un piégeur de radicaux (A-H) [82]
Protocole expérimental
L’activité antioxydante des extraits et des composés purs a été évaluée sur couche
mince par le DPPH (1,1-diphényl-2-picrylhydrazyle) en suivant un protocole adapté de Takao
et al. (1994) [83]. Les échantillons ont été déposés sur 2 plaques Silicagel 60 F254 sur feuille
d’aluminium (Merck), et celles-ci développées dans le système d’élution approprié : AcOEt-
AcOH-HCOOH-H2O (100:11:11:26). Une plaque est examinée sous UV et gardée sans
révélation, tandis que l’autre est révélée par une solution méthanolique de DPPH à 0.2 %.
91
Ce réactif est un radical stable qui, réduit par des capteurs de radicaux, passe du pourpre
au jaune, révélant ainsi les composés avec une activité antioxydante.
9-3.3 Test de l’activité antioxydante par la méthode du β−β−β−β−Carotène par
bioautographie
L’activité antioxydante des extraits est confirmée par la révélation du β-Carotène
Les plaques de chromatographie sur couche mince CCM après migration dans les
solvants appropriés sont pulvérisées par une solution chloroformique de β-Carotène à 0.05%.
Les zones antioxydantes sont observées au visible. La présence d’une activité anti-
radicalaire se confirme par l’apparition de spot jaune sur fond blanc.
9-3.4 Test de l’activité anti-radicalaire du radical stable DPPH (1.1 diphenyl-2-
picrilhydrazyle)
Pour évaluer l’activité anti-radicalaire et antioxydante, nous avons utilisé la méthode
du DPPH [85,85, 86]
Dans des tubes secs, on introduit 50µl de la solution à tester, on ajoute 1950 µl de la
solution de DPPH à 6.10-5 M.
Après agitation par un vortex, les tubes sont placés à l’obscurité à la température
ambiante pendant 1h30 min. Pour chaque concentration, le test est répété 3 fois.
La lecture est effectuée par la mesure de l’absorbance à 517 nm par un
spectrophotomètre.
Pour réaliser cette mesure on a utilisé trois témoins positifs, un témoin négatif et un
blanc de la réaction qui ne contient pas d’extrait méthanolique mais du méthanol pur.
Le contrôle positif est représenté par trois antioxydants de référence (BHA, Acide
ascorbique, Quercétine)
Le contrôle négatif est composé de 1950µl de la solution méthanolique au DPPH
(6.10 -5M) et de 50µl de MeOH.
92
9-3.5 Dosage de l’activité antioxydante par spectrophotométrie:
Le pouvoir réducteur de l’extrait méthanolique a été mesuré selon la méthode de Yen et Chen
[87]. Brièvement: 1ml de l’extrait contenant (0,25-0,5-0,75 ou 1 mg/l) est ajouté à 2,5 ml de tampon
phosphate (0,2 M, pH 6,6) et 2,5 ml de ferricyanure de potassium à (1%, p/v). Le mélange est
incubé à 50 °C pendant 20 min. La réaction est arrêtée en ajoutant 2,5 mL d’une solution de TCA
(10 %, p/v) et le mélange est centrifugé à 10 000 tr/min pendant 10 min. 2,5 ml du surnageant sont
alors mélangés à 2,5 ml d’eau distillée et 0,5 ml de chlorure ferrique (0.1 %, p/v).
L'absorption de la solution résultante est mesurée à 700 nm contre un témoin négatif
renfermant de l’eau distillée au lieu de l’extrait et traité dans les mêmes conditions. Un témoin
positif renfermant du BHT (Le butylhydroxytoluène) est utilisé dans les mêmes conditions. Plus
grande est l’absorbance du milieu réactionnel, plus grand est le pouvoir antioxydant.
9-4 Test d’inhibition de l’acétylcholinestérase (AChase) par bioautographie:
Principe:
L'AChase est une enzyme présente chez l’homme et les animaux, notamment au niveau des
synapses cholinergiques où elle catalyse la réaction d'hydrolyse de l'acétylcholine en choline et
acide éthanoïque (acétique) selon l'équation suivante :
Acétylcholinestérase
CH3COOCH2CH2N+(CH3)3 + H2O -------------> CH3COOH + HOCH2CH2N
+(CH3)3
Acétylcholine Acide acétique Choline
Pour prévenir la stimulation nerveuse incontrôlée, l'acétylcholine doit être dégradée dans le
corps après son activité initiale par l'acétylcholinestérase. En inhibant l’acétylcholinestérase, la
stimulation neuronale prolongée peut être accomplie. Les organophosphates inhibant
l’acétylcholinestérase irréversiblement, ont été utilisés comme insecticides. D’autres composés (par
exemple les carbamates) ont une activité inhibitrice réversible sur l'enzyme, et ont été proposés dans
le traitement de la maladie d'Alzheimer.
Cette enzyme est spécifique des esters de l'acide acétique et si, physiologiquement, son
substrat est l'acétylcholine, elle catalyse également l'hydrolyse de la butyrylcholine, de la
butyrylthiocholine ou de l'acétylthiocholine selon la réaction suivante :
AChase
Acétylthiocholine + H2O ----------------> Acide acétique + Thiocholine
93
Protocole expérimental
L’inhibition de l’acétylcholinestérase par les extraits bruts et les produits purs a été testée
par bioautographie sur couche mince selon la méthode développée par Marston et al. (2002) [88].
Les extraits (10 µg) et les composés (0.05, 0.5 et 5 µg) ont été déposés sur des plaques Silicagel 60
F254 sur feuille d’aluminium (Merck). Les échantillons ont été élués par un système de solvants
hexane : AcOEt (1 : 1) pour les extraits DCM et les produits purs, et CHCl3 : MeOH : H2O (65 : 35
:5) pour les extraits MeOH. Après avoir été soigneusement séchées, les plaques ont été pulvérisées
avec une solution d’acétylcholinestérase (Sigma) dans un tampon Tris-HCl 0.05 M à pH 7.8
contenant de l’albumine de sérum bovin pour stabiliser l’enzyme (1000 U/150 ml = 6.67 U/ml).
Après 20 min d’incubation à 37°C dans une atmosphère humide, les couches minces ont été
pulvérisées avec un mélange (1:4) d’une solution éthanolique de naphtyl-1-acétate (2.5 mg/ml) et
d’une solution aqueuse de sel Fast Blue B (2.5 mg/ml). Les composés actifs se sont signalés par des
taches claires sur un fond pourpe.
94
Chapitre IV
Résultats et discussions
95
1- Résultat des tests phytochimiques :
Les tests phytochimiques préliminaires effectués sur les fruits d’Ammodaucus, ont
permis de mettre en évidence les différents groupes phytochimiques présents dans la plante.
� Les alcaloïdes
Le test de présence des alcaloïdes effectué sur les fruits a donné les résultats suivants :
La réaction de Dragendorff sur l’extrait en milieu acide a été négative, tandis que
l’extrait alcalin a donné des réactions positives.
Ces résultats ont été confirmés par la séparation chromatographique et visualisation des
composés à l’aide du réactif de Dragendorff : extinction à 254 nm et fluorescence bleue et
jaune à 365 nm et une coloration brune et bleue au visible après pulvérisation avec
Dragendorff et H2SO4 à 10 % dans l’éthanol, ce qui laisse penser à l’existence de deux
alcaloïdes basiques au moins et qui seraient de types indoles, quinolines, isoquinolines,
purines et/ou tropane [89].
La séparation chromatographique des constituants à été meilleure dans le système :
cyclohexane–EtOH–diethyl amine (80:10:10) que dans le système : CH2Cl2–MeOH–NH4OH
(95: 5:0.5),
Sur la plaque du système Al-3, on observe des taches alcaloïdiques, de couleur bleue et
brune de Rf = (0.387 ; 0.520).
� Les Saponines
Les profils des CCM réalisées sur les 4 extraits dans différents systèmes ont révélé que
cette plante contient des saponines.
La séparation chromatographique des constituants à été meilleure dans le système :
CHCl3–MeOH–AcOH–H2O (150:80:30:20).
� Les polyphénols
� Les Acides phénoliques libres
Les acides phénoliques ont été recherchés dans l’extrait méthanolique par
chromatographie sur couche mince.
L’apparition de deux taches bleu–noires après fumigation de l’ammoniaque, nous
indique que ces composés ne possèdent pas de groupements p- ou o-dihydrobenzène; ce qui
confirme l’existence de deux acides phénoliques (l’acide cinnamique et l’acide férulique).
96
CH CH COOH
CH
H3CO
HO CH COOH
Acide Cinnamique Acide Férulique
� Les Anthocyanes
La réaction de mise en évidence des anthocyanes a été négative aussi bien en milieu
acide qu’en milieu alcalin.
� Les Tanins
Le résultat a été négatif, car la réaction au chlorure, ferrique ne donne pas de précipité
bleu–noir qui caractérise les tanins galliques et ellagiques. De même, la réaction de Stiasny
ne donne pas de précipité orange–rouge ce qui indique l’absence de tanins condensés.
� Les Flavonoïdes
Les résultats de la chromatographie ont révélé que cette plante contient des flavonoïdes
détectables par leur fluorescence bleue, jaune et orange caractéristiques sous UV365 nm.
La séparation des constituants a été meilleure dans le système : AcOEt – AcOH –
HCOOH – H2O (100 :11 :11 :26).
� Les Anthraquinones
L’observation sous UV à 365 nm et à 254 nm, montre que les dérivés
anthraquinoniques n’existent pas dans la plante.
� Les Quinones
Les réactions de mise en évidence des quinones libres et des quinones combinées ont
été toutes négatives.
97
� Les Coumarines
La présence des coumarines est confirmée par la fluorescence bleue, obtenue en
examinant sous lumière ultraviolette à 365 nm, dans quatre tubes à essai renfermant les 4
extraits. Ces résultats sont confirmés par la CCM.
Sous UV à 254 nm, toutes les coumarines présentent une extinction tandis que sous UV
à 365 nm, la fluorescence est bleue intense [89].
� Les glycosides cardiotoniques
Avant révélation, une extinction est notée pour les 3 systèmes sous UV254 nm tandis que
sous UV365 nm, une fluorescence bleue intense apparaît.
Après révélation, on observe 2 à 3 bandes, selon le système de séparation
chromatographique et selon les révélateurs :
1- Réactif de chlorure d’antimoine SbCl2 : Apparition de bandes violettes au visible.
2- H2SO4 50 % dans l’éthanol : Apparition de bandes violettes au visible, brunes à UV365
nm.
3- H2SO4 concentré : Des bandes brunes au visible, bleues ou brunes sous UV à 365 nm.
Ces résultats confirment l’existence de glycosides cardiotoniques dans les fruits
d’Ammodaucus leucotrichus
� Les sesquiterpènes lactones
Avant révélation, une extinction est notée pour les quatre systèmes sous UV254 nm
Après révélation, apparition d’une bande brune jaunâtre
L’absence de coloration violet-grisâtre caractéristiques des sesquiterpénes [89] dans les
extraits soumis à la CCM et colorés par le réactif de Zimmermann est en faveur de
l’inexistence de ces composés dans ces extraits obtenus par extraction à l’eau ou au méthanol.
98
Tableau07:Récapitulatif des résultats du screening chimique des fruits d’Ammodaucus
leucotrichus:
(-) = absence, (+) = présence en faible quantité, (++) = présence en quantité moyenne, (+++)
= présence en grande quantité.
Phytoconstituants Résultat
Alcaloïdes :
Extraction en milieu alcalin /Dragendorff
Extraction en milieu acide /Dragendorff
CCM de l’extrait en milieu alcalin
CCM de l’extrait en milieu acide
+
-
+
-
Saponines :
CCM de l’extrait C6H14 sous reflux
CCM de l’extrait CH2Cl2 sous reflux
CCM de l’extrait AcOEt sous reflux
CCM de l’extrait MeOH sous reflux
+
+ +
+ +
+ + +
Acides phénoliques :
CCM
Anthocyanes :
HCl
NH4OH
Tanins :
FeCl3
Stiasny (HCHO-HCl)
Filtrat /AcONa, FeCl3
Flavonoïdes :
CCM de l’extrait C6H14 sous reflux
CCM de l’extrait CH2Cl2 sous reflux
CCM de l’extrait AcOEt sous reflux
CCM de l’extrait MeOH sous reflux
Quinones :
-Libres : HCl 1N, CHCl3- NH4OH
Acide cinnamique
Acide férulique
-
-
-
-
-
+
+
+
+ + +
-
99
-Combinées : H2SO4, 2N, reflux/CHCl3,
NH4OH
CCM (extrait EtOH, 50%)
Dérivés anthracéniques :
CCM
-
-
-
Coumarines :
CCM de l’extrait C6H14 sous reflux
CCM de l’extrait CH2Cl2 sous reflux
CCM de l’extrait AcOEt sous reflux
CCM de l’extrait MeOH sous reflux
+
+ + +
+
+
Glycosides cardiotoniques :
CCM
+
Sesquiterpènes lactones :
Extrait aqueux/CHCl3
-
Les tests préliminaires réalisés sur notre plante ont mis en évidence les principaux
phytoconstituants du métabolisme secondaire : acides phénoliques (acide cinnamique, acide
férulique), flavonoïdes, coumarines, glycosides cardiotoniques, saponines.
Il ressort également de ces tests préliminaires que les fruits d’ Ammodaucus
leucotrichus ne renferment que très peu d’alcaloïdes à l’état de base, pas d’anthocyanes, de
quinones (libre ou combinées), de dérivés anthracéniques, tanins condensés et tanins
hydrolysables et de sesquiterpènes lactones.
100
2- La Chromatographie sur couche mince :
2-1 CCM analytique :
Le 1er système n’a pas permis une bonne séparation tandis que, le deuxième système a
donné des résultats positifs : 2 bandes de fluorescence bleue sous UV à 365 nm de Rf voisins
de 0.5.
Ces deux bandes sont séparées par une chromatographie sur couche mince préparative
(CCMP).
2-2 CCM préparative :
� Avant révélation :
Les deux bandes ont un Rf moyen de 0,68 et 0,54, respectivement dans le système utilisé.
a- Observation sous UV
Deux bandes séparées sont révélées sous lumière UV :
Bande 1 : Bleue.
A 254 nm
Bande 2 : Extinction.
Bande 1 : Une fluorescence bleue intense.
A 365 nm
Bande 2 : Une fluorescence bleue intense.
� Après révélation :
b- NEU
Bande 1 : Jaune-vert
A 365 nm
Bande 2 : Jaune
c- KOH à 5-10% dans EtOH
Bande 1: Bleue
A 254 nm
Bande 2 : Bleu – vert
Ces deux bandes sont délimitées au crayon et prélevées de la plaque en les grattant à
l’aide d’une spatule, puis mélangée avec du chloroforme. La solution est
101
enfin filtrée sur des filtres de type Sartorius de porosité 0.2 µm et évaporée à sec.
3- Chromatographie sur colonne ouverte :
3-1 Chromatographie sur colonne à petite échelle :
� 1er essai :
On remarque qu’il y’a une diversité dans les flavonoïdes obtenus. Ils se distinguent par
leur polarité différente.
Les flavonoïdes apolaires sont extraits par le mélange de solvants apolaires (hexane –
CHCl3) et les flavonoïdes polaires extraits par le mélange de solvants polaires (AcOEt –
MeOH).
� 2éme essai :
On obtient des bandes de fluorescence bleue et blanche – jaune, détectées sous UV à
365 nm ainsi que différentes bandes de saponines.
3-2 Chromatographie d’exclusion moléculaire :
Cette technique de chromatographie d’exclusion-diffusion sur gel de Sephadex LH–20,
ne donne pas un bon résultat (une bonne séparation). Ainsi, nous avons été amenés à adopter
une deuxième technique, celle de la chromatographie sous vide (verre fritté).
4- Isolement des produits:
4-1 Isolement de F3 (Chromatographie sous vide):
Cinq fractions ont été obtenues (I, II, III, IV, V).
La fraction I, (contient 3 bandes) est la moins complexe (moins de bandes). La
séparation des 3 bandes de cette fraction se fait par un deuxième essai de verre fritté, élué par
un gradient de CHCl3 – MeOH (95 :5) jusqu’au (75 :25).
La CCM de ces fractions indique l’existence d’un produit pur I2, appelée F3 de
fluorescence bleue intense sous UV à 365 nm et vert amande au visible, élué par le mélange
de solvant CHCl3 – MeOH (90:10).
102
5 g d’extrait méthanolique
* filtration sous vide sur verre fritté
(Ø x L : 70 x 55 mm)
* Si 60 (40-63µm)
* gradient CHCl3-MeOH
Evaporation à sec
CHCl3 – MeOH (80 : 20)
MeOH pur + une goutte d’AcOH
(I) (II) (III) (IV) (V)
* filtration sous vide sur
verre fritté (Ø x L : 35 x 50 mm)
* Si 60 (40-63µm)
* gradient CHCl3-MeOH
Evaporation à sec
(95:5) (90:10) (85:15) (80:20) (75 25)
(I1) (I2) (I3) (I4) (I5)
Produit pur F3
Figure36: Schéma de fractionnement du produit pur F3.
103
4-2 Isolement de F4 (Chromatographie sous vide):
Six fractions ont été obtenues :
• Fraction (I)’ : CHCl3 100%, CHCl3 – AcOEt (90 :10)
(80 :20)
(70 :30)
(60 :40)
• Fraction (II)’: CHCl3 – AcOEt (50 :50)
(40:60)
(30:70)
(20:80)
(10:90)
AcOEt 100%
AcOEt – MeOH (90:10)
• Fraction (III)’ : AcOEt – MeOH (80 :20)
(70 :30)
(60 :40)
• Fraction (IV)’ : AcOEt – MeOH (50 :50)
(40 :60)
• Fraction (V)’ : AcOEt – MeOH (30 :70)
(20 :80)
(10 :90)
• Fraction (VI)’ : MeOH 100%, MeOH 100% + 1 goutte AcOH
La fraction (II)’ contient un produit pur de fluorescence bleue intense sous UV à 365 nm
et vert foncé au visible, appelée F4.
104
5g d’extrait méthanolique
* filtration sous vide sur
verre fritté (Ø x L : 10 x 9 cm)
* Si 60 (40-63µm)
* gradient CHCl3–AcOEt
AcOEt - MeOH
Evaporation à sec
CHCl3 100%,
CHCl3 - AcOEt (90:10) AcOEt 100%
AcOEt - MeOH (90:10) MeOH 100%
MeOH pur + une goutte d’AcOH
(I)’ (II )’ (III)’ (IV)’ (V)’ (VI)’
Produit pur F4
Figure 37: Schéma de fractionnement du produit pur F4.
105
4-3 Isolement de F5 (selon l’extraction de Wagner et Bladt, 1996) :
Le résultat des trois fractions est :
Fraction 1 : fluorescence jaune, orange et bleue à 365 nm après révélation.
Fraction 2 : fluorescence bleue principalement.
Fraction 3 : fluorescence bleue.
L’isolement des différents constituants de la fraction 3 se fait par chromatographie sur
colonne ouverte sur gel de Sephadex LH-20 d’après les conditions décrites au chapitre III
(matériel et méthodes).
Cinq fractions ont été obtenues : Fraction 3.1 :1ertube.
Fraction 3.2 :2émetube.
Fraction 3.3 : du 3émetube 9émetube.
Fraction 3.4 : du 10émetube 16émetube.
Fraction 3.5 : du 17émetube 19émetube.
La fraction 3.4 contient deux bandes, une de fluorescence bleue et l’autre orange à
365 nm.
La dernière fraction (fraction 3.5), appelée F5 contient un seul produit de fluorescence bleue.
106
5g poudre végétale
EtOH 40%,75ml
Sous reflux, 1h
Extrait EtOH
Filtration
Evaporation
Ampoule à décanter
+30ml CH2Cl2 +2ml EtOH
Agiter 5 min
Ф INF Ф SUP
a jeter +20 ml CH2Cl2 agiter
Ф INF Ф SUP
a jeter +20 ml CH2Cl2 agiter
Ф INF Ф SUP
a jeter Evaporation a 10 ml
+5g polyamide
Mélanger,remplie
une colonne
(F) Fraction mère
Fraction1 Fraction2 Fraction3
Sephadex LH – 20
Col, 2x15cmd.i
MeOH
Fraction 3.1 Fraction 3.2 Fraction 3.3 Fraction 3.4 Fraction 3.5
F5
Figure 38: Schéma d’isolation de F5
107
4-4 Isolement de F6 :
L’isolement des deux bandes de fraction 3.4 se fait par une chromatographie sur
colonne à petite échelle. On récupère 8 fractions dont le résultat est le suivant :
Les 6 premières fractions contiennent deux bandes de fluorescence bleue et orange à
365 nm
Les deux dernières fractions réunies sous le nom de F6 contiennent une seule bande de
fluorescence orange (jaune – brun).
Après fumigation de l’ammoniaque NH3 et observation sous UV, on remarque que :
La fraction F5 : Fluorescence bleu Blanc jaunâtre
La fraction F6 : Orange Orange (pas de changement), c’est le cas des flavonols
ayant un hydroxyle en position 3 libre
Fraction mère (F)
Fraction 1 Fraction 2 Fraction 3
Sephadex LH – 20
Col, 2 x 15cm d.i
MeOH
Fraction 3.1 Fraction 3.2 Fraction 3.3 Fraction 3.4 Fraction 3.5
-Cartouche Isolute
-Si, RP – 18 (50 mg, 1 ml)
-Acétonitrile–H2O (50 :50)
(90 :10)
Acétonitrile 100%
Acétonitrile – Acétone (50 :50)
Acétone 100%
F3.4.1 F 3.4.2 F 3.4.3 F 3.4.4 F 3.4.5 F 3.4.6 F 3.4.7 F 3.4.8
F6
Figure 39:Schéma d’isolation de F6
108
4-5 Spectroscopie UV :
L’enregistrement des spectres UV des produits (F1, F2, F3, F4, F5) est réalisé dans le
méthanol. Ces spectres montrent l’absorption maximale de ces bandes tableau 08.
Tableau08 : Propriétés spectrales des produits purs isolés à partir des fruits
d’Ammodaucus leucotrichus Coss. et Dur.
Produit Max. 1 (λλλλ nm) Max. 2 (λλλλ nm)
F1 245 325
F2 253 335
F3 191,5 374
F4
F5
282
196,6
293
277,5
F6 194 -
Ces résultats suggèrent que F3, F5 et F6 portent tous, au moins, un chromophore identique
absorbant dans la zone 191 à 196 nm.
4-6 Spectrométrie Infra-Rouge (IR) du produit F4 :
Le spectre IR du produit F4 obtenu est représenté sur la (fig.40).Les bandes
caractéristiques révélées sur le spectre sont représentées dans le tableau 09
Tableau09 : Bandes caractéristiques du spectre IR de F4
Fonctions Fréquence υ (cm-1)
CO(ester)
OH(alcool)
CH(duCH3)
CH(duCH2)
1738.5
3460.6
2959.2
2924.5-2854.1
109
Figure 40 : Spectre IR de F4
5 – Hydrolyse des produits
5-1 Hydrolyse acide des produits (F1, F2, F 3, F4) :
� Identification des génines :
L’observation des quatre produits, sous UV à 254 nm et à 365 nm avant et après
révélation, montre que les produits n ont pas les Rf des quatre acides phénoliques témoins
utilisés : acide cinnamique, acide sinapique, acide férulique et acide p-hydroxybenzaldéhyde.
� Identification des glucides :
Cette hydrolyse acide n’a pas permis de détecter les monosaccharides, car les quatre
produits sont apolaires et les sucres sont polaires. Donc les produits en question ne sont pas
glycosylés.
5-2 Hydrolyse alcaline du produit F4 :
� Identification des sucres :
L’observation sous UV à 254 nm et à 365 nm, avant et après révélation du
chromatogramme de l’hydrolysat alcalin du produit F4 suggère que ce produit n’est pas
glycosylé.
6- Extraction de l’huile essentielle (H.E.) :
6-1 Rendement :
110
Le rendement d’extraction, exprimé en pourcentage, est calculé par le rapport de la
quantité d’H.E extraite sur la quantité de la plante.
Pour une meilleure évaluation, nous avons regroupé dans les tableaux 10 et 11 les
rendements des essences d’Ammodaucus leucotrichus et des essences de la même famille,
retrouvées dans la littérature.
Tableau 10 : Les rendements de l’H.E d’Ammodaucus leucotrichus et des différentes
espèces d’Apiacées.
H.E Ammodaucus
leucotrichus
Pimpinella
anisum
Foeniculum
vulgare
Petroselinum
crispum
Rdt % 1.68 1.5 à 5 [90]
1.2 [91]
1.5 à 3 [91]
1.5 à 4.99 [92]
0.04 à 0.16 [93]
Tableau 11 : Les rendements de l’H.E des sous espèces d’Ammodaucus leucotrichus : ssp.
nanocarpus (ALN1, ALN2) et ssp. leucotrichus (ALL) [94].
HE ALN1 ALN2 ALL
Rdt %
1.33
1.22
2.76
On constate que le rendement d’extraction de l’H.E, obtenue par hydrodistillation
durant 8 h lors de notre expérience, est presque du même ordre que ceux retrouvés dans la
littérature.
6-2 Propriétés physiques :
� Caractéristiques organoleptiques :
Les propriétés organoleptiques (l’aspect, la couleur et l’odeur) de l’huile essentielle
d’Ammodaucus leucotrichus sont regroupées dans le tableau 12.
Tableau12:Caractéristiques organoleptiques de l’H.E d’Ammodaucus leucotrichus
Caractéristiques
organoleptiques
Aspect Odeur Couleur
H.E Liquide huileux Anisée Bleue
� Densité, indice de réfraction, pouvoir rotatoire :
Les résultats de calcul des caractéristiques physiques de l’H.E d’Ammodaucus
leucotrichus, obtenue par hydrodistillation à partir du matériel végétal sec, sont regroupés
111
dans le tableau 13. Ces résultats expérimentaux sont comparés à ceux de différentes essences
appartenant à la famille des Apiacées, retrouvées dans la littérature.
Tableau13 : Caractéristiques physiques de l’huile essentielle des fruits
d’Ammodaucus leucotrichus et des huiles de quelques plantes appartenant à la famille
des Apiacées.
H.E
C. physiques
Ammodaucus
leucotrichus
Pimpinella
anisum
[95]
Foeniculum
vulgare
[96]
Angelica
archangelica
[97]
Densité
relative d
0.8417 0.978 à 0.992 0.900 à 0.920 0.8624
Pouvoir
rotatoire α16
0.75° 0° à 0.25° 4° à 12° 13.15°
Indice
réfraction n16
1.6019 1.557 à 1.559 1.539 à 1.550 1.4854
� Solubilité de H.E :
Tableau 14 : Solubilité de l’huile essentielle des fruits d’Ammodaucus dans quelques solvants organiques.
Solvant Densité d Solubilité des H.E des fruits
d’Ammodaucus
Eau 1 Faible
Eau salée saturée 1.13 Très faible
Cyclohexane 0.78 Très grande
Dichlorométhane 1.32 Très grande
Ethanol 0.79 Très grande
6-3 Etude chromatographique :
6-3.1 Analyse par chromatographie sur couche mince (CCM) :
Les résultats de la séparation des constituants de l’huile essentielle ainsi que leur
détection à l’aide des différents révélateurs sont reportés respectivement sur le tableau 15.
112
Tableau 15 : Facteurs de rétention (Rf) et couleurs des constituants majoritaires de
l’H.E d’ Ammodaucus leucotrichus.
Spots Rf U.V
(nm)
(a) (b) (c)
1 0.034 365 Blanc jaunâtre Vert _
2 0.103 _ _ Rose Bleu
3 0.229 _ Mauve Rose Bleu gris
4 0.23-0.36 365 Rose Bleu Bleu gris
5 0.609 254 Jaune Jaune Jaune
6 0.666 254-365 Vert Brun Bleu
(a) : Vanilline sulfurique à 2 %
(b) : Aldéhyde anisique
(c) : Acide phosphomolybdique
6-3.2 Analyse par chromatographie en phase gazeuse (CG et CG/MS) :
Les résultats des analyses par CG et CG/MS de l’huile essentielle extraite des fruits
d’Ammodaucus leucotrichus sont présentés dans le tableau 16. Cinq composés sont identifiés pour
notre échantillon et listés suivant l’ordre d’élution de leur indice de rétention.
Nous avons tenté d’établir une comparaison entre la composition de l’H.E d’Ammodaucus
leucotrichus provenant de l’Afrique du nord, Sahara occidental, Dakhla (Villacisneros) [98] et celle
de l’essence algérienne.
113
Tableau 16 : Pourcentage des constituants de l’H.E des fruits d’Ammodaucus leucotrichus des
deux pays.
N°du
pic
H.E ALS H.E ALA Composé identifié
Tr
%
Tr %
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
920
938
964
975
989
1012
1016
1169
1272
1285
1350
1352
1448
1715
4.7
0.3
1.4
0.4
1.1
26.8
0.1
0.1
63.6
0.2
0.5
0.4
0.2
0.2
513
-
-
783
-
1151
-
-
3211
4224
-
-
-
-
2.40
Nd
Nd
0.48
Nd
19.23
Nd
Nd
76.92
0.96
Nd
Nd
Nd
Nd
α pinéne
camphéne
ß pinéne
myrcéne
α phellandréne
limonéne
ß phellandréne
α terpineol
perillaldehyde
perillalcool
methyl perillde
3-hydroxyperillaldehyde
γ decalactone
chamazuléne
H.E ALA : Essence Algérienne (notre essence)
H.E ALS : Essence trouvée dans la littérature
Nd : non déterminé.
En comparant nos résultats à ceux cités dans la littérature, on note une ressemblance dans les
pourcentages des principaux constituants plus particulièrement pour le pèrillaldéhyde et le
limonène. Quant aux temps de rétention, les différences s’expliquent par le fait que les conditions
opératoires sont différentes dans les deux cas.
114
CH2OH
CHO
Perillalcool Myrcène Limonène Perillaldehyde
α-pinène
Figure 41 : Structure des constituants identifiés dans l’huile essentielle d’Ammodaucus
leucotrichus.
7- Résultat de l’étude biologique et biochimique :
7-1 Teneur en polyphénols totaux et flavonoïdes :
L’étude quantitative de l’extrait méthanolique au moyen des dosages
spectrophotométriques, avait pour objectif la détermination de la teneur totale des
polyphénols et les flavonoïdes. Deux courbes d’étalonnage (fig. 42, 43) : ont été tracées pour
cet objectif, une réalisée avec l’acide gallique, l’autre avec la catéchine.
Les mesures de densité pour l’extrait méthanolique sont réalisées à 730nm pour les
polyphénols et à 510 nm pour les flavonoïdes.
Les teneurs en polyphénols et en flavonoïdes de l’extrait méthanolique des fruits
d’Ammodaucus ont été calculées à partir de deux courbes d’étalonnage et exprimées en
milligrammes d’équivalents d’acide gallique pour les polyphénols ou en milligrammes
d’équivalents de catéchine pour les flavonoïdes par gramme de l’extrait méthanolique.
115
Figure42: courbe d'étalonnage des polyphénols totaux.
Figure43: courbe d'étalonnage des flavonoïdes.
La teneur en polyphénols des fruits d’Ammodaucus leucotrichus, déduite de la courbe
d’étalonnage, est de l’ordre de 482.28 mg d’équivalents d’acide gallique /g MeOH ; celle des
flavonoïdes est de l’ordre de 61.57 mg d’équivalents de catéchine /g MeOH.
7-2 Tests de l’activité antioxydante :
7-2.1 Méthode bioautographique:
116
Une activité anti-radicalaire a été détectée dans tous les extraits, faible dans l’extrait aqueux,
huile essentielle et produit pur F4, et forte dans l’extrait méthanolique.
Tableau 17 : Résultats de l’activité anti-radicalaire par la méthode bioautographique des
extraits d’Ammodaucus leucotruchus.
Extraits DPPH β-Carotène
MeOH + + + + + +
H2O (partie aérienne) + +
Huile essentielle + +
F4 + +
+ : activité faible
7-2.2 Test de l’activité antioxydante par spectrophotométrie :
Les activités antioxydantes des différentes concentrations de l’extrait méthanolique
(traduites en valeurs de densités optiques) ainsi que celle du BHT (antioxydant synthétique)
sont représentées dans la figure 44.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
D.O
0,25 0,5 0,75 1
Concentration mg/ml
D.O BHT
D.O extraitméthanolique
Figure44 : Dosage de l’activité antioxydante de l’extrait méthanolique par
spectrophotométrie.
L’activité antioxydante de l’extrait méthanolique est faible par rapport à celle du
composé de référence (BHT) aux trois premières concentrations (0.25, 0.5, 0.75 mg/ml).
Mais à partir de la concentration 1 mg/ml l’activité devient nettement meilleure (140 %)
117
7-2.3 Test de l’activité anti-radicalaire par la méthode du DPPH :
La mesure de l’absorbance (ou densité optique) a été effectuée par spectrophotométrie
à 517 nm. Le spectrophotomètre est couplé à un enregistreur qui affiche les différentes
valeurs obtenues. A partir de ces valeurs, on calcule les pourcentages d’inhibition en utilisant
la formule suivante :
Abs (témoin) – Abs (antioxydant)
P.I % = x 100 [99]
Abs (témoin)
Soit :
Abs : Absorbance à la longueur d’onde de 517 nm
Les valeurs obtenues ont permis de tracer les différentes courbes (fig. 45, 46, 47) qui
représentent la variation du pourcentage d’inhibition en fonction de la concentration des
extraits (extrait méthanolique, extrait aqueux, huile essentielle).
Figure45 : Pourcentage d’inhibition en fonction de la concentration d’extrait MeOH
118
Figure46 : Pourcentage d’inhibition en fonction de la concentration d’HE
Figure47 : Pourcentage d’inhibition en fonction de la concentration d’extrait aqueux
Le dosage de l’activité antioxydante par blanchiment du DPPH, au niveau des différents
extraits montre que c’est l’extrait méthanolique qui présente la meilleure performance
notamment à la concentration de 500 où l’activité est équivalente à celle des témoins positifs
utilisés : Le BHT, l’acide ascorbique et la quercétine.
Cette forte activité dénote que l’extrait méthanolique renferme des substances
réagissantes avec le radical du DPPH, ce qui a été montré dans les tests phytochimiques
effectués sur ces extraits.
L’activité antioxydante des différents extraits d’Ammodaucus leucotrichus, mise en
évidence par les différentes techniques que nous avons utilisées, apporte un fondement
scientifique à l’utilisation traditionnelle de cette plante dans le traitement du diabète. En effet,
119
ce type de pathologie est souvent du à une carence dans le système antioxydant naturel des
personnes atteintes. Ce résultat est, à notre connaissance, le premier de son genre.
Parmi les phytoconstituants actifs potentiels présents dans cet extrait, on note la présence
de flavonoides, d’acides phénoliques (acides cinnamique et férulique) et des coumarines.
La valeur d’IC50, déterminée pour chaque extrait, est définie comme étant la
concentration de substrat qui cause la perte de 50 % de l’activité de DPPH.
Les valeurs IC50 moyennes (fig. 45, 46, 47) ont été calculées par les régressions
linéaires des trois essais séparés où l’abscisse est représentée par la concentration des
composés testés et l’ordonnée par l’activité antioxydante en pourcentage. Ces valeurs sont
comparées à celles trouvées pour les composés de référence (BHA, Acide ascorbique,
Quercétine).
Tableau 18 : Concentrations inhibitrices de 50 % des radicaux DPPH.
Extraits I.C50 (µg/ml)
Extrait méthanolique
H.E
Extrait aqueux
Quercétine
Acide ascorbique
BHA
2.256
3.216
4.486
1.495
1.945
2.167
Tous les extraits possèdent une capacité de réduction du radicale libre, les
concentrations requises pour la neutralisation et la stabilité de 50% de la concentration du
DPPH s’échelonne entre 2 et 4µg/ml.
120
0102030405060708090
Quer BHA HE
Pourcentage de IC50
QuerVit CBHAextr MeOHHEextr H2O
Figure48 : Concentrations inhibitrices de 50% des radicaux DPPH
En comparant les résultats de nos extraits de l’activité antioxydante à ceux des composés de
référence (BHA, Quercétine, acide ascorbique), on constate que l’activité de l’extrait méthanolique
est presque identique à celle du BHA et la capacité antioxydante des trois extraits est dans l’ordre :
Extrait méthanolique des fruits > H.E des fruits > Extrait aqueux de la partie aérienne.
121
7-3 Tests de l’activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase (AChE) par la méthode
bioautographique :
Une inhibition de l’acétylcholinestérase faible à moyenne a été mise en évidence seulement
pour l’extrait méthanolique (Tableau19).
Tableau 19 : Résultats de l’activité inhibitrice d’AChE par méthode bioautographique des
extraits d’Ammodaucus leucotruchus.
Extraits AChEase
MeOH +
H2O (partie aérienne) -
Huile essentielle -
F4 -
- : pas d’activité ; + : activité faible
122
CONCLUSION
123
CONCLUSION
Le travail que nous avons effectué apporte une contribution originale à l’étude
phytochimique des fruits d’Ammodaucus leucotrichus, plante appartenant à la famille des
Apiaceae.
On peut dire que cette plante mérite de retenir notre intérêt à divers autres points de vue.
En effet, les tests préliminaires laissent ressortir que cette plante est dépourvue de substances
toxiques majeures comme les sesquiterpènes lactones et les quinones.
L’essence d’Ammodaucus leucotrichus, extraite des fruits par hydrodistillation, est
obtenue avec un rendement quantitatif et comparable à de nombreuses plantes de la même
famille.
La composition chimique de l’H.E des fruits d’Ammodaucus a été établie grâce a
l’utilisation conjointe des méthodes chromatographiques et spectroscopique. En effet, le
regroupement des résultats obtenus par CCM et la chromatographie en phase gazeuse CPG et
la CG-SM indique que l’essence des fruits d’Ammodaucus leucotrichus est constituée
principalement par des monoterpènes : périllaldéhyde 76.92 %, limonène 19.23 %, myrcène
0.48 %, périllalcool 0.96 %, α-pinène 2.40 %.
L’étude comparative de sa composition chimique avec les essences étrangères, révèle
une constitution normale et conforme à ce qui est généralement cité dans la littérature pour
d’autres espèces.
Les polyphénols sont des métabolites secondaires à intérêt préventif et thérapeutique
grâce à leurs propriétés anti-radicalaires et anti oxydantes.
Les extraits de notre plante ont été soumis à différents tests biochimiques, biologiques
et chimiques afin de déterminer leurs :
• Teneur en polyphénols
• Teneur en flavonoïdes
• Activité anti-radicalaire et antioxydante
• Activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase (AChE)
Le dosage des composés phénoliques contenus dans l’extrait méthanolique a révélé une
quantité appréciable en polyphénols et flavonoïdes.
124
Quantitativement, les analyses effectuées par la CCM montre la présence d’une
multitude de variété de ces composés dont les flavonoïdes, coumarines et les acides
phénoliques (acide cinnamique, acide férulique).
L’étude du pouvoir antioxydant par les différentes méthodes a confirmé les propriétés
puissantes que possèdent nos extraits à piéger les radicaux libres. L’extrait MeOH présente
l’activité anti-radicalaire la plus élevée avec un IC50= 2.256µg/l qui est du même ordre de
grandeur que celle de l’antioxydant de synthèse BHA, ce qui nous permet de dire que notre
plante est une source prometteuse d’antioxydants naturels et justifie son utilisation
traditionnelle dans le traitement du diabète.
125
REFERENCES
BIBLIOGRAPHIQUES
126
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130
ANNEXE
131
ANNEXE 1
FORMULE DES REACTIFS
� Alcaloïdes (Réactif de Dragendorff):
• Composition du réactif :
Solution acide d’iodobismuthate de potassium
A : 10 ml d’acide acétique glacial.
40 ml d’eau.
0,85 g de nitrate de bismuth basique.
Chauffer et filtrer si nécessaire.
B: 20 ml d’eau.
8 g d’iodure de potassium.
Mélanger 5 ml de solution A et 5 ml de solution B avec 20 ml d’acide acétique glacial et
100 ml d’eau.
Conserver à l’abri de la lumière .Pulvériser et chauffer jusqu’à l’apparition des couleurs
� Saponines
1-Réactif de Vanilline –H2SO4 :
• Composition du réactif :
Solution (I) : Vanilline 1% dans éthanol.
Solution (II) : Acide sulfurique 10% dans éthanol.
Pulvériser avec Sol (I) puis par Sol (II), puis chauffer à 110 С° avec un pistolet thermique
pendant 5 à 10 minutes.
2-Réactif de Komarowsky :
• Composition du réactif :
Mélange (5 :1, v/v) de p-hydroxybenzaldéhyde (2 % p/v dans MeOH) et H2SO4 50% dans éthanol. � Les Sucres (Réactif de DPAP acide diphénylaminophosphorique) :
• Composition du réactif :
2 g de diphénylamine et 2 g d’aniline sont ajoutés à 10 ml d’acide ortho-phosphorique 85 %
puis complétés à 100 ml de méthanol.
� Tanins (Réactif de Stiasny) :
132
• Composition du réactif :
Mélange de formol à 30 % - HCl concentré (2 : 1 V/V).
� Flavonoïdes (Réactif de NEU) :
• Composition du réactif :
Solution A : 2-aminoéthyle diphényle borinate 1 % dans le méthanol.
Solution B : PEG 4000 (5 %) dans l’éthanol.
Après pulvérisation du réactif (mélange de 10 ml de solution A et de 8 ml de solution
B), on chauffe la plaque à l’aide d’un sèche cheveux.
� Sesquiterpènes lactones (Réactif de Zimmermann) :
• Composition du réactif :
A : 10 g de dinitrobenzène + 90 ml de toluène.
B : 6 g de NaOH + 25 ml H2O + 45 ml méthanol.
La plaque est d’abord pulvérisée avec (A) puis avec (B) puis observée en lumière
visible. Les sesquiterpènes apparaissent colorés en violet–grisâtre.
� Acides phénoliques libres (Réactif de Folin-Ciocalteu) :
• Composition du réactif :
Dans un ballon à fond rond de 1 litre, placer 700 ml d’eau déminéralisée, 100 g de tungstate de
sodium, 25 g d’acide phosphomolybdique, 100 ml d’acide chlorhydrique et 50 ml d’acide
orthophosphorique à 85 %. Bouillir sous reflux pendant 10 h, refroidir puis ajouter 150 g de
sulfate de lithium. Ajouter quelques gouttes de brome liquide jusqu’à ce que le réactif soit
jaune (non vert). Eliminer le brome en excès par ébullition sous hotte (flacon ouvert). Ajuster le
volume à 1 l avec de l’eau déminéralisée
� Révélateurs des H.E :
• Une solution de vanilline sulfurique à 2 % : ce révélateur est préparé en ajoutant,
goutte à goutte, 2 ml d’acide sulfurique concentré dans 100 ml de solution de vanilline à 1 %
dans l’alcool à 96 %. Ce réactif doit être utilisé 48 heures après la préparation.
• Une solution d’aldéhyde anisique : l’anisaldéhyde est obtenue en mélangeant,
dans l’ordre, 0,5 ml d’aldéhyde anisique avec 10 ml d’acide acétique glacial, 85 ml de
méthanol et 5 ml d’acide sulfurique.
133
• Une solution d’acide phosphomolybdique : Dissoudre 20g d’acide
phosphomolybdique dans 100 ml d’éthanol
SYSTEMES CHROMATOGRAPHIQUES
Supports :
� CCM analytique :
Silice 60 254 (Merck), 250µm, pour la phase normale, sur plaque de verre.
Silice 60254 (Merck), 0.2mm, pour la phase normale, sur plaque d’aluminium.
Silice RP-18 (Merck), pour la phase inverse, sur plaque de verre.
� CCM préparative :
Silice 60 F254 (Merck), 20x20 cm, 0.5mm d’épaisseur, sur plaque de verre.
� Chromatographie sur colonne ouverte :
Gel de Sephadex LH-20 pour la chromatographie d’exclusion-diffusion.
Silice normale 63-200 µm (Merck) pour la chromatographie d’adsorption
134
ANNEXE 2 � Dosage des polyphénols totaux :
� Préparation des réactifs :
- 10 ml du réactif Folin Ciocalteu dilué dans 10 ml d’eau distillée.
- 2 g de carbonate de sodium (Na2CO3) dilué dans 100 ml d’eau distillée
Tableau I: Densités optiques accordées aux différentes concentrations de l’acide gallique.
[]Acide
gallique (g/l)
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
D.O
0 0.0387 0.1185 0.1556 0.2336 0.3232
� Dosage des Flavonoïdes:
� Préparation des réactifs :
- Solution de NaNO2 à 5%
5g de nitrate de sodium, dissous dans une fiole de 100ml.
- Solution de AlCl3 à 10%
10g de chlorure d’aluminium, dissous dans une fiole de 100ml.
Tableau II : Densités optiques accordées aux différentes concentrations de l’acide
catéchine.
[] Acide
catéchine (µg/ml)
0
10
20
30
40
50
D.O
0 0.1244 0.2357 0.3016 0.3974 0.5735
� Dosage des antioxydants :
� Préparation de la solution tampon phosphate:
Solution tampon :
La solution tampon est une solution permettant de conserver un PH à peu près constant.
Le tampon utilisé est le tampon phosphate à PH (5.6-8.0) :
135
Préparer une solution de di-hydrogénophosphate de potassium à 0,2 M (soit 9.08g de
KH2PO4 par litre) et une solution de di-sodium hydrogénophosphate 0,2 M (9.07g de
Na2HPO4 par litre)
Préparation du tampon phosphate à PH=6.6 :
PH Na2 HPO4 à 0.2 M KH2 PO4 à 0.2 M
6.6 74.5 ml 125.5 ml
� Préparation des réactifs :
Solution de K3Fe (CN) 6 à 1% :
1 g de ferricyanure de potassium, dissous dans une fiole de 100 ml.
Solution de FeCl3 à 0.1% :
0.1g de chlorure ferrique, dissous dans une fiole de 100ml.
Tableau III : Densités optiques accordées aux différentes concentrations de l’extrait
méthanolique et le BHT.
Concentration (mg/ml) 0.25 0.5 0.75 1
BHT 0.5763 0.5835 0.6800 0.703
D.O Extrait
MeOH
0.0165 0.1518 0.4455 0.9796
� Dosage de l’activité antioxydante par la méthode du DPPH :
Les résultats du pourcentage d’inhibition du radical DPPH par les trois échantillons
(H.E, extrait méthanolique et aqueux de la partie aérienne) sont représentés aux tableaux
suivants.
Tableau IV : Pourcentage d’inhibition du radical DPPH de l’extrait méthanolique
Concentration µg/ml 10 100 200 400 500
D.O
0.565
0.586
0.574
0.318
0.293
0.289
0.062
0.075
0.058
0.012
0.085
0.027
0.010
0.010
0.012
Moyenne 0.577 0.299 0.065 0.040 0.011
A.A % 4.35 50.57 89.29 93.31 98.16
136
Tableau V : Pourcentage d’inhibition du radical DPPH de l’huile essentielle
Concentration µg/ml 10 100 200 400 500
D.O
0.4457
0.4392
0.3868
0.2090
0.1278
A.A % 26.45 27.52 36.17 65.51 78.91
Tableau VI: Pourcentage d’inhibition du radical DPPH de l’extrait aqueux de la partie
aérienne
Concentration µg/ml 10 100 200 400 500
D.O
0.535
0.543
0.536
0.500
0.492
0.493
0.454
0.457
0.420
0.392
0.390
0.393
0.218
0.215
0.201
Moyen 0.538 0.495 0.443 0.391 0.211
A.A % 11.22 18.31 26.89 35.47 65.18
Tableau VII: Pourcentage d’inhibition du radical DPPH des antioxydants de référence
(BHA, Acide ascorbique, Quercétine).
1-BHA
Concentration (µg/ml) 1 2 4 8 10
D.O
0.411
0.428
0.412
0.420
0.354
0.352
0.197
0.186
0.176
0.0.05
0.0.04
0.0.04
0.0.03
0.0.03
0.0.03
Moyen 0.417 0.375 0.186 0.0.04 0.0.031
A.A % 31.18 38.11 69.30 92.07 94.88
2-Acide ascorbique
Concentration (µg/ml) 1 2 4 8 10
D.O
0.454
0.451
0.450
0.362
0.363
0.349
0.102
0.008
0.008
0.006
0.004
0.01
0.001
0.009
0.009
Moyen 0.451 0.358 0.039 0.006 0.006
A.A % 25.57 40.92 93.56 99 99
137
3-Quercétine
Concentration (µg/ml) 1 2 4 8 10
D.O
0.388
0.383
0.403
0.174
0.167
0.177
0.014
0.014
0.011
0.008
0.016
0.015
0.011
0.022
0.007
Moyen 0.391 0.172 0.013 0.013 0.013
A.A % 35.47 71.61 97.85 97.85 97.85
138
ANNEXE 3
� Appareillages: Au cours de ce travail nous avons utilisé différents appareils.
Spectroscopie UV :
Spectrophotomètre 8500 UV-VIS
Spectroscopie IR :
Le spectre IR a été enregistré à l’aide d’un spectromètre JASCO - 4200 série FT/IR en solution
dans le chlorure de méthyléne.
• Chromatographie en phase gazeuse couplée à la masse :
Chromatographe TURBOMATRIX 40
Systèmes chromatographiques :
Supports :
CCM analytique :
Silice 60 F254 (Merck), 250µm, 20x20 cm pour la phase normale, sur plaque d’aluminium.
CCM préparative :
Silice 60 F254 (Merck), 20x20 cm, 0.5mm d’épaisseur, sur plaque de verre.
Chromatographie sur colonne ouverte :
Gel de Sephadex LH-20, pour la chromatographie d’exclusion-diffusion.
Silice normale Si 60 (40-63µm) pour la chromatographie d’adsorption.
Polyamide
139
Les spectres de CG et CG/MS des différents constituants de l’huile essentielle des
fruits d’Ammodaucus leucotrichus
Figure : Spectre CG de l’huile essentielle des fruits d’Ammodaucus
leucotrichus
Spectre CG/MS de l’ α pinène
140
Spectre CG/MS du myrcène
Spectre CG/MS du limonène
Spectre CG/MS du périllaldéhyde
Spectre CG/MS du périllalcool
141
Figure : Profil chromatographique des constituants majoritaires de l’HE des fruits
d’Ammodaucus leucotrichus analysés par GC-MS
142
