EXPRESSION DES GENES HOX DANS L'ALVEOLISATIONEXPRESSION DES GENES HOX DANS L'ALVEOLISATION

Responsable de stage : Jacques BOURBON, Directeur de rechercheEquipe « Pathologie des épithéliums respiratoires et du développement pulmonaire »

Stage réalisé dans le Laboratoire INSERM Unité 651,Faculté de Médecine : 8, Rue du Général Sarrail, 94010 Créteil Cedex

Mémoire présenté par Amine GHOZLANE

• Alvéolisation :– Dernière phase du développement pulmonaire– Aboutit à la formation d’un poumon mature et

complètement fonctionnel

Introduction

Humain

Rat

Naissance36 semaines 2 ans

4 jours 14 jours

Alvéolisation

Alvéolisation

Anténatal Postnatal

source : http://www.snv.jussieu.fr/bmediahomeotiqueindex.html

Modifications structurales dans les régions distales du poumon pendant l’alvéolisation

1. Canal alvéolaire2. Septa secondaire3. Alvéole

4. Pneumocyte de type I5. Pneumocyte de type II6. Capillaire

Avant l’alvéolisation (stade sacculaire) :

1. Canal alvéolaire2. Septa primaire3. Sacs alvéolaires

4. Pneumocyte de type I5. Pneumocyte de type II6. Capillaire

Après l’alvéolisation :

•Peu de gènes impliqués identifiés

Analyse systématique des gènes modulés pendant l’alvéolisation (Puces à ADN)

Données des puces ADN Affymetrix : Gènes dont l’expression est fortement augmentée pendant l’alvéolisation

0 0.5 1 2 3 4 >5

Gènes

Midkine (Mdk)

Homeobox A2 (Hoxa2)

Drosophila polarity gene (frizzled) homologue (Fzd1)

Eph receptor B2 (Ephb2)

Retinol-binding protein (Rbp1)

Retinoid X receptor gamma (Rxr)

Integrin, alpha 1 (Itga1)

Drebrin 1 (Dbn1)

Shab-related delayed-rectifier K+ channel (Kv9.3)

Homeobox A4 (Hoxa4)

Fibulin 5 (Fbln5)

Mesenchyme homeobox 2 (Meox2)

Timeless (Drosophila) homolog (Timeless)

Latent transforming growth factor beta binding protein 2 (Ltbp2)

Fibroblast growth factor receptor 3 (Fgfr3)

Homeobox A5 (Hoxa5)

Platelet-derived growth factor receptor alpha (Pdgfra)

Fibrillin-1 (Fbn1)

Fibrillin-2 (Fbn2)

Lysyl_oxidase_(Lox)

Fibronectin 1

Chondroitin sulfate proteoglycan 2 (versican)

Agrin

Glypican 3 (Gpc3)

Fibroblast growth factor 10 (Fgf10)

Slit (Drosophila) homolog 3 (Slit3)

Endothelial differentiation sphingolipid G-protein-coupled receptor 1

Pleiotrophin (Ptn)

7 J/ 2 J

21 J/7 J

Fold-change ratio

Hoxa2

Hoxa4

Hoxa5

Rat

Naissance

4 jours 14 jours

Alvéolisation

• Les gènes Hox :– facteurs de transcription à homéodomaine– impliqués dans l’organogenèse– inactivation Hoxa5 = défaut d’alvéolisation

(Kinkead et al. 2004)– pas d’autres données sur les Hox dans

l’alvéolisation

• Implication des gènes Hox dans les mécanismes de contrôle de l’alvéolisation ?

0

50

100

150

200

250

300

350

2 jpp 7 jpp 21 jpp

Hoxa5

* *

0

50

100

150

200

250

300

350

400

2 jpp 7 jpp 21 jpp

Hoxa4

* *

0

50

100

150

200

250

300

350

400

2 jpp 7 jpp 21 jpp

Hoxa2

* *

Confirmation des variations de l’expression des gènes Hoxa2, Hoxa4 et Hoxa5 par une méthode plus précise : la PCR en temps réel

Les gènes Hox sont effectivement plus exprimés pendant l’alvéolisation dans les fibroblastes.Les variations sont-elles spécifiques de la période de l’alvéolisation ?

Profil temporel d’expression des gènes Hoxa2, Hoxa4, Hoxa5 dans le poumon de rat depuis la période fœtale (stade canaliculaire) jusqu’à l’âge adulte

Augmentation de l’expression des gènes Hox dans le poumon entier seulementpendant l’alvéolisation.

Alvéolisation

0

50

100

150

200

250

300

F18 F19 F21 J1 J3 J5 J8 J14 J20 Adulte

Hoxa2Hoxa4Hoxa5

naissance

Y a-t-il modification de l’expression de ces gènes lors de l’altération du développement alvéolaire ?

jours

(% de F18)

• Hyperoxie : FiO2 à 95%

• Administration d’un glucocorticoïde :

Modèles expérimentaux d’altération du développement alvéolaire

Hyperoxie (FiO2 = 95%)

100 µm

Air (FiO2 = 21%)

100 µm

Dex 0.1 µg/g/j

Dexamethasone (0,1µg/g/j pendant 5 jours).

Diluent

Témoin

Effets de l’exposition du rat nouveau-né à l’hyperoxie (FiO2>95%) sur l’expression des gènes Hoxa2, Hoxa4 et Hoxa5.

Diminution de l’expression des gènes Hox dans le poumon entier sous hyperoxie.

0

20

40

60

80

100

120

140

Hoxa2

air O2 air O2

NS

*

4jpp 7jppair O2 air O2

0

20

40

60

80

100

120

140

Hoxa4

*

*

4jpp 7jpp

0

20

40

60

80

100

120

air O2 air O2

Hoxa5

*

*

4jpp 7jpp

0

20

40

60

80

100

120

Témoin Dex0,1µg/g/j

Dex0,5µg/g/j

Hoxa5

* **

Effets de l’administration répétée de dexamethasone (dex) 0,1µg/g ou 0,5µg/g

par jour sur l’expression des gènes Hoxa2, Hoxa4 et Hoxa5 chez le rat nouveau-né.

Diminution de l’expression des Hox dans le poumon entier après administration de dexamethasone.

Hoxa4

Témoin Dex0,1µg/g/j

Dex0,5µg/g/j

0

20

40

60

80

100

120 *

Témoin Dex0,1µg/g/j

Dex0,5µg/g/j

Hoxa2

0

20

40

60

80

100

120 * *

Effets in vitro de la dex sur l’expression des gènes Hoxa4 et Hoxa5 dans des fibroblastes isolés du poumon de rats nouveau-nés.

0

20

40

60

80

100

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140

Témoin

Hoxa4

dex 10-6 M

0

20

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80

100

120

140

Témoin

Hoxa5

dex 10-6 M

Pas d’effet de la dexamethasone sur l’expression des gènes Hoxa4 et Hoxa5 dans les fibroblastes en culture.

Conclusion

• L’expression des 3 gènes Hox :– est augmentée pendant l’alvéolisation– est diminuée lors de l’altération de

l’alvéolisation– suit un profil identique

• Ces résultats sont en faveur d’un rôle positif de ces gènes dans le mécanisme de contrôle de l’alvéolisation

Bilan du stage

• Techniques pratiquées:– Isolement et culture primaire de fibroblastes– Extraction des ARN– RT- PCR temps réel

• Aborder et exposer une problématique scientifique

• Implication physiopathologique