Eviter ou contrôler les erreurs de prélèvements en ... · de cytologie et de biochimie. En biologie médicale humaine, à lex’ ception des situations d’urgence, les prélèvements

Revue Méd. Vét., 2015, 166, 9-10, 280-303

BRAUN (J.P.) AND COLLABORATORS280

Tout ce qui concerne les prélèvements biologiques jusqu’à leur analyse constitue la phase dite « pré-analytique » qui est définie par la norme ISO 15189 comme une « série d’étapes commençant chronologiquement par la prescription des analyses par le clinicien, comprenant la demande d’analyse, la préparation du patient, le prélèvement du spécimen, l’acheminement jusqu’au laboratoire et au sein du laboratoire et finissant au début de la procédure analytique » [4]. Cela concerne toutes les analyses de biologie médicale, la présente revue étant limitée à des exemples d’hématologie-hémostase, de cytologie et de biochimie.

En biologie médicale humaine, à l’exception des situations d’urgence, les prélèvements sont effectués par des personnels spécialisés chez des patients préparés selon les besoins des analyses à effectuer, par exemple diète depuis la veille, repos de courte durée avant le prélèvement, environnement calme et isolé. Les spécimens sont ainsi collectés dans des locaux spécialisés équipés pour recevoir les patients, disposer de tous les matériels nécessaires, effectuer les prélèvements dans des conditions définies par des procédures validées, puis les

identifier, les stocker ou les (faire) transporter si nécessaire. Même dans ces conditions presque optimales, des erreurs interviennent et on estime qu’elles constituent la majorité (de 50 à 75%) de la totalité des erreurs de laboratoire ; cependant, la plupart pourraient évitées et, selon une étude [39], elles seraient même susceptibles de nuire au patient dans 3 à 12% des cas [110].

La fréquence des erreurs préanalytiques n’a été que peu étudiée en biologie médicale vétérinaire. Selon une étude effectuée dans un laboratoire autrichien, environ les deux tiers des erreurs totales de ce laboratoire interviendraient à ce stade [118]. Une étude récente a montré que 27 et 15% des spécimens canins et félins soumis à un laboratoire de cytologie étaient de mauvaise qualité [6]. A l’exception des hôpitaux vétérinaires, les prélèvements sont réalisés par des vétérinaires ou des auxiliaires qui sont des professionnels qualifiés mais non des spécialistes de la biologie médicale. De plus, les conditions de la pratique font que les animaux peuvent ne pas être à jeun, être stressés par le transport, la capture ou le délai dans une salle d’attente. Dans ces

RÉSUMÉ

Preanalytical Variability Advisor est un logiciel permettant d’accéder aux informations publiées dans la littérature sur les facteurs pouvant affecter les résultats de biologie médicale lors de la collecte et du traitement des spécimens biologiques avant analyse. Alors que la variabilité analytique est maintenant très faible et bien contrôlée dans les laboratoires, la variabilité préanalytique est responsable d’un nombre important d’erreurs. Celles-ci ont deux grands types de causes : soit des facteurs techniques aisément contrôlables soit des facteurs biologiques liés à l’animal souvent impossibles à maîtriser mais qu’il faut connaître pour éviter des erreurs d’interprétation des résultats. Les principaux facteurs techniques sont le choix des anticoagulants, le délai et la température de stockage des spécimens avant analyse, les conditions de centrifugation, éventuellement la durée et la température de stockage après analyse. Parmi les effets biologiques, les variations les plus notables sont dues à la proximité d’un repas, au stress de la contention, parfois de la capture chez les animaux sauvages, à la sédation ou à l’anesthésie, ainsi qu’à la prise de médicaments.

Mots-clés : Préanalytique, prélèvement, sang, anticoagulants, urine, analyse, erreur

SUMMARY

An introduction to Preanalytical Variability Advisor, a freeware to avoid or manage sampling errors in animal hematology, hemostasis and clinical chemistry

Preanalytical Variability Advisor is a search engine giving access to published information on factors affecting results of clinical patholgy during specimen sampling and handling before analysis. Whereas analytical variabililty is now very low and well controlled in laboratories, preanalytical variability is responsible for numerous errors. These have two categories of causes : either easily contollable technical factors, or biological factors, which are often impossible to control but which must be known to avoid errors in result interpretation. The main technical factors are the choice of anticoagulants, duration and temperature of storage before analysis, centrifugation conditions, duration and temperature of storage after analysis. Among biological effets, the most notable ones are the proximity of a meal, the stress of restraint, sometimes of capture in wild animals, sedation and anesthesia, and drug treatments.

Keywords: Preanalytical, sampling, blood, anticoagulants, urine, analysis, error

Eviter ou contrôler les erreurs de prélèvements en hématologie, hémostase, cytologie, biochimie animales : une introduction à Preanalytical Variability Advisor

J.P. BRAUN1, N. BOURGÈS-ABELLA2, A. GEFFRÉ1, D. CONCORDET3, P. BOURDAUD’HUI3, C. TRUMEL1

1Université de Toulouse, UPS, INP, ENVT, UMS006, Sciences cliniques, F-31076 Toulouse, France2Université de Toulouse, UPS, INP, ENVT, UMS006, Sciences biologiques et fonctionnelles, F-31076 Toulouse, France3Université de Toulouse, INP, ENVT, UMR1331 Toxalim, F-31076 Toulouse, France

Auteur chargé de la correspondence : [email protected]

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UNE INTRODUCTION À PREANALYTICAL VARIABILITY ADVISOR 281

conditions, il n’est pas étonnant que les personnels des laboratoires vétérinaires rapportent qu’une fraction notable des spécimens reçus soit de qualité médiocre, voire parfois impropre aux analyses demandées. Il en résulte des erreurs, de mauvaises interprétations, la répétition inutile des prélèvements, des coûts surajoutés et finalement une qualité insuffisante. Il est par conséquent nécessaire d’identifier les causes de variabilité préanalytique soit pour prévenir les éventuelles erreurs, soit pour tenir compte des facteurs interférents dans l’interprétation des résultats.

Catégories de facteurs de variation préanalytique

De manière simplifiée, les effets préanalytiques peuvent être subdivisés en deux grandes catégories (Tableau I) :

- des facteurs techniques dus à la technique de prélèvement et au traitement du spécimen avant l’analyse. Ce sont notamment le choix de l’anticoagulant, du site de prélèvement, le délai de centrifugation, le stockage réfrigéré ou non, l’envoi à un laboratoire extérieur.

- des facteurs biologiques liés à l’animal prélevé, comme la proximité d’un repas, un transport ou un effort physique, les éventuels effets des rythmes biologiques, l’anesthésie du sujet. Des facteurs de variation comme l’âge, le sexe, la race, la gestation, la lactation, etc. relèvent davantage des intervalles de référence [85] et ne sont donc pas envisagés ici.

Les différents facteurs techniques sont faciles à identifier, à étudier et à contrôler par des procédures adéquates. Il n’en est pas de même pour la plupart des facteurs biologiques ; en revanche, leur liste doit être connue ainsi que leurs possibles effets de façon à en tenir compte lors de l’interprétation des résultats.

Information disponible sur la variabilité préanalytique en biologie médicale vétérinaire

Il y a de nombreux ouvrages sur la variabilité préanalytique en biologie médicale humaine, dont un énorme répertoire fondé sur l’analyse de milliers d’articles originaux et publié en 2007 [280]. Ce corpus a été récemment repris par l’Association Américaine de Chimie Clinique et l’éditeur Wiley dans une base de données accessible en ligne (http:// clinfx.wiley.com/aaccweb/aacc/) [242]. Une part notable de cette information est vraisemblablement transposable en biologie animale mais il faut être très prudent et, lorsque cela est possible, confirmer avec des articles originaux concernant l’espèce d’intérêt ou bien valider soi-même les conditions nécessaires.

Il n’existe pas à notre connaissance de revue exhaustive des effets préanalytiques en biologie animale. La phase préanalytique est abordée dans :

- des chapitres d’ouvrages généraux, fréquemment sans références aux publications originales, donc sans possibilité de vérifier si l’information est pertinente pour l’utilisation envisagée ;

- des recommandations de l’ASVCP (American Society of Veterinary Clinical Pathology) sur le contrôle de qualité [99, 266] ;

- des articles de revue généraux [78, 187] ou consacrés aux animaux domestiques [14, 87, 119, 165, 167] ou de laboratoire [21, 72, 126, 204, 212]. Cependant, l’information est soit très générale, soit résumée, ce qui nécessite le recours à un grand nombre d’études originales pour accéder de manière précise aux détails.

IDENTIFICATION DES SOURCES ORIGINALES

Les sources originales sont souvent difficiles à identifier avec les bases de données du type de PubMed car :

- les articles sont rarement identifiés avec des mots clés tels que « preanalytic » ou « preanalytical », mais parfois avec

Facteurs de variation pré-analytiques

Effets techniques Effets biologiques

Prélèvement- Choix du spécimen sanguin : sang total, plasmas,

sérum- Choix du(des) anticoagulant(s) pour les plasmas- Types d’aiguilles et/ou de seringues et/ou de systèmes

sous vide- Utilisation de cathéters

Traitement du spécimen- Délai avant centrifugation- Conditions (durée, température) de stockage avant

analyseUrines spontanées ou obtenues par cystocentèse

Alimentation :- Effets d’un repas - Composition des aliments

Stress - Contention- Capture- Transport- Environnement/Effets sociaux

Sédation/AnesthésieMédicaments/PolluantsRythmes biologiquesEffort physique

- Sport- Travail

Tableau I : Catégories de facteurs de variation pré-analytiques pouvant affecter les résultats d’analyses biologiques et exemples des principaux facteurs de chaque catégorie

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des mots plus précis comme « hemolysis » ou « storage » ou « freezing », qui mènent également à de nombreuses sources non pertinentes. Il en résulte que la réponse précise à une question donnée peut être longue, laborieuse et parfois totalement inefficace. Une recherche sur PubMed avec les deux mots clés « preanalytic » ou « preanalytical », en Décembre 2014, a fait ressortir un peu plus de 2000 références, dont un grand nombre sans rapport avec la biologie médicale. Après application du filtre « other (than human) animals », il n’en restait que moins de 150.

- de nombreuses informations sur la stabilité des analytes, les effets des anticoagulants ou des médicaments, etc. peuvent être trouvées dans de petits paragraphes d’études de validation analytique. Elles ne figurent pas dans les mots clés ni bien souvent dans les résumés et ne sont donc pas identifiées par les moteurs de recherche. De plus, dans ces études, le nombre de cas est souvent limité et l’information peu précise.

QUALITÉ ET PERTINENCE DES INFORMATIONS

Caractéristiques et biais des études

- L’information est parfois trop imprécise pour être exploitable. La phrase « toutes les valeurs hématologiques et biochimiques sont restées dans l’intervalle de référence à toutes les échéances », suggère que les analytes de routine n’ont pas varié dans les conditions testées mais les variables étudiées restent hypothétiques lorsque leur liste n’est pas fournie [136].

- La procédure expérimentale ne permet pas dans certains cas de soutenir les conclusions, rendant ces dernières incertaines ; par exemple lorsque les interférences de l’hémolyse et de l’hyperprotidémie sur la mesure de l’ionogramme chez le chien sont étudiées par addition d’hémoglobine et d’albumine hétérologues [20].

- L’étude simultanée de multiples facteurs de variation complique et limite l’interprétation des résultats, comme chez des lapins de différents âges, piégés ou abattus, en été ou en hiver [149].

- Les effets observés sont parfois dépendants de la méthode utilisée, ce qui a été montré pour la mesure de la glycémie chez les ratites et l’interférence de l’hémolyse qui diminue ou augmente les résultats selon que l’on utilise des méthodes de chimie liquide ou des supports de réactifs secs [8].

- De nombreux effets biologiques, particulièrement les rythmes biologiques, ont été étudiés chez des sujets en bonne santé, au moins apparente, mais ils n’ont pas été validés chez des sujets malades.

- Les études d’interférences et d’effets de biologie médicale humaine sont probablement transposables pour les effets strictement méthodologiques, tels que la glycolyse lors de délai avant centrifugation de sang total ou la fuite de zinc

à partir des bouchons en caoutchouc ; cependant, ils n’ont majoritairement pas été validés dans d’autres espèces.

Qualité du rapport

- Certaines informations semblent relever davantage de la « tradition orale » que de l’information scientifique ; en effet, les sources originales d’effets communément rapportés et acceptés sont parfois impossibles à trouver. Un cas en est la recommandation de ne pas utiliser des tubes avec séparateur pour le dosage de la progestérone dans toutes les espèces animales dont nous n’avons réussi à trouver de sources originales que pour l’homme [77, 112, 237] et les bovins [202].

- Une grande partie de l’information est ancienne, ayant été publiée il y a plus de 10 à 20 ans. Les analyseurs et les techniques peuvent être obsolètes mais les effets observés sont peut-être valides avec de nouvelles méthodes. L’appréciation de la pertinence de telles informations requiert de se référer à la source primaire, ce qui est souvent difficile car de nombreuses revues scientifiques n’ont pas mis en ligne les articles publiés avant 2000.

- La quantité d’information disponible pour un analyte donné n’est pas proportionnelle à la fréquence de son utilisation clinique. C’est en particulier le cas du cortisol, de la corticostérone et de leurs catabolites qui ont été étudiés comme marqueurs de stress dans le plasma, le sérum, l’urine, la salive et les fèces de presque toutes les espèces possibles des poissons aux hommes. Cela leur donne une sur-représentation par rapport à d’autres variables bien moins étudiées et plus fréquemment utilisées en routine.

- Les tables d’interférences ou d’effets publiés dans les articles de synthèse ou les traités généraux sont des résumés reflétant la documentation et l’interprétation du/des auteur(s). Elles sont par conséquent le plus souvent trop simplifiées et incomplètes, parfois même erronées.

Il est par conséquent prudent d’aborder la littérature avec précaution, de se reporter si possible à une source primaire et de se rappeler « le danger d’extrapoler les résultats d’une étude donnée dans une espèce à une autre et d’une [variable] à une autre » [201].

La phase pré-préanalytique

Il n’y a pas de définition internationalement reconnue de cette (sous)-phase. Cette subdivision est fondée sur l’idée formulée il y a plus de 30 ans du « brain-to-brain turnaround time » [153], de façon à clairement identifier les actions associées à la sélection des tests par le clinicien du reste de la phase pré-analytique (collecte et traitement du spécimen)[141]. D’autres auteurs ont proposé d’y inclure toutes « les procédures initiales qui ne sont pas effectuées dans le laboratoire de biologie et ne sont pas sous le contrôle du

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personnel du laboratoire » [193], c’est-à-dire dans certains cas la collecte, l’identification et le transport du/des spécimen(s). Cette dernière définition correspondrait davantage à la situation la plus fréquente en biologie médicale vétérinaire.

En biologie médicale humaine, « les erreurs pré-préanalytiques, erreurs faites par des cliniciens bien intentionnés dans la prescription de tests inutiles ou la non prescription de tests adaptés, ont lieu plusieurs milliers de fois par jour aux USA… Cela n’est peut-être pas étonnant car le plus cultivé des médecins ne peut pas avoir une connaissance correcte lui permettant de toujours savoir … quel est le meilleur test de laboratoire à une époque où plus de 20 000 journaux médicaux publient constamment de nouvelles découvertes » [193]. Dans de nombreux cas, de telles erreurs amènent à une duplication des analyses ; dans un hôpital humain, on a estimé que ces doublons représentaient de 4.6 à 8.7% des analyses effectuées [31].

En biologie médicale vétérinaire, la phase pré-préanalytique n’a pas fait l’objet d’études. Mais il ne fait pas de doute que la prescription fréquente de « profils » sans évaluer si toutes les analyses sont pertinentes ou si d’autres ne le seraient pas aussi relève des mêmes doutes. Il en est de même lorsque pour le suivi d’un cas des profils sont répétés alors qu’une ou quelques analyses pourraient suffire. C’est aussi le cas en médecine préventive, notamment pour la surveillance des animaux de compagnie âgés, où des profils sont prescrits alors que la probabilité pré-test que le sujet ait une affection donnée est faible et que, par conséquent, la probabilité post-test est souvent inférieure à 50%, c’est-à-dire à jouer à pile-ou-face [70].

Cela donne à penser qu’en médecine vétérinaire également la phase pré-préanalytique pourrait être améliorée.

Facteurs techniques de variabilité préanalytique

COLLECTE DES SPÉCIMENS

De nombreuses recommandations générales ont été publiées dans des chapitres d’ouvrages ou des articles de revue pour les animaux de compagnie, les animaux exotiques et les espèces de laboratoire.

Sang/Sérum/Plasmas

CHOIX DU SPÉCIMEN : SANG VS. SÉRUM VS. PLASMAS

Le sang total rendu incoagulable est le spécimen utilisé dans la plupart des analyses hématologiques. Chez les mammifères, l’anticoagulant le plus fréquemment utilisé est l’EDTA alors que c’est l’héparine chez les oiseaux et quelques autres espèces dont les reptiles [266]. Chez certains mammifères, en particulier les chats, l’EDTA est responsable d’une fréquence élevée d’agrégation plaquettaire in vitro et

donc de fausses thrombopénies [180]; on a ainsi suggéré dans cette espèce d’utiliser d’autres anticoagulants ou additifs tels la prostagladine E1 [260], le CTAD (Citrate, Théophylline, Adénosine, Dipyridamole )[92, 93, 179], qui n’altèrent pas les autres analytes. Certains auteurs ont montré que les comptages hématologiques différaient peu chez le chien et le chat en utilisant soit de l’EDTA, soit de l’héparine, soit du citrate [15], ce qui permettrait éventuellement de réduire le nombre de tubes prélevés, surtout chez les sujets de petite taille ; cela nécessite cependant d’être validé pour chaque analyseur d’hématologie. Par ailleurs, le sang total, souvent sans anticoagulant, est le spécimen utilisé par les analyseurs de gaz du sang ainsi que par les petits analyseurs portables utilisables au chevet des patients (analyseurs de glucose ou de lactate, etc.).

La composition du sérum et des plasmas diffère peu, à l’exception de la présence de l’anticoagulant et des facteurs de la coagulation dans les plasmas. La plupart des ouvrages recommandent l’utilisation de sérum ou de plasma hépariné pour les analyses de biochimie de routine, de plasma citraté pour la coagulation et de plasma fluoré pour l’analyse de certaines molécules instables comme le glucose ou les corps cétoniques. Pour la majeure partie des analyses de biochimie, il n’y a pas de différence entre sérum et plasma hépariné [42, 81, 255, 256], même si pour des raisons techniques certaines analyses ne peuvent être correctement faites qu’avec du sérum comme le dosage des acides biliaires ou l’électrophorèse des protéines ; pour cette dernière analyse, l’interférence du fibrinogène dans le plasma peut être atténuée chez le chien par précipitation par l’éthanol [217] ou bien on peut avoir recours à l’électrophorèse capillaire [160]. En revanche, le nombre de différences est plus important avec le citrate ou l’EDTA, en particulier pour les métaux divalents [42, 171].

Même si les différences de composition entre sérum et plasmas sont limitées, la coagulation peut entraîner des modifications de la concentration de certains analytes :

- certaines molécules intracellulaires « fuient » du milieu intracellulaire des cellules endommagées par la formation du caillot vers le sérum. L’exemple le plus connu est celui du potassium dont la concentration intracellulaire est voisine de 100 mmol/L, ce qui crée une différence de 0,5 à 1,5 mmol/L entre sérum et plasma dans la plupart des espèces. Cette différence est plus faible chez le chien [121], à l’exception des Akitas [56] ou bien dans les cas de thrombocytose [200]. Une fuite similaire est observée pour de nombreuses enzymes en particulier la lactate déshydrogénase (LDH), l’aspartate aminotransférase (ASAT) et la créatine kinase (CK) [5, 255].

- la formation du caillot peut aussi piéger certains analytes. C’est la cas du cuivre dont la concentration est en moyenne 25% plus basse dans le sérum que dans le plasma des ruminants avec une très forte variabilité inter-individuelle [142-145].

- le délai nécessaire à la coagulation et donc à la formation du sérum n’est pas compatible avec l’instabilité de certaines molécules, en particulier de peptides soumis à la protéolyse des peptidases plasmatiques. Dans ce cas, il est obligatoire

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d’utiliser des plasmas qui peuvent être séparés immédiatement après le prélèvement ; on utilise alors le plus souvent l’EDTA, parfois avec des inhibiteurs de protéases comme l’aprotinine.

CHOIX DE LA VOIE DE PRÉLÈVEMENT

Dans la plupart des cas, il n’y a que peu de différences entre les résultats d’hématologie et de biochimie selon le vaisseau ponctionné, même si des différences statistiquement significatives ont été rapportées [125, 208]. Les bovins sont fréquemment prélevés aux vaisseaux de la queue, ce qui provoque parfois le mélange de sang artériel et veineux impropre à la gazométrie [261] et produit des résultats de phosphatémie supérieurs à ceux de la veine jugulaire [174]. Les résultats obtenus dans des spécimens collectés aux capillaires de l’oreille chez le chien et le chat diffèrent parfois de ceux obtenus à partir de plus gros vaisseaux, par exemple pour l’hématocrite, les protéines ou le lactate [46, 74], mais chez le chat il n’y a que peu de différences pour les analyses hématologiques [124].

Chez le rat, l’hématocrite et les numérations cellulaires sont plus élevés dans le sang collecté par ponction cardiaque qu’à partir du sinus orbital ou de la veine de la queue, alors que le volume globulaire moyen (VGM) et la concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH) sont identiques [247]. Chez les rongeurs de laboratoire, la qualité du spécimen, spécialement l’absence d’hémolyse ou de caillots, dépend notablement de la voie de prélèvement ; chez la souris, l’hémolyse est minimale par ponction du sinus orbitaire, faible par incision latérale de la queue, et forte par ponction de la queue ou amputation de son extrémité [44].

Lorsqu’un vaisseau sanguin n’est pas facilement accessible, il a été suggéré d’utiliser la ponction osseuse, notamment chez le porc ; cependant, les résultats de certaines analyses différaient de ceux obtenus dans le spécimen prélevé à la veine jugulaire [95]. Une autre possibilité, utilisée pour les animaux de zoo, consiste à utiliser des parasites hématophages tels que Dipetalogaster maximus ; ils permettent d’obtenir jusqu’à 2.4 mL de sang et les résultats obtenus chez le lapin et les primates étaient identiques à ceux des spécimens conventionnels dans environ 50% des cas (hémoglobine, hématocrite, albumine, protéines, glucose, alanine aminotransférase (ALAT), créatinine, urée, amylase, magnésium) [158, 254].

CHOIX DE LA TECHNIQUE DE COLLECTE DU SPÉCIMEN

Un point important, souvent souligné en biologie humaine mais peu dans les articles vétérinaires, est que le sang ne devrait jamais être prélevé à partir d’une voie de perfusion et lorsque celle-ci a été mise en place, le prélèvement devrait être fait à partir d’un autre vaisseau. De même, lorsqu’un prélèvement est effectué à partir d’un cathéter, il faut s’assurer d’éliminer tout le volume mort avant de collecter le spécimen. Dans ces dernières conditions, les résultats de la plupart des dosages ne sont pas modifiés, par exemple pour les temps de coagulation chez le chien [155]

ou les analyses de routine hématologiques et biochimiques du cheval [163]. Cependant, la présence de cathéters permanents peut provoquer une réaction inflammatoire ; ainsi, chez le rat, après 7 jours, on a observé un doublement de la concentration de l’haptoglobine sans modification des concentrations de calcium, de créatinine ou d’ASAT [80].

Les effets éventuels de l’anesthésie locale ou de la détersion cutanée n’ont pas été rapportés chez les animaux à notre connaissance. Chez l’homme, le nettoyage de la peau avec des tampons imbibés d’alcool n’a que des effets négligeables sur le dosage de l’alcool plasmatique [219], l’utilisation de polyvinylpyrrolidone iodée n’a pas d’effets sur la fonction thyroïdienne lors d’une utilisation isolée [279]. Si la ponction veineuse est incorrecte, les muscles sous-jacents peuvent être atteints et aspirés ; il en résulte une augmentation de l’activité plasmatique des enzymes d’origine musculaire, comme la CK chez le chien ou le cheval [73].

Lorsque plusieurs tubes doivent être collectés chez le même patient, l’ordre de prélèvement doit éviter une contamination d’anticoagulant ou d’additifs d’un tube à l’autre. En biologie médicale humaine, l’ordre recommandé est le suivant : 1/ Citrate ; 2/ Tube sec pour sérum ; 3/ Héparine ; 4/ EDTA ; 5/ Fluorure-oxalate [176]. A notre connaissance, les éventuels effets d’un ordre de prélèvement différent n’ont pas été étudiés chez les animaux.

CHOIX DU MATÉRIEL

En général, les éventuels effets du diamètre de l’aiguille, de l’écoulement libre comparé à l’utilisation d’une seringue ou de tubes sous vide n’ont pas été étudiés. En biologie médicale humaine, on recommande d’utiliser des aiguilles d’un diamètre suffisant pour limiter la friction des cellules et de n’exercer qu’une dépression faible en utilisant une seringue [176]. Chez le cheval, l’utilisation de seringues en verre permet une meilleure stabilité de la pO2 mais non du pH que les seringues ou les tubes en plastique [178, 192]. Pour les animaux de petite taille, on peut également utiliser des tubes capillaires ; chez le chien et le chat, il a été montré qu’il n’y avait aucune différence cliniquement interprétable entre les résultats ainsi obtenus et ceux de tubes sous vide pour l’hématologie et la biochimie de routine [208, 209, 273, 274].

Les tubes en plastique ont remplacé les tubes en verre pour des raisons de sécurité ; les résultats obtenus sont identiques en hématologie, biochimie, endocrinologie et coagulation humaines [113, 138, 194]; cela n’a pas été validé chez les animaux. Les tubes avec séparateur (un gel de densité intermédiaire entre les cellules et le plasma/sérum) permettent une séparation plus facile après centrifugation et évitent tout mélange accidentel. Dans quelques rares cas, des anomalies ont été observées chez l’homme mais n’ont pas été rapportés chez les animaux ; elles étaient dues à une hyperprotidémie massive ou à la présence de produits de contraste iodés modifiant la densité du plasma [244,

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263]. Les tubes contiennent également des additifs non mentionnés, tels que surfactants, revêtements des parois, etc. pour optimiser la récupération des spécimens ; ils n’ont en général aucun effet sur les analyses, excepté quelques tests immunologiques chez l’homme [245].

Le volume des tubes devrait être adapté aux besoins analytiques. Excepté chez les petits sujets, il excède souvent largement ces besoins conduisant à un gaspillage considérable de spécimen. Une enquête effectuée aux USA a montré que le volume collecté était en moyenne 8 .5 fois supérieur aux besoins en hématologie humaine [52]. En tout cas, le remplissage correct des tubes est nécessaire pour assurer un rapport adéquat entre sang et anticoagulant. Un remplissage insuffisant a peu d’effets avec l’héparine mais en a plus avec l’EDTA et surtout le citrate ; chez le chien, cela entraîne des allongements des temps de Quick et de céphaline activée [130].

La date de péremption des tubes devrait être respectée. Cependant, les fabricants s’assurent d’une telle marge de sécurité que la plupart des analytes biochimiques du chien n’étaient pas modifiés en utilisant des tubes héparinés avec séparateur périmés depuis 11 mois [61].

Urine

La collecte d’urine est souvent considérée comme une procédure simple et non invasive, comme c’est le cas chez les humains. Au contraire, c’est une technique parfois très invasive nécessitant une contention forte, la mise en place de cathéters, voire une cystocentèse et parfois une sédation ; tout cela peut altérer la composition de l’urine, spécialement lorsqu’une contamination bactérienne peut être suspectée, par exemple chez le cheval [154]. Cependant, la plupart des analytes de routine ont les mêmes concentrations urinaires, quelle que soit la technique de prélèvement, en particulier rapport protéines/créatinine chez le chien ou le chat [13, 17, 269] ; en revanche, certains marqueurs, notamment sexuels chez les animaux sauvages, peuvent être apportés lors du passage de l’urine dans les voies urinaires [57].

Lorsque la concentration d’un constituant plasmatique (hydrosoluble et filtré par le rein) varie au cours de la journée, son élimination urinaire totale sur 24h est un meilleur reflet de son métabolisme que sa concentration plasmatique à n’importe quel moment. En pratique, le recueil des urines pendant 24 heures n’est pas facile et impose d’utiliser des cages à métabolisme, elles-mêmes causes possibles de variabilité :

1/ les animaux doivent avoir été préalablement habitués à cet environnement stressant ; chez le rat pendant au moins 3 à 4 jours [246] ;

2/ une perte d’analyte peut intervenir par l’urine séchée sur les parois de la cage ; cette perte variable d’un sujet à l’autre ne peut être palliée qu’en rinçant soigneusement les cages, comme cela a été montré pour les clairances urinaires chez le chien [272];

3/ les analytes peuvent être instables dans l’urine.

Pour éviter ces difficultés et faciliter la collecte, on utilise le plus souvent des urines ponctuelles (de préférence prélevées le matin chez les animaux de compagnie) et on exprime l’élimination de l’analyte d’intérêt en fonction de la concentration de la créatinine urinaire pour pallier les dilutions-concentrations de l’urine (rapports cortisol/créatinine ou protéines/créatinine urinaires, …).

Fèces

Les fèces sont parfois le spécimen obligatoire, comme pour la détection de sang occulte ; l’alimentation est alors une source possible d’interférence soit en modifiant la flore bactérienne [159], soit en agissant directement sur la réaction analytique, comme cela a été montré chez le chien et le chat [211, 259].

Les fèces sont principalement utilisées pour explorer le métabolisme hormonal des animaux sauvages et à un moindre degré des animaux domestiques. Elles sont faciles à collecter sans perturber les animaux ; cependant, leur utilisation impose des précautions et des restrictions :

1/ l’élimination fécale des catabolites d’une hormone peut varier de manière très importante chez un même animal au cours de la journée, notamment en raison de leur excrétion biliaire pour les glucocorticoïdes[104] ; par exemple, chez le porc, le coefficient de variation intra-individuel de l’élimination des catabolites du cortisol varie de 10 à 100% [38];

2/ la nature des catabolites varie selon les espèces et leur élimination est « polluée » par l’excrétion urinaire chez les oiseaux, ce qui impose des validation pour chaque espèce [186, 187, 257];

3/ en raison du délai de transit intestinal, l’excrétion fécale est décalée par rapport aux variations plasmatiques et ne permet pas d’observer de phénomènes très récents ou temporaires ; ainsi, le stress de la capture de vaches cause-t-il une augmentation de la concentration des glucocorticoïdes plasmatiques mais non fécaux [220], ou bien le stress n’entraîne qu’un pic faible 2 à 3 jours plus tard chez des gorilles [231] ;

4/ après leur élimination, les fèces sont exposées plus ou moins longtemps à l’environnement (humidité, prolifération microbienne, exposition au soleil, etc.), comme rapporté pour la dilution des estrogènes fécaux par la pluie chez le lynx [1].

Autres spécimens

L’information concernant les effets préanalytiques sur les autres spécimens est beaucoup plus limitée. Il y a de nombreuses recommandations dans les ouvrages de cytologie (voir [48, 49, 197]); ce ne sont pas des sources primaires validées mais ce sont les reflets de l’expérience des auteurs et souvent les seules sources disponibles.

- Salive : la salive est peu utilisée en biochimie de routine, alors qu’il a été montré que les concentrations de nombreux

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constituants, notamment hormonaux sont parallèles à celles du plasma/sérum. Les conditions de collecte n’ont pas été validées chez la plupart des animaux (voir une revue chez les ruminants [139]). Chez l’homme, la composition protéique de la salive varie notablement selon la technique de collecte [91, 168], alors que chez le chien la concentration en cortisol varie peu et reste stable pendant les 4 premières minutes de contention [63, 134].

- Liquide cérébrospinal : Chez le chien et le chat mais non chez le cheval, la concentration protéique est environ deux fois supérieure dans les spécimens collectés dans la zone lombaire que dans la zone atlanto-occipitale [11, 117, 164]. La présence de sang intact ou hémolysé n’a que peu ou pas d’effet sur la concentration de protéines, la numération leucocytaire ou l’activité de la CK [86, 120, 122, 277].

- Synovie : la composition chimique et les numérations cellulaires varient selon l’articulation chez le cheval [152, 265, 268] et le chien [75, 223]; chez ces derniers, les numérations varient peu lorsque des spécimens sont collectés plusieurs fois [18].

- Liquides d’épanchement : La composition du liquide péritonéal du cheval est fortement affectée lors de laparotomie, de castration ou d’entérocentèse [16, 225, 226]. Les numérations cellulaires et la concentration protéique varient lorsque les prélèvements sont répétés sur 24 heures [131], lors de contamination sanguine [156] ou de poulinage [264].

- Lavages broncho-alvéolaires (voir une revue chez le chien et le chat dans [106]). Chez le chien, les formules leucocytaires diffèrent entre les deux poumons [262] et selon les lobes [199]. Les résultats de cytologie diffèrent dans environ 2/3 des cas entre les lavages broncho-alvéolaires et trachéaux [107]. Chez le chat, les résultats obtenus dans 3 lavages consécutifs étaient similaires [108].

IDENTIFICATION DES SPÉCIMENS

Une identification insuffisante des spécimens est une source importante d’erreurs préanalytiques : les laboratoires reçoivent de nombreux tubes insuffisamment identifiés qui rendent aléatoire l’appariement des résultats et du sujet. Cette difficulté est certainement moindre pour les analyses effectuées dans les cliniques vétérinaires, où les analyses sont moins nombreuses, souvent effectuées très rapidement et interprétées immédiatement, limitant ainsi les possibles ambiguïtés. Une autre difficulté est l’identification correcte et le stockage d’aliquotes quand des analyses complémentaires peuvent être nécessaires.

PRÉPARATION DES SPÉCIMENS

La préparation des spécimens est effectuée de manière correcte dans les laboratoires spécialisés, parfois moins dans les cliniques vétérinaires. Cela peut avoir des effets

notables pour les analytes instables ; pour d’autres analytes, les conditions de préparation et de stockage ont peu d’effets comme cela a été montré pour la plupart des constituants biochimiques sériques chez l’homme [250] et pour certaines IgG chez le porc [177]; dans ce dernier cas, les auteurs ont volontairement effectués 11 types d’erreurs sans affecter notablement les résultats. Cependant, cela ne doit pas être une incitation à ne pas respecter les procédures, surtout lorsque la robustesse d’une analyse n’est pas connue.

Homogénéisation du spécimen

Les recommandations de la biologie médicale humaine sont en général appliquées aux spécimens animaux : « Immédiatement après avoir rempli chaque tube contenant un additif, agiter le sang doucement et totalement en retournant le tube 5 à 10 fois. Pour éviter l’hémolyse, ne pas agiter vigoureusement » [176].

Délai avant traitement du spécimen

Il n’y a pas de recommandation internationale concernant le délai ni les conditions de stockage des spécimens non réfrigérés, réfrigérés ou congelés ; il n’y pas non plus de définition de la stabilité d’un analyte de biologie médicale. C’est peut être une des raisons pour lesquelles des résultats différents sont rapportés sur ces délais et conditions. La recommandation générale est de traiter les spécimens le plus rapidement possible pour éviter toute altération in vitro. En biologie humaine, un délai maximal de deux heures est recommandé pour optimiser la fiabilité des résultats [45], même s’il a été établi que de nombreux analytes sont stables pendant beaucoup plus longtemps (voir une étude de biologie humaine portant sur 81 variables [183]). Cependant, cette instabilité peut aussi être notable, par exemple pour le glucose [59] : depuis les années 1940, il a été montré que les ions fluorure réduisaient la glycolyse in vitro [33], même si les effets ont un délai d’action d’environ 90 min [169] ; c’est la raison pour laquelle certains spécialistes recommandent d’utiliser des tubes avec séparateur et de les centrifuger dès que possible [32, 76].

- Température ambiante : En hématologie, les principaux changements observés en 48 heures dans des spécimens félins sur EDTA sont une augmentation de l’hématocrite, du VGM, des numérations de réticulocytes et d’éosinophiles, et une diminution de la CCMH et de la numération des monocytes ; ces effets sont moins intenses si du CTAD est ajouté à l’EDTA [92]. Chez le chien, dans les mêmes conditions, on observe principalement une augmentation du VGM et de l’hématocrite, et une diminution des numérations de monocytes et de plaquettes [24, 166, 189]. Ces altérations sont reflétées par des variations des diagrammes de répartition cellulaire [24, 92]. Dans certaines espèces, la stabilité des variables hématologiques est beaucoup plus courte : chez les requins la formule leucocytaire est modifiée dès la troisième heure [9]. De nombreux analytes biochimiques ne sont pas modifiés dans les spécimens conservés un ou deux jours ou

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le sont peu; par exemple, chez les bovins l’augmentation de la CK n’était que de 10% après 12 heures [67]. En revanche, les analytes sensibles à la lumière, comme la bilirubine ou les carotènes, imposent un stockage à l’obscurité. Il n’y a que peu d’informations sur la stabilité des analytes urinaires ; en biologie humaine, les résultats des bandelettes sont identiques après 2 ou 4 heures de délai [267].

- Réfrigération : Des effets controversés de la réfrigération ont été rapportés, comme pour les globules blancs du chien [15, 111, 189]. Les comptages plaquettaires sont stables pendant 3 jours chez le chat mais l’agrégation plaquettaire est plus forte qu’à température ambiante chez le chien [175]. Les analytes instables comme les catécholamines, l’ACTH et d’autres peptiques nécessitent une réfrigération rapide ; mais dans ce cas encore, les résultats sont parfois controversés, ainsi pour l’ammoniémie du chien a-t-on rapporté des augmentations ou des diminutions pendant le stockage [90, 116, 205].

- Congélation : De nombreux analytes biochimiques sériques ou plasmatiques ne sont pas stables pendant de longues périodes en congélation à -20°C (phosphatases alcalines, ALT, amylase, AST, CK, GGT, GLDH, LDH, acides biliaires, calcium, cholestérol, créatinine, fructosamine, magnésium, phosphate, urée) mais le sont pendant des délais plus courts ; certains de ces constituants ne sont stables qu’à très basse température (-70°C), comme la CK. [256]. La congélation peut altérer fortement la composition de l’urine, comme cela a été montré chez l’homme avec la formation de précipités qui diminuent la concentration des protéines et du calcium nécessitant une homogénéisation très vigoureuse des spécimens à température ambiante avant analyse [221]. Chez le chien, le rapport protéines-sur-créatinine est stable jusqu’à 3 mois à -20°C [216]; il en est de même de l’albumine [236, 275] ou de la cystatine C [173]. La plupart des enzymes urinaires sont rapidement inactivées par la congélation ; cela a été rapporté pour la gamma-glutamyltransférase (GGT) chez le rat [28], le lapin [157] et le cheval [3], ou la N-acétyl-β-glucosaminidase (NAG) chez le chien et le chat [127, 236].

- Décongélation : La décongélation de plasma ou de sérum crée un gradient de concentration des analytes de 35 à 200% de la concentration moyenne du haut au bas du tube ; ce gradient est plus marqué lorsque la décongélation est lente à basse température et s’accroît au cours de répétition de cycles de congélation-décongélation [115]. Cela justifie de soigneusement réhomogénéiser les spécimens décongelés ; avec des sérums humains, il a été montré que cela était obtenu par au moins deux retournements [105] mais il est prudent d’en effectuer davantage. Il n’est généralement pas recommandé de répéter des cycles de congélation-décongélation mais la plupart des analytes de biochimie n’étaient pas modifiés après trois cycles dans le plasma du chien [207].

Vitesse de centrifugation

Les spécimens destinés à la cytologie sont centrifugés à basse vitesse pour préserver la morphologie cellulaire ; cependant, une brève centrifugation à grande vitesse d’urine de chien donne les mêmes résultats pour les numérations de cellules et de cristaux mais les effets éventuels sur la morphologie n’ont pas été étudiés [146]. Pour la plupart des analyses biochimiques plasmatiques, il est important de préparer des plasmas pauvres en plaquettes en centrifugeant fortement pour éviter l’interférence d’analytes présents à forte concentration dans les plaquettes, comme la LDH ou la CK chez le rat ; cela est encore plus important si l’on envisage de congeler les spécimens car les plaquettes sont alors détruites et la totalité de leur contenu libéré [161].

Transport et expédition des spécimens

Un nombre croissant d’analyses est effectué dans des laboratoires centralisés, ce qui pose la question de la stabilité des spécimens pendant le transport. En médecine vétérinaire, ce transport a une importance variable selon les pays et selon les analytes ; dans de nombreux cas, les possibles effets du transport, réfrigéré ou non, par poste ou transporteur, n’ont pas été étudiés. Chez le chien, il a été montré que l’hématocrite et le VGM étaient légèrement supérieurs après expédition postale, alors que la CCMH était abaissée, la concentration d’hémoglobine et la numération érythrocytaire étant inchangées [114].

VALIDATION DES FACTEURS PRÉANALYTIQUES TECHNIQUES : EXAMEN DU SPÉCIMEN AVANT ANALYSE

Dès sa réception au laboratoire (ou à la clinique avant analyse), les conditions préanalytiques doivent être examinées soigneusement : conditions de prélèvement, remplissage correct, identification, adéquation des spécimens aux analyses demandées, volume suffisant pour les analyses. Finalement, avant l’analyse, le spécimen est observé pour détecter d’éventuelles couleurs anormales, la présence d’une turbidité ou celle de caillots.

Couleurs anormales du plasma ou du sérum

Les trois couleurs anormales des plasmas ou sérum sont le rouge, le blanc et le jaune. Leurs effets ont été étudiés en fonction de leur intensité sur les principaux analytes biochimiques du chien, du chat, de la vache et du cheval avec les interférogrammes correspondants [123]. L’estimation visuelle des couleurs est imprécise et subjective, même avec des chartes de couleurs, comme cela a été établi en biologie médicale humaine [89, 109]. Enfin, les interférences peuvent varier en fonction de la technique pour un même analyte, ce qui impose une grande prudence dans l’utilisation des données publiées : l’hyperbilirubinémie entraîne une fausse hypoprotidémie par la technique du biuret mais non par réfractométrie [83, 100, 101].

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- Rouge-rose dû à l’hémolyse, la plus fréquente des anomalies observées dans les laboratoires de biologie médicale humaine, affectant environ 3% des spécimens [22, 40]. C’est probablement aussi le cas en médecine vétérinaire, mais aucune enquête n’a été effectuée à notre connaissance. L’hémolyse affecte :

1/ les mesures par spectrométrie d’absorption de manière variable selon les techniques utilisées [182]; dans certains cas, l’interférence est proportionnelle à l’intensité de l’hémolyse, permettant l’utilisation d’équations de correction, comme pour le dosage de l’haptoglobine chez la vache ou la chèvre [235];

2/ les comptages cellulaires par la lyse des globules ; 3/ les concentrations de certains analytes libérés par les

cellules : ions, enzymes, protéines.

- Blanc dû à la lipémie qui provoque une diffraction de la lumière ; celle-ci interfère avec les mesures hématologiques fondées sur cette technique (les comptages plaquettaires chez l’homme [37]) et avec de nombreuses techniques spectrométriques, notamment le dosage de l’hémoglobine [36]. Lorsqu’elle est massive, la lipémie entraîne un déplacement d’eau interférant avec les dosages d’ions par potentiométrie indirecte, et elle s’accompagne souvent d’une augmentation de l’hémolyse chez le chien [248]. Chez les carnivores, elle peut souvent être évitée en respectant une diète d’une douzaine d’heures ; sinon, l’interférence peut être atténuée par ultracentrifugation ou par utilisation d’agents clarifiants comme le polyéthylène glycol chez le chien [253].

- Jaune dû à la bilirubine qui interfère de manière variable avec la plupart des techniques photométriques.

Présence de caillots

La présence de caillots dans le sang récemment collecté est faible en biologie médicale humaine, environ 0.3% des tubes dans un hôpital brésilien [98] mais probablement supérieure pour les spécimens animaux. Les microcaillots peuvent passer inaperçus si les spécimens ne sont pas examinés très soigneusement. Ils provoquent des erreurs de comptages cellulaires, parfois une obstruction des circuits des appareils, une interférence possible des lectures optiques. C’est une des raisons qui font que le sérum est parfois préféré au plasma pour les analyses de biochimie [60] Des microcaillots et des agrégats plaquettaires indétectables se forment également dans le sang total ; ils sont plus fréquents chez le chat que chez le chien [23], surtout dans les spécimens collectés sur EDTA [180].

De petits caillots d’aspect parfois floconneux apparaissent parfois dans les plasmas héparinés décongelés. Ils pourraient être en partie dus à la liaison de l’héparine sur d’autres protéines que l’antithrombine [34]. A notre connaissance, les effets possibles de ces caillots sur la concentration des analytes biochimiques n’ont pas été évalués.

Facteurs biologiques de variabilité préanalytique

Les facteurs de variation biologiques sont très nombreux et se superposent dans l’interprétation des résultats. Certains de ces facteurs sont plus ou moins couverts par les intervalles de référence et leur compartimentation en fonction du sexe, de l’âge, de la race, des stades physiologiques tels que lactation, gestation des mammifères, mue des oiseaux, etc [85, 270]. De très nombreux autres facteurs de variation biologiques sont susceptibles d’influer sur les résultats, comme la proximité d’un repas, l’alimentation, l’exercice, le transport, la capture, la contention, les rythmes biologiques. Certains ont été étudiés dans une ou plusieurs espèces, souvent dans des conditions très différentes, majoritairement chez des sujets sains. Par conséquent, les résultats doivent être utilisés avec prudence, en se référant à la source primaire pour s’assurer qu’ils correspondent effectivement au cas étudié. Il est cependant important de les prendre en compte car ils peuvent modifier notablement les valeurs de certaines variables biologiques. Quelques exemples sont donnés ci-après pour montrer leur importance éventuelle.

ALIMENTATION

Effets d’un repas vs. effets du jeûne

- Effets d’un repas : Les effets d’un repas ont été principalement étudiés chez le chien. Déjà en 1855, Claude Bernard avait noté l’élévation post-prandiale du « sucre » sanguin, même si son interprétation était alors incomplète [19]. Les effets d’un repas résultent de l’absorption des produits de la digestion, des sécrétions digestives et hormonales (voir une revue chez le chien et le chat [14]); certains de ces effets sont d’ailleurs utilisés à des fins diagnostiques (le plus fréquent en routine est le dosage des acides biliaires post-prandiaux). Chez les monogastriques, les principales variations sont des augmentations de la concentration plasmatique de l’urée, du glucose, de la créatinine, de l’ammonium, des acides biliaires, du trypsinogène (TLI) et une diminution de la concentration des bicarbonates.

- Pertinence du jeûne précédant le prélèvement : Le jeûne n’a de véritable pertinence que chez les animaux monogastriques domestiques et de laboratoire ; il en a moins chez les polygastriques, excepté lorsqu’il est prolongé et ses effets sont impossibles à évaluer chez les animaux sauvages. Bien que généralement accepté par les biologistes, le jeûne précédant le prélèvement a été mis en cause par certains auteurs qui considèrent que c’est « une déviation de l’état normal » [150] et que cela ne n’améliore pas l’interprétation médicale de certains tests, en particulier des lipides sanguins chez les humains en bonne santé [140, 232]. Cependant, il est important que l’éloignement ou non d’un repas soit connu. Une mise à la diète depuis le repas du soir précédant un prélèvement effectué le matin est la transposition d’une recommandation de biologie humaine qui offre l’avantage

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majeur de diminuer la fréquence des spécimens lipémiques et de limiter la variabilité intra-individuelle. Un tel jeûne nocturne est peut-être mieux adapté au mode de vie des humains faisant des analyses biologiques qu’au rythme de vie des espèces nocturnes.

- Effets du jeûne : Un jeûne, même de courte durée, modifie notablement la concentration de certains analytes ; en particulier, augmentation de la concentration de la bilirubine plasmatique chez les équidés [69, 82] ou les rats [137]. La durée de jeûne d’une douzaine d’heures semble correcte pour la plupart des variables, des délais atteignant 16 heures ont été proposés chez le rat [132], le macaque [282] et le mouton [35]. Cependant, chez le chien, ce délai n’est pas suffisant pour que les concentrations d’urée [27, 271] et de triglycérides reviennent à leurs valeurs pré-prandiales et le jeûne ne permet pas d’obtenir un état stable pour toutes les variables ; par exemple, chez le chien la concentration des acides gras libres plasmatiques augmente après 4 à 5 heures de diète mais fluctue ensuite dans des marges de ± 25% [238].

- Effets de la coprophagie : Chez les rongeurs de laboratoire, une attention particulière doit être portée à la coprophagie. La concentration plasmatique d’urée « à jeun » était de 20 à 40% supérieure chez des rats élevés dans des cages traditionnelles que chez ceux qui avaient des cages comportant une grille au fond, ce qui élimine les fèces et empêche la coprophagie [151], mais l’hématocrite était inchangé [84]. Une situation analogue est observée chez les lapins et les cobayes qui ingèrent leurs caecotrophes ou leurs fèces : chez des lapins empêchés d’ingérer leurs caecotrophes pendant 6 semaines, les concentrations plasmatiques du glucose et du L-lactate étaient inchangées mais celle du D-lactate était plus basse [58].

Effets de la composition des aliments

Dans certains cas, la composition de l’alimentation peut être un facteur limitant de certaines analyses : la détection de sang occulte fécal chez le chat par des techniques utilisant du guaiacol ou de l’o-tolidine impose une restriction alimentaire stricte pour éviter un taux élevé de faux positifs [259]. La plupart des analyses sont peu ou pas influencées par l’alimentation, mais chez le chien le passage d’une ration commerciale à une autre a entraîné une très forte élévation de la concentration plasmatique du cholestérol sans modifier celles des triglycérides, phospholipides et acides gras libres [55]. Il en est de même chez les ruminants à la mamelle qui développent progressivement une carence en fer provoquant une anémie avec toutes les altérations correspondantes des analyses hématologiques [68].

Un effet particulier observé chez les mammifères est lié à l’ingestion du colostrum et à l’absorption de ses protéines chez les nouveau-nés. Outre l’augmentation de la concentration plasmatique des protéines totales et des immunoglobulines, on observe une augmentation très intense de l’activité d’enzymes comme la GGT ou les PAL

chez les jeunes ruminants [29, 30, 252] et à un moindre degré chez le chien [41].

STRESS

Le mot stress est très imprécis et recouvre des situations d’adaptation des animaux à des conditions très différentes comme la contention pour un prélèvement, la capture des animaux sauvages, le transport, le travail (chiens détecteurs de drogue, …), les conditions d’environnement (cages individuelles vs. collectives, environnements enrichis pour les rongeurs) ou sociales (notamment proximité de zones d’activité humaine pour les animaux sauvages), etc. Il en résulte que les effets rapportés sont très divers

Prélèvement : capture/contention

Chez les animaux domestiques, c’est chez le chat que les effets du stress lié à un prélèvement sont le plus intenses. Ils peuvent entraîner des augmentations massives de la glycémie ; les modifications des autres variables n’ont été que peu étudiées dans le cadre du stress dû aux prélèvements, mais il est probable que, comme d’autres stress expérimentaux, il entraîne aussi une forte élévation de la concentration plasmatique des lactates ou une lymphocytose [196].

Chez les animaux sauvages, le stress de la capture ne peut pas être évité, dans certains cas cette dernière peut être longue, provoquant l’épuisement, des myopathies chez les mammifères marins [215], voire la mort des animaux, comme chez le chevreuil [172].

Le stress lié à la manipulation, aux prélèvements et aux expérimentations des petits animaux de laboratoire est très important (voir une revue [12]) surtout lorsque les procédures doivent être répétées ou bien lorsqu’elles sont de longue durée, comme cela a été montré chez des poulets : l’augmentation des concentrations plasmatiques de la corticostérone et des lactates dépendaient davantage de la durée de la manipulation que de sa vigueur [43]. Dans de nombreux cas, les animaux peuvent être entraînés à ces procédures, ce qui limite les variations qui en résultent. Ainsi, l’entraînement de singes est-il une alternative à la contention ou à l’anesthésie, ce qui réduit la concentration plasmatique du cortisol [203]. De même, l’activité plasmatique de la CK était fortement augmentée chez des lapins lors de la répétition de prélèvements sanguins au cours de la journée, alors que l’activité de l’enzyme est restée stable après que les lapins ont été habitués à être manipulés [147]. La période de familiarisation des animaux peut être longue pour certains analytes, comme la concentration de l’adrénaline plasmatique du chien qui ne s’est stabilisée qu’après environ un mois [234].

Transport

Les effets du transport ont été étudiés dans des conditions très différentes, principalement chez le bétail et le porc dans un souci de bien-être animal, mais aussi chez les animaux

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de laboratoire pour évaluer leur impact éventuel sur les expérimentations. Les résultats sont aussi variés que les conditions ; transports plus ou moins longs par route, air ou mer, à des températures différentes et avec des périodes de stabulation variables. A notre connaissance, les effets du transport des animaux de compagnie vers les cliniques vétérinaires n’a été étudié que sur les variables physiologiques (fréquence cardiaque, pression sanguine) du chien [25], mais il est vraisemblable qu’il a aussi des effets notables sur certaines variables hématologiques ou biochimiques, tout comme un délai de 20 minutes en salle d’attente qui augmente la concentration plasmatique du cortisol mais non du glucose chez le chien [190].

Les effets du transport (voir une revue chez les ruminants [249]) associent :

- la manipulation des animaux qui a été surtout évaluée par les augmentations de la concentration des glucocorticoïdes plasmatiques pendant le transport et durant la phase de récupération [181]; les autres marqueurs utilisés ont été la numération et la formule leucocytaires ainsi que les catécholamines [184, 213].

- la fatigue physique avec des augmentations de l’activité plasmatique d’enzymes d’origine musculaire, principalement la CK, pouvant persister plusieurs jours après le transport [65].

- la déshydratation et le jeûne éventuels.- des effets souvent inexpliqués, par exemple une

diminution de l’hématocrite persistant jusqu’à 11 jours chez des bovins après un transport de longue durée [66].

MÉDICAMENTS ET POLLUANTS

Les médicaments et les polluants ont deux grands types d’effets sur les résultats de laboratoire :

1/ la molécule ou ses métabolites peuvent interférer avec la technique analytique ; c’est la cas de la surestimation de la chlorémie chez les chiens traités par les ions bromure pour épilepsie [218] ;

2/ la molécule provoque chez l’animal un effet entraînant la modification d’une ou plusieurs variables. Le cas le plus fréquent en routine canine est l’induction de la synthèse hépatique de la phosphatase alcaline chez les chiens traités par les glucocorticoïdes qui se traduit par une augmentation de l’activité plasmatique de cette enzyme [2, 26, 62, 222]. Un effet très rare, uniquement rapporté chez l’homme à notre connaissance, est l’interférence d’un excipient ; ainsi une préparation pour injection IV de dexaméthasone contenant une forte concentration de créatinine a provoqué une hypercréatininémie chez un patient [53].

Sédation – anesthésie

Une sédation ou une anesthésie est parfois nécessaire pour procéder à un prélèvement soit parce que la législation le requiert, soit parce que la procédure le nécessite (comme pour la mesure du débit de filtration glomérulaire par imagerie rénale), soit parce que le bien-être de l’animal est amélioré,

comme pour les chats « difficiles ». Les effets de la sédation sur les résultats de biologie médicale qui ont été rapportés sont en général assez faibles, ne pouvant provoquer que peu d’erreurs d’interprétation. Cependant, ils diffèrent selon les molécules, leurs associations et les doses ; par conséquent, il est nécessaire d’en valider les effets dans chaque cas dans l’espèce concernée. Ainsi, l’association kétamine – diazépam a peu d’effets cliniquement significatifs sur l’hématologie, la biochimie ou la coagulation chez le chat [210] ; l’anesthésie par le phénobarbital entraîne une hémolyse chez le lapin en solution dans du soluté salé mais non dans l’eau [97].

Un autre effet observé chez les sujets anesthésiés est lié à la position. Chez l’homme, il a été établi que des changements importants de la répartition de l’eau intervenaient entre les position debout, assis et couché avec des modifications correspondantes de la concentration de nombreux analytes (voir une revue [281]). A notre connaissance, ces effets n’ont pas été étudiés chez les animaux, excepté pour les effets d’un décubitus prolongé provoquant une augmentation de l’activité plasmatique de l’ASAT, la LDH et la CK chez des vaches [230].

Autres médicaments

Les effets de nombreux médicaments ont été testés chez les animaux en raison de potentiels effets toxiques, tels que des lésions hépatiques ou rénales avec des conséquences sur les résultats de biologie médicale ; par exemple, une augmentation de l’excrétion urinaire de la GGT et de la NAG lors d’administration de gentamicine à des chiens [94], ou une augmentation de l’activité plasmatique de ASAT, ALAT, LDH, PAL après ingestion de paracétamol chez le chat [10]. Dans de tels cas, le point le plus important pour l’utilisation de ces marqueurs est de savoir après quel délai les variables retrouvent leurs valeurs de base après traitement.

Les effets médicamenteux les plus souvent rapportés concernent les AINS et les glucocorticoïdes. Dans ce cas également, des différences importantes sont observées en fonction de la molécule utilisée, de sa forme galénique, de sa voie d’administration, de sa posologie et de l’espèce ; c’est la cas des glucocorticoïdes qui produisent une élévation de la numération leucocytaire et des neutrophiles dans la plupart des espèces de mammifères, mais l’augmentation de la concentration plasmatique du fer ou de l’activité des PAL est principalement observée chez le chien [26, 62].

Polluants

Les effets de polluants ou de toxiques sur certaines variables biologiques sont utilisés à des fins diagnostiques chez les animaux domestiques et sauvages, comme l’inhibition des cholinestérases par les carbamates et les organophosphorés [47, 251] ou de la delta-aminolévulinate déhydratase par le plomb [214]. Les effets de certains polluants de l’environnement sont souvent beaucoup moins intenses et difficiles à démontrer dans des études expérimentales ;

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ainsi, des chiens de traineau et leurs petits nourris pendant 2 ans avec de la viande contaminée par des organohalogénés n’ont présenté que des variations négligeables des variables urinaires et sanguines, à l’exception d’une diminution de la concentration des hormones thyroïdiennes [133, 241]. Chez des rapaces sauvages, l’ingestion d’organohalogénés est corrélée à des élévations de l’ALAT, des protéines totales, du cholestérol, des urates et de la bilirubine, et à des diminutions des PAL, du glucose et de la créatinine [239, 240].

RYTHMES BIOLOGIQUES

Excepté dans des cadres expérimentaux très contrôlés, les effets éventuels de rythmes biologiques sont biaisés par de nombreux facteurs tels que les repas, la reproduction, les migrations des animaux sauvages, la mue des oiseaux, etc. Ces facteurs de confusion sont surtout nombreux chez les animaux sauvages, mais semblent plus fréquents qu’on ne le pensait chez les animaux domestiques, comme le montre une revue récente sur l’utilisation des glucocorticoïdes comme marqueurs de stress [102].

De nombreux effets des rythmes biologiques sont faibles et cette variabilité intra-individuelle est le plus souvent intégrée dans les intervalles de référence. Cependant, pour certains analytes, le rapport entre valeurs minimale et maximale peut être élevé et justifier des intervalles de référence spécifiques : la concentration de l’α-MSH est environ 10 fois plus faible à la fin du printemps qu’au milieu de l’été chez les chevaux [224]. Les rythmes d’un même analyte peuvent également différer d’une espèce à l’autre : un des modèles en est la cortisolémie, maximale en début de matinée chez l’homme, et ne présentant que peu ou pas de variations chez le chien et le chat [103, 128, 129] alors que la concentration de la corticostérone est maximale en début de soirée chez le rat [188]. Chez les souris, des rythmes différents peuvent même être observés en fonction de la souche, par exemple pour les numérations globulaires chez les souris Balb et les CB6 F1 [135].

ENVIRONNEMENT – CONDITIONS DE VIE

Chez les animaux domestiques, l’influence des facteurs d’environnement est parfois difficile à identifier. Ainsi, des chiens croisés vivant dans un faubourg populaire en Afrique du Sud ont été comparés à des chiens de la police ; si certaines différences peuvent être expliquées par de mauvaises conditions alimentaires (déficit en fer plasmatique) ou une exposition plus intense à des agents pathogènes (forte concentration des gamma-globulines sériques), la plupart des différences observées sont difficilement explicables [198]. Il en est de même pour la concentration de l’haptoglobine plus basse chez des porcs élevés dans des loges fermées que dans des enclos ouverts mais ayant également un taux inférieur d’infections respiratoires [7]. Les conditions d’élevage et de production peuvent également entraîner des variations de certains analytes ; ainsi, les concentrations plasmatiques des acides gras libres et du β-hydroxybutyrate étaient plus

élevées chez des vaches traites 6 fois que 3 fois par jour en début de lactation [71]. L’altitude, comme chez les humains (voir une revue [278]), provoque des augmentations de l’hématocrite, de la concentration d’hémoglobine et des numérations cellulaires sanguines chez les poulets [283], ou les chevaux [96, 276], ainsi que chez les animaux sauvages comme les loutres [50] ou les ours lippus [229]; en revanche, chez des chiens, l’hématocrite n’a pas été modifié après 5 mois à 3500m [88].

Chez les animaux sauvages, les facteurs d’environnement superposent de nombreux facteurs dont le climat, le parasitisme, les conditions nutritionnelles, les conditions de vie. Chez les oiseaux migrateurs [51], il est difficile de faire la part entre les efforts liés au vol, le délai de récupération suivant ce vol, les conditions climatiques, l’alimentation sur le nouveau site ; par ailleurs, les conditions pouvant changer d’une année à l’autre certaines variations observées ne persistent pas, comme pour les différences de calcémie de tétras entre deux zones du Nevada [64], ou bien persistent pour l’hématologie et la biochimie de grands dauphins [227]. La pression humaine peut également affecter certaines variables : l’excrétion fécale de corticoïdes et les activités plasmatiques de CK et ASAT étaient supérieures dans les colonies de loups vivant à proximité de zones fréquentées par des humains [162, 243]; il en était de même pour les stéroïdes fécaux de hamsters [233]. Ces différences sont encore plus importantes entre animaux sauvages en liberté et captifs, par exemple chez le lynx [170].

Chez les animaux de laboratoire, la prise en compte du bien-être des animaux a conduit à enrichir leur environnement, parfois avec des effets paradoxaux sur les variables biologiques : chez des souris, l’enrichissement des cages n’a pas eu d’effets sur les résultats moyens de l’hématologie de routine mais a notablement augmenté la variabilité interindividuelle ; de même, cela a entraîné une augmentation de la concentration plasmatique de la corticostérone chez les mâles et une diminution chez les femelles [258]. Lorsque des singes Cynomolgus sont hébergés dans des cages leur permettant de voir leur congénères, la concentration sérique des hormones thyroïdiennes augmente avec l’ordre des prélèvements, alors que celle du cortisol est inchangée ; cet effet n’est pas observé lorsque les singes ne peuvent pas se voir [79].

EXERCICE PHYSIQUE – SPORT

Effets de l’entraînement

L’entraînement affecte les valeurs au repos de certains analytes, alors que d’autres ne varient pas, comme la troponine I chez les pur-sang [191] ; et lorsqu’ils varient, les changements observés peuvent différer selon que les chevaux sont en forme ou mal adaptés à l’effort [148]. Par ailleurs, l’entraînement est souvent fait en parallèle avec une adaptation de l’alimentation, par exemple chez les chiens de traineaux avec des variations des concentrations plasmatiques

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de glucose, triglycérides et acides gras libres [206] ; chez ces mêmes animaux, l’activité de la CK n’est pas modifiée alors que la numération leucocytaire augmente modérément, surtout pour les neutrophiles [54, 195].

L’effort physique peut affecter très notablement certaines variables, pendant des périodes plus ou moins longues, limitant éventuellement l’utilisation clinique des résultats pendant cette période, excepté pour suivre la forme des animaux et éventuellement servir à décider s’ils peuvent ou non poursuivre une épreuve [185]. Après des courses de vitesse chez le cheval, les principales modifications observées sont une augmentation modérée de l’hématocrite et intense des concentrations plasmatiques de lactate et d’ammonium, qui reviennent rapidement vers leurs valeurs de base ; en revanche, après des courses d’endurance, les modifications du protéome plasmatique persistent pendant 2 jours .[228]

Introduction à Preanalytical Variability Advisor

Les exemples précédents montrent que les facteurs de variation pré-analytiques peuvent avoir une influence notable sur nombre d’analyses biologiques effectuées en clinique. La majorité des facteurs techniques peut être contrôlée par des procédures adaptées et lorsque c’est impossible, ces facteurs peuvent être relevés pour être intégrés dans l’interprétation des résultats. Cependant, si ces effets techniques sont bien connus et documentés pour les analyses de routine dans les principales espèces d’animaux domestiques, il n’en est pas de même pour les analyses moins fréquentes et les autres espèces. Quant aux facteurs de variabilité biologique, ils sont si nombreux et variés qu’il est impossible de connaître tous les effets qui ont été rapportés ni de savoir s’ils sont transposables d’une espèce à l’autre.

Pour aider à améliorer l’abord de la phase pré-analytique

nous avons créé Preanalytical Variability Advisor, moteur de recherche en libre accès permettant de retrouver tous les effets que nous avons pu documenter, par variable (>200) et par espèce (presque 100) avec les références de la source primaire correspondante (>1300) dans le site web : http://www.biostat.envt.fr/pre-analytical-variability/. Par ailleurs, toutes les sources originales peuvent être lues sur le site d’enseignement de l’INPT-ENT à l’adresse : http://moodle.envt.fr; Semestre 7, Biologie Médicale Animale et Comparée, § 28, dont l’accès est également libre. Ces deux ressources sont régulièrement mises à jour. Le caractère fragmentaire de la documentation fait que certaines informations manquent; dans ce cas, les laboratoires vétérinaires spécialisés sont des sources d’information de grande valeur pour les analyses qu’ils effectuent.

Remerciements

Cet article de revue se fonde très largement sur une précédente revue des mêmes auteurs : The preanalytic phase in veterinary clinical pathology, Veterinary Clinical Pathology, 2015, 44, 8-25 avec l’aimable autorisation de l’Editeur John Wiley & Sons.

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Figure 1 : Résultat de recherche d’effets préanalytiques avec Preanalytical Variability Advisor en utilisant les mots-clés « Rabbit » et « GGT »

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Eviter ou contrôler les erreurs de prélèvements en ... · de cytologie et de biochimie. En biologie médicale humaine, à lex’ ception des situations d’urgence, les prélèvements