Figure 1-1

NIZAR CHETOUI

CARACTÉRISATION DU RÔLE DE LA PROTÉINE KINASE MEK1 DANS LES VOIES DE TRANSDUCTION DES MAP KINASES

Thèse présentée à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de doctorat en biologie cellulaire et moléculaire pour l’obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

FACULTÉ DE MÉDECINE

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

AVRIL 2005 © Nizar Chetoui, 2005

Résumé

Le développement tumoral nécessite une dérégulation des contrôles normaux de la

prolifération et de la différenciation cellulaires. Il est bien connu que la voie de

signalisation ERK/MAP kinase est impliquée dans ces processus de régulation cellulaire.

De plus, un rôle essentiel dans la transformation cellulaire est attribué à MEK1 qui est un

élément central de cette voie. Une meilleure compréhension de l’implication de MEK1

dans les voies de transduction devrait donc nous permettre de mieux comprendre le

developpement cellulaire et la transformation morphologique. Mes travaux de recherche

tentent d’élucider les mécanismes de régulation des protéines kinases MEK1 et MEK2 dans

le but de mieux comprendre leur divergence fonctionnelle et leur implication dans les

différentes réponses cellulaires. Ainsi, l’étude de la voie ERK/MAPK chez les fibroblastes

embryonnaires mutants pour le gène Mek1 indique que la transduction du signal amorcée

par un neuropeptide, la bombésine, passe spécifiquement par MEK1 et serait indépendant

de MEK2. La région C-terminale de MEK1 semble médier la spécificité de la réponse à la

bombésine. Le domaine MSS, qui est une insertion d’une séquence riche en proline unique

à MEK1 et MEK2 pourrait être la clef de cette réponse spécifique. En outre, nos travaux de

délétion et d’interactions protéiques suggèrent qu’une variation de la conformation de la

région C-terminale de MEK1 pourrait avoir lieu entre l’état inactif et l’état actif de ces

MAPKKs. En absence d’activation, la région en caboxy du domaine kinase semble

interagir avec la boucle d’activation se trouvant au cœur du domaine kinase. Cette

interaction intramoléculaire serait dépendante de l’état de phosphorylation de MEK1. Par

contre, la région en carboxy ne semble pas être un domaine d’autoinhibition ou un pseudo

substrat puisque sa délétion ne met pas la protéine dans un état constitutivement actif.

Ainsi, il est possible que cette région soit essentielle du point de vue structural pour

permettre, en fonction de son activité, la régulation des interactions de MEK1 (ou MEK2)

avec ses activateurs, substrats ou protéines d’échafaudage.

iii

Avant-propos

Je n’avais que 14 ou 15 ans lorsque je suivais, à la télévision, la série de dessins animés Il

était une fois… La vie. J’étais particulièrement émerveillé en découvrant le fonctionnement

du corps humain au niveau cellulaire et moléculaire, la transcription des gènes, la

production des enzymes jusqu'à l’organisation et la mobilisation des différents dispositifs

dans la lutte contre les pathogènes. Cette fascination m’a beaucoup marquée et depuis, je

savais que j’allais faire de la biologie cellulaire, ma carrière.

Voilà que j’en suis arrivé à finir mes études et à franchir une grande étape pour le

couronnement de mes aspirations en décrochant mon doctorat en biologie cellulaire et

moléculaire. Pour en arriver là, j’ai eu tout l’aide et le soutien de professeurs, de collègues,

d’amis et de membres de ma famille. Je tiens ici à les remercier.

Tout d’abord, mon directeur de thèse, le Dr Jean Charron, de m’avoir bien accueilli dans

son laboratoire, de m’avoir soutenue dans mon projet de recherche et d’avoir été un bon

conseil.

Un grand merci à tous les membres de mon comité de thèse, Dr Jacques Huot, Dr Robert

Faure et le Dr Carl Séguin. Le soutien que vous m’avez apporté est inestimable.

Merci à Michel Tremblay, qui a beaucoup participer à l’avancement de mes travaux et qui

m’a transmis tous ces connaissances en culture cellulaire.

Un grand merci à mes chers amis Vick, Seb, Julie et Jérôme. Je suis content de vous avoir

rencontrer au laboratoire Charron/Jeannotte. Je souhaite que notre amitié se prolonge

indéfiniment.

Merci à tous les collègues que j’ai côtoyé au centre de recherche de l’Hôtel-dieu de Québec

tout au long de mes études doctorales.

iv

Merci aux chercheurs du centre de recherche en cancérologie de l’université Laval qui, de

près ou de loin, ont participé à l’avancement de mes travaux, Dr Lucie Jeannotte, Dr Josée

Aubin, Dr Jacques Landry, Dr Josée Lavoie et Dr Luc Bélanger, directeur du centre.

Ma thèse présentée ici représente pour moi l’effort de plusieurs années d’acharnement. Être

patient et très persévérant, c’est ce qu’il faut être pour arriver au bout des difficultés qu’on

rencontre durant les études doctorales. Pour moi, ce n’aurait pas été facile sans le soutien,

l’encouragement, et l’amour de ma femme Kaouther et l’immense joie de vivre que m’ont

procuré mes enfants Walid et Sabrina.

Enfin, c’est grâce à mes parents, Jameleddine et Bärbel Chetoui que je dois tout, ma

réussite scolaire et l’épanouissement de ma vie.

La recherche dans le domaine de la cancérologie est en progression et toute contribution,

aussi modeste qu’elle soit, permettra d’arriver à bout de cette maladie qu’est le cancer. Mes

travaux présentés ici portent sur l’implication de la voie ERK MAP kinase dans la

prolifération et la migration cellulaire, deux processus primordiaux utilisés par les cellules

cancéreuses pour se développer et se propager. Bonne lecture.

À mes parents Jameleddine et Bärbel Chetoui

"Marche avec des sandales jusqu'à ce que la sagesse te procure des souliers"

Avicenne, Ibn Sinà (980-1037)

«La joie de regarder et de comprendre est le plus beau cadeau de la nature»

Albert Einstein (1879-1955)

vi

Table des matières

Résumé................................................................................................................................... ii

Avant-propos ........................................................................................................................ iii

Table des matières .................................................................................................................vi

Liste des figures & des tableaux ............................................................................................ix

Listes des abréviations ............................................................................................................x

1. Introduction générale ......................................................................................................1

1.1. Introduction.....................................................................................................................2

1.2. Activation du sentier ERK par des stimuli extracellulaires............................................4

1.3. Les composantes kinases du module de signalisation ERK/MAPK...............................7 1.3.1 Les isoformes Raf ...............................................................................................7 1.3.2. MEK1 et MEK2................................................................................................12

1.3.2.1 Domaines d’interaction dans MEK1/MEK2.................................................14 1.3.2.1.1. La région MSS......................................................................................15 1.3.2.1.2. Le domaine D........................................................................................17

1.3.2.2. Autres sites importants dans MEK1 .........................................................17 1.3.2.2.1. La séquence NES ..................................................................................17 1.3.2.2.2. Le site d’attache de PD 184352 ............................................................19 1.3.2.2.3. La région C-terminale...........................................................................20

1.3.3. ERK1 et ERK2..................................................................................................21 1.4. Autres voies de signalisation MAP kinases chez les mammifères ...............................23

1.4.1. Le sentier JNK/SAPK.......................................................................................23 1.4.2. Le sentier p38....................................................................................................24 1.4.3. Autres MAP kinases .........................................................................................25

1.4.3.1. ERK3 ........................................................................................................25 1.4.3.2. ERK5 ........................................................................................................26 1.4.3.3. NLK ..........................................................................................................28

1.4.4. MEKKs, la première marche dans la cascade des MAP kinases......................28 1.5. L’organisation, la localisation et la spécificité des cascades des MAP Kinases ..........32

1.5.1. Prédiction de la formation de complexes signalétiques par l’étude de la signalisation intracellulaire chez la levure........................................................................32

1.5.1.1. Ste5p .........................................................................................................33 1.5.1.2. Pbs2p.........................................................................................................35

1.5.2. Association des protéines kinases dans les voies MAP kinases chez les mammifères ......................................................................................................................36

vii

1.5.2.1. Les protéines d’échafaudage du sentier ERK ...........................................36 1.5.2.1.1. MP-1 .....................................................................................................37 1.5.2.1.2. Grb10 ....................................................................................................37 1.5.2.1.3. KSR.......................................................................................................38 1.5.2.1.4. RKIP .....................................................................................................39

1.5.2.2. Les sites d’amarrage ou Docking Sites .....................................................40 1.5.3. L’inactivation des MAP Kinases ......................................................................43 1.5.4. La régulation de la localisation subcellulaire de ERK......................................46 1.5.5. Spécificité et intégrité du signal........................................................................50

1.6. L'organisation différentielle des signaux transmis via la voie ERK/MAPK. ...............54 1.6.1. La différenciation..............................................................................................55 1.6.2. La signalisation entre la prolifération et l'arrêt de la croissance.......................57

1.7. Le projet de recherche...................................................................................................60 1.7.1. Mise en contexte ...............................................................................................60 1.7.2. Hypothèse de travail .........................................................................................63 1.7.3. Objectifs du projet ............................................................................................64

2. Étude de la signalisation ERK/MAPK chez les fibroblastes embryonnaires de souris Mek1-/- ...................................................................................................................................65

2.1. Résumé..................................................................................................................66 2.2. Introduction...........................................................................................................67 2.3. Matériels et méthodes ...........................................................................................72 2.4. Résultats................................................................................................................74 2.5. Discussion.............................................................................................................83 2.6. Références.............................................................................................................86

3. Identification et caractérisation d’un domaine d’interaction phospho-dépendant dans MEK1 et MEK2....................................................................................................................92

3.1. Résumé..................................................................................................................93 3.2. Article ...................................................................................................................94

3.2.1. Abstract.........................................................................................................95 3.2.2. Inroduction....................................................................................................96 3.2.3. Experimental procedures ..............................................................................98 3.2.4. Results.........................................................................................................103 3.2.5. Discussion...................................................................................................123 3.2.6. Acknowledgements.....................................................................................127 3.2.7. References...................................................................................................128

4. Résultats complémentaires .........................................................................................131 4.1. Interaction MEK1-Histones H3 ..........................................................................132 4.2. Interaction MEK1-M96A ...................................................................................133

Discussion générale ............................................................................................................136

Annexe ................................................................................................................................143

viii

A. Criblage double hybride chez la levure ......................................................................144 A.1. Tableaux récapitulatifs des clones isolés lors du criblage double hybride .........144 A.2. Vue d’ensemble des faux positives courrament isolés lors des criblages double hybride chez la levure .....................................................................................................147

Bibliographie ......................................................................................................................148

ix

Liste des figures & des tableaux

Figure 1-1 : Les composantes kinases de base de la voie ERK/MAP kinase.....................5

Figure 1-2: La transmission du signal extracellulaire via la voie de signalisation ERK/MAPK et les multiples molécules signalétiques qui régulent sa progression. ......8

Figure 1-3 : Les protéines MEK1 et MEK2. Structure et comparaison. ..........................16

Figure 1-4 : Les voies de signalisation des MAP kinases. ...............................................30

Figure 1-5 : Les complexes d'échafaudage de la voie MAP kinase chez la levure saccharomyces cerevisiae.............................................................................................34

Figure 1-6 : MEK1 est impliquée dans la signalisation intracellulaire menant à la migration des fibroblastes embryonnaires de souris.....................................................61

Figure 2-1 : Schéma général de la signalisation induite par la bombésine.......................69

Figure 2-2 : Activation de la voie ERK/MAPK via Gi et Gq...........................................71

Figure 2-3 : Altération de la signalisation induite par la bombésine chez les MEFs mutants pour le gène mek1............................................................................................78

Figure 2-4 : La signalisation induite par la bombésine est spécifique à MEK1. ..............80

Figure 2-5 : Activation de la voie ERK/MAPK en réponse à la bombésine chez les MEFs Mek1 confluents............................................................................................................82

Figure 3-1 : Structure of MEK protein regions recover from yeast two-hybrid screen against MEK1. ............................................................................................................105

Figure 3-2 : Mapping of the MEK1-binding sites by the two-hybrid assay...................109

Table 3-1 : Intra-molecular interaction of the carboxyl terminal with the activation loop is dependent on the phosphorylation state. .................................................................111

Figure 3-3: MEK1 C-terminal domain bind to a truncated form of MEK1 in vivo.......114

Figure 3-4 : Catalytic activity and cellular localisation of MEK1 C362 mutants. .........118

Figure 3-5 : Deletion of the carboxyl-terminal domain of MEK1 does not affect the regulation of MEK1 activity. ......................................................................................120

Figure 3-6 : MEK1 activity is not affected by point mutations in the proline-rich sequence in vitro. ........................................................................................................122

Tableau 4-1 : Essai d’interaction double hybride chez la levure ..................................134

Tableau 4-2 : Les histones H3 et M96A sont des faux positifs ....................................135

x

Listes des abréviations

GÉNÉRALES

ADN Acide désoxyribonucléique

AMPc Adénosine Monophosphate cyclique

ATP Adénosine Triphosphate

CDKs Kinases dépendantes des cyclines (Cyclin-Dependent Kinases)

CRD domaine riche en cystéine (cystein-rich domain)

DAG diacylglycérol

eIF4E Facteur d’initiation de la traduction chez les eucaryotes 4E (eukaryotic

translation initiation factor 4E)

EGF Facteur de croissance épidermique (Epidermal Growth Factor)

EGFR Récepteur du facteur de croissance épidermal (Epidermal Growth Factor

Receptor)

ERK Kinase régulée par un signal extracellulaire (Extracellular signal-Regulated

Kinase)

FAK Kinase d'adhérence focale (Focal Adhesion Kinase)

FGF Facteur de croissance fibroblastique (Fibroblast Growth Factor)

GCK La kinase du centre germinal (germinal center kinase)

GFP Protéine fluorescente verte (Green Fluorescent Protein)

GDP Guanosine di-phosphate

GPCRs récepteurs couplés aux protéines G (G protein-coupled receptors)

Grb2 Protéine qui lie le récepteur des facteurs de croissance 2 (growth-factor-

receptor-bound protein 2)

Grb10 Protéine qui lie le récepteur des facteurs de croissance 10 (growth-factor-

receptor-bound protein10)

GTP Guanosine tri-phosphate

HPK1 (hematopoietic progenitor kinase 1)

HSPs Protéines de choc thermique (Heat Shock Proteins)

xi

HSP27 Protéine de choc thermique 27 (Heat Shock protein of 27 kDa)

IGF-I Facteur de croissance analogue de l’insuline (insulin-like growth factor I)

IL Interleukine

IP3 Inositol- triphosphate

IRS Substrat du récepteur de l'insuline (Insulin Receptor Substrate)

JIP Protéine qui lie JNK (JNK-interacting protein)

JNK Kinase de la partie N-terminale de la protéine c-Jun (c-Jun N-terminal

Kinase)

KSR Protéine kinase suppresseur de RAS (Kinase suppressor of Ras)

MAP Protéine activée par les mitogènes (Mitogen Activated Protein)

MAPK Protéine-kinase activée par les mitogènes (Mitogen Activated Protein

Kinase)

MAPKK Protéine-kinase kinase activée par les mitogènes (Mitogen Activated Protein

Kinase Kinase)

MEC Matrice extracellulaire

MEF Fibroblaste embryonnaire de souris (Mouse Embryonic Fibroblast)

MEK MAP/ERK kinase

MKK MAP kinase kinases

MKKK MAP kinase kinase kinases

MKP MAPK phosphatase

MNK MAP kinase-interacting kinase

MP-1 Partenaire de MEK1 -1 (MEK1-Partner-1)

MSK kinase activée par les mitogènes et par le stress (mitogen- and stress-

activated protein kinase)

MSS Séquence spécifique à MEK (MEK-specific sequence)

NES Séquence d’exclusion nucléaire

NGF Facteur de croissance neuronal

NIK Kinase qui lie Nck (Nck-interacting kinase)

NLS Signal de localisation nucléaire

PAGE Électrophorèse en gel de polyacrylamide (Polyacrylamide gel

electrophoresis)

xii

PAK p21-activated protein kinase

PCR Réaction de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain Reaction)

PDGF Facteur de croissance dérivé des plaquettes (Platelet-derived growth factor)

PI-3K Kinase-3 phosphoinositide (Phosphoinositide 3-Kinase)

PIP2 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate

PKA Protéine kinase A

PKC Protéine kinase C

RKIP Protéine inhibitrice de la kinase RAF (RAF kinase inhibitor protein)

RTK Récepteur à activité tyrosine kinase

SAPK Protéine-kinase activée par le stress (Stress Activated Protein Kinase)

SAPK2 Protéine-kinase 2 activée par le stress (Stress Activated Protein Kinase-2)

Ser Résidu sérine

SOS Facteur d’échange de GTP pour Ras (Son of Sevenless)

ST Syncytiotrophoblastes

TGF-β Facteur de croissance tumorale-béta (Tumor growth factor-β)

Thr Résidu Thréonine

TNF Facteur de nécrose tumorale (Tumor Necrosis Factor)

TNF-α Facteur de nécrose tumorale alpha (Tumor Necrosis Factor Alpha)

TNFR Récepteur du facteur de nécrose tumorale (Tumor Necrosis Factor Receptor)

Tyr Résidu Tyrosine

VEGF Facteur de croissance endothélial vasculaire (Vascular Endothelial Growth

Factor)

WT Type sauvage (Wild Type)

UNITÉS

µ Micro

Da Dalton

g Gramme

h Heure

kb Kilobase

M Molaire

xiii

min Minute

mg Milligramme

sec seconde

RÉACTIFS ET SUBSTANCES CHIMIQUES

3-AT 3-amino-1,2,4-triazole

DMEM Milieu de Eagle modifié par Dulbecco (Dulbecco's modified Eagle's medium)

DMSO Diméthyle sulfoxide

DTT Dithiothréitol

EDTA Acide éthylène-diamine tétra acétique (ethylene diamine tetraacetic acid)

EGTA Acide éthylène glycol-bis-b aminoéthyl éther-N, N, N', N'-tétra acétique

(ethylene glycol tetra acetic acid)

FBS Sérum foetal de bovin (Foetal Bovine Serum)

HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

MOPS Acide propane sulfonique 3-(N-morpholino)

PBS Tampon phosphate salin (Phosphate buffer salin)

PMSF Fluorure de phényl-méthyl sulfoxide (Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride)

SDS Dodécyle-sulfate de sodium (Sodium Dodecyl Sulfate)

TRIS Tris (hydroxyméthyle) aminométhane

Chapitre 1

1. Introduction générale

2

1.1. Introduction

Les protéines kinases ainsi que divers systèmes de messagers forment des réseaux

fortement interactifs pour exécuter, au niveau cellulaire, des fonctions intégrées dans

l’organisme. La compréhension des mécanismes de signalisation pour un agent, son

répertoire de transducteurs et les interactions de ceux-ci dans un réseau devrait être définie

dans un contexte cellulaire. Ceci inclut la production de seconds messagers, l’activation de

protéines kinases, et la distribution subcellulaire de ces composants signalétiques pour les

mettre en contact avec les cibles appropriées. La recherche menée depuis la dernière

décennie a permis la découverte de plusieurs réseaux signalétiques intra et extracellulaires

et de faire le lien entre les défaillances possibles de ces réseaux avec plusieurs maladies

comme le cancer [1,2]. Parmi ceux là, on distingue des voies de signalisation formées de

protéines kinases connues sous le nom de MAP kinases pour mitogen-activated protein

kinases. Les voies de transduction des MAP kinases représentent un des systèmes

signalétiques primordiaux que la nature utilise dans plusieurs systèmes cellulaires pour

accomplir une variété étonnante de tâche. Elles existent chez tous les eucaryotes et

contrôlent des processus cellulaires fondamentaux aussi complexes que la prolifération, la

différenciation et l’apoptose.

L'arrangement de base d’une cascade de signalisation MAP kinase inclut une petite GTPase

se situant en amont d'un module central constitué de trois kinases : La MAPK kinase kinase

(MAPKKK), qui phosphoryle et active la MAPK kinase (MAPKK ou MKK), qui à son

tour, active la MAPK (Figure 1-1a). Cette organisation ne permet pas seulement

l'amplification du signal, mais aussi, de façon plus importante, fournit des interfaces

régulées supplémentaires donnant une cinétique, une durée et une amplitude précises à

l’activité [3-9]. Chez les mammifères, nous pouvons distinguer six modules MAP kinases

qui partagent des composantes structuralement apparentées tout en servant de médiateurs

dans des réponses biologiques spécifiques.

En dépit d'une décennie débordante d'intérêt scientifique et révélant d’énormes progrès

dans la compréhension de l'ensemble des circuits de signalisation intracellulaire, la voie

3

ERK/MAPK cache encore beaucoup de secrets. Ceux-ci concernent principalement la

régulation des composantes kinases du module, la compréhension de l’importance, dans

une réponse biologique précise, des changements spatio-temporels de l'activité et de la

distribution subcellulaire des composantes de la voie et enfin l’orchestration de ces

variations au niveau moléculaire [5,10].

Les travaux de plusieurs groupes de recherche pointent les interactions protéine-protéine

comme des moyens puissants de coordination des processus signalétiques. Cette

coordination est identifiée d'une manière claire au niveau de l'assemblage de complexes

protéiques sur les récepteurs activés, ou de complexes de facteurs de transcription sur les

promoteurs des gènes. Cependant, il devient apparent que ce motif de régulation est aussi

largement utilisé pour le contrôle des réseaux de signalisation intracellulaire.

Dans cette introduction, il sera question du rôle des interactions protéine-protéine dans la

régulation de la transduction du signal via les cascades de signalisation des MAP kinases,

en particulier dans la voie ERK/MAPK dont fait partie la protéine kinase MEK1 en étude.

Les points importants qui seront traités sont : 1) Le rôle des protéines d’échafaudage dans

la spécification, la localisation et le maintien de l’intégrité des voies de signalisation MAP

kinases. 2) L’importance des sites d’amarrage (docking sites), qui sont des éléments

d’interaction protéine-protéine puissants, dans la spécification du signal et l’acheminement

de ce dernier via les modules kinases des voies de signalisation. 3) Enfin, une partie de

l’introduction sera consacrée à l’entrecroisement des signaux (cross-talk) entre les

différents modules MAP kinases ainsi qu’entre les modules MAP kinases et les autres voies

de signalisation intracellulaires et leur rôle décisif dans la spécification de la réponse

cellulaire.

4

1.2. Activation du sentier ERK par des stimuli

extracellulaires

Deux composantes de cette voie, Ras et Raf, sont des proto-oncogènes. Il n’est donc pas

surprenant que la fonction majeure de cette voie soit le contrôle de la croissance cellulaire

dans toutes ses facettes, y compris la prolifération cellulaire, la transformation, la

différenciation et l’apoptose. Une grande variété d'hormones, de facteurs de croissance et

de différenciation, ainsi que de substances tumorigènes, utilisent cette voie.

La voie de signalisation la mieux définie depuis la membrane cellulaire jusqu’au MAP

kinases ERK1 et ERK2 est probablement celle qui est initiée par les récepteurs à activité

tyrosine kinase, RTKs [6]. La stimulation de ces récepteurs par le ligand approprié

provoque une augmentation de l’activité catalytique du récepteur et son

autophosphorylation subséquente sur les résidus tyrosines. La phosphorylation du récepteur

induit la formation de multi complexes protéiques dont l'organisation dicte la progression

du signal en aval. En général, l’étape subséquente est l'activation de la protéine

monomérique G, Ras. La transmission du signal des RTKs vers RAS se fait via le

recrutement d’adaptateurs moléculaires, tels que Shc et Grb2 (growth-factor-receptor-

bound protein 2), au récepteur via des interactions entre leurs domaines SH2 et les résidus

phosphotyrosines, puis du facteur d'échange du nucléotide de la guanine (GEF) et Sos (Son

of Sevenless). Lorsque SOS est engagée dans le complexe, elle induit, chez Ras, l’échange

du GDP pour du GTP. Réciproquement, GTP-Ras interagit directement avec plusieurs

effecteurs, y compris les isoformes de Raf. Ras se lie à Raf et provoque un changement

dans sa conformation native, ce qui augmente son activité kinase ou fournit tout

simplement un environnement adéquat pour son activation [11-14]. La localisation de Raf à

la membrane plasmique permettrait aussi à d’autres protéines kinases telles que Src, PKC,

et PAK de modifier Raf pour augmenter son activité [13,15-18]. L'augmentation dans

l’activité Raf est convertie par la suite via le module MEK-ERK. La phosphorylation par

rétroaction de SOS par ERK provoque le démontage du complexe SOS-Grb2 et

l'inactivation de Ras [19].

5

Récepteur

Protéine G

MAPKKK

MAPKK

MAPK

Kinase

P P P

P P

P P

Substrats cytoplasmiques

Substrats nucléaires

Signal extracellulaireMembrane

Noyau

Cytoplasme

Récepteur

Ras

Raf

MEK

ERK

Kinase

P P P

P P

P P

RSK, MLCK

Elk, SAP

Facteurs de croissance et de différenciation

Membrane

Noyau

Cytoplasme

Map kinase kinase kinase

Map kinase kinase

Map kinase

a) b)

Récepteur

Protéine G

MAPKKK

MAPKK

MAPK

Kinase

P P P

P P

P P




Noyau

Cytoplasme

Récepteur

Ras

Raf

MEK

ERK

Kinase

P P P

P P

P P

RSK, MLCK

Elk, SAP


Membrane

Noyau

Cytoplasme


Map kinase kinase

Map kinase

a) b)

Récepteur

Protéine G

MAPKKK

MAPKK

MAPK

Kinase

P P P

P P

P P




Noyau

Cytoplasme

Récepteur

Ras

Raf

MEK

ERK

Kinase

P P P

P P

P P

RSK, MLCK

Elk, SAP


Membrane

Noyau

Cytoplasme


Map kinase kinase

Map kinase

Récepteur

Protéine G

MAPKKK

MAPKK

MAPK

Kinase

P P P

P P

P P




Noyau

Cytoplasme

Récepteur

Protéine G

MAPKKK

MAPKK

MAPK

MAPKKK

MAPKK

MAPK

Kinase

P P P

P P

P P




Noyau

Cytoplasme

Récepteur

Ras

Raf

MEK

ERK

Raf

MEK

ERK

Kinase

P P P

P P

P P

RSK, MLCK

Elk, SAP


Membrane

Noyau

Cytoplasme


Map kinase kinase

Map kinase

a) b)

Figure 1-1 : Les composantes kinases de base de la voie ERK/MAP kinase.

a). Schéma général d’un sentier MAP kinase. b). la voie ERK/MAPK. Voir texte pour

détails.

6

L’interaction de certaines intégrines avec la matrice extracellulaire peut également recruter

les mêmes complexes et participer ainsi à l’activation de Ras. Les intégrines ne possédant

pas d’activité kinase, plusieurs mécanismes d’activation de la voie ERK/MAPK peuvent

être envisagés. Un mécanisme complexe impliquant les kinases FAK (Focal adhesion

kinase) et src, qui dans un jeu mutuel de phosphorylation, attire une protéine adaptatrice

telle que Grb2, est vraisemblablement impliqué dans la motilité cellulaire. Autrement, la

signalisation mitogène passerait par le recrutement de l’adaptateur Shc via la protéine

membranaire cavéoline (Cav), la phosphorylation s’effectuant par l’un des membres de la

famille Src [20,21].

La signalisation initiée par les récepteurs couplés aux protéines G (G protein-coupled

receptors ; GPCRs) pour l’activation des ERKs implique aussi la modulation de l’activité

Raf. Cependant, les mécanismes de régulation déployés par ces récepteurs sont très variés.

L'existence de multiples classes de protéines G, la capacité de certains récepteurs d'activer

plus qu'une classe de protéine G ainsi que les mécanismes spécifiques aux types cellulaires

contribuent à la diversité [22-24].

Les signaux transmis par les récepteurs via les petites protéines G hétérotrimèriques Gαs

sont particulièrement divers. L’exemple le plus concret de cela serait la variété d'effets sur

l’activité ERK observée suite à l’élévation de la concentration intracellulaire de l’AMP

cyclique (AMPc). La kinase dépendante de l’AMPc, PKA (protein kinase A), a été

rapportée comme étant un inhibiteur de l'activité Raf-1. Dans certains contextes, PKA

phosphoryle directement Raf-1 sur les résidus sérine 43 et sérine 621 [25-27]. Dans

d’autres cas, par exemple chez les cellules d'origine neuronale, PKA phosphoryle la

GTPase Rap1a qui peut influencer positivement ERK via l’activation de B-Raf [28,29].

Dans le cas de l’activation de ERK via Gαi, les sous-unités βγ libres peuvent être les

transducteurs actifs du signal. Cela a été démontré dans la signalisation du mating chez la

levure [30]. Des études de surexpression ont montré que les sous unités βγ seraient

suffisantes pour activer ERKs et que l’inactivation des sous-unités βγ réduirait la

stimulation de ERK par Gαi [31,32]. Dans un modèle proposé, βγ stimulerait l’activité

kinase de Src d’une manière dépendante de PI-3 kinase et de la sous unité γ [33]. Src

7

phosphorylerait alors un récepteur RTK ou une protéine kinase telle que PYK2 ou FAK,

pour créer un motif de liaison SH2 pour un adaptateur moléculaire [34-36]. Dans un autre

modèle, l’activation de la voie ERK/MAPK serait faible chez certaines cellules qui

expriment PI-3 kinase, ce qui suggère une alternative au mécanisme d'activation via Src ou

PYK2 [34,37].

L'activation de ERK2 via Gαq est souvent un processus dépendant de PKC. Elle peut être

dépendante ou indépendante de Ras [35,38]. L’effecteur direct de G αq est le PLCβ qui

produit l'inositol- triphosphate (IP3) et le diacylglycérol (DAG) via le clivage du

phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2). Quelques isoformes de PKC sont activés par

le DAG et le Calcium intracellulaire libéré à la suite de la production de IP3. PKC

régulerait alors Raf par phosphorylation directe [18]. PKC régulerait aussi MEK, mais le

mécanisme est encore pas clair [39]. Chez les cellules PC12, la stimulation de Gαq par ses

récepteurs induit la phosphorylation de PYK2 et de Shc.

1.3. Les composantes kinases du module de signalisation

ERK/MAPK

1.3.1 Les isoformes Raf

En dépit de la conservation de Ras et autres MAPKKKs, MAPKKs et MAPKs, il n'y a

aucun homologue de Raf dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Toutefois, les

homologues de Ras chez la levure ne font pas partie des cascades MAPKs, mais sont

présents dans les voies nutritives qui régulent l’adénylate cyclase. Par ailleurs, la mouche à

fruits Drosophila melanogaster et le ver Caenorhabditis elegans possèdent chacun au

moins un gène raf fonctionnel, dont le produit est présent en aval de Ras dans le sentier

ERK de façon similaire à celle des cellules de mammifères. Chez la Drosophile, Raf est

essentiel pour la prolifération et la différenciation cellulaires pendant le développement

[40].

8

Figure 1-2: La transmission du signal extracellulaire via la voie de signalisation

ERK/MAPK et les multiples molécules signalétiques qui régulent sa progression.

MEK1

Raf-1B - Raf

PKA Ras

Rap

ERK1,2

Akt/PKB

Pak

PI - 3K

cAMP SOS

PKC

Ca2+

He - PTP PTP - SL

Rac

αβ

Facteurs de transcription

MKPNoyau

Membrane

Cytoplasme

RTK PGCRIntegrin

+

-

-

-

+

+

+

+

+

-+

+

+

+ +

+ +++

-+

++

+

+

CavFak - 1

MEK1

B - Raf

PKA Ras

Rap

ERK1,2

Akt/PKB

Pak

PI - 3K

cAMP SOS

PKC

Ca2+

He - PTP PTP - SL

Rac

αβ

Facteurs de transcription

MKPNoyau

Membrane

Cytoplasme

RTK PGCRIntegrin

+

-

-

-

+

+

+

+

+

-+

+

+

+ +

+ +++

-+

++

+

+

CavFak - 1

9

De toutes les MAPKKKs connues, les isoformes Rafs et Mos sont peut-être les seules qui

phosphorylent les MAPKKs dans une cascade unique. En effet, ces protéines semblent

phosphoryler seulement deux membres de famille MEK, MEK1 et MEK2, et se placent

exclusivement dans la cascade ERK/MAPK [41,42]. La famille des protéines kinases Raf

est composée de A-Raf, B-Raf, et Raf-1 (ou c-Raf) [43]. Chaque isoforme contient trois

régions conservées appelées, CR1, CR2, et CR3. Les deux premières régions sont

localisées en amino-terminal de la protéine et sont impliquées dans la régulation du

domaine catalytique. Leur suppression crée un mutant Raf-1 possédant une activité

constitutive élevée ou encore pouvant être activée indépendamment de Ras [44,45]. Le

domaine kinase est localisé dans la région CR3. L’expression de Raf-1 est ubiquitaire. La

plus haute expression de B-Raf se produit dans les tissus neuronaux et dans les testicules.

Enfin A-Raf semble s’exprimer primordialement dans les tissus urogénitaux.

Les phénotypes très différents chez les souris mutantes Raf-1, A-Raf et B-Raf démontrent

d’une façon claire et persuasive que ces protéines ne sont pas redondantes et servent des

fonctions distinctes [46]. Chez l’espèce canine, et selon l'origine génétique, l'élimination de

A-Raf produit des défauts intestinaux et/ou neurologiques, mais les chiots naissent vivants.

Par contre, les souris mutantes pour le gène B-raf présentent des défauts dans la

différenciation des cellules neuro-épitheliales et dans la maturation des cellules

endothéliales, et meurent in utero dû à une hémorragie vasculaire.

La suppression du gène raf-1 chez des souris inbred provoque la mort à la mi-gestation.

Les souris Raf-1 outbred meurent très tôt après la naissance et présentent un retard dans la

croissance et des défauts dans le développement qui sont très apparents dans le placenta, les

poumons et la peau. À noter que les souris sans fonction Raf-1 expriment encore une

protéine Raf-1 tronquée qui est dépourvue de l’activité catalytique, mais qui peut

néanmoins contribuer aux phénotypes anormaux observés en agissant comme un mutant

dominant négatif. En résumé, Raf-1 semble jouer un rôle essentiel dans la prolifération

cellulaire, alors que A-Raf et B-Raf réaliseraient plus de fonctions spécialisées.

La régulation de Raf-1 est complexe. Elle comprend notamment des interactions protéine-

protéine, l’implication de plusieurs sites de phosphorylation dans Raf-1 et une localisation

10

cellulaire variable [43]. Ces multiples modes de régulation permettent à Raf-1 de fluctuer à

travers des états d’activation graduels. Raf fait partie d'un complexe multi protéique

composé de Raf-1 ou B-Raf, de la protéine du choc thermique hsp90, de p50cdc37, et un

nombre indéterminé de protéines 14-3-3 [47-52]. 14-3-3 semble stabiliser Raf-1 dans ses

différentes conformations actives en fonction du degré de phosphorylation de Raf et de ses

interactions avec d’autres protéines régulatrices telles que Ras-GTP. 14-3-3 servirait dans la

spécification du signal transmis via Raf-1 en recrutant ce dernier à des complexes

protéiques hautement agencés [48]. La dissociation du regroupement hsp90-p50 de Raf, par

l'usage d'agents pharmacologiques tels que la geldanamycine et la dexaméthasone ou de

mutants de p50 incapables de lier hsp90, interrompt la signalisation dépendante de Raf

[51,53,54]. La geldanamycine n'affecterait pas la capacité de Raf à former des complexes

avec son activateur Ras et ne réduirait pas son activité qui est stimulée par le facteur

mitogénique EGF. La co-expression de p50 avec Raf chez les cellules Sf9 augmente

l'activité de Raf et potentialise son activation par v-src.

Il y a des différences considérables dans la régulation des divers isoformes de Raf. Raf-1 et

B-Raf sont régulés différemment par les petites protéines G, Ras et Rap1a [28,55-57]. Raf-

1 est activée par H -, K-, et N-Ras [58]. Bien que Raf-1 puisse aussi interagir avec Rap1a,

la fonction de cette interaction n’est pas claire, parce qu'aucune augmentation dans son

activité n’est observée. En revanche, B-Raf est activée aussi bien par Ras que par Rap.

Chez les cellules PC12, l’activation de B-Raf par Rap1 semble être le dispositif dominant.

Cette différence fonctionnelle a été attribuée aux domaines riches en cystéine (CRDs) de

ces protéines. L’échange des domaines CRDs de Raf-1 et B-Raf provoque l'activation de

Raf-1 par Rap1 et inhibe l’activation de B-Raf [59].

L’état de phosphorylation de Raf-1 est influencé par de multiples protéines kinases, y

compris Src, les membres de la famille de la protéine kinase C (PKC), p21 PAK (la

protéine kinase activée par Rac/Cdc42), et Akt (aussi appelé la protéine kinase B ou PKB).

Les sites de phosphorylation par PAK et Src sont localisés au N-terminal du domaine

catalytique, à savoir, la sérine 338 et la tyrosine 340 pour PAK et la tyrosine 341 pour Src

[17,60]. Lorsque phosphorylés, ces sites peuvent potentiellement stimuler l'activité d’une

manière interactive, selon le contexte du signal [13,16,61,62]. Les résidus de la boucle

11

d'activation, les sérines 497 et 499, semblent être des sites de phosphorylation possible par

PKC [18], cependant, la mutation de ces sites n'a aucun impact perceptible sur la

stimulation de Raf par le sérum [41]. Wolfman et ses collègues ont récemment trouvé que

PKCε forme un complexe stable avec Raf-1 et phosphoryle la sérine 338, le même site

modifié par PAK [15,18]. L’inactivation de PKCε bloque l'activation de Raf-1 par l'ester de

phorbol, mais n'a pas d’effet sur l’activation par EGF. Ces lignes d’évidence, parmi

d’autres, démontrent l’existence de divers mécanismes indépendants pour l’activation de

Raf-1.

Akt semble phosphoryler Raf-1 sur le résidu sérine 259 chez les cellules cancéreuses du

sein, MCF-7 [63]. Ce résidu est un site présumé d’interaction de 14-3-3 [64,65]. Lorsque

lié à ce site, 14-3-3 a un effet inhibiteur sur l’activité de Raf-1. In vivo, la mutation de cette

sérine en alanine crée un mutant actif de Raf-1 [60,66]. L’inactivation de ERK1/2 chez les

cellules C2C12 cultivée en présence de sérum peut stimuler les premiers stades de

différenciation du myotube [67]. De même, Akt peut réduire l'activité Raf-1 dans plusieurs

contextes, notament, lors de la différenciation des myoblastes C2C12 [68]. Le site de

phosphorylation de Raf-1 par Akt chez les cellules C2C12 n'a pas encore été cartographié.

Par contre, dans le cas des myotubes différenciées traitées par le facteur de croissance IGF-

I (insulin-like growth factor-I), il y a diminution du niveau de phosphorylation de la sérine

338 lorsque qu’un mutant dominant positif de Akt est exprimé. Ces modes de régulation ne

sont en revanche pas exclusives. La capacité de Akt d'inhiber l'activité Raf-1 peut varier

selon le type cellulaire. Il est aussi intéressant de noter que, chez les cellules C2C12, une

association Akt-Raf-1 se produit seulement pendant la différenciation et est dépendante de

l’activité kinase de Akt. Alors que chez les cellules MCF-7, l'association des deux protéines

paraît être constitutive. Des études futures pourraient déterminer le rôle médiateur de Akt

dans la régulation négative de Raf-1 pendant les processus physiologiques.

Il a été démontré que les inhibiteurs chimiques de l’activité de Raf, ZM336372 et

SB203580, sont incapables de bloquer l'activation de MEK et de ERK par les facteurs de

croissance et les esters de phorbol. Alors que ces inhibiteurs réduisent l'activité Raf in vitro,

ils induisent paradoxalement une activation vigoureuse de Raf-1 lorsque administré aux

12

cellules [69,70]. Une explication possible pour ce phénomène est que cette activité Raf-1

est contrôlée normalement par une autorégulation négative. En empêchant cette régulation,

les inhibiteurs induisent une activation massive de Raf-1 [69,70]. Raf paraît donc être

suspendu dans une balance entre activation et autoinhibition.

La nature de l’autorégulation négative n'est pas encore bien connue, mais elle préconise des

conséquences importantes. Elle jette tout doute sur l'utilité des inhibiteurs de Raf comme

traitement anticancéreux. Elle montre que l'activation de Raf-1 peut être efficacement

accompli en ôtant une contrainte inhibitrice. Il n’est cependant pas clair si ce principe est

utilisé physiologiquement. Enfin, elle suggère que l'attachement de Raf à MEK est un

processus régulé. En dépit de l'hyperactivation de Raf-1, les drogues ne stimulent pas

l’activité de MEK ni celle de ERK, indiquant qu’une association efficace à MEK

nécessiterait plus que l'activité catalytique de Raf. Comme il sera discuté ci-dessous,

l'interface Raf-MEK est en effet utilisée comme moyen de régulation. Raf peut activer

MEK1 et MEK2 avec une efficacité semblable in vitro. Cependant, quelques modèles

génétiques et expériences de transfection suggèrent une interaction préférentielle entre

certains Raf et isoformes de MEK [71,72]. La signification de cela est encore inconnue,

parce que les deux isoformes MEK activent, en aval, les mêmes kinases ERKs.

1.3.2. MEK1 et MEK2

MEK1 et MEK2 font partie de la rare famille de protéines kinases à double spécificité

capables de phosphoryler aussi bien les résidus sérines et thréonines que tyrosines. Bien

que ces deux isoformes de MEK soient fortement homologues dans leur séquence primaire

d'acides aminés, et bien qu'elles génèrent des réponses transcriptionnelles et

morphologiques semblables dans les fibroblastes NIH3T3, elles semblent être

différemment régulés par leurs activateurs ascendants RAF-1, A-RAF, et B-RAF dans

divers types de cellules et en réponse à différents stimuli extracellulaires. A-RAF active

préférentiellement MEK1 [73], tandis que c-Raf-1 active aussi bien MEK1 que MEK2. B-

RAF se lie à MEK1 et à MEK2 mais semble activer MEK1 mieux que MEK2 [74].

13

Toutefois, cette spécificité est, dans la majorité des cas, une conséquence de variations

quantitatives dans les affinités des interactions activateur/substrat et peut être perdue quand

les associés sont surexprimés [71]. Ceci dit, une étude récente suggère que ces deux

protéines MEK contribuent de manières distinctes à la régulation de l’activité ERK et à la

progression G1/S du cycle cellulaire [75]. Dans une autre étude, il a été suggéré que le

module MEK2-ERK2 inhibe la transition G1/S du cycle celluaire, alors que le module

MEK1-ERK1 inhible celle du G2/M [76]. MEK1 et MEK2 auraient un impact different sur

l’intensité et la durée de la signalisation ERK contribuant distinctivement à l’inhibition ou

l’induction de la prolifération cellulaire. L’activation spécifique de MEK1 ou de MEK2

pourrait donc médier des réponses biologiques différentes dépendamment de la nature du

signal extracellulaire et du contexte cellulaire.

Les analyses histopathologiques d’une lignée de souris mutante dans laquelle le gène mek1

a été perturbé par mutagenèse d'insertion montrent une réduction de la vascularisation du

placenta. Cette anomalie serait due à l’incapacité des cellules endothéliales vasculaires

d’envahir la région du labyrinthe [77]. En outre, les essais de migration cellulaire ont

indiqué que la migration des fibroblastes embryonnaires (MEF) MEK1-/- est altérée lorsque

ces derniers sont étalés sur une matrice de fibronectine. Les niveaux d’expression et

d’activation de MEK2 et de ERK1/2 lors de ces essais semblaient être normaux. La

réexpression de MEK1 dans les MEFs mutants reconstitue leur capacité à migrer (Charron

et collaborateurs, travaux en cours). Ces résultats suggèrent que MEK1 est nécessaire pour

une réponse adéquate aux signaux angiogéniques qui pourraient favoriser la vascularisation

de la région du labyrinthe du placenta [77]. MEK2 ne semble pas être impliquée dans la

maturation placentaire chez la souris. En fait, les souris mutantes pour le gène mek2 sont

viables et fertiles et ne démontrent aucune anomalie placentaire [78].

Les MAPKKKs de la famille Raf ne sont pas les seuls activateurs de MEK1/2. En effet,

MEKK1, Tpl-2 et Mos, semblent phosphoryler et activer MEK1 [79,79-83]. L’activation

du module MEK-ERK par MEKK1 semble jouer un rôle dans la progression du signal

apoptotique médié par les récepteurs Fas. L’activation par Mos a été décrite comme

essentielle à la maturation des ovocytes [84]. Enfin, le rôle de Tpl-2 dans l’activation de la

14

voie ERK n’est pas tout à fait caractérisé. Néanmoins, tout comme Raf et Mos, Tpl-2

semble jouer un rôle dans la différenciation des cellules PC12 [85].

MEK1 et MEK2 sont phosphorylées et activées par phosphorylation directe sur leurs

résidus sérines de la séquence 218SMANS222 présente dans la boucle d’activation. La

phosphorylation de MEK1 sur les deux sites stimulerait son activité par plus que 7,000 fois.

La phosphorylation d’un seul site produit une augmentation moins considérable dans

l’activité [86]. La substitution des deux sites de phosphorylation par des résidus acides

augmente aussi leur activité. De même, la délétion d’une séquence d’acides aminés dans la

région N-terminale accroît encore plus leur activité basale. La combinaison de ces deux

modifications crée des mutants MEK1/2 constitutifs aussi actifs que les protéines de type

sauvage activées [86]. Ces mutants MEK, nommés MEK1R4F, ont été utilisés dans

beaucoup de systèmes pour inférer des événements associés exclusivement à la cascade

ERK [87,88].

MEK1 et MEK2 sont en mesure de phosphoryler et activer ERK1 et ERK2 [89-93]. Ces

MAPKs semblent être les seuls substrats connus de MEK1/2. Les deux MEKs

phosphorylent ERK1/2 sur les résidus tyrosine et thréonine qui se situent dans le segment

d’activation du domaine catalytique (appelé encore boucle d’activation). Cette

phosphorylation est suffisante pour activer ERK1/2 in vitro, comme in vivo [94,95]. À la

suite de la double phosphorylation, l’activité de ERK1/2 augmente par bien plus de 1000

fois avec une activité spécifique de 1-2 mmol/min/mg. Le plus grand effet paraît être dû à

une augmentation du Vmax, la variation du Km pour le substrat étant très faible [96,97]. La

stœchiométrie de phosphorylation de ERK1/2 par MEK2 approche plus aisément les 2 mol

de phosphate/mol de ERK que ne fait la phosphorylation par MEK1.

1.3.2.1 Domaines d’interaction dans MEK1/MEK2

En dehors du domaine catalytique typique conservé chez toutes les protéines kinases des

voies MAP kinases, MEK1 et MEK2 présentent deux éléments nécessaires à leur activité.

Le premier est unique à ces deux MEKs et est communément appelé MSS (MEK specific

sequence). Le deuxième, EDS (ERK docking site), semble être conservé chez tous les

15

membres de la famille MEK. En outre, ces deux éléments représentent aussi le point de

divergence entre les deux kinases. En effet, l’alignement de séquence de MEK1 et MEK2

indique que ces deux protéines sont quasiment identiques dans leurs domaines kinase mais

sont particulièrement différentes au niveau de ces deux éléments (figure 1-3). Cette

variation au niveau de ces deux séquences impliquées dans l’activité suggère une

divergence possible dans le rôle de MEK1 et de MEK2 dans la signalisation chez les

mammifères. En fait, plusieurs observations ont montré que MEK1 et MEK2 peuvent avoir

des fonctions distinctes menant à des réponses physiologiques uniques. MEK1 semble être

activée dans les macrophages et les cellules Swiss 3T3 en réponse au TNF-α et à la

bombésine respectivement [98,99]. D’autre part, MEK2 est spécifiquement activée par le

lactosylcéramide chez les cellules du muscle lisse de l’aorte humaine [100]. MEK2 peut

aussi affecter, d’une façon spécifique, la cinétique du point de contrôle G2/M du cycle

cellulaire [101].

1.3.2.1.1. La région MSS

La région MSS (MEK specific sequence) est un élément unique présent chez les MEKs

dans la voie ERK/MAPK. Cette région riche en proline est insérée entre les domaines

kinases IX et X des protéines MEK1 et MEK2 [71,102,103]. Aucun autre membre connu

de la famille MAPKK ne possède ce domaine spécifique. Du fait de la présence de

plusieurs résidus prolines dans cet élément, certains lui ont proposé tout simplement

l’appellation de séquence riche en proline ou PS (proline-rich sequence). Les études de

délétions ont indiqué que ce domaine est requis pour la stimulation de ERK, bien que son

absence n'ait in vitro aucun effet sur l’activité catalytique de MEK1 [71,103]. L'expression

d'un peptide qui comprend le domaine MSS inhibe l’activation de ERK2 par EGF,

suggérant que cette région est importante pour la progression du signal via cette cascade.

Le domaine MSS semble jouer un rôle essentiel dans la modulation de l’activité de MEK1

ainsi que dans le cross-talk avec d’autres voies de signalisation. En fait, cette région semble

être le site d’interaction de MEK1/2 avec les membres de la famille Raf et est importante à

leur activation subséquente [71,102]. Elle contient de multiples sites d’interaction

16

potentiels pour les domaines SH3 et est phosphorylée par plusieurs protéines kinases

[80,104-106].

a.a 200 300 3931001

EDS NES MSS

EDS NES MSS

66% 90% 36%

S218 / S222

S222 / S226

MEK1

MEK2

a.a 200 300 3931001

EDS NES MSS

EDS NES MSS

66% 90% 36%

S218 / S222

S222 / S226

MEK1

MEK2

Figure 1-3 : Les protéines MEK1 et MEK2. Structure et comparaison.

Les pourcentages représentent l’homologie de séquence de la région indiquée. Par exemple,

il y’a 66% d’homologie au niveau de la région EDS et seulement 36% au niveau de la

région MSS. Les deux protéines sont, dans l’ensemble, homologues à 90%. EDS : Site

d’attachement de ERK. NES : Signal d’exclusion nucléaire. MSS : Séquence spécifique à

MEK1/2. Les sites de phosphorylation indiqués sont ceux qui se retrouvent dans la boucle

d’activation et qui sont donc nécessaires à l’activation de la kinase.

17

1.3.2.1.2. Le domaine D

L’élément qui est conservé chez la famille des MAPK kinases est un site d’interaction

stable pour les MAP kinases, ERK1/2. Il est localisé à l’extrémité N-terminale de MEK1 et

MEK2, dans une courte région riche en acides aminés basiques. Cette séquence possède

toutes les caractéristiques d'un domaine de liaison au substrat. Ce domaine, appelé domaine

D, semble être spécifique aux MAP kinases. Dans MEK1 et MEK2, ce domaine est aussi

nommé EDS pour ERK docking site. Une liste exhaustive des protéines ayant ce domaine D

ont été présentés par Nishida et collaborateurs [107] et par d’autres groupes de recherche

[108,109]. Ce site d’interaction dans MEK1 est requis aussi bien in vitro que chez les

cellules pour l’activation de ERK2. Un mutant de délétion MEK1 dépourvu de la séquence

N-terminale comprenant le domaine D perturbe l’activation de ERK2 par EGF [108].

Lorsque introduit chez les cellules, un peptide dérivé du N-terminal de MEK1 inhibe la

progression du cycle cellulaire [110]. Le facteur mortel de l’Anthrax (ALF) clive le

domaine D de MEK et inhibe l'activation de ERK [111]. En utilisant la mutagenèse et les

études de délétions, le site de liaison au domaine D sur ERK1/2 a été localisé à une paire de

résidu aspartate dans le C-terminale de ERK2, juste à extérieur du domaine catalytique

(discuté plus en détails ultérieurement)[107] et [112].

1.3.2.2. Autres sites importants dans MEK1

1.3.2.2.1. La séquence NES

L’implication de ERK dans la phosphorylation et la régulation d'un grand nombre de

facteur nucléaire suggère que la redistribution de ERK du cytoplasme aux compartiments

nucléaires est nécessaire pour la signalisation. En outre, la localisation nucléaire stable de

ERK a été rapportée pour la différenciation des cellules PC12, un processus nécessitant la

phosphorylation de facteurs nucléaires impliqués dans l’expression de gènes neuronaux

[113].

18

Les premières études faites sur les MEKs ne montraient pas une translocation semblable de

ces protéines losque la voie ERK est activée [114,115]. Ceci a été rectifié plus tard par la

découverte d'une séquence riche en leucine, située en N-terminal de ces protéines. Cette

séquence comprise entre les résidus 32 et 42 dans MEK1 (ALQKKLEELEL) se comporte

comme un signal d'exportation nucléaire (NES) [116]. La délétion ou la mutation du NES

contribuent à la localisation nucléaire constitutive de MEK1. L’ajout d’un peptide

contenant la séquence NES à des protéines hétérologues facilite leur exportation nucléaire.

Les séquences de ce type se sont avérées être des sites de reconnaissance pour lier

Crm1/exportin 1, une protéine nucléaire qui facilite l'exportation des composants cellulaires

y compris PKIα, IκB, Rev, et Dsk1, en plus de MEK1 [117,118]. La leptomycine B, qui est

un antibiotique anti-fongique, lie Crm1 et s’interfère dans son association avec les protéines

ayant le NES et bloque ainsi leur exportation [118-121]. En outre, MEK1 migre vers le

noyau des cellules COS après seulement une heure de traitement avec la leptomycine B

[119], suggérant que, bien que la localisation nucléaire de MEK1 n'est pas stable, son

importation est active avec un taux rapide d'afflux et de reflux.

L’importation nucléaire des mutants MEKs manquant le NES semble se produire en

réponse au traitement par le sérum. Chez les cellules COS ou HEK293, un mutant MEK1

(∆-NES, K97A, et S218E/S222E) est principalement cytosolique mais il est relocalisé dans

le noyau après 10 minutes de traitement au sérum [122]. Ceci suggère que les mécanismes

pour l'importation nucléaire de MEK sont régulés soit par l'importation accrue ou par

l’inhibition de l'exportation. De tels mécanismes exigeraient l'activation des voies de

signalisation, de telle sorte que la phosphorylation et l'activation de MEK pourraient être

les conditions importantes pour stabiliser sa distribution nucléaire.

Deux mécanismes différents pour la translocation nucléaire de ERK ont été proposés. L’un

impliquerait une navette constante et non réglée de MEK entre le noyau et le cytoplasme

aussi bien avant et après la stimulation par des mitogènes. L'autre mécanisme semble exiger

l'activité de MEK et est facilité par la réponse aux stimulations mitogéniques [123].

L’importance de l’interaction ERK avec MEK dans la localisation subcellulaire de ERK a

été adressée en utilisant des mutants MEK1, des peptides dérivés de MEK1, et des

19

protéines chimériques ERK2-MEK1. Plusieurs études de localisation subcellulaire ont

démontré que MEK1 serait essentiellement une protéine cytoplasmique [114,115,124].

MEK1 activée peut se retrouver dans le noyau mais elle y est rapidement exporté grâce à sa

séquence NES [116]. Un peptide MEK1 qui contient le domaine D et le NES cause la

rétention de ERK2 dans le cytoplasme [125]. En outre, une protéine ERK2-MEK1 est

exclue du noyau si le NES de MEK1 est intact, mais s'accumule au noyau si les résidus

leucines dans le NES sont mutés en alanines [126].

1.3.2.2.2. Le site d’attache de PD 184352

Un rôle majeur a été attribué à MEK1 dans le développement des tumeurs. En effet, il a été

rapporté qu’une petite molécule qui inhibe l’activité de MEK, le PD 184352, est capable

d'empêcher la croissance de tumeurs jusqu'à 80% chez les souris porteuses de carcinomes

du colon d'origine humaine ou provenant de souris [127]. Le composé est sélectif et est non

compétitif ni pour la fixation de l’ATP ni pour l’interaction avec la MAP kinase ERK

[127]. PD 184352 peut aussi bien bloquer l'activation de MEK par RAF qu'inhiber la forme

active de MEK (phosphorylée par RAF ou mutée). Cependant, dans une étude récente, le

groupe de Dudley a montré que le PD 184352 ne bloque pas la phosphorylation de MEK et

ce aussi bien in vitro qu’in vivo [128].

Les inhibiteurs rapportés de MEK1 ; PD 98059, PD 184352, et U0126, se sont avérés

particulièrement spécifiques. Ils n’affectent pas les membres relatifs de famille de

MAPKK ; MKK3, MKK4, MKK6, ou MKK7, mais ils inhibent MEK2 [127,129].

Récemment, ces composés ont été rapportés efficaces, quoique plus faibles, contre l'activité

MKK5 [130,131]. Parmi les membres de la famille MAPKK, MKK5 montre l'homologie la

plus étroite avec MEK1 et à MEK2, avec 46% d’identité en acides aminés dans le domaine

catalytique [131].

Le site d’attachement de PD 184352 se trouve entre les domaines kinases III et IV de

MEK1 et MEK2 [128]. Cette région héberge la lysine 97 impliquée dans la fixation de

l’ATP et l’acide glutamique 114 qui est conservé chez tous les protéines kinases et qui est

essentiel pour la stabilité structurale de la protéine [132]. Des études par mutagenèse

20

ponctuée ont permis d’identifier plusieurs résidus importants dans l’attachement de

PD184352 à MEK1. Ces mutations n’affecteraient pas l'activité kinase et n’interféraient pas

dans la capacité de MEK à lier l’ATP. Par contre, tous les mutants MEK1 présentent une

augmentation substantielle de l’activité basale [128].

Une explication possible pour l’augmentation de l’activité de base des mutants est qu'une

conformation plus active serait obtenue par modification de l’emplacement des sous-

domaines dans le domaine kinase. Les structures en trois dimensions de plusieurs protéines

kinases ont indiqué que l'activité catalytique de ces enzymes implique deux changements

primaires dans la conformation [133]. Le premier se produit en raison de la

phosphorylation des résidus qui se trouvent dans la boucle d'activation de la kinase. Cette

phosphorylation aide à stabiliser la kinase sous sa forme active. Le second se produit alors

que les deux lobes que comporte le domaine kinase pivotent l'un par rapport à l'autre pour

fermer la fente catalytique et positionner les résidus essentiels dans une conformation

favorisant la catalyse [133]. Cependant, d'autres études ont indiqué qu’un mouvement

dynamique subtil impliquant diverses structures secondaires peut également être important

pour la catalyse. Précisément, le groupe de Ahn a prouvé par essai d’échange de deutérium

qu’un mouvement et une flexibilité dynamique significative sont observés chez la forme

activée de MEK1, tout particulièrement dans le lobe N-terminal du domaine kinase qui

comprend la région d’attachement du PD 184352 [134].

Enfin, l’inhibiteur PD 184352 pourrait fermer l'enzyme sur une conformation inactive,

empêchant la catalyse tout en permettant la phosphorylation de la Ser218 et de la Ser222 de

la boucle d'activation. Cette conformation pourrait interférer avec la reconnaissance par les

phosphatases spécifiques à MEK1 et provoquer l’hyperphosphorylation de MEK1 qui est

observée chez les cellules KBALB traitées avec le PD184352 [135].

1.3.2.2.3. La région C-terminale

L’extrémité C-terminale de MEK1 se prolonge par environ 40 acides aminés au delà d'une

arginine conservée (Arg349) dans le domaine XI, qui marque la fin du corps kinase [132].

L'importance fonctionnelle de la séquence se trouvant au delà du domaine XI a été explorée

21

en construisant des mutants tronqués C373, C367, C363, C358 ou C343 [86]. L’activité

basale de ces protéines semblait être comparable à celle de la protéine type sauvage,

indiquant que l’activité catalytique est intacte chez ces mutants. Cependant, la

phosphorylation par v-Mos immunoprécipitée n'active pas ces mutants de manière

significative. La troncation C373 dans MEK1R4F qui est constitutivement active produit

une protéine avec seulement 10% de l'activité initiale de MEK1R4F [86]. La région C-

terminale semble être nécessaire pour l'activation de l’enzyme. D'autre part, la région C-

terminale de MEK1 semble être nécessaire pour l’activation de la voie ERK/MAPK et la

survie cellulaire. En effet, Cha et co-auteurs ont indiqué que cette région, et tout

particulièrement la séquence comprise entre les acides aminés 330 et 379, serait importante

pour la localisation adéquate de MEK1 dans le cytoplasme [136]. Sa délétion entraine la

relocalisation de MEK1 dans les compartiments endosomales/lysosomales et provoquer la

mort cellulaire par apoptose. De plus, ces auteurs ont indiqué que la séquence 330-379 est

importante pour l’activation de MEK1 par Raf-1 et qu’elle est donc essentielle pour

l’activation de la voie ERK/MAPK [136].

1.3.3. ERK1 et ERK2

Plusieurs essais biochimiques et expériences de transfection suggèrent que ERK1 et ERK2

sont fonctionnellement équivalentes, à se demander pourquoi existerait-il deux gènes ERK?

Toutefois, le fait que MEK et les isoformes ERK sont habituellement co-exprimées, et la

présence, chez tous les mammifères, de deux gènes chacun pour MEK1/2 et ERK1/2 paraît

indiquer une diversification essentielle. ERK est une sérine/thréonine kinase avec un

portefeuille impressionnant de plus de 50 substrats, ce qui la met clairement à

l’embouchure finale de cette voie. Cependant, cela n'exclut pas l'existence de points

d’embranchement au niveau de Raf ou de MEK.

ERK1 et ERK2 sont des protéines de 43 et 41 kDa qui sont identiques à presque 85%, avec

de plus grande identité dans les régions centrales impliquées dans la liaison des substrats.

22

Les deux sites phosphoaccepteurs, tyrosine et thréonine, dont la phosphorylation est

essentielle pour l’activation, sont séparés par un résidu glutamate dans ERK1 et ERK2 pour

donner motif TEY dans la boucle d'activation [137]. Le remplacement des deux sites de

phosphorylation dans ERK2 par des résidus acides n'élève pas l'activité de la protéine

[138].

Les deux kinases sont exprimées partout, bien que leur abondance relative dans les tissus

soit variable. Par exemple, ERK2 est la forme prédominante chez beaucoup de cellules du

système immunitaire, alors que chez plusieurs cellules d'origine neuroendocrinienne, les

deux formes s’expriment également. Elles sont stimulées dans une certaine mesure par un

vaste nombre de ligands et perturbations cellulaires, avec quelques spécificités liées au type

cellulaire [23]. Chez les fibroblastes (le type cellulaire dans lequel leurs activités et

fonctions ont été développées), elles sont activées par le sérum, les facteurs de croissance,

les cytokines, certains stress mais aussi par les ligands des récepteurs couplés aux protéines

G et agents transformant pour ne citer que quelques-uns. Elles sont fortement exprimées

dans les neurones post-mitotiques et autres cellules hautement différenciées [139]. Chez ces

cellules, elles sont souvent impliquées dans des réponses adaptatives telles que la

potentialisation à long terme [140].

Un variant d’épissage de ERK1, ERK1b, a été identifié comme étant une bande

immunoréactive qui migre plus lentement que la forme ubiquiste de ERK1 [141]. ERK1b

correspondrait originairement à l’isoforme nommée ERK4 [142]. Un épissage alternatif de

erk2, tronquée de quelques résidus en N-terminal, a aussi été rapporté. Des essais de

surexpression ont suggéré que cette forme de ERK2 est localisée essentiellement à la

membrane plasmique [143]. Les structures tridimensionnelles de ERK2 native ou

phosphorylée ont été déterminées.

23

1.4. Autres voies de signalisation MAP kinases chez les

mammifères

1.4.1. Le sentier JNK/SAPK

Une première forme de JNK/SAPK (c-Jun N-terminal kinase/stress-activated protein

kinase), une kinase qui active la protéine MBP, a été purifiée de foies de rats traités à la

cycloheximide [144]. Bientôt, deux formes de JNK/SAPKs de 46 et 54 kDa sont purifiées

par adsorption à une protéine chimérique c-Jun [145]. L'isolement de plusieurs ADNc qui

codent pour ces enzymes et l’analyse subséquente de leur niveau d’expression ont révélé

trois gènes qui codent pour des protéines dont pas moins de 10 formes épissées [146-149].

Les domaines catalytiques de JNK1/SAPKγ, JNK2/SAPKα, et JNK3/SAPKβ sont à 85%

identiques. Les JNK/SAPKs sont activées par phosphorylation sur deux sites, tyrosine et

thréonine, comme tous les autres MAP kinases [149]. Ces résidus sont séparés par un

résidu proline pour donner un motif TPY à l’intérieur de la boucle d'activation. Les

JNK/SAPKs sont activés par les cytokines, certains ligands pour les GPCRs, des agents qui

perturbent la synthèse de l’ADN et des protéines, le stress et dans une certaine mesure par

le sérum, des facteurs de croissance ainsi que des agents transformants [3].

Deux membres de famille MAPKK, MKK4 (SEK1, MEK4, JNKK1, SKK1) et MKK7

(MEK7, JNKK2, SKK4), ont été impliqués dans les voies JNK/SAPK. Ces deux enzymes

ont été identifiées initialement par stratégie de clonage d’ADNc [3,150-157]. L’approche

du système double hybride a identifié MKK7 comme un partenaire de MEK1, bien que la

signification de leur association ne soit pas connue. MKK4 et MKK7 phosphorylent les

membres de la famille de p38 in vitro lorsque surexprimées, bien que JNK/SAPKs soient

les substrats préférés [158]. L’activation de JNK/SAPK est affaiblie chez les cellules

animales dans lesquels l’expression du gène MKK4 a été interrompue, mais les variations

dans l’activation de p38 sont dépendantes du type cellulaire [159]. Le fait que MKK4 agit

exclusivement dans les cascades de JNK/SAPK reste une question ouverte. Les

JNK/SAPKs sont toujours activées par certains stimuli chez les cellules MKK4-/-, indiquant

24

que MKK7 est aussi lié à la cascade JNK/SAPK. In vitro, MKK4 phosphoryle

préférentiellement le résidu tyrosine dans le motif TPY de la boucle d’activation de

JNK/SAPK, alors que MKK7 phosphoryle préférentiellement le résidu thréonine. En se

basant sur cette spécificité, il a été suggéré que ces kinases coopèrent pour activer

JNK/SAPKs, tout en conservant l’intégrité du signal [160,161]. Ces mêmes travaux

indiquent aussi que la phosphorylation du résidu thréonine serait très importante pour

l'activité de JNK3 [161].

1.4.2. Le sentier p38

La MAP kinase p38α a été découverte indépendamment dans trois contextes. C’est une

protéine phosphorylée sur tyrosine qui se retrouve dans des extraits de cellules traités avec

des cytokines inflammatoires. Elle a été identifiée comme étant la cible du SB 203580 de

type pyridinyl imidazole, qui bloque la production du TNFα [162], comme étant la

cytokine- suppressive anti-inflammatory drug-binding protein ou CSBP [163], et comme

étant une kinase pour la MAP kinase activated protein kinase (MAPKAP) kinase-2 [164].

Trois autres gènes qui codent pour des membres de la sous-famille de p38 ont été identifiés

par des stratégies de clonage plutôt que par des approches biologiques: p38β (ou p38-2),

p38γ (ERK6 ou SAPK3), et p38δ (SAPK4) [165-170]. Toutes ces kinases possédent la

séquence TGY dans leur boucle d’activation. p38α et β sont sensibles aux inhibiteurs

dérivés du pyridinyl imidazole, mais les isoformes γ- et δ- sont résistantes à ces drogues

[169,170]. Une variété de facteurs, y compris les cytokines, les hormones, les facteurs

osmotiques, les chocs thermiques ainsi que bien d’autres stress activent les membres de la

famille de p38 [3]. Dans certains contextes, ces protéines kinases peuvent réagir

différemment à un stimulus [171].

Deux protéines MAPKKs, MEK3 et MEK6, active fortement les p38 MAP kinases

[3,150,172,173]. MEK3 paraît favoriser la phosphorylation de p38α et les isoformes de

25

p38β, alors que MEK6 phosphoryle efficacement tous les membres de la famille p38 [172].

Les deux kinases phosphorylent aussi les isoformes de JNK/SAPK. MEK6 phosphoryle les

chimères p38/ERK2, et NLK in vitro, suggérant qu'elle a une spécificité étendue par

rapport aux autres MAPKKs [174,175]. Les implications physiologiques de cette spécificité

ne sont pas encore claires.

1.4.3. Autres MAP kinases

1.4.3.1. ERK3

Un ADNc qui code pour ERK3 chez le rat (ERK3α) a été isolé d'une banque d’ADNc en

utilisant une sonde provenant de ERK1 [139]. Un autre ADNc humain qui code pour une

deuxième protéine kinase ERK3 (ERK3β) a ensuite été isolé. Cette MAP kinase de 63 kDa

est identique à 75% à ERK3α [176]. Ces deux kinases ERK3 sont 50% identiques à ERK1

et ERK2 au niveau du domaine catalytique, et les deux contiennent des extensions en C-

terminal d'approximativement 180 résidus. L’immunodétection, avec des anticorps

spécifiques à ERK3, a révélé des protéines de 63, 95, et 160 kDa présentes dans de

multiples tissus chez le rat et chez plusieurs autres lignées cellulaires [177]. Un clone de

ERK3 codant pour une forme de 100 kDa a été récemment isolé chez la souris par Meloche

et collaborateurs et un seul locus génomique a été cartographié [178]. L'analyse de la base

de données génomiques a suggéré qu'il y a deux gènes fonctionnels, MAPK6 et MAPK4, et

plusieurs pseudogènes [178]. Aucun gène codant pour ERK3 n'a été trouvé dans les

génomes de la levure et des nématodes, suggérant que les isoformes ERK3 proviennent

d'une duplication génomique relativement tardive [179,180].

En dépit de sa ressemblance à ERK1/2, ERK3 a quelques traits qui sont différents des

autres membres de la famille. Le motif des sites de phosphorylation dans la boucle

d'activation chez les isoformes ERK3 a un seul phosphoaccepteur, la serine189 chez

ERK3α. Une glycine remplace le site de phosphorylation tyrosine retrouvé chez la plupart

26

des MAP kinases. Peu est connu sur l’activité catalytique de ERK3α. Cette MAP kinase

s’autophosphoryle mais aucun substrat n’a été clairement identifié [177]. Plusieurs MAP

kinases sont localisées dans le cytoplasme des cellules non stimulées et au noyau quand les

cellules sont stimulées. Par contre, ERK3α est concentrée dans le noyau sous toutes les

conditions examinées [177]. Le mécanisme de la rétention nucléaire est inconnu. En outre,

ERK3 ne possèderait pas la séquence consensus de la localisation nucléaire. Une kinase qui

lie et phosphoryle ERK3α sur la Ser189 a été décrite mais son identité moléculaire est

inconnue [180]. Cette ERK3 kinase ne phosphorylerait pas d’autre MAP kinases.

1.4.3.2. ERK5

ERK5 ou BMK1 (Big MAP kinase-1), a été identifiée indépendamment par deux groupes.

L’un a utilisé un criblage double hybride avec comme l'appât, son activateur potentiel,

MEK5. L'autre a exploité la stratégie de PCR dégénérée pour cloner une nouvelle MAP

kinase [181,182]. Le point marquant chez la protéine ERK5 est sa taille, 816 acides aminés,

due à une extension d'approximativement 400 acides aminés en carboxy du domaine

kinase. Lorsque comparé aux autres MAP kinases de mammifères, la séquence primaire du

domaine catalytique paraît être similaire à celle de ERK2. Cependant, la région C-terminale

de 400 résidus ne présente aucune analogie à d’autres protéines connues et n’a aucune

fonction connue. ERK5 est capable de s’autophosphoryler [183]. Le rôle de cette

autophosphorylation dans la régulation de ERK5 n’a pas été précisé.

Chez les mammifères, ERK5 s’exprime d’une façon ubiquitaire. Comme d'autre MAP

kinases, l'activité ERK5 est régulée par une large variété d’agents prolifératifs et de stress.

Les stimuli prolifératifs incluent le sérum, le EGF, le NGF (nerve growth factor), l’acide

lysophosphatidique (LPA), et l’ester de phorbol [130,184,185]. La capacité de ces agonistes

d'activer ERK5 est dépendante de Ras chez certain type cellulaire. Chez les cellules HeLa,

l'activation par le EGF requière l'activité de MEKK3 [130,184,186]. Les stimuli du stress

incluent le sorbitol, le H2O2, l’irradiation par l’UV, le cisaillement vasculaire, et l’ischemie

[130,185,187-189]. Ces stimuli activeraient la voie ERK5 via Src [190]. Chez les cellules

27

3T3, les formes dominantes négatives de ERK5 peuvent inhiber la prolifération stimulée

par EGF et la formation de foyers de transformation stimulée par RafBXB [184,191].

Anglais et collaborateurs ont examiné la régulation du domaine catalytique de ERK5 après

la délétion de son domaine C-terminal [183]. Le domaine catalytique est activé par V12Ras

et par un mutant actif de MEK5, MEK5DD (les deux sites d'activation sont remplacés par

des résidus acides). In vitro, ERK5 produite chez les bactéries, est phosphorylée sur son

motif TEY par MEK5DD immunoprécipitée et démontre une forte affinité/activité pour son

substrat. Ceci porte à croire que ERK5 se comporte comme la majorité des MAP kinases

dont la taille totale dépasse légèrement celle de leur domaine catalytique. Le domaine

kinase de ERK5 présente la même spécificité d'activation que les autres MAPKs. MEK1,

par exemple, est incapable de phosphoryler ERK5 in vitro ou d’augmenter son activité

lorsque co-exprimées chez les cellules HEK 293. ERK5 phosphoryle des facteurs de

transcription tel que MADS, MEF2A et C, et SAP1a [130,185,192]. Elle active les

isoformes MEF2 et permet la régulation de la concentration intracellulaire de c-Jun [192].

MEK5 est une protéine identifiée à l'origine dans le foie et le cerveau. Il existe des variants

d’épissage qui incluent une isoforme α de 50 kDa et une isoforme β de 40 kDa.

L’expression de l’isoforme β est ubiquitaire. MEK5 est cytoplasmique et son unique

substrat connu est ERK5. Ainsi, le rôle de MEK5 dans la transduction des signaux serait

limité à sa capacité d'activer ERK5 [181,193].

D'après l’alignement de séquences, MEK5 serait principalement reliée à MEK1 et 2. En

fait, MEK5 est aussi inhibée par PD98059 et U0126, deux composés qui sont considérés

comme des inhibiteurs très sélectifs de MEK1 et MEK2 [130,192]. À basses

concentrations, les effets de ces inhibiteurs sont dirigés sur MEK1/2, car le Ki de MEK5 est

considérablement plus élevé. Malgré la ressemblance à MEK1/2, MEK5 n'est pas

phosphorylée par Raf-1 [183]. Bien que Raf-1 soit incapable de réguler l'activité de MEK5,

cette dernière est impliquée intimement à la voie de signalisation Raf-1. MEK5 inactivée,

MEK5KM, peut inhiber la formation de foyers de transformation stimulée par RafBXB

chez les cellules 3T3, alors que la forme constitutivement active de MEK5, MEK5DD,

induit la transformation cellulaire lorsque co-exprimée avec RafBXB [191]. MEK5KM

28

peut inhiber aussi la transformation cellulaire induite par le proto-oncogène Tpl-2/Cot, et la

co-expression de Tpl-2 avec MEK5 augmente les phosphosérines dans MEK5 [194].

L’effet direct de Tpl-2 sur l’activité MEK5 n'a pas été démontré. Les seules MEK5 kinases

identifiées à nos jours sont MEKK2 et 3 [186,195,196].

1.4.3.3. NLK

NLK a été identifiée par le groupe de Erikson comme étant reliée à nemo chez la

Drosophile [197]. Cette kinase a des propriétés qui la placent entre les MAP kinases et les

cdks. Bien qu’elle soit presque 45% identique à ERK2, le motif de double phosphorylation

TXY dans la boucle d'activation est absent, et est remplacé par un motif TQE semblable à

celui des cdks où seul le résidu thréonine est phosphorylé. Néanmoins, NLK paraît prendre

place dans une cascade de MAP kinases qui régule négativement la signalisation par Wnt

[175,198,199]. Des études chez C. elegans ont démontré qu'un homologue à NLK est activé

par la protéine MEKK, Mom-4. Mom-4 est un homologue de TAK1, une MAPKKK dans

la voie p38 MAP kinase. Dans des essais de transfection, TAK1 peut augmenter l'activité

de NLK. Bien qu'aucune MAPKK spécifique à NLK n'a été rapportée, NLK semble être

activée in vitro par MKK6, un substrat de TAK1. Il est donc possible que TAK1 et MKK6

puissent être les régulateurs cellulaires de p38 et de NLK.

1.4.4. MEKKs, la première marche dans la cascade des

MAP kinases

Une enzyme MAPKKK spécifique peut réguler une ou plusieurs MAPKKs dépendamment

de sa spécificité enzymatique, de la distribution cellulaire et subcellulaire des composantes

de la signalisation, de la formation de complexes protéiques et de la nature des stimuli qui

déclanchent la signalisation. Par conséquent, des variations considérables dans l’intensité et

la cinétique d'activation des MAP kinases peuvent se produire sous des circonstances

différentes et en réponse à un agent donné. Plusieurs kinases qui agissent au niveau

29

MAPKKK ont été identifiées, ajoutant de la complexité aux mécanismes de la

signalisation. De plus, il n'y a aucune ressemblance apparente parmi ces protéines en dehors

de leurs domaines catalytiques. La contribution relative de chaque MAPKKK à l'activation

d’une voie MAP kinase unique, avec l'exception possible de Raf dans la voie ERK1/2, est

vague.

Mis à part les isoformes Raf, la première MEK kinase isolée est la protéine à 195 kDa,

nommée MEKK1 [200,201]. Cette kinase est la plus reliée à la protéine kinase de la levure,

Ste11p [202]. Dans leurs domaines catalytiques, MEKK2 et MEKK3, ayant chacune

approximativement 70 kDa et MEKK4, possédant une masse moléculaire proche de 150

kDa, sont presque 50% identiques à MEKK1 [200,203].

Les autres enzymes ayant une activité MAPKKK sont moins analogues et sont de 30 à 40%

identiques à MEKK1. Elles sont, en général, associées à la voie JNKs/SAPKs (figure 1-3);

MAP3kinase (MTK1) [204,205], Tpl-2/Cot [82,206,207], DLK (dual leucine zipper

kinase) [208,209], MLK2/MST (mixed lineage kinase) [210], MLK3/PTK-1/SPRK [211],

TAK1 (transforming growth factor-β (TGFβ)-activated kinase) [212,213],

ASK1/MAPKKK5 [214,215] et ASK2/MAPKKK6 (apoptosis signal-regulating kinases)

[215] et enfin TAOs1 et 2 (thousand and one amino acid kinases) [216,217]. MEKKs 1-3

et Tpl-2 peuvent activer aussi la voie ERK1/2 [82]. MEKK3 et Tpl-2 activent en plus la

voie ERK5 [192,194]. TAK1, ASK1, TAOs1/2, et MTK1 font aussi partie de la voie p38.

Démêler les relations entres ces MAPKKKs et les MAP kinases qu’elles activent a été une

rude tâche. L’identification des spécificités enzymatiques intrinsèques, la distribution, et les

phénotypes d'animaux et de cellules chez lesquels ces gènes MAPKKK sont mutés

devraient commencer à aider à déchiffrer leur diversité et leurs fonctions dans les cascades

de signalisation.

30

MEKK

MEK

MAPK

Rafs, MosMEKK1-4Tpl-2

MLK DLKASK1,2 MTK1MEKK1-4Tpl-2

TAO1,2ASK1 MTK1TAKMEKK1-4

MEKK2,3Tpl-2?TAK ?

MEK1,2 MKK4,7 MKK3,6 ERK3 KinaseMEK5

ERK1,2 JNK1-3

MKK6?

p38α,β,γ ERK5NLK ERK3α,β

Réponse ProliférationDifférenciationdéveloppement

Inflammation Apoptosedéveloppement

Prolifération? ?

Facteurs de croissanceStimulus Cytokines, Stress Sérum

Stress ?

?

?

MEKK

MEK

MAPK

Rafs, MosMEKK1-4Tpl-2

MLK DLKASK1,2 MTK1MEKK1-4Tpl-2

TAO1,2ASK1 MTK1TAKMEKK1-4

MEKK2,3Tpl-2?TAK ?

MEK1,2 MKK4,7 MKK3,6 ERK3 KinaseMEK5

ERK1,2 JNK1-3

MKK6?

p38α,β,γ ERK5NLK ERK3α,β

Réponse ProliférationDifférenciationdéveloppement

Inflammation Apoptosedéveloppement

Prolifération? ?

Facteurs de croissanceStimulus Cytokines, Stress Sérum

Stress ?

?

?

Figure 1-4 : Les voies de signalisation des MAP kinases.

Les différents modules MAP kinases chez les mammifères régulent la croissance cellulaire,

la différenciation, la réponse au stress et le développement.

31

La fonction de MEKK1 est encore obscure. Elle a été impliquée dans l’activation des voies

MAP kinases JNK/SAPK, ERK, et p38. Elle semble aussi jouer un rôle dans l'activation du

facteur nucléaire NF-κB (nuclear factor-κB) [218,219]. In vitro, MEKK1 phosphoryle

MEK 1, 2, 3, 4, 6, et 7 [83,95,201,220]. Cependant, bien que la protéine recombinante

MEKK1 phosphoryle MEK1 et 2 sur les mêmes sites que Raf-1, la phosphorylation de

MEK4 par MEKK1 est relativement plus importante, à l’instar de la découverte que la

signalisation via JNK/SAPKs est la plus affectée chez les cellules sans fonction MEKK1

[221-223].

Bien que le module MAPK classique soit formé de trois niveaux de phosphorylation, une

quatrième kinase peut agir directement en amont comme un activateur des MEKKs. Les

kinases impliquées dans l’activation de JNK/SAPK au niveau MEKK kinase incluent PAK

1-4 [224-226], GCK (germinal center kinase) [227,228], KHS et HGK qui sont apparentées

ou homologues à GCK [229,230], HPK1 (hematopoietic progenitor kinase 1) [231] et NIK

(Nck-interacting kinase) [232].

Les petites protéines G et les protéines hétérotrimèrique G peuvent activer des cascades

MAP kinases (discuté avec plus de détail pour ERK1/2 dans le chapitre précédent) [233].

L’activation de JNK/SAPKs et de p38 en réponse à l’interleukine (IL)-1β, la muscarine, la

bradykinine, et au complexe des sous unités βγ des protéines hétérotrimèrique G peut être

médiées par des membres de la famille des petites protéines G Rho, Rac et Cdc42 [234-

237].

32

1.5. L’organisation, la localisation et la spécificité des

cascades des MAP Kinases

Il y a un haut degré d'homologie entre les différents modules MAPK, dans leur organisation

générale mais aussi au niveau de la composition protéique. Un haut pourcentage de

ressemblance existe dans la séquence primaire des différentes MAPKs (60% entre ERK1/2

et JNK ou p38 MAPK). En outre, les substrats des trois MAPKs principales: ERK, JNK, et

p38 MAPK affichent des motifs de consensus de phosphorylation semblables, (T/S) P.

Deux mécanismes empêchent le cross-talk inapproprié entre les différents modules MAPK.

En premier lieu, les protéines d’échafaudage créent des complexes multi enzymatiques qui

réunissent ensemble des composantes d’une cascade MAP kinase isolée [238]. Ces

complexes préviennent l’activation de la voie par des stimuli inappropriés et favorisent la

transmission rapide du signal à travers la cascade. En second lieu, les sites d’amarrage

spécifiques sur les MAPKs qui sert à l’attachement de substrats, d’activateurs et de

régulateurs, augmentent la fidélité et l'efficacité des réactions enzymatiques.

1.5.1. Prédiction de la formation de complexes signalétiques

par l’étude de la signalisation intracellulaire chez la levure

Les études faites chez la levure ont montré que les protéines d'échafaudage sont

primordiales pour la spécificité et l’intégrité du signal. Ces protéines, qui sont généralement

dépourvues de domaine actif, contrôlent les voies de signalisation en désignant, selon le

contexte cellulaire, la voie qui doit être activée. Chez la levure, et en réponse à la

phéromone, la MAPKKK Ste11p active la MAPKK Ste7, qui a son tour active les MAP

kinases Kss1p et Fus3p. En réponse à un stress osmotique, Ste11p active sélectivement

Pbs2p, la MAPKK de la voie Hog1p (l’équivalent de voie p38 chez les mammifères) [239-

241]. Quel signal activerait Ste11p et quelle MAPKK serait la cible de Ste11p est dictée par

33

les protéines d’échafaudages. En effet, dans le cas d’une réponse à la phéromone, la

protéine d’échafaudage Ste5p rapproche Ste11p à son substrat Ste7p, alors qu’en cas de

réponse à un stress osmotique, Pbs2p crée une interaction stable avec Ste11p et avec le

senseur osmotique Sho1p, ce qui fait transmettre le signal à Hog1p (figure 1-4) [242].

1.5.1.1. Ste5p

Ste5p est la première protéine d'échafaudage identifiée qui est capable de lier les

composantes kinases de la voie MAP kinase chez la levure S. cerevisiae. Les mutants Ste5p

sont stériles, d’où provient le nom de la protéine. Ils ont une déficience dans la progression

du croisement sexué (mating) induite par la phéromone [243]. Des études de double

hybride ont révélé que Ste5p interagit avec les trois kinases du module MAP kinase : la

MAP kinase Fus3p (ou son homologue Kss1p), la protéine MEK, Ste7p et la MEKK,

Ste11p [244-246]. Ces résultats supportent les premières études biochimiques avec la

protéine surexprimée qui montraient que Ste5p est un substrat de Fus3p [247]. Des études

de délétion ont montré que les sites d’interaction de Ste5p avec les MAP kinases sont

distincts, et suggèrent qu'un complexe multi protéique peut être formé [244-246]. La

phosphorylation et l’état d’activation affectent l’interaction des différentes kinases avec

Ste5p [248].

Quatre propriétés de Ste5p ont été soulignées comme clefs possibles de sa fonction. La

première est sa capacité de lier toutes les composantes de la cascade MAP kinase. La

seconde est sa capacité d’interagir avec les transducteurs du signal qui se trouvent en

amont. Ceux-ci incluent la protéine G hétérotrimèrique qui est activée par la phéromone.

En fait, dans cette voie, les sous unités βγ (Ste4p et Ste18p) transmettent le signal avec

l’aide de Ste5p [249] et l’'interaction de Ste5p avec la sous unité Gβ est essentielle pour

l’activation de Ste11p [250,251]. La troisième est que Ste5p forme des oligomères qui

peuvent stimuler l'activation des complexes [251,252]. Finalement, Ste5p peut être aussi un

élément essentiel dans la localisation des kinases dans des complexes. Ste5p est localisée à

la membrane plasmique pour l’activation de la cascade, cependant son entrée et sa sortie du

noyau sont aussi impliquées dans la signalisation induite par la phéromone [253].

34

Figure 1-5 : Les complexes d'échafaudage de la voie MAP kinase chez la levure

saccharomyces cerevisiae.

(a) Le module général de la voie MAP kinase. (b) La voie MAP kinase, en réponse à une

phéromone, comporte la MAP kinase kinase kinase (MKKK) Ste11p, la kinase de la MAP

kinase (MKK) Ste7p, et les map kinases Fus3p et Kss1p. Cette cascade est coordonnée par

la protéine Ste5p d'échafaudage. Ste5p interagit également (directement et indirectement)

avec des composants additionnels de cette voie de signalisation, y compris les sous-unités

Gβ (Ste4p) et Gγ (Ste18p) de la protéine G, Ste20p, Cdc42p, Cdc24p et Bem1p. (c) Une

deuxième protéine d'échafaudage, la MKK Pbs2p, est une protéine kinase qui interagit avec

le senseur osmotique Sho1p, Ste11p et avec la MAP kinase Hog1p pour créer un module

signalétique qui régule la biosynthèse du glycérol en réponse à un stress osmotique [242].

Tiré de la référence [238].

35

1.5.1.2. Pbs2p

La formation de complexes protéiques est déterminante pour la régulation des MAP kinases

et leur bon fonctionnement. Cette idée a été fortement suggérée par les conclusions de

l’étude d’un deuxième module MAP kinase présent chez la levure ; la voie de réponse

homéostatique au choc osmotique [241,254,255]. La voie HOG contient la MAP kinase

Hog1p, l’homologue de p38 chez les mammifères [255]. La MAPKK qui se trouve en

amont dans la voie est Pbs2p [241,255]. Deux senseurs osmotiques peuvent activer la voie

HOG via l’un des trois différents MAPKKKs ; Ste11p, Ssk2p et Ssk22p [240]. Un senseur

osmotique transmembranaire, Sho1p, active Ste11p, la même MAPKKK de la voie qui

répond à la phéromone [241]. Donc, les voies du mating et du stress osmotique partagent

une MAPKKK commune. Quand la voie osmotique est activée, Ste11p se lie à Pbs2p. Cette

dernière favorise alors l’assemblage et l’activation des composantes MAP kinases de la

voie HOG. Pbs2p lie Sho1p, Ste11p et Hog1p [241]. Ste5p est absente ou alors présente à

très faible quantité chez les cellules diploïdes. Sa présence peut être exigée pour la

reconnaissance de Ste7p par Ste11p. Par conséquent, son absence serait un facteur

important dans la spécificité de Ste11p pour Pbs2p. Les partenaires d’interaction de Ste11p

paraissent donc déterminer les signaux qu’elle transmet. Ce mode de régulation peut bien

se passer dans les cascades des MAP kinases chez les mammifères.

La spécificité des interactions entre les différentes composantes de la cascade des MAPKs

n'est pas seulement déterminée par leur association avec Ste5p. Par exemple, la MEK Ste7p

interagit avec Fus3p et Kss1p indépendamment de Ste5p [246,256]. L'interaction de Ste7p

avec Fus3p (ou Kss1p) est tout à fait spécifique parce que deux autres MAPKs, Hog1p et

Slt2p, n’interagissent pas avec Ste7p [256]. L'interaction entre Ste7p et Fus3p (ou Kss1p)

pourrait être une interaction enzyme/substrat qui implique la liaison de la MAPK au site

catalytique de la MAPKK. Cependant, parce que Ste7p est un substrat de Fus3p (et de

Kss1p) dans un mécanisme potentiel de rétroaction [256,257], cette interaction pourrait

également refléter l'attachement de la MAPKK au site catalytique de la MAPK. Ni l'un ni

l'autre de ces possibilités n'explique la forte interaction entre la MAPKK et la MAPK. Par

contre, Fus3p (ou Kss1p) lie étroitement une région NH2-terminale de Ste7p qui ne

36

contient aucun site de phosphorylation et ne fait pas partie du domaine kinase qui est en

COOH-terminale de la protéine [256,258].

1.5.2. Association des protéines kinases dans les voies MAP

kinases chez les mammifères

La fonction cellulaire de Ste5p n’est encore pas complètement élucidée. Néanmoins, le fait

que Ste5p est importante pour l’activité de la voie MAP kinase a mis en évidence

l'importance de la formation de complexes dans les cascades de signalisation. En outre, le

contrôle de la spécificité de Ste11p, qui paraît être exercé par son attachement à Ste5p (ou à

Pbs2p,) indique que la réception du signal et sa transmission peuvent être canalisées par la

formation de complexes protéiques. Une autre fonction essentielle de Ste5p est sa capacité

de se déplacer et de se localiser convenablement dans la cellule.

Alors que la spécificité enzymatique inhérente des isoformes Rafs et de MEK1/2 peut être

suffisante pour garantir leur sélectivité pour ERK1/2, quelques-unes des MAPKKKs et

MAPKKs impliquées dans les voies du stress paraissent être moins spécifiques in vitro et

lors d’essais de surexpression chez les cellules en culture. Par exemple, la surexpression de

Tpl-2 a été reliée à l'activation d'au moins cinq voies MAP kinases et MKK6 phosphoryle

au moins sept différentes kinases in vitro. Ce manque apparent de sélectivité enzymatique

suggère que l'assemblage de ces enzymes dans des complexes pourrait restreindre leurs

actions au MAP kinases et autres kinases présentes dans le complexe et permettre une

progression contrôlée du signal.

1.5.2.1. Les protéines d’échafaudage du sentier ERK

Plusieurs études d’interaction, de clonage, et essais d’activité de différents mutants MEKs

suggèrent que les interactions protéine-protéine sont primordiales pour la transmission des

signaux intracellulaires via la voie ERK1/2. Ces interactions régissent la localisation des

kinases pour la réception du signal, le déplacement des kinases aux sites d'action, la

37

reconnaissance et la spécificité envers les substrats et enfin le contrôle temporel de

l’activité kinase. Plusieurs protéines d’échafaudage spécifiques à la voie ERK/MAPK ont

récemment été identifiées. Comme leurs homologues chez la levure, ces protéines de

soutien semblent jouer un rôle important dans l’organisation, la localisation et le maintien

de l’intégrité fonctionnelle des voies de signalisation des MAP kinases [259].

1.5.2.1.1. MP-1

MP-1 est une protéine d’échafaudage d'approximativement 13 kDa qui a été identifiée par

Weber et les collaborateurs dans un criblage double hybride avec MEK1 comme appât

[260]. La suppression de la région MSS de MEK1 empêche son interaction, suggérant que

cette région est le site d'interaction entre MEK1 et MP-1. Il a été suggéré que MP-1 est une

protéine d’échafaudage qui rehausse la formation de complexes protéiques, parce qu'elle se

lie aussi à ERK1. MP-1 lie beaucoup moins bien ERK2, indiquant une sélectivité

inattendue entre ces deux MAP kinases homologues. Des études au niveau cellulaire ont

démontré que MP-1 augmente l'activation de ERK1 [260]. À cause de sa petite taille, MP-1

est loin d'être un équivalent fonctionnel de Ste5p. Cependant, MP-1 peut être une unité d'un

système d’échafaudage modulaire qui peut faciliter la formation d'un regroupement de

complexes protéiques possédant des différences mineures dans la composition en protéines.

Récemment, un nouveau partenaire à MP-1, p14, a été découvert. Le complexe MP-1-p14

entraîne MEK1 et ERK1 à la surface cytoplasmique des endosomes/lysosomes tardifs où

p14 est localisée [261]. La présence de ERK1 au niveau des endosomes/lysosomes pourrait

l’impliquer dans la signalisation par les récepteurs membranaires internalisés ou alors dans

la régulation de la sécrétion lysosomales.

1.5.2.1.2. Grb10

Nantel et collaborateurs [262] ont montré que le MSS de MEK1 lie Grb10. Grb10 a été

isolé originairement dans un criblage de protéines qui lient le domaine C-terminal tyrosine-

phosphorylé du récepteur EGF. Grb10 [263] et ses homologues Grb7 [264] et Grb14 [265]

sont considérés des protéines adaptateurs parce qu'ils interagissent avec plusieurs protéines

38

de signalisation et manquent d’activité enzymatique apparente (voir la référence [266] pour

revue). Ensemble, ils se nomment la famille Grb7 et partagent un domaine SH2 dans la

région C-terminale qui leur permet de se lier à plusieurs récepteurs RTK activés, un

domaine PH (Pleckstrin homologie) central, et une petite séquence riche en proline pouvant

lier les domaines SH3 [267]. Le domaine BPS, situé entre les domaines PH et SH2 dans

Grb10 et dans Grb14, lie les récepteurs de l’insuline et de l’IGF-I [268,269].

Les complexes Grb10-MEK1 ont été identifiés en association avec la mitochondrie et

peuvent être impliqués dans la progression des signaux de la survie cellulaire qui sont

produits au niveau de la mitochondrie [270]. Grb10 interagit aussi avec Raf-1

mitochondriale [262,268], ce qui suggère que Grb10 pourrait être employé dans la

régulation de la mort cellulaire programmée en modulant l'activité de la voie ERK

mitochondriale. Grb10 servirait de lien entre les récepteurs membranaires et le complexe

apoptotique localisé à la membrane externe des mitochondries. Grb10 pourrait entre autres

faire le lien avec la voie du phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/Akt, qui joue un rôle

dans la régulation de l'activité anti-apoptotique de l'insuline et des récepteurs de IGF-I

[271-274]. La voie du PI-3K/Akt régulerait en fait la phosphorylation de Grb10 et celle de

Raf-1 mitochondriale [275,276].

1.5.2.1.3. KSR

Les premières études génétiques faites sur le développement de l’oeil chez Drosophile et

sur l’induction vulvaire chez le nématode C. elegans ont permit de discerner les

mécanismes de base de la signalisation par la protéine G Ras et par les autres composantes

de la cascade ERK/MAP kinase. Dans chacun des systèmes d’étude, la cascade MAP

kinase est régulée par un récepteur à activité tyrosine kinase ; le récepteur Sevenless chez la

mouche et le récepteur de EGF chez le nématode. Chacun fonctionne via Ras pour

contrôler un processus cellulaire. Pour identifier des molécules qui sont nécessaires au

fonctionnement de la voie Ras, des mutants Ras sans effet sur Raf et sur les molécules en

aval ont été utilisés [277-279]. KSR (Kinase suppressor of Ras) a résulté de ces criblages et

semble agir dans de nombreuses voies. KSR, comme Raf, a une région N-terminale riche

39

en cystéine et un domaine kinase C-terminal. Des homologues à KSR ont été identifiés

chez de nombreuses espèces animales mais pas chez la levure. Plusieurs évidences

substantielles indiquent que KSR agit comme une molécule d’échafaudage qui lie les

composantes kinases de la voie ERK/MAPK [277,280]. Cependant, KSR possède une forte

homologie de séquence lorsque comparée à d’autres protéines kinases, sa fonction pourrait

donc dépendre de son activité kinase, bien que son domaine kinase interagit à la fois avec

Raf-1 et avec MEK1 [277,280-283]. Récemment, on a démontré que l’activité catalytique

de KSR est importante dans la transmission du signal stimulé par EGF via la voie Ras-

ERK/MAPK [284]. Cette activité serait une propriété intrinsèque de KSR et indépendante

de son attachement à MEK [285]. KSR1 transite du cytoplasme à la membrane cellulaire en

réponse au traitement par des facteurs de croissance. Ce processus est contrôlé par la

sérine/thréonine kinase C-TAK1 qui phosphoryle KSR à un site qui lui confère la fixation à

14-3-3 [286]. KSR est donc séquestrée dans le cytoplasme en absence de stimulation. En

réponse à un facteur de croissance, le site S392 de KSR est déphosphorylé par une

phosphatase inconnue, et KSR est libérée de 14-3-3 et transite à la membrane plasmique où

elle amène MEK et ERK au complexe signalétique actif de Raf. Par conséquent, KSR

paraît agir comme une protéine d’échafaudage pour maintenir la spécificité du signal et

amplifier ce dernier à travers la cascade ERK/MAPK. Comme Ste5p, KSR pourrait

localiser le module des MAP kinases à la membrane pour y être activé. Il semble aussi se

lie à la sous- unité γ de la protéine G hétérotrimèrique, suggérant que KSR peut avoir un

rôle aussi bien dans la signalisation médiée par les récepteurs associés aux protéines

hétérotrimèriques G que par les récepteurs à activité tyrosine kinase [287].

1.5.2.1.4. RKIP

Une protéine qui lie Raf 1, nommé RKIP (RAF kinase inhibitor protein), a été isolée lors

d'un criblage double hybride utilisant Raf-1 comme appât [288]. Tel que suggéré par son

nom, RKIP inhibe la phosphorylation et l’activation de MEK par Raf-1. En fait, RKIP

paraît interrompre la formation du complexe Raf-MEK. Elle se lie directement à Raf-1,

MEK, et ERK in vitro et en essais de co-immunoprécipitation de lysats cellulaires, et

semble ainsi prévenir l’activation de la voie ERK/MAPK [289]. Basé sur des études de

40

surexpression et de l’usage d’ARN anti-sens et d’anticorps inhibiteurs, il a été conclu que

RKIP fonctionne physiologiquement pour empêcher l'activation du module ERK1/2. Il est

possible que RKIP ait d'autres fonctions, par exemple, comme une molécule d’échafaudage

qui soutient l’activation de la cascade dans certaines circonstances ou localise la cascade à

une organelle spécifique. Bien qu'il n'y ait pas actuellement de données qui supportent cette

idée, JIP, la protéine qui lie JNK [290] et PKI, une protéine qui inhibe l’activité de PKA

[291], ont été identifiées originairement comme inhibiteurs et sont maintenant connues

pour avoir d’autres fonctions. JIP est un échafaud relié à Ste5p. PKI précise l'activité

nucléaire de PKA en formant un complexe qui stimule l'exportation de la sous unité

catalytique de PKA du noyau [290,292-294].

De toutes ces études, un nouveau concept émerge: les protéines d'échafaudage ne sont pas

seulement des isolants entre les modules signalétique homologues, mais elles jouent un rôle

important comme régulateurs de l’activité et de la localisation subcellulaire des

composantes de la cascade.

Ces leçons tirées de l’étude des voies MAP kinases, chez la levure au début puis chez les

mammifères, ont permis de caractériser le rôle que peut avoir les protéines d’échafaudage

dans la progression du signal de façon spécifique et précise. Quatre fonctions clés de ces

molécules sont ainsi à considérer: 1) Elles peuvent organiser les cascades MAP kinases

pour une activation efficace des différentes composantes. 2) Elles peuvent restreindre la

réception du signal en reconnaissant des signaux provenant uniquement de certains

récepteurs; 3) Elles peuvent restreindre la spécificité de la transmission du signal en

interagissant avec un répertoire limité de composantes de la cascade. Et 4) elles peuvent

déterminer la destination du signal pas seulement par la sélection des MAP kinases qu’il

faut impliquer, mais aussi en localisant la cascade à des sites d'action présélectionnés, par

exemple, la membrane plasmique, le noyau, la mitochondrie, les microtubules, etc.

1.5.2.2. Les sites d’amarrage ou Docking Sites

La régulation précise des réseaux des protéines kinases est cruciale afin que les cellules

puissent répondre convenablement aux signaux dans leur environnement. En outre, un

41

certain nombre de maladies, en particulier le cancer, serait associé à la dérégulation d’une

voie de transduction. Par conséquent, l’élucidation des mécanismes par lesquels la fidélité

et l'efficacité du signal sont maintenues peut permettre le développement de procédés

thérapeutiques avec une spécificité accrue et des traitements avec des effets secondaires

réduits.

Un des mécanismes qui influence aussi bien la spécificité que l'efficacité du signal est

l'interaction des protéines kinases avec leurs substrats et régulateurs (activateurs) avec une

affinité élevée via les sites d’amarrage [9,258,295,296]. Ces interactions sont distinctes des

interactions transitoires qui se produisent entre le site actif d'une protéine kinase et le site

phosphoaccepteur de son substrat. Plusieurs études ont permis d’élucider le rôle des sites

d’amarrage dans l'attachement des MAPKs à leurs activateurs MAPKKs

[107,125,222,256,297-300], aux protéines d'échafaudage [242,301,302], aux facteurs de

transcription [303-309], à des protéines kinases cibles [107,310,311], aux phosphatases

[107,312-315] et à toute autre enzyme [316-318].

Les trois MAPKs majeures phosphorylent leurs substrats sur la séquence consensus (T/S)

P. Plusieurs substrats potentiels contiennent ce motif [23]. Par conséquent, les MAPKs ont

acquis des sites d’amarrage spécifiques pour trier les substrats pertinents avec qui elles

interagissent. Le site d’amarrage principal de ERK est composé d'un groupe d'acides

aminés chargés négativement, conservé de C. elegans à l’être humain (common docking;

CD) [107,258]. Les données sur la structure en trois dimensions de ERK indiquent que le

site CD est localisé sur le côté opposé de la kinase par rapport à la poche catalytique. Les

substrats doivent donc se dissocier du site d’amarrage pour être phosphorylé, ce qui indique

que l'association via le site d’amarrage est très dynamique [319]. Les sites CD dans ERK

lui permettent d’interagir avec une panoplie de protéines, certains sont des substrats,

d’autres des activateurs, des protéines d’échafaudage ou des phosphatases. Le site

d’amarrage dans ces protéines est généralement constitué par un groupe d'acides aminés

chargés positivement (Le domaine D), ce qui permet d’interagir avec le site CD riche en

résidus chargés négativement. Cela implique que l’interaction de ces protéines avec ERK

est mutuellement exclusive, tout en fournissant un mécanisme moléculaire pour l'activation

et l’inactivation séquentielles de ERK.

42

La spécificité d'interaction de ERK avec ses partenaires ne peut pas être déterminée

uniquement par le motif chargé négativement de ERK. En fait, l’échange, par mutation, du

site présent sur ERK par celui présent sur p38 MAPK permet toujours l’attachement de

MEK à ERK et aucune interaction avec MKK6 n’est détectée [107]. Il est donc possible

que la région d'amarrage dans ERK soit contenue dans une zone d'amarrage où plusieurs

motifs d’interaction coopèrent pour conférer un lien fort et spécifique pour chaque

molécule liant la MAPK [319,320]. L'espacement et l’organisation de ces différents motifs

sur les protéines liant les MAPKs seraient à l’origine des spécificités différentielles

observées chez les MAPKs [295].

D'ailleurs, l'état de phosphorylation des protéines associées peut également moduler

l'affinité de l'interaction. Par exemple, l'association de ERK avec son substrat Elk-1 est

renforcée suite à l'activation de ERK [303], tandis que l'interaction de ERK avec son

activateur MEK est réduite après activation du sentier de signalisation [125]. Fait

intéressant, l'interférence avec d'autres voies de signalisation peut être atténuée en régulant

des interactions d'amarrage. Par exemple, dans certains type cellulaire, la tyrosine

phosphatase PTP-SL retient ERK dans le cytoplasme par association via le site d'amarrage

tout en la maintenant sous une forme inactive [321,322]. Après phosphorylation du résidu

Ser231 de PTP-SL par PKA, l'attachement et la déphosphorylation de ERK sont altérés, ce

qui permet son activation et sa translocation nucléaire subséquente.

Il existe deux classes de site d'amarrage sur les protéines substrats ; le domaine D et le

motif FXFP, dont le site d’ancrage sur ERK reste à être déterminée. Une étude

systématique de sites d'amarrage sur Elk-1 indique que le domaine D et le motif FXFP

forment un système modulaire flexible qui a deux fonctions : D’une part, l'affinité d'un

substrat pour ERK peut être régulée par le nombre, le type, la position et l’arrangement de

ces sites. D’autre part, les sites d’amarrage peuvent diriger la phosphorylation vers les

résidus appropriés, comme ceux de la séquence consensus (S/T) P [304,319].

La découverte des sites d’amarrage a fourni de nouveaux outils pour la dérégulation de la

voie ERK. Par exemple, la micro-injection dans le noyau d'un peptide qui comprend le

domaine D de MEK1 interrompt l'association de ERK-MEK dans le noyau et inhibe

43

considérablement l’exportation de ERK hors du noyau [116]. De la même façon, la micro-

injection dans le noyau d'un peptide qui correspond au site d’interaction avec ERK de

p90rsk interrompt l'interaction entre ERK et les phosphatases nucléaires, ce qui augmente le

taux de ERK active dans le noyau [323]. Cette dernière expérience suggère que plusieurs

protéines interagissent avec les MAPKs via des sites d'amarrage très homologues.

La constatation que les sites d’amarrage des MAPKs dans MEKs, Elk-1 et MKPs

concurrencent tous pour la liaison à ERK suggère que chacune des trois classes de

protéines interagit avec ERK sur le(s) même site(s). En accord avec ceci, l’accepteur

commun identifiée dans ERK2 serait en fait la région CD décrites ci-dessus [107,112]. Les

connaissances actuelles sur la localisation subcellulaire de toutes ces protéines indiquent

que MEK1 et MEK2 maintiennent ERK1 et ERK2 dans le cytoplasme en absence

d'activation [125,323-325]. Après activation, ERK se déplace au noyau où elle phosphoryle

Elk-1 et d'autres cibles nucléaires, puis se relocalise au cytoplasme. Comme Elk-1, MKP-1

et MKP-2 sont des protéines nucléaires. Il est donc possible que MKP-1 et MKP-2

concurrencent Elk-1 pour lier ERK activée au noyau. Dans ce cas, les molécules ERK qui

rencontrent Elk-1, ou d'autres substrats physiologiques, seraient temporairement protégées

contre l'action des phosphatases, tandis que les molécules qui ne trouvent pas de cibles

appropriées sont rapidement désactivées. Une étude récente a démontré que la

relocalisation de ERK2 de nouveau au cytoplasme dépend de son attachement à MEK, qui

fait la navette entre le noyau et le cytoplasme [326]. Ainsi, les protéines ERKs qui ont

trouvé une cible nucléaire appropriée peuvent aussi être protégées contre l'exportation

nucléaire médiée par MEK. Ainsi, l'amarrage concurrentiel des substrats et des régulateurs

des MAPKs peut jouer un rôle direct dans la consolidation de la fidélité de signal.

1.5.3. L’inactivation des MAP Kinases

La durée et l'amplitude de l'activation de la MAP kinase représentent l'équilibre entre le

signal et les mécanismes d'inactivation. Tous les deux semblent être influencés par la

44

rétroaction négative déclenchée par le signal activateur en amont de la MAP kinase. Tel

que discuté plutôt, l'activité de ERK est étroitement stimulée par la phosphorylation des

résidus tyrosine et thréonine dans la boucle d'activation. La soustraction d'un ou des deux

phosphates par les tyrosine ou la sérine/thréonine phosphatases ou encore par les

phosphatases à double spécificité diminue nettement l'activité de la MAP kinase. La

spécificité des phosphatases est fortement dictée par la localisation intracellulaire. Ainsi, il

a été difficile de définir clairement leur implication dans la régulation des MAP kinases.

Néanmoins, plusieurs études biochimiques et analyses génétiques ont démontré

l’implication des phosphoprotéine phosphatases de chacune des trois catégories principales

dans l'inactivation des MAP kinases [327,328,328,329].

Schématiquement, l'activation de ERK par les mitogènes lors de la transition G0/G1 du

cycle cellulaire se produit en quatre phases. D'abord une forte activation suivie d’une

inactivation très rapide (quelques minutes). Par la suite, une activation prolongée se produit

avec un maximum qui se situe entre 2 et 4 heures après stimulation. Enfin, l'activation

diminue graduellement et l'activité de ERK est réduite au niveau basal. Considérant que la

déphosphorylation de la thréonine ou de la tyrosine dans le motif TEY de la boucle

d'activation de ERK est suffisante pour l'inactivation enzymatique totale [330], de

nombreuses phosphatases pourraient être impliquées dans les deux phases d'inactivation : la

phase initiale rapide et la phase tardive qui est plus lente.

La sérine/thréonine phosphatase PP2A est impliquée dans la première phase d’inactivation

de ERK observée après quelques minutes de stimulation des cellules NIH 3T3 [331] et des

ovocytes de Xenopus [329]. Le résidu phospho-tyrosine restant semble être modifié par une

phosphatase constitutive. Plusieurs phosphatases spécifiques au résidu tyrosine, telles que

PTP-SL, STEP et He-PTP/LC-PTP démontrent une spécificité envers les MAP kinases

ERKs [320,332-334]. Cependant ces tyrosine-phosphatases cytosoliques semblent présenter

un patron d'expression restreint. Aucune phosphatase exprimée d’une façon ubiquiste et

pouvant jouer le même rôle chez la plupart des cellules n’a été identifiée. Une tyrosine

phosphatase cytosolique de la drosophile, PTP-ER, homologue aux tyrosine phosphatases

mentionnées ci-dessus, joue un rôle important dans la répression de ERK pendant le

45

développement de l’oeil [335]. Toutefois on ne connaît pas si PTP-ER joue un rôle

important dans l'inactivation du premier pic d’activation de ERK.

La phase tardive de l'inactivation dépend de la synthèse de protéines, indiquant que la néo-

synthèse des phosphatases est exigée [331,336]. En plus, ces phosphatases semblent avoir

une spécificité au résidu tyrosine puisqu'elles sont inactivées par le traitement au vanadate

[323,329,331]. Les phosphatases qui possèdent ces critères sont les MAPK phosphatases

(MKPs). Les MKPs appartiennent à la famille des phosphatases ayant une double

spécificité, puisqu'elles sont capables de déphosphoryler les résidus tyrosine et thréonine

des MAPKs [337,338].

Un nombre substantiel de phosphatases à double spécificité est consacré à l'inactivation des

MAP kinases aux temps et aux endroits appropriés [337,339]. Les MKPs sont classées en

deux groupes : Elles sont encodées par des gènes induits par le stress et par des facteurs de

croissance et sont localisées principalement au noyau. Ou alors, elles ne sont pas

ardemment régulées au niveau transcriptionnel et sont situés dans le cytosol. Les deux

classes ont une organisation semblable de leurs domaines : un domaine de régulation N-

terminal et un domaine catalytique C-terminal qui démontre une homologie de séquence

avec la phosphatase à double spécificité VH1 [340]. Les différences dans la localisation et

l'induction impliquent des divergences dans l'inactivation temporelle et spatiale qu'elles

peuvent produire. La spécificité des MKPs semble être différente pour chaque membre de

la famille des MAP kinases [315,341-343].

Certaines évidences indiquent que les MKPs sont de bons candidats pour le contrôle de la

rétroaction négative dans l’activation de ERK. D'abord, on a montré que la production de

MKP1 et MKP2 sont induites au niveau transcriptionnel par l'activation de la voie ERK

[336]. De plus, MKP1 et MKP2 semblent être stabilisées suite à la phosphorylation par

ERK [344]. En fait, MKP1 est phosphorylée sur la Ser359 et la Ser364 par ERK, ce qui ne

modifie en rien son activité phosphatase, mais réduit le taux de sa dégradation par les

protéasomes. Enfin, MKP3 [345,346] et MKP1 [313] sont activées suite à l’attachement de

ERK à leur domaine de régulation via des sites d'amarrage. Par conséquent, la spécificité

46

envers le substrat est assurée par deux moyens : l’interaction protéine-protéine et

l’activation catalytique de la phosphatase.

Le rôle précis de chacune des MKPs in vivo n'est pas encore clair. L'expression de certaines

MKPs est limitée à des compartiments subcellulaires spécifiques, là où elles doivent

couvrir la gamme de substrats disponibles. En plus, certaines phosphatases, telle que MKP1

et MKP2, sont les produits de gènes induits par la voie ERK, alors que d’autres, tel que

MKP3, sont produites passivement à un rythme beaucoup plus lent. Enfin, une MKP peut

être efficace dans l'inactivation de plusieurs MAPKs, fournissant de ce fait une possibilité

de cross-talk avec certaines voies de signalisation alors qu’elle est activée par une voie de

signalisation distincte. En outre, il est probable qu'il y ait redondance entre les MKPs

puisque la suppression du gène MKP1 n'affecte en rien la physiologie de la souris mutante

[347]. De nouvelles approches seraient nécessaires pour évaluer, d’une façon individuelle,

le rôle fonctionnel des MKPs in vivo.

Alors que la déphosphorylation des MAP kinases semble être un moyen d’inactivation

efficace et largement répandu chez tous les membres de la famille des MAPKs, la

phosphorylation peut aussi être un moyen pour arrêter la progression du signal et

l’inactivation des composantes kinases des voies de signalisation. La rétroaction négative

est un phénomène courant dans la voie ERK/MAPK. En effet, ERK semble phosphoryler

plusieurs composants de la voie dont SOS et MEK1/2 ce qui provoquerait la dissociation

des différents modules de la cascade et l’arrêt du signal [348,349].

1.5.4. La régulation de la localisation subcellulaire de ERK

L'organisation spatiale des kinases et de leurs substrats détermine la nature des signaux

transmis et leur destination. En outre, le type et/ou le contexte cellulaire et l’agencement

des protéines de signalisation sont des éléments déterminants qui régissent la distribution et

la localisation intracellulaire adéquates des MAP kinases. Ainsi, une population distincte de

MAP kinases peut répondre, d’une façon spécifique, à un signal extracellulaire.

47

L’agencement des protéines kinase peut se produire grâce à la formation de complexes très

spécialisés, à la concentration d'une MAP kinase à un compartiment unique, tel que la

membrane plasmique, ou encore grâce à la concentration d’une population de MAP kinases

à un compartiment où la diffusion est limitée, tel que les vésicules membranaires ou le

noyau.

Les MAP kinases ERK1 et 2 sont généralement associées au cytosquelette [350,351]. Une

fraction de ERK1 constitutivement active serait associée à la tubuline, alors que ERK2

serait liée aux microtubules via la protéine MAP-2 (microtubule-associated protein 2)

[352]. Les ERKs peuvent aussi se localiser à la membrane plasmique grâce à leur

association avec des composantes membranaires [353,354]. Cependant, leurs formes

actives sont généralement retrouvées dans le noyau [355-357], associées aux kinétochores

et aux asters pendant certaines étapes de la mitose [358,359]. Leur protéine d’ancrage

nucléaire semble être la protéine du centromère CENP-E [359], une découverte

particulièrement intéressante puisque ERKs et p38 MAPKs ont été impliquées dans la

régulation du point de restriction (checkpoint) pendant la phase M du cycle cellulaire

[360,361].

Les mécanismes de ciblage visant les composantes des voies MAPKs sont encore mal

compris et plusieurs stratégies sont possibles. Par exemple, les substrats ou les activateurs

ayant une distribution subcellulaire restreinte peuvent faciliter le recrutement des kinases

par des interactions directes. Par exemple, Ras associée à la membrane plasmique lie RAF

et la recrute à la membrane [44]. D’autre part, la MAP kinase JNK est localisée à des

structures ponctuées le long des microtubules en association avec son activateur, la JNK

kinase kinase MLK2 [362].

La localisation nucléaire semble être essentielle pour la transformation morphologique des

fibroblastes et la différenciation des cellules PC12 [126,363]. Bien que la régulation de la

transcription dépendante de la phosphorylation exige généralement la localisation nucléaire

des kinases appropriées, dans certains cas, les facteurs de transcription peuvent être activés

tandis qu’ils sont encore dans le cytoplasme [364,365].

48

La translocation nucléaire peut se produire via des mécanismes distincts selon la MAP

kinase et le contexte cellulaire. Dans le cas des ERK/MAP kinases, plusieurs événements

peuvent contribuer à la régulation de la quantité de ERK1/2 qui transitent entre le

cytoplasme et le noyau : 1) la séquestration cytoplasmique, 2) l’entrée nucléaire par

diffusion, 3) la phosphorylation et la dimérisation subséquente, 4) le transport actif des

monomères, des dimères, ou des complexes de protéines à travers la membrane nucléaire,

5) l’exportation nucléaire de MAP kinases seules ou dans des complexes et 6)

l’attachement à des sites de rétention au noyau [125,325,326,356,357].

La redistribution intracellulaire des protéines ERKs suite à une stimulation mitogènique se

produit en deux phases. D’abord, il y a entrée rapide mais partielle dans le noyau. Puis,

après plusieurs heures de stimulation, ces ERKs s’accumulent massivement dans le noyau.

Les stimuli non-mitogéniques induisent l'entrée nucléaire initiale de ERK mais ne provoque

pas son accumulation nucléaire [114,323]. Les signaux menant à la différenciation

semblent provoquer une activation prolongée et une accumulation nucléaire de ERK [366].

La rétention artificielle de ERK activée dans le cytoplasme semble être suffisante pour

bloquer la réplication de l’ADN induite par les facteurs de croissance [367] et empêcher la

transformation des cellules [126]. Alternativement, en rétablissant la translocation nucléaire

de ERK dans les fibroblastes sénescents, il est possible de rétablir l'activation de c-fos

[368]. En outre, la rétention cytoplasmique de ERK peut jouer un rôle critique dans le

maintient du phénotype différencié de certains types de cellule. Par exemple, la

surexpression de la protéine PEA15 qui séquestre ERK dans le cytoplasme bloque la

prolifération cellulaire des astrocytes [369]. D’autre part, la β-arrestine semble s’associer

avec ERK dans le cytoplasme et inhiber la transcription [370]. La régulation du module

ERK/MAPK par la séquestration cytoplasmique semble donc être un phénomène fréquent.

La régulation de la translocation nucléaire de ERK serait alors une étape critique pour

générer des réponses biologiques adaptées selon le contexte cellulaire.

Divers groupes de recherche suggèrent que les interactions MEK-ERK jouent un rôle

prédominant dans la redistribution cellulaire de ERK1/2 [112,125,126,326,371]. ERK

s'associe avec MEK dans le cytoplasme des cellules en repos via leurs sites d'amarrage. La

protéine d’échafaudage KSR participerait à cette localisation cytoplasmique du complexe

49

MEK-ERK. La contribution de KSR dans le dégagement de ERK du complexe

cytoplasmique n’est pas claire. Cependant, l'activation de la voie est essentielle, puisque

l’inhibition de l'activité MEK abroge la translocation nucléaire de ERK [357]. D’autre part,

Les mutants ERK constitutivement inactifs migrent au noyau après activation de la cascade

[356,357]. De plus, chez la levure, les mutants inactifs Fus3-GFP migrent au noyau au

même taux que le type sauvage [372]. L’activation des MEKs semble donc suffisante pour

le détachement des ERKs du complexe cytoplasmique.

ERK2 lie également, d’une façon stable, un certain nombre de protéines qui peuvent limiter

son accès au noyau. Par exemple, le détachement, suite à l’activation de la voie

ERK/MAPK, de ERK2 de la phosphatase cytoplasmique PTP-SL serait responsable de

l'accumulation nucléaire de ERK2 [321].

Il est maintenant certain qu'il y a un flux continu de mouvement de ERK entre le

cytoplasme et le noyau. En effet, lorsque des cellules quiescentes sont traitées avec la

Leptomycine B, qui bloque l'exportation nucléaire dépendante de crm-1, ERK apparaît

rapidement dans le noyau [323]. Ceci se produit en absence d'activation de la voie ERK

puisqu'il n'est pas perturbé par le traitement antérieur avec l'inhibiteur U0126 de MEK

[373].

Il semble que plusieurs mécanismes pourraient réguler le taux de transfert de ERK vers le

noyau. Il a été proposé que ERK traverse la membrane nucléaire par diffusion passive car

l’inhibition du trafic nucléo-cytoplasmique actif avec de l'agglutinine n'empêche pas

l'importation nucléaire de ERK [325]. Cependant, chez la levure, le trafic de Fus3-GFP

semble être réduit mais n'est pas complètement inhibé quand le transport nucléo-

cytoplasmique actif est altéré, suggérant l’existence d’un mécanismes de transport actif

dans l’entrée de ERK au noyau. Ce mode de transport n’est pas encore clair car ERK ne

possède pas de motif de localisation nucléaire (NLS) connue. On a également proposé que

ERK se dimèrise et que cette dimérisation favoriserait son entrée au noyau. En effet, les

protéines de fusion ERK-β-galactosidase ne peuvent passer dans le noyau quand les motifs

de dimérisation de ERK sont mutés [325]. Enfin, il a été récemment proposé que le

transport de ERK à travers le pore nucléaire serait propulsé par un mouvement brownien.

50

En effet, chez des cellules perméabilisées, ERK s'associe directement au complexe présent

dans les pores nucléaires et se transfère au noyau indépendamment des facteurs solubles et

de l’ATP. En outre, ERK interagit in vitro avec une région à répétition de FG de la

nucléoporine CAN/Nup214. [374]

L'exportation de ERK hors du noyau n'est pas entièrement comprise non plus. ERK1 et

ERK2 ne présentent aucun motif d'exportation nucléaire et ne devraient pas ainsi être

exportées activement par l'intermédiaire d’un mécanisme dépendant de la protéine Crm-1.

Le blocage de l'exportation nucléaire par Crm-1 avec la Leptomycine B provoque

l'accumulation nucléaire de ERK et de MEK [325,326]. Par conséquent, l'exportation active

de MEK par l'intermédiaire de son NES pourrait être l'un des mécanismes qui conduit ERK

hors du noyau.

Quand l'activation de la voie ERK/MAPK est transitoire, les protéines ERKs sont

rapidement expulsées du noyau [114]. Toutefois lors d’une activation soutenue, elles s'y

accumulent. L'accumulation nucléaire de ERK exigerait une induction rapide et dépendante

de son activité de la transcription de gènes qui codent pour des protéines d’ancrage

nucléaire [357]. L'identité de ces ancres nucléaires demeure inconnue. Toutefois,

l'utilisation d’anticorps anti-phospho-ERK a fourni de nouveaux indices pour expliquer

l’accumulation nucléaire de ERK. En fait, les phosphatases MKP1 et MKP2 semblent être

de bonnes candidates pour la séquestration de ERK dans le noyau car elles possèdent les

caractéristiques d’ancres nucléaires ; leur expression est brève et est stimulée par la voie

ERK/MAPK [336,344], elles sont nucléaires et elles possèdent des sites d'amarrage pour

les MAP kinases ERK1/2. D’autres études devraient dans le futur démontrer le rôle de

MKP1/2 dans l'inactivation et la séquestration nucléaires des MAP kinases ERKs.

1.5.5. Spécificité et intégrité du signal

Les modules MAPKs chez les mammifères sont entrelacés dans un réseau complexe de

cascades signalétiques. L'induction d'une réponse biologique particulière exige souvent plus

51

d'un signal d'entrée. La coordination des voies d'entrée et l'intégration subséquente des

signaux sont requises pour produire un signal de sortie approprié. Pour réaliser ceci, les

modules MAPK utilisent différentes stratégies pour communiquer avec d'autres voies.

Parmis ces stratégies, l’entrecroisement ou cross-talk peut affecter les propriétés

signalétiques et l'effusion de l'information et peut modifier la spécificité des voies

impliquées.

Le cross-talk entre les cascades de signalisation se produit dans de nombreuses voies dans

le but d’intégrer des réponses spécifiques ou des effets modérées. Plusieurs évidences

laissent croire que les MAP kinases ont des spécificités aux substrats qui sont

chevauchantes [8,23]. L’activité résultante des substrats reflète l’enjeu de la

phosphorylation sur les sites régulateurs qui sont partagés par une multitude de protéines

kinases. Tout au long des cascades, les MAP kinases forment des complexes qui facilitent

leur activation et renfoncent leur localisation, leur spécificité, et précise leurs cibles. La

régulation de la formation de ces complexes protéiques fournit un contexte pour le cross-

talk entre les voies de signalisation.

Plusieurs membres de la famille MEK contiennent des sites qui sont phosphorylés par des

kinases d’autres voies. Ces phosphorylation semblent influencer la capacité des MEKs à

interagir dans les complexes [104,375-377]. L'intégration peut se produire aussitôt dans la

voie de signalisation et au sommet du module kinase. Certaines MEKK peuvent réguler

plus qu'une cascade de MAP kinases, de même que plusieurs cascades peuvent être

contrôlées par plusieurs MEKKs distinctes.

Par exemple, un niveau élevé de l’AMPc qui induit l'activation de PKA peut déterminer

quelle isoforme de RAF sera engagée pour stimuler MEK1/2. Chez les fibroblastes Rat-1,

l'activation de c-Raf-1 peut être sélectivement inhibée par des niveaux élevés de l’AMPc

intracellulaire [27,378,379] et la phosphorylation directe de c-Raf-1 par PKA [27]. En

revanche, chez les cellules PC12, B-RAF serait activée par un niveau élevé d’AMPc

indépendamment de Ras [55,380,381]. Chez les cellules LNCaP du cancer de la prostate,

l’AMPc renforce l'activation des MAPKs en réponse à l’EGF [382]. Cette activation est

médiée par la petite GTPase Rap1 qui est sensible à l’AMPc [383] et qui active directement

52

une isoforme B-RAF [28,384]. Ainsi, un niveau élevé d'AMPc et l’activation subséquente

de PKA peuvent changer le cheminement de l’information, résultant dans l'activation

sélective de B-RAF et l'inhibition de c-Raf-1. Ceci suggère que l'AMPc pourrait servir de

commutateur moléculaire pour préciser la spécificité des isoformes dans la cascade des

MAPKs [385,386]. De même, MEK1 peut être sélectivement régulée par la machinerie du

cycle cellulaire. En effet, la phosphorylation de MEK1 (mais pas de MEK2) par la kinase

dépendante de la cycline- 2 (cdk-2) peut réduire son activité kinase [387].

Les modules de MAPK peuvent affecter les propriétés d'autres voies de signalisation. Tel

que mentionné précédemment, JNK peut contrecarrer l'activation du facteur de transcription

NFAT4 par phosphorylation directe [388]. ERK peut répondre à des signaux d'oestrogènes

en phosphorylant son récepteur ER (estrogen receptor) à la sérine 118 [389]. Cette

phosphorylation augmente l’activité transcriptionnelle du récepteur ER induite par

l’œstrogène ou le tamoxifène. Ces observations indiquent que l’attachement de l'oestrogène

et la stimulation de ERK par les facteurs de croissance peuvent coopérer pour une

activation maximale du récepteur de l'oestrogène. ERK interagit également avec la voie de

signalisation JAK-STAT activée par l’interféron alpha/bêta, et la forme dominante négative

de ERK2 peut inhiber l'activation transcriptionnelle d'un gène rapporteur sensible à

l’interféron [390].

Les propriétés signalétiques des modules MAPKs peuvent également être modifiées par des

cascades MAPKs étroitement liées. Par exemple, les petites protéines G, Rac1 et Cdc42,

qui activent normalement le sentier JNK, peuvent coopérer avec RAF pour activer la

cascade ERK [104]. Cette collaboration semble solliciter la protéine kinase activée par Rac

et par Cdc42, PAK1, qui phosphoryle MEK1 sur le résidu Ser298 dans sa région riche en

proline impliquée dans la signalisation [103,391]. Cette phosphorylation semble accroître

l'affinité de MEK1 à Raf-1 et être impliquée dans la migration cellulaire et la réponse aux

signaux mitogéniques qui est dépendante de l’adhérence à la matrice extracellulaire

[104,377,391,392]. PAK3, un membre de la même famille de kinases semble augmenter

l'activité de Raf-1 par phosphorylation directe sur le résidu sérine 338 [62], soutenant

encore le concept de communication par cross-talk. Dans le cas de MEKK1, un effet cross-

talk indirect peut se produire. En fait, MEKK1 semble induire l'expression du gène codant

53

pour la phosphatase MKP-1, atténuant, de ce fait, la signalisation par des cascades MAPKs

hétérologues [389,393].

Il est aussi clair que les modules MAPK en aval peuvent converger. Par exemple, ERK et

p38 MAPK peuvent tous deux activer MNK1 (signal-integrating kinase 1) [394,395] et

MSK1 (mitogen- and stress-activated protein kinase 1) [396]. De même que, la MAPKAP

kinase 3 peut être ciblée par ERK, JNK, et p38 MAPK [397]. En outre, beaucoup de

facteurs de transcription sont régulés par plus qu’une voie MAPK. C’est le cas de Elk-1 qui

peut être activé aussi bien par ERK que par JNK ou p38 MAPK [398-400]. D'autres

facteurs de transcription interagissent avec un sous-ensemble de MAPKs. C’est le cas de

ATF2, qui est régulé tant par JNK que par p38 MAPK [400,401].

Pourquoi les cellules mettraient-elles tant d'efforts dans la génération d'un signal spécifique

si, à l’extrémité des voies, le signal converge sur les mêmes cibles ? Ou comment est-ce

que la spécificité des signaux peut-elle être maintenue quand plusieurs voies utilisent la

même protéine comme cible ultime de la signalisation ? Bien que la compréhension de cette

question soit inachevée, plusieurs mécanismes ont jusqu'ici été identifiés.

D'abord, des modules MAPKs peuvent être liés à certains effecteurs d'une façon spécifique

au type cellulaire. Ceci a été suggéré dans une étude récente qui démontrait que, chez les

cellules PC12, ERK mais pas JNK active c-Jun pour induire le développement neuronal

[113]. Cependant, chez d'autres lignées cellulaires, c-Jun est sélectivement régulée par JNK

[402,402,403,403], suggérant que des facteurs additionnels spécifiques au type cellulaire

peuvent déterminer quel module MAPK activerait c-Jun.

Ensuite, les cibles qui sont communes à tous les modules MAPKs seraient impliquées dans

la régulation de fonctions cellulaires courantes, telles que la régulation de la traduction.

Cette notion est soutenue par l'observation que MNK1, une kinase qui est un substrat

commun de ERK et de p38 MAPK, peut phosphoryler eIF4E (eukaryotic translation

initiation factor 4E) à un site physiologiquement approprié, affectant probablement de ce

fait le déclenchement de la traduction [395].

54

Finalement, les cibles communes qui sont en aval des MAPKs peuvent également

acheminer des signaux d'entrée uniques à un module MAPK pour générer des réponses

biologiques qui sont discrètes.

1.6. L'organisation différentielle des signaux transmis

via la voie ERK/MAPK.

L'amplitude et la durée de l'activation de ERK peuvent être affectées à plusieurs points dans

cette cascade de signalisation et sont régulées par un équilibre découlant de l’activation par

les kinases et l’inactivation par les phosphatases. L'importance et la durée des signaux

dérivés de MEK1-ERK1/2 seraient déterminantes dans l'issue physiologique finale des

cellules.

Le système expérimental qui illustre le mieux ceci est le modèle de

différenciation/prolifération des cellules cultivées du phéochromocytome 12 de rat (PC-12).

Ces cellules prolifèrent en réponse au facteur de croissance épidermique (EGF), alors que

l’exposition au facteur de croissance neuronal (NGF) ou au facteur de croissance

fibroblastique (bFGF) cause la différenciation des cellules marquée par l’immaturation

neuronale et l’arrêt de cycle cellulaire en G1. La réponse différentielle est en grande partie

régie par la prédisposition du NGF, mais pas le EGF, de provoquer l'activation soutenue de

ERK1/2 et leur translocation au noyau. Cette activation prolongée peut durer pendant

plusieurs heures et semble être nécessaire pour maintenir l’état différencié des cellules

[404-408]. À l’encontre des effets observés chez les cellules PC-12, l’activation soutenue

de ERKs chez les fibroblastes mène à la croissance et à la transformation des cellules.

Cependant, dans les deux cas, la translocation nucléaire de ERK se produit seulement en

réponse à l'activation prolongée. Ceci suggère que les événements ultimes responsables de

la différenciation des cellules PC-12 ou la prolifération des fibroblastes impliquent la

phosphorylation de cibles nucléaires.

55

Au-delà de cela, et sans compter leur organisation temporelle, les interactions spécifiques

enzyme/substrat médiées par les protéines d'échafaudage et d’ancrage peuvent contrôler la

séquestration et l’organisation subcellulaire des composantes signalétiques. Ainsi est née la

notion de la fonction cellulaire à trois dimensions (cellomic fonction) des modules de la

signalisation MAPK. L'organisation différentielle des signaux, qu’elle soit spatiale et/ou

temporelle, pourrait expliquer les effets physiologiques et pathologiques observés chez

différents types cellulaires et chez les organismes mammifères.

1.6.1. La différenciation

Comme chez les cellules PC12, un rôle important a été attribué à la voie ERK/MAPK dans

la différenciation des cellules sanguines. L’expression de MEK1 constitutivement active

(caMEK1) dans deux lignées de cellules humaines d'érythroleucémie, K562 et CMK, mène

à l'inhibition de la croissance des cellules, l’induction de morphologie caractéristique des

mégacaryocytes et l’expression à la surface des cellules de l'intégrine-αIIbβ3, un récepteur

d'adhérence spécifiquement exprimé chez les plaquettes [409,409,410,410,411,411]. En

outre, l'expression des gènes de la globine chez les cellules K562 est bloquée par une

activité élevée du module MEK1-ERK1/2 et est dérégulée par l’inhibition de MEK [412].

Ceci suggère que ce module de signalisation favorise la différenciation des mégacaryocytes

en même temps qu'il supprime la différenciation d'érythrocytes. D'ailleurs, les résultats

obtenus chez des souris sans fonction ERK1 ont démontré que son activité est requise pour

la différenciation des thymocytes double positifs CD4+ CD8+ en simple positif et pour la

prolifération [413].

Ces MAPKs semblent également être impliquées dans la régulation de différentes étapes de

la différenciation du muscle squelettique. Chez les myoblastes C2C12 et en absence de

mitogènes, des gènes spécifiques aux muscles tels que MyoD et myogenin sont exprimés

[414,415]. L'inactivation de la voie ERK/MAPK semble être impliquée dans la myogenèse

des myoblastes C2C12. En fait, la surexpression de la phosphatase MKP1 est suffisante pour

56

interférer avec l'activité ERK2 endogène et la croissance des myoblastes. Cependant,

l’expression de MKP1 endogène décline dans les myotubes différenciés et multi-nucléaires

[67]. Cette diminution dans l’activité phosphatase pourrait être nécessaire pour la formation

de myotube plus tard pendant la myogenèse. Des études de transfection, utilisant caMEK1

et MEK1 dominante négative chez les cardiomyocytes ventriculaires de rat, ont indiqué que

MEK1 peut induire un patron d'expression de gènes caractéristiques des cellules

hypertrophiques [416].

Des approches expérimentales indépendantes utilisant des lignés cellulaires provenant de

rein canin de Madin-Darby (MDCK) suggèrent que l’activation soutenue de ERK2 mène à

la dédifférenciation épithéliale, à l’échec de la morphogenèse et à l’apparition chez ces

cellules d'un phénotype fortement invasif. En effet, chez les cellules MDCK-C7Focus

(C7F) alcali- dédifférenciées, la réduction de l'expression de la protéine ERK1 et la

stimulation de l'activité basique de ERK2 par le sérum sont associés à une conversion

stable du phénotype mésenchymateux des cellules. D’autre part, l’expression stable d'un

mutant caMEK1 chez les cellules MDCK-C7 (cellules C7caMEK1) a comme conséquence

des changements phénotypiques prononcés semblables à ceux obtenus chez les cellules

C7F, y compris l'acquisition d'une morphologie fibroblastique, la réduction de l'expression

des cytokeratines, la surexpression de la vimentine et l’assemblage de fibres de stress

d’actine caractéristiques du muscle lisse α [417,418].

De plus, les cellules dédifférenciées (C7F aussi bien que C7caMEK1) étalées sur collagène

ne peuvent pas reproduire les structures épithéliales et se comportent en tant que cellules

fortement invasives [419]. Par ailleurs, l'inhibition de MEK induit un étalement prononcé

des cellules C7caMEK1 et réduit nettement leur invasion dans la matrice de collagène. En

conclusion, le phénotype trans-différencié et les propriétés invasives de ces cellules

transfectées caMEK1- MDCK-C7 sont reflétées par la la baisse du niveau d’expression de

protéines qui sont cruciales pour les jonctions d’adhérence d’actine comme la E-cadherin et

les α- et β-catenin [420]. L’ensemble de ces résultats suggère que cette activation soutenue

du module MEK1-ERK1/2 représente un mécanisme de signalisation important impliqué

dans la trans-différenciation des cellules épithéliales tubulaires en myofibroblaste. Les

57

cellules épithéliales tubulaires pourraient jouer un rôle pathophysiologique dans les

maladies rénales qui sont associées aux altérations dans la différenciation et/ou la

prolifération des ces cellules, tel la fibrogenèse ou la carcinogenèse rénales. Cependant,

parce l’activation de MEK1 et de ERK1/2 mène à la différenciation de certaines cellules

nerveuses, des mégacaryocytes, et des thymocytes mais induit la dédifférenciation des

cellules épithéliales rénales, les réponses (patho) physiologique lié au module signalétique

MEK1/2-ERK1/2 serait spécifiques au type cellulaire.

1.6.2. La signalisation entre la prolifération et l'arrêt de la

croissance

L’idée, que la divergence dans la fonction du module de signalisation ERK/MAPK est

spécifique au type cellulaire, est encore appuyée par les résultats obtenus à partir

d’expériences faites chez les fibroblastes. L’expression des mutants caMEK1/2, par

exemple, semble transformer les fibroblastes et induire la formation de tumeurs chez les

souris nues [421,422]. La stimulation de ce module de signalisation intracellulaire est non

seulement liée aux altérations de la différenciation cellulaire mais également à la régulation

de la prolifération cellulaire. Pagès et collaborateurs ont été les premiers à prouver que

l'activation de ERK est essentielle pour l’entrée des fibroblastes en phase G0 du cycle

cellulaire [423]. La prolifération est inhibée par l’expression d’une forme dominante

négative de ERK1 ou d'ARN ERK1 anti-sens dans les fibroblastes CCL39. La coexpression

du type sauvage ERK1 renverse ces effets. Plus tard, d’autres études ont rapporté que

l’expression de la forme dominante positive de MEK1 stimule ERKs et accélère la

prolifération. Les inhibiteurs de MEK ou la transfection de phosphatase MKP1 active

empêchent la prolifération cellulaire induite par les mitogènes. L’ensemble des résultats

suggère qu’il existe des liens importants entre la voie ERK/MAPK et le cycle cellulaire. En

fait, les signaux dérivant de cette voie peuvent influencer la croissance cellulaire par

l'intermédiaire de plusieurs mécanismes.

58

D’ailleurs, ERK2 serait essentielle au contrôle de la synthèse de nucléotide, la première

étape dans la production de l'ADN et de l'ARN, en contrôlant directement l'activité de la

carbamoyl-phosphate synthétase II (CPSII) [424]. Cette enzyme est importante dans la

synthèse de novo des nucléotides pyrimidique. ERK2 induit la phosphorylation de CPSII et

son activation subséquente par le phosphoribosyl-pyrophosphate.

De plus, ERK1 et ERK2 semblent accroître la traduction protéique en stimulant la capacité

du facteur de la traduction eIF4E à recruter des ribosomes et autres facteurs d’initiation de

la synthèse protéique aux ARNm [425]. Cet effet peut être médié par la phosphorylation de

facteurs de traduction par des protéines kinases qui sont activées par ERK1/2 [425,426]. En

outre, ERKs favorisent la croissance cellulaire via la phosphorylation de facteurs de

transcription. La phosphorylation de plusieurs facteurs de transcription par ERKs augmente

leur niveau de transcription, ce qui augmente alternativement la production de protéines et

facteurs nécessaires à la croissance cellulaire. D’autre part, les ERKs peuvent également

faciliter la transcription en changeant la structure de la chromatine. Des substrats de

ERK1/2 tels que Rsk-2 et MSK-1 et -2 phosphorylent l'histone H3, l'histone H1, et HMG-

14 (high-mobility group-14) [427-431]. Bien que la fonction exacte de ces événements de

phosphorylations ne soit pas connue, il semble qu’elle améliore l'accessibilité de l'ADN aux

facteurs de transcription ou q’elle permet le recrutement des enzymes de modification.

Finalement, le cycle cellulaire est lui-même influencé par la voie de signalisation

ERK/MAPK. ERK augmente la transcription du gène de la cyclin D1 et facilite également

la formation de complexes actifs cycline D1/ CDK4 [432-434]. Ceux-ci phosphorylent la

protéine rétinoblastoma (rb) [435,436], menant au déplacement de ces protéines et des

histones déacétylases, ce qui a comme conséquence l'activation des gènes régulés par le

facteur de transcription E2F au point de restriction. E2F favorise l'expression de la cyclin A

et de la cyclin E vers la fin G1 [437]. Ces cyclines, à leur tour, s'associent à CDK2 et

favorisent la réplication de l’ADN et la croissance cellulaire. En outre, l'entrée dans la

phase S est favorisée par la dégradation protéolytique de l'inhibiteur p27Kip1 à la fin de la

phase G1, et le dégagement du complexe cycline E-CDK2 de l'inhibition [438-441]. Aussi,

il a été montré que p27 peut être phosphorylée in vitro par ERK et que cet événement de

phosphorylation peut jouer un rôle dans la dégradation de p27 et/ou réguler sa capacité de

59

lier CDK2 [438,442]. Ainsi, la voie MEK/ERK n’agit pas seulement au niveau

trancriptionnel pour induire le gène de la cyclin D mais aussi au niveau posttraductionnel

pour réguler l’assemblage de la cycline D avec CDK4 et empêcher l’effet inhibiteur de

p27kip1 [432].

En plus de fonctionner comme un régulateur positif dans la progression du cycle cellulaire,

la stimulation de la voie ERK/MAPK peut également induire l'arrêt du cycle cellulaire chez

les fibroblastes [443,444]. Ces événements sont associés avec l'induction dépendante de

ERK1/2 de l'inhibiteur de CDK2, p21WAF1/Cip1 [443,445]. L’induction de p21WAF1/Cip1 a été

rapportée pour se produire non seulement par voie transcriptionnelle dépendante de p53,

mais aussi par des mécanismes indépendants de p53 par l'intermédiaire de l’activation de

ERK [444,446,447]. Bien que l'activité ERK soit associée à l'induction de la cyclin D1 et

de p21WAF1/Cip1, plusieurs études ont montré que, contrairement au processus d’activation de

la cycline D1, la décision cellulaire à induire p21WAF1/Cip1 dans la phase G1 du cycle

cellulaire serait en grande partie dicté par l'importance, plutôt que la durée, du signal ERK

[127,443]. Ainsi une activation soutenue de MEK1-ERK1/2 pourrait mener à l’arrêt de la

croissance via l'induction à long terme de p21WAF1/Cip1, alors que l'activation biphasique

mais moins robuste de la voie ERK/MAPK pourrait principalement mener à la prolifération

et à la croissance des cellules. À cet égard, il est intéressant de noter que, chez les cellules

C7caMEK1, l’expression accrue de la cycline D serait liée à une prolifération réduite des

cellules [418,420]. Une forte activation de ERK1/2 chez ces cellules pourrait mener à une

expression forte et persistante de p21WAF1/Cip1, atténuant de ce fait la progression de cycle

cellulaire en dépit de l'expression accrue de la cycline D1.

60

1.7. Le projet de recherche

1.7.1. Mise en contexte

Le laboratoire du Dr Charron du centre de recherche en cancérologie de l’Université Laval

a généré par mutagenèse d’insertion une souris sans fonction MEK1 [77]. L’absence de

protéine MEK1 chez les souris homozygotes pour la mutation cause la mort des embryons

entre les jours 10 et 11 de la gestation. L’analyse histopathologique des embryons a permis

de montrer que les embryons sont normaux. Cependant, MEK1 est essentiel au

développement normal du placenta. Les embryons mutants sont incapables de vasculariser

le labyrinthe, une région du placenta où les sinus maternels (aire de la circulation sanguine

maternelle) se retrouve à proximité des vaisseaux sanguins de l’embryon pour faciliter les

échanges gazeux et nutritionnels. La caractérisation détaillée du phénotype placentaire a

permis de montrer que la néovascularisation n’est pas affectée chez les embryons mutants.

Cependant, les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins chez les mutants s’accumulent

à la frontière du labyrinthe suggérant plutôt un problème d’angiogenèse [77].

L’angiogenèse implique la digestion de la matrice extracellulaire pour remodeler les tissus

et permettre la migration, la prolifération et la différenciation des cellules endothéliales

nécessaires à la production de nouveaux vaisseaux [448]. Plusieurs facteurs de croissances

et cytokines stimulant la mobilité et l’angiogenèse ont été identifiés, les FGFs (fibroblast

growth factors), les EGFs (endothelial growth factor) et les VEGFs sont les plus

caractérisés [449]. Des études ont montré que la voie ERK/MAPK est impliquée dans la

migration induite par les matrices extracellulaires. Les récepteurs membranaires à activité

tyrosine kinase et les intégrines sont des éléments essentiels de la cascade intracellulaire

des MAPKs visant la régulation de l’expression génique et de l’organisation

cytosquelletique nécessaires à la migration cellulaire [450].

61

Figure 1-6 : MEK1 est impliquée dans la signalisation intracellulaire menant à la

migration des fibroblastes embryonnaires de souris.

Panneau du haut : Essai le migration en chambre de Boyden : Les MEFs Mek1 type

sauvage ou mutants sont mis au repos pendant 24h puis testés pour leur capacité à migrer à

travers une membrane en polycarbonate recouverte de BSA (contrôle), de collagène ou de

fibronectine. Les photos : Images en contraste de phase des MEFs Mek1 type sauvage ou

mutants 90 min après avoir été mis au repos et étalés sur sur diverses matrices; BSA,

collagène ou fibronectine. Panneau du bas : Niveau de phosphorylation de ERK2 chez les

MEFs Mek1 type sauvage (mek1+/+) ou mutants (mek -/-) en suspension (sus) ou étalés sur

fibronectine (fn). Tiré de la référence [77].

62

L’utilisation de fibroblastes embryonnaires (MEFs) de type sauvage ou mutant pour le gène

Mek1 a permis de montrer que la migration induite par la fibronectine est réduite chez les

MEFs Mek1-/-alors que la migration induite par le collagène n’est pas affectée (figure 1-5)

[77]. La migration induite par la fibronectine peut être restaurée chez les cellules mutantes

par la transfection de vecteur d’expression MEK1 [77]. Ces résultats montrent que

l’induction de la migration par la fibronectine est dépendante de la fonction MEK1.

Cependant ERK1 et ERK2, les substrats de MEK1 et MEK2, sont activés chez les MEFs

Mek1-/- induits par la fibronectine suggérant donc que MEK2, toujours présent dans les

MEFs Mek1-/- pourrait activer ERK1 et ERK2, et que MEK1 serait impliquée dans la

migration via l’activation d’un substrat encore inconnu.

D’autres travaux qui sont en cours dans le laboratoire du Dr Charron suggèrent que la cause

principale de la mort des embryons Mek1-/- serait une morphogenèse anormale de la

barrière de syncytiotrophoblastes (ST) (Bissonauth et Charron, en préparation). Cette

couche de ST constitue la barrière ultime entre le sang fœtal et le sang maternel. Chez les

individus de type sauvage, les précurseurs de ST semblent prendre leur origine dans des

petits amas de cellules au niveau du chorion vers E8.5, lorsque l’allantois fusionne avec le

chorion. Ces précurseurs s’invaginent ensuite dans le chorion pour donner éventuellement

une barrière de cellules entre le sang fœtal et le sang maternel. Chez le placenta Mek1-/- par

contre, bien que les cellules souche ST apparaissent normalement à E8.5, elles n’arrivent

pas à envahir le chorion et se retrouvent plutôt en amas à la jonction chorion-allantois. De

plus, des essais de phosphatase alcaline, d’immunofluorescence et de microscopie

élecronique suggèrent que certains de ces précurseurs Mek1-/- se différencient en ST mais

restent toujours bloqués à la jonction chorion-allantois (Bissonauth et Charron, en

préparation). D’autre part, des expériences d’analyse Western faits à partir d’extraits

protéiques totaux de placentas Mek1-/- montrent que MEK2 n’arrive pas à remplacer MEK1

pour l’activation de la voie ERK/MAPK. En outre, des essais d’immunohistochimie

utilisant des anticorps anti phospho-MEK1/2 et anti phospho-ERK1/2 montrent que MEK2

est phosphorylée de façon ubiquiste au niveau du chorion Mek1-/- mais n’active pas ERK.

(Bissonauth et Charron, en préparation). L’ensemble de ces résultats suggère une fonction

divergente entre MEK1 et MEK2 au niveau des syncytiotrophoblastes placentaires.

63

Récemment, il a été démontré que la voie de signalisation MAPK/ERK peut mener à

l’activation de protéines intracellulaires responsables de la mobilité [450]. Plusieurs

nouvelles protéines d'échafaudage ayant un rôle important dans la voie MAPK ont été

trouvées [260,262,277]. De nouveaux substrats de MEK1, autres que ERK1 et ERK2,

existeraient d’après deux récentes recherches [451,452], indiquant que la voie dépendante

de MEK1 serait plus complexe que celle que l'on connaît aujourd’hui.

1.7.2. Hypothèse de travail

En tenant compte de ces recherches et à la lumière de l’ensemble des résultats obtenus dans

notre laboratoire, notre hypothèse de travail est qu’il y aurait une voie de signalisation

spécifique à MEK1 qui pourrait ne pas impliquer la protéine kinase MEK2 ni les seuls

substrats connus de MEK1 et 2, ERK1 et ERK2. Les protéines kinases MEK1 et MEK2

pourraient être différemment régulées selon le contexte cellulaire et l’issue physiologique

finale imposée par le signal extracellulaire. En d’autres mots, l’activité de MEK1 pourrait

être dépendante de la formation d’un complexe protéique composé de MEK1, de son

activateur (Raf ou autre) et d’un substrat encore inconnu. L’existence de nouveaux

substrats spécifique à MEK1 impliquerait vraisemblablement une nouvelle voie de

signalisation menant à une réponse cellulaire spécifique tel que la migration cellulaire. En

outre, la présence d’un cross-talk entre le sentier ERK et une voie de transduction qui est

médié par MEK1 n’est cependant pas exclue des mécanismes possibles menant à une

réponse cellulaire spécifique. De plus, grâce à des protéines d’échafaudage spécifiques,

MEK1 pourrait être incluse dans un complexe protéique différent de celui impliqué dans la

réponse aux mitogènes et/ou se localiser à des compartiments cellulaires différents.

64

1.7.3. Objectifs du projet

Les MAP kinases de la famille ERK sont impliquées de façon importante dans la

transmission des signaux émis par les facteurs de croissances, les hormones, et divers types

de stress. Elles font partie d’une cascade de signalisation dont leurs activateurs les plus

précoces sont les MAPKKs, MEK1 et MEK2. Mon projet de doctorat portait sur la

caractérisation de la fonction de MEK1.

Les objectifs spécifiques du projet étaient :

1. De démontrer que l’activation de MEK1 et MEK2 pouvait être spécifique à certains

agonistes.

2. De caractériser les mécanismes sous-jacents à cette spécificité.

Dans cette optique, j’ai étudié le comportement de la voie ERK, chez les fibroblastes

embryonnaires de souris mutants pour le gène Mek1, en réponse à divers stimuli,

notamment des facteurs de croissance, des cytokines et des hormones. J’ai observé que

MEK1 mais non pas MEK2 était nécessaire à l’activation de ERK par la bombésine. Ces

résultats vont dans le même sens que ceux des travaux antérieurs faits dans notre

laboratoire et qui démontraient que MEK2 n’active pas ERK chez les trophoblastes

embryonnaires de souris. Afin de caractériser les mécanismes possiblement impliqués dans

ces réponses différentielle, j’ai utilisé l’approche double hybride et fait une étude

approfondie des interactions de MEK1 ou mutants de délétion MEK1 avec d’autres

protéines, notamment Raf, ERK et MEK1 elle-même. Par des études de délétions et

d’interaction protéiques, j’ai pu démonter que MEK1 interagit avec Raf via sa région C-

terminale et que cette même région est impliquée dans une interaction intramoléculaire

MEK1-MEK1. Je me suis, alors, particulièrement intéressé à caractériser le rôle et les

mécanismes de cette interaction intramoléculaire.

Chapitre 2

2. Étude de la signalisation ERK/MAPK chez les fibroblastes embryonnaires de souris Mek1-/-

[MEK1 vs MEK2 est activée par la bombésine chez les MEFs Mek1-/-]

Nizar Chetoui, Michel Tremblay, Sophie Roy et Jean Charron

Les travaux présentés dans ce chapitre font partie d’un projet en cours dans le laboratoire

du Dr Jean Charron au centre de recherche en cancérologie de l’Université Laval.

L’ensemble des résultats obtenus dans ce projet fera l’objet d’une publication. J’ai participé

à la réalisation du projet à plusieurs niveaux, tout particulièrement les essais d’activation de

la voie ERK/MAPK par la bombésine présentés dans la figure 2-5 de ce chapitre. Les

résultats présentés dans les figures 2-3 et 2-4 ont été obtenus par Michel Tremblay, alors

assistant de recherche au laboratoire.

66

2.1. Résumé

La voie de signalisation ERK/MAPK fait partie d’un ensemble de voies de transduction des

signaux à l’intérieur de la cellule qu’on appelle les voies MAP kinases. La voie ERK joue

un rôle majeur dans la prolifération cellulaire, mais elle est aussi impliquée dans la

différenciation, la mobilité et l’apoptose cellulaires. L’issue physiologique de la cellule est

déterminée par la force et la durée de l’activation de la voie ERK/MAPK. Ainsi, elle

dépenderait du type cellulaire, de la nature des agonistes et des récepteurs qui déclenchent

le signal et des caractéristiques des composantes signalétiques qui interviennent dans la

transmission du signal à l’intérieur de la cellule. La voie ERK/MAPK est activée par une

grande panoplie de stimuli extracellulaires qui sont transmis aussi bien via les récepteurs à

activité tyrosine-kinase que via les récepteurs transmembranaires couplés aux protéines G

et les intégrines. Ici, nous montrons que, chez les fibroblastes embryonnaires de souris

(MEF), le neuropeptide bombésine active la voie ERK/MAPK et que cette activation

requiert l’implication de la MAPKK, MEK1, mais pas celle de son homologue MEK2. En

effet, la stimulation, par la bombésine, des MEFs mutants pour le gène Mek1 ne semble pas

induire l’activation de ERK. En outre, la réexpression, chez ces MEFs, de transgènes Mek1

rétablie l’activation de ERK. Par contre, la surexpression de MEK2 n’a aucun effet sur la

voie ERK en réponse à la bombésine. D’autre part, la caractérisation des domaines

protéiques impliqués dans cette réponse spécifique suggère que la séquence riche en

proline, présente dans la région C-terminale de MEK1, est impliquée dans l’activation de

ERK par la bombésine. L’ensemble de nos travaux fournit ainsi un excellent modèle pour

l’étude des divergences fonctionnelles des MAPKKs MEK1 et 2 et pour la caractérisation

du rôle unique de MEK1 dans la voie de signalisation ERK/MAPK.

67

2.2. Introduction

La bombésine fait partie d’un groupe de neuropeptides mitogènes, dit bombesin-like

peptides ou bombésine/GRP, dans lequel on retrouve aussi la gastrine et la

cholécystokinine (CCK) [1]. La bombésine a été décrite comme un facteur de croissance

autocrine dans le cancer des petites cellules du poumon chez l’humain [2]. La bombésine

est un tétradecapeptide qui se lie aux récepteurs transmembranaires couplés à Gq. Chez les

cellules 3T3, qui ont souvent été employées comme système d’étude, elle induit la synthèse

d'ADN et la prolifération cellulaire [3]. Différentes voies de transduction du signal ont été

suggérées pour médier les effets de la bombésine [2,4,5]. La nature de la voie de

signalisation transmettant une réponse à la bombésine semble être dépendant du contexte

cellulaire. Différentes GTPases peuvent être impliquées, mais ces dernières ne semblent pas

être requises chez certains types cellulaires [3,6]. Les premières études menées par

Rozengurt et collaborateurs ont identifié la protéine kinase PKC comment étant un élément

important dans la transmission des signaux intracellulaires médiés par les neuropeptides

bombésine/GRP [7-9]. Des études ultérieures ont indiqué le rôle majeur de la voie

ERK/MAPK dans la prise en charge des signaux provenant de PKC et/ou des GTPases en

réponse à la bombésine/GRP [10-14].

La bombésine lie les récepteurs couplés aux protéines G hétérotrimèriques,

particulièrement ceux du sous-type bombésine/GRP (Figure 2-1) [15]. L’attachement au

récepteur est suivi par l’activation de la phospholipase C et la production des seconds

messagers, l’inositol-1,4,5-trisphosphate et le diacylglycérol, ce qui mène à la mobilisation

du calcium intracellulaire et l’activation de la protéine kinase C [6]. En outre, la

sensibilisation du récepteur de la bombésine peut mener à l'activation des protéines kinases

FAK, JNKs et S6 kinases [16-19]

La bombésine active les MAP kinases ERKs dans divers tissus et cellules telles que les

fibroblastes Swiss 3T3 [3,20,21], les fibroblastes Rat1 [10], les acini pancréatiques de rat

[11,22], les cellules du muscle lisse du rectosigmoïde de lapin [23] et dans la lignée de

cellules STC-1, qui sont des cellules entéroendocrines qui secrètent la CCK

68

(cholecystokinin) [12]. La bombésine semble induire une activation soutenue de ERK1 et 2

chez les cellules Swiss 3T3 [3,5] via une voie de signalisation qui est dépendante de Gq et

de PKC [3] et qui ne semble pas impliquer Ras ou l’activation de Raf-1 [3,24]. Cette voie

se distingue de celle induite par Gi et les récepteurs RTK, qui implique l'activation de Raf-1

via Ras/GTP. Le ou les mécanismes précis par lesquels les isoformes de la famille PKC

activent les MAP kinases ERKs ne sont pas encore clairs [25].

Cependant, Ras peut aussi être impliquée dans l'activation des MAP kinases ERKs par les

récepteurs couplés à Gq [26]. Le contexte cellulaire dans lequel la voie ERK est activée

devient alors un élément important dans la compréhension du rôle de la bombésine dans

divers processus cellulaires [10,27,28]. En effet, chez les cellules Rat-1 dans lesquelles on a

introduit le récepteur de la bombésine/GRP, la bombésine induit l'activation de ERK via

une voie indépendante de PKC mais dépendante de Ras [10,29]. Ces données démontrent

que le même récepteur peut activer la cascade ERK/MAPK via des voies distinctes, et ce

dépendamment du contexte cellulaire (Figure 2-2).

Récemment, on a proposé que, chez certaines cellules (e.g., HEK 293 et PC12), les signaux

via Gβγ et Gα peuvent converger pour favoriser la mobilisation du Ca2+ d’une manière

dépendante du PLC et menant à la stimulation de Pyk2 (proline-rich tyrosine kinase 2) et

l’activation de c-Src (Figure 2-2) [27,30-32]. Src mène alors à l'activation des MAP kinases

via la phosphorylation d’adaptateurs moléculaires, tels que Shc, sur des résidus tyrosines. Il

est donc possible que la transactivation du récepteur de EGF ait lieu via les agonistes des

récepteurs GPCRs et que cela mènerait à l'activation du module Raf-MEK-ERK via

l’activation de la GTPase Ras [33-35]. Ceci dit, les études faites sur cette voie restent

controversées [36]. En effet, on a également montré que l'activation de ERK via certains

GPCRs semble exiger l'endocytose du récepteur [37], reliant ainsi la signalisation du

récepteur à son internalisation subséquente[30].

69

Figure 2-1 : Schéma général de la signalisation induite par la bombésine

La voie ERK/MAPK est une des voies de signalisation induites par la bombésine. Tiré de la

référence [6].

70

Les deux MAPKKs de la voie ERK/MAPK, MEK1 et MEK2, démontrent une forte

homologie de séquence dans leur domaine kinase. Par contre, la région N-terminale ainsi

que la région riche en proline particulière à ces MAPKKs sont très divergentes

(respectivement, 66% et 36% d’identité). Cette divergence ainsi que plusieurs études

récentes suggèrent que MEK1 et MEK2 auraient des fonctions distinctes. Les souris sans

fonction MEK1 meurent in utero suite à une déficience placentaire alors que MEK2 ne

semble pas être importante pour le développement et la croissance [38,39].

Nos travaux indiquent que, chez les fibroblastes embryonnaires de souris, la signalisation

induite par la bombésine emprunte une voie spécifique à MEK1 au dépend de son

homologue MEK2. Alors que la plupart des facteurs de croissance testés ne présentent pas

cette spécificité, l’effet bombésine s’est présenté comme un moyen intéressant pour étudier

la divergence fonctionnelle entre MEK1 et MEK2. Ainsi, nos résultats suggèrent que la

région C-terminale de MEK1 médie l’activation de ERK par la bombésine. Nous proposons

que la séquence riche en proline présente dans cette région soit à l’origine de cette

spcificité.

71

Figure 2-2 : Activation de la voie ERK/MAPK via Gi et Gq.

Importance du contexte cellulaire dans l’acheminement du signal jusqu’au module

RAF/MEK/ERK de la voie de signalisation ERK MAP kinase. Tiré de la référence [6].

72

2.3. Matériels et méthodes

Culture cellulaire et Stimulation

Les MEFs MEK1 sont maintenues à 37°C dans du milieu DMEM (Dulbecco’s modified

Eagle’s medium) avec 10% de sérum foetal bovin (FBS) dans une atmosphère humide

contenant 5 % de CO2. Pour préparer les cellules aux différents essais de stimulation, deux

procédures différentes ont été suivies quant à leur prolifération et leur mise au repos. Dans

la première procédure, les cellules sont étalées à raison de 5 à 7.5 105 cellules par pétri de

35 mm. Après 24 h d’incubation dans du milieu DMEM-FBS 10%, les cellules sont mises

au repos dans du milieu DMEM-FBS 0.1% pendant 24h. Dans la deuxième procédure, les

cellules sont étalées dans des pétri 35 mm à 1-3 105 cellules par pétri et incubées pendant

7–9 jours jusqu’à confluence et quiescence. Les MEFs sont ensuite lavés deux fois avec du

milieu DMEM dépourvu de sérum, conditionnés à 37°C pour environ 10 minute et ensuite

traités avec les agonistes tel qu’indiqué. La stimulation est terminée en plaçant les pétris sur

de la glace, en aspirant le milieu et en solubilisant les cellules dans in 0,3 ml de tampon de

lyse froid (20 mM Tris {pH 7.5}, 10 % glycérol, 5 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 % Triton

X-100, 2 mM ß-glycérolphosphate, 50 mM NaF, 10 µM Na3VO4, 5 mM DTT, 10 µg/ml

leupeptin et 0.2 mM PMSF). Les lysats cellulaires sont ensuite clarifiés par centrifugation à

14,000 rpm pour 10 min à 4°C. Les surnageants sont transférés dans de nouveaux tubes et

conservés à -70 °C.

Immunopurification de ERK2 et essai kinase

Les extraits cellulaires clarifiés sont incubés pendant une heure avec des anticorps anti

ERK2 (Obtenue du laboratoire du Dr. John H. Grose) puis encore une heure en présence de

billes de protéine A-Sépharose. Après immunoprécipitation, les billes sont lavées 3 fois

avec le tampon de lyse puis récupérées dans le tampon kinase (20 mM Tris {pH=7.5}, 10%

glycérol, 120 mM pNPP, 30 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 1 µM leupeptin, 100

µM ATP, 3 µCi [γ32P] ATP, 1 µg of MBP (Cell Signaling Technology, Pickering, ON)).

73

Les réactions kinase ainsi amorcées sont effectuées à 30oC pendant 20 min et ensuite

arrêtées par ajout de tampon TEX (SDS-loading buffer). Les protéines sont ensuite séparées

par SDS-PAGE et les protéines MBP phosphorylées sont détectées par autoradiogramme.

Immunodétection

Après SDS-PAGE, les protéines sont transférées sur des membranes PVDF (polyvinylidene

difluoride). Pour la détection des protéines, les membranes sont bloquées avec 3% de lait

déshydraté dans du tampon PBS (phosphate buffered saline) {pH 7.5} puis incubées

pendant 1 h avec les anticorps appropriés dilués dans le tampon PBS {pH 7.5} contenant

1% de lait déshydraté. Les anticorps primaires fixées sur les bandes immunoréactives sont

visualisés par la détection de la chemiluminescence (ECL+) des anticorps secondaires

conjugués à la HRP (horseradish peroxidase).

Essais d’activité de ERK1 et ERK2

L’activation de ERK1 et ERK2 se produit par la phosphorylation des résidus thréonine et

tyrosine de la boucle d’activation. Ainsi, ces protéines phosphorylées migrent plus

lentement que les formes non phosphorylées sur un gel dénaturé SDS-PAGE [40]. Ces

formes activées sont détectées soit par l’utilisation d’anticorps anti-ERK2 dans un essai de

retardement ou par l’utilisation d’anticorps antiphospho-p44/p42mapk (New England

Biolabs, Beverly, MA) qui ne reconnaissent que les formes activées de ERK1 et ERK2.

74

2.4. Résultats

La voie ERK n’est pas activée chez les MEFs Mek1-/-traités à la bombésine

Dans le but de mieux comprendre l’implication de MEK1 dans la transmission des signaux

via la voie de signalisation ERK/MAPK, nous avons observé, chez les MEFs Mek1-/-, le

niveau d’activation de cette voie en réponse à différents stimulis et inducteurs connus.

Ainsi, l’absence de MEK1 ne semble pas affecter l’activation de la cascade ERK/MAPK

lorsque les cellules sont traitées avec PDGF, EGF, LIF, HGF (Figure 2-3a et b), la

thrombine ou encore le VEGF (données non présentées). MEK2, qui est toujours présente

chez les MEFs Mek1-/-, phosphoryle et active ERK et semble ainsi compenser la perte de

MEK1. Par contre, lorsque les cellules sont traitées avec le neuropeptide bombésine, la

perte de MEK1 semble empêcher la progression du signal vers le module ERK (Figure 2-

3c). Ainsi, ERK1 et ERK2 ne semblent pas être activées par MEK2 en réponse à la

bombésine. L’ensemble de ces résultats indique que la bombésine génère une cascade de

signalisation spécifique à MEK1 chez les fibroblastes embryonnaires de souris. Nos

résultats corroborent ceux obtenus avec la lignée de fibroblastes Swiss 3T3 et qui

démontraient que l’activation de ERK par la bombésine est spécifiquement médiée par

MEK1 [3].

La bombésine induit la voie ERK via MEK1

Pour confirmer le rôle unique de MEK1 dans la réponse à la bombésine, nous avons

analysé l’activation de la voie ERK/MAPK chez les MEFs Mek1-/- dans lesquels nous

avons réexprimé MEK1 ou surexprimé MEK2 (Figure 2-4). Nos résultats indiquent que la

réintroduction d’un transgène Mek1, qui permet la production de la protéine MEK1 à

seulement 10% du niveau normal présent dans les MEFs, peut rétablir l’activation de la

voie ERK/MAPK en réponse à la bombésine. La surexpression à l’aide d’un transgène

Mek2 à de très hauts niveaux, allant jusqu’à 380% du niveau d’expression de Mek2

endogène, ne peut restaurer l’activation de la voie ERK/MAPK.

75

La région riche en proline de MEK1 médie l’activation de la voie ERK par la bombésine

La région riche en proline qui est unique à MEK1 et MEK2 mais qui est divergente dans sa

composition primaire se trouve dans la région C-terminale de ces protéines et est décrite

comme élément important dans la fonction signalétique de MEK1 et MEK2 (voir la région

MSS dans le chapitre 1 pour détails). Pour déterminer si cette région est essentielle à la

spécificité de MEK1 en réponse à la bombésine, nous avons réexprimé dans les MEFs

Mek1-/- une protéine chimérique MEK2/1 formée de la région N-terminale de MEK2 (a.a 1-

116) et la région C-terminale de MEK1 (a.a 117-393). Tel qu’indiqué dans la figure 2-4, la

présence de MEK2/1 chez les cellules sans fonction Mek1 rétablit l’activation du sentier

ERK par la bombésine. Ces résultats suggèrent que la région C-terminale de MEK1 médie

la spécificité de la réponse cellulaire à la bombésine.

La confluence cellulaire serait importante pour l’induction de la voie ERK par la

bombésine

Nos essais d’activation de la voie ERK par la bombésine ont démontré que la confluence

des MEFs serait importante pour l’activation adéquate de la voie ERK/MAPK. En effet,

nous n’avons pu observé l’activation de la voie ERK/MAPK par la bombésine lorsque nous

avons repris les expériences de stimulation des MEFs Mek1-/-. Les MEFs Mek1-/- aussi bien

que les MEFs de type sauvage ne semblent pas répondre à la bombésine, bien que la

réponse aux facteurs de croissance tel que EGF ou au sérum semblait être normale (données

non présentées). Nous avons alors repris les essais d’induction en utilisant un nouveau

protocole de mise en culture des cellules et de stimulation (voir section Matériels et

méthodes pour comparer les deux protocoles). Alors qu’au premier protocole, les MEFs

cultivés n’atteignent généralement pas la confluence, au deuxième prototole, ils sont

maintenus à confluence pendant plusieurs jours. Nos résultats indiquent que, dans ces

nouvelles conditions de culture, les MEFs de type sauvage répondent bien à l’induction par

la bombésine (Figure 2-5). Ces données suggèrent, que la bombésine est plus susceptible

d’induire l’activation de la voie ERK/MAPK chez les cellules qui atteignent la confluence

que chez celles qui ne sont pas confluentes. Le rôle de la confluence cellulaire dans la

76

réponse à la bombésine n’est pas clair. Cependant, il est possible que, chez les MEFs,

l’expression des récepteurs de la bombésine soit régulée en fonction de la confluence

cellulaire et/ou dépendante de la présence de facteurs mitogéniques qui sont produits par les

MEFs en état de confluence.

Par ailleurs, l’activation de la voie ERK/MAPK par la bombésine semble atteindre son

seuil maximale au bout de 5 min de stimulation et s’estomper rapidement de telle sorte qu’à

15 min, il y a perte totale d’activation (Figure 2-5). La réponse cellulaire à la bombésine

chez les MEFs, tout comme celle de EGF, semble être brève et rapide.

Les MEFs Mek1-/- meurent en condition de confluence prolongée

Plusieurs lignées MEFs Mek1-/- qui ont fait l’objet des essais de stimulation par la

bombésine décollaient du fond du pétri après 4 à 5 jours d’incubation ce qui suggère que

ces cellules ne tolèrent pas des niveaux élevés de confluence ou qu’elles tolèrent moins

l’épuisement de sérum dans le milieu de culture. D’autre part, les lignées MEFs Mek1-/-

stables chez lesquelles nous avons réintroduit un transgène Mek1 présentent la même

défaillance et décollent aussi après une incubation prolongée sans apport de sérum.

L’absence de MEK1 chez les MEFs serait-elle la cause de cette défaillance? L’expression

du transgène Mek1 est sous le contrôle d’un promoteur CMV, ce dernier est un promoteur

fort mais qui est sensible à l’absence de sérum (Aubry et Charron, résultat non publié). Il

est donc possible que l’expression de transgène Mek1 soit faible chez les MEFs cultivés

plusieurs jours sans apport de sérum. Échanger le promoteur CMV par un autre promoteur

insensible à l’absence de sérum, tel que le promoteur RSV, pourrait être une alternative

pour mieux comprendre le rôle de MEK1 dans la prolifération et la survie des MEFs

lorsque cultivés à une forte confluence.

77

Figure 2-3

78

Figure 2-3 : Altération de la signalisation induite par la bombésine chez les MEFs

mutants pour le gène mek1.

Les MEFs Mek1 de type sauvage (Mek1+/+ ; 10126) ou mutants (Mek1-/-, 10124 ou 13187)

sont étalés sur des pétris 35 mm à raison de 5-7.5 x 105 cellules par pétri et maintenus

pendant 24 heures en milieu contenant 10% de FBS. Ils sont ensuite mis au repos en les

incubant dans un milieu ne contenant que 0.1 % de FBS pendant encore 24 heures. (a) Les

fibroblastes sont induits par le sérum foetal de veau FCS (fetal calf serum), ou par les

facteurs de croissance PDGF ou EGF pendant 5 min. Les concentrations utilisées sont

indiquées. L’activation de la voie ERK/MAPK est détectée par le niveau de

phosphorylation de MBP dans un essai kinase in vitro. (b) Les fibroblastes sont stimulés

par la cytokine LIF (leukemia inhibitory factor) ou le facteur de croissance HGF

(hepatocyte growth factor) avec les concentrations ou les dilutions indiquées pendant 5

min. Les niveaux de phosphorylation de ERK1/2 sont détectés en utilisant des anticorps

anti phospho-ERK1/2. (c) Les fibroblastes MEK1 sont induits par la bombésine en utilisant

les concentrations indiquées pendant 5 min. Les niveaux de phospho-ERK1/2 sont détectés

avec les anticorps dirigés contre ERK1/2, du fait que les formes phosphorylées et non

phosphorylés de ERK1/2 migrent différemment sur un gel de polyacrylamide dénaturé. ctl ;

cellules non traitées. L’induction au FCS a servi de contrôle positif pour le niveau

d’activation de la voie ERK/MAPK.

79

Figure 2-4

80

Figure 2-4 : La signalisation induite par la bombésine est spécifique à MEK1.

Les MEFs Mek1 de type sauvage ou mutants (Mek1-/-) sont étalés sur des pétris 35 mm à

raison de 5-7.5 x 105 cellules par pétri et maintenues pendant 24 heures en milieu contenant

10% de FBS. Ils sont ensuite mis au repos dans un milieu ne contenant que 0.1 % de FBS

pendant encore 24 heures jusqu’à quiescence. Les fibroblastes sont ensuite induits par des

concentrations variables de bombésine (tel qu’indiqué, 5 ou 10 ng/ml) ou par 20 % de FBS

qui a servi comme contrôle positif de l’activation de ERK2. ctl ; cellules non induites.

MEK2/1 signifie une protéine chimérique formée de la région N-terminale de MEK2 (a.a

1-116) fusionnée à la région C-terminale de MEK1 (a.a 117-393).

81

Figure 2-5

ERK1-p

ERK2-pα-pp ERK1/2

α- ERK1/2

Bombésine (µM) 0 FBS5 10 50 10 10

ERK2-pERK2

ERK1-pERK1

Induction (min) 5 3 15 5

ERK1-p

ERK2-pα-pp ERK1/2

α- ERK1/2

Bombésine (µM) 0 FBS5 10 50 10 10

ERK2-pERK2

ERK1-pERK1

Induction (min) 5 3 15 5Induction (min) 5 3 15Induction (min) 5 3 15 5

82

Figure 2-5 : Activation de la voie ERK/MAPK en réponse à la bombésine chez les MEFs

Mek1 confluents

Les MEFs Mek1 de type sauvage (10126) sont étalés sur des pétris 35 mm à raison de 105

cellules par pétri puis incubés pendant 7–9 jours jusqu’à confluence et quiescence. Les

fibroblastes sont ensuite induits, tel qu’indiqué, avec des concentrations variables de

bombésine et pour des temps variables d’induction. Le taux d’activation de la voie

ERK/MAPK est détecté de deux façons ; par l’utilisation d’anticorps anti ERK1/2 (panneau

du haut) ou par l’utilisation d’anticorps anti phospho-ERK1/2 (panneau du bas). La

stimulation par le FBS à 20% a servi de contrôle positif.

83

2.5. Discussion

La compréhension des mécanismes permettant des réponses biologiques spécifiques est une

des issues majeures dans la transduction des signaux intracellulaire. Cette compréhension

ne pourrait être parfaite que par l’illustration des voies de transduction utilisée par un

agoniste distinct et par la désignation des composantes impliquées dans une réponse

cellulaire particulière. Plusieurs mécanismes favorisant une telle réponse ont été proposés :

Elle résulterait d’une force et/ou d’une durée spécifique de l'activation de la cascade

conventionnelle. Elle résulterait de la combinaison de signaux ou de cascades multiples tel

que le cross-talk. Enfin, seulement quelques composantes d'une cascade seraient

spécifiquement activées et être ainsi impliquées dans la production d'une réponse

particulière.

Il est ainsi plausible que, chez les mammifères, MEK1 et son homologue MEK2 pourraient

jouer des rôles distincts dans la cascade ERK pour réaliser des fonctions uniques.

D'ailleurs, beaucoup d'observations indiquent des différences fonctionnelles entre MEK1 et

MEK2. Par exemple, seulement MEK1 est activée chez les cellules Suisse 3T3 en réponse

à la bombésine et chez les macrophages stimulés par le TNFα [3,41].

Dans nos travaux, nous avons montré que la signalisation induite par la bombésine

emprunte une voie spécifique à MEK1 au dépend de son homologue MEK2. Alors que

plusieurs facteurs de croissance testées dans notre étude ne présentent pas cette spécificité,

l’effet de la bombésine sur la voie ERK/MAPK s’est présenté comme un moyen intéressant

pour étudier la divergence fonctionnelle entre MEK1 et MEK2 et mieux définir les voies de

signalisation qui mènent à des effet biologiques uniques.

La voie de signalisation conventionnelle Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 activée par des signaux

mitogéniques tels que EGF ou PDGF ne semble pas présenter une divergence fonctionnelle

entre les modules homologues MEK1 et MEK2 ou ERK1 et ERK2. Cette voie, dite

proliférative, pourrait être considérée comme une voie principale dont l’issue pourrait être

84

modulée par des voies annexes plus spécifiques et qui font appel à d’autres modules de

signalisation et au phénomène de cross-talk entre les différentes voies de signalisation.

La divergence fonctionnelle entre MEK1 et MEK2 telle qu’observée dans le cas de la

l’induction par la bombésine, pourrait être une alternative à la voie de signalisation

conventionnelle Ras-ERK. Elle suggère l’existence de chevauchement entre plusieurs voies

de signalisation via le module MEK. Ce module formé de deux protéines, bien que très

homologue et généralement équivalent de point de vue fonctionnel, permettrait dans un

contexte unique de médier une réponse spécifique.

L’élément ou la séquence protéique dans MEK1 qui semble médier la réponse spécifique à

la bombésine se retrouverait dans la région C-terminale. Nos résultats indiquent que la

réexpression d’une protéine chimérique MEK2/1; (a.a 1-116)/MEK1 (a.a 117-393), dans

les MEFs Mek1-/- rétablit l’activation de ERK. La région C-terminale, tout particulièrement

le domaine riche en proline ou MSS (MEK specific sequence), semble jouer un rôle

essentiel dans la régulation de l’activité catalytique de MEK1 et MEK2. Le MSS qui se situ

approximativement entre les résidus 270 et 310 semble prendre part à la modulation de

l’activité de MEK1 ainsi qu’au cross-talk du sentier ERK avec d’autres voies de

signalisation. En fait, cette région semble être le site d’interaction de MEK1/2 avec les

membres de la famille Raf et être importante pour l’activation de ERK et l’attachement de

certaines protéines d’échafaudage tel que MP-1 [42-45]. Elle contient de multiples sites de

phosphorylation pour plusieurs protéines kinases, dont PAK1, cdk5 et ERK [46-49]. PAK1

phosphoryle spécifiquement MEK1 sur le résidu Ser298, ce qui permet le cross-talk entre

le sentier ERK et la voie Rac-cdc42. Cette phosphorylation serait nécessaire pour générer

des réponses cellulaires particulières telles que la migration et la prolifération cellulaires

dépendantes de l’adhérence à la matrice extracellulaire [50-52]. L’absence d’un site de

phosphorylation de PAK1 dans MEK2 indique que MEK2 ne peut répondre à des signaux

provenant du sentier Rac/cdc42 et qu’il n’est donc pas impliqué dans le cross-talk avec

cette voie de signalisation.

Le rôle de la confluence cellulaire dans la réponse à la bombésine n’est pas clair.

Cependant, il est possible que, chez les MEFs, l’expression des récepteurs de la bombésine

85

soit régulée en fonction de la confluence cellulaire et/ou dépendante de la présence de

facteurs mitogèniques. Alors que les mécanismes d’induction de la voie ERK/MAPK par

les récepteurs RTKs soient largement identifés, ceux des récepteurs GPCR semblent être

très variés et plus complexes. En effet, plusieurs voies de signalisation peuvent coopérer

pour l’activation du module Raf-MEK-ERK de la voie ERK/MAPK. Ces voies

impliqueraient différentes composantes signalétiques dépendamment du contexte cellulaire

(le type cellulaire, l’adhérence à la MEC, etc.) et de la réponse cellulaire recherchée [53-

55].

Nos résultats fournissent de nouvaux arguments quant au rôle unique que pourrait jouer

MEK1 dans la cascade ERK/MAPK et son importance pour accomplir certains processus

cellulaire spécifique. Alors que, dans un organisme, chaque cellule est exposée

physiologiquement aux multiples agonistes tels les facteurs de croissance, les hormones et

les cytokines, il paraît clair que la nature de la voie transmettant le signal soit susceptible de

dépendre des signaux extracellulaires qui rentrent en contact avec la cellule. Ce concept est

propice au développement de drogues qui sont spécifiques à des composantes signalétiques

uniques et qui tiennent compte de la nature du signal et de la réponse cellulaire que ce

dernier engendre. Ainsi, il a été proposé que MEK1 serait une bonne cible pour des drogues

ou d'autres agents capables d'empêcher la transformation cellulaire [56]. L’utilisation de

drogues spécifiques à MEK1 pourrait inhiber des processus cellulaires spécifiques qui

dépendent de MEK1, sans pour autant toucher à la voie proliférative qui elle sera

maintenue par MEK2.

86

2.6. Références

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Chapitre 3

3. Identification et caractérisation d’un domaine

d’interaction phospho-dépendant dans MEK1 et MEK2

Ce chapitre fait l’objet d’un manuscrit préparé en vue d’une publication. Ce manuscrit a été

écrit avec les résultats découlant de mes travaux. J’ai effectué l’ensemble des figures. J’ai

également écrit la première version du manuscrit et contribué à cette version.

Dans le chapitre précédant, nous avons montré que les protéines MEK1 et son homologue

MEK2 n’ont pas nécessairement des propriétés signalétiques redondantes. Les résultats

obtenus montraient clairement que l’activation de la voie ERK MAP kinase par la

bombésine fait appel à MEK1 et que MEK2 n’est pas impliquée dans ce processus. De

plus, nous avons montré que la région C-terminale de MEK1est à l’origine de la spécificité

de la réponse à la bombésine.

Dans le présent chapitre, nous avons tenté de caractériser les raisons sous-jacentes à cette

spécificité de MEK1. Par le biais du système double hybride, nous avons procédé à une

étude systématique visant à identifier des protéines pouvant intéragir d’une façon

spécifique avec MEK1. L’ensemble de nos résultats suggère un rôle essentiel à la région C-

terminale de MEK1 dans la régulation de son activité et de sa localisation cellulaire.

93

3.1. Résumé

MEK1 et MEK2 sont deux kinases à double spécificité qui sont homologues et qui agissent

au niveau MAPKK dans la voie de signalisation ERK/MAPK. Ces MAPKKs contribuent,

de manière distincte, à la régulation de l’activité de ERK. La région C-terminale de MEK1

et de MEK2 semble jouer un rôle essentiel dans la régulation des interactions protéiques et

la distribution cytoplasmique des protéines MEKs. La région riche en proline typique de

MEK1 et MEK2, présente en C-terminal, semble être importante dans l'interaction avec la

kinase Raf-1 et la régulation de l'activité de ERK. En outre, la région C-terminale de MEK1

contient des sites de phosphorylation unique qui peuvent augmenter ou atténuer son activité

intrinsèque. En particulier, la phosphorylation du résidu Ser298 par PAK-1 semble régler la

formation de complexes MEK1-ERK spécifiques et l'activation de la voie ERK/MAPK par

les intégrines. Par le biais du système double hybride chez la levure, nos travaux

démontrent que la région C-terminale de MEK1 interagit avec la région de la boucle

d'activation. Cette interaction semble être de nature intramoléculaire puisque les protéines

MEKs ne semblent pas former de dimères. Par ailleurs, la phosphorylation de MEK1 sur

les sites Ser218 et Ser222 de la boucle d'activation empêche cette interaction, suggérant que

cette dernière est dépendante de l'état d'activation de MEK1. La perturbation de cette

interaction par la délétion de la région C-terminale n'est pas suffisante pour augmenter

l'activité catalytique de MEK1. En outre, la phosphorylation de la boucle d'activation est

toujours requise pour l’activation de MEK1 indiquant que la région C-terminale n’est pas

un domaine d’autoinhibition. Nous proposons que cette interaction reflète une variation

conformationnelle entre l’état actif et inactif de MEK1 qui peut être importante pour la

régulation des interactions MEK1 et MEK2 avec leurs substrats, activateurs ou leurs

protéines d'échafaudage.

3.2. Article

CHARACTERIZATION OF PHOSPHO-DEPENDENT INTERACTING DOMAIN

OF MEK1 AND MEK2 PROTEINS

Nizar Chetoui and Jean Charron*

Centre de recherche en cancérologie de l’Université Laval, Centre Hospitalier

Universitaire de Québec, L’Hôtel-Dieu de Québec, Québec, QC, Canada, G1R

2J6.

* Corresponding author. Mailing address:

Centre de recherche de L'Hôtel-Dieu de Québec,

9 rue McMahon, Québec, QC, Canada, G1R 2J6.

Phone: (418) 525-4444 ext 15557. Fax (418) 691-5439.

E-mail: [email protected].

mailto:[email protected]

95

3.2.1. Abstract

MEK1 and MEK2 are two homologue dual specificity kinases that act at the MAP kinase

kinase level in the ERK/MAPK signaling pathway. They have distinct ways to contribute to

a regulated ERK activity. It was previously shown that the C-terminal region of MEK1 and

MEK2 may function in regulating protein-interaction and were necessary for regulating the

cytoplasmic distribution of MEK proteins. The MEK C-terminal region contains a proline-

rich region that seems to be important in regulating interaction with the Raf-1 kinase and

ERK activities. In addition, the C-terminus of MEK1 contains phosphorylation sites that

may either sustain or attenuate MEK1 activity. Particularly, Ser298 phosphorylation by

PAK-1 kinase has been suggested to regulate the formation of a specific MEK1-ERK

signaling complex and the activation of the ERK/MAPK signaling pathway by integrins.

Here, using the yeast Two-hybrid system, we show that the carboxyl-terminal end of

MEK1 and 2 interact with the activation loop. This interaction seems to be intramolecular

since no interaction was observed between MEK proteins. Furthermore, phosphorylation of

MEK1 at Ser218 and Ser222 in the activation loop prevents this interaction indicating that

this interaction may depend on the activation state of MEK. Elimination of this interaction

by truncation is not sufficient to activate the catalytic activity of MEK. Moreover,

phosphorylation of the activation loop is still required indicating that this interaction does

not act as an intramolecular inhibitory interaction modulated by phosphorylation of the

activation loop. We propose that the intramolecular interaction reflects a conformational

adjust between the active and inactive states that may be important to regulate MEK protein

interactions with substrates, activators or scaffolding proteins.

96

3.2.2. Inroduction

The MAP kinase signaling pathways consist in protein kinase cascades linking extracellular

stimuli to various targets scattered in the cytoplasm, the cytoskeleton, the membrane and

the nucleus [1,2]. There are at least three distinct MAPK signaling pathways in mammals

including the extracellular signal-regulated kinases (ERKs), the c-Jun N-terminal kinases

(JNKs) and the p38 MAPKs [3]. These kinases are activated in cascades by

phosphorylation on both threonine and tyrosine residues in the regulatory TXY loop present

in all MAP kinases. This phosphorylation is carried out via distinct upstream dual-

specificity MAP kinase kinases (MAPKKs). The classical pathway, that appears to be the

major one in growth factor signaling, uses MAP kinase or ERK-activating kinases (MEK;

MAPKK) and ERK isoforms (MAPK) and is also named the ERK/MAP kinase-signaling

pathway.

In mammals, the MAPKKs constitute a small family of related proteins that activate the

MAPKs. However, only MEK1 and MEK2 are known participants in the ERK/MAP kinase

cascade [2]. MEK1 and MEK2 distinguish themselves by the presence of a proline rich

region call MEK specific sequence (MSS) between the kinase domain IX and X [4,5]. This

region is involved with the interaction of MEK1 and MEK2 to its activators and is required

for efficient activation of its substrats [5]. The only identified substrates of MEK1 and

MEK2 are the MAP kinase ERK1 and ERK2 even if another substrate such as a Golgi-

associated ERK was suggested [6,7].

The mechanisms of regulation of MEK1 and MEK2 activity are not completely understood.

RAFs, MOS, PAK1, MEKK1, cyclin B-CDC2, CDK5 and ERKs proteins are able to

phosphorylate MEK but only RAFs and Mos lead to phosphorylation of Ser 218 and 222 in

the activation loop and activation of the ERK/MAP kinase [8-10]. MEKK1 seems to

phosphorylate Ser 218 and Ser 222 without significant activation of the MAP kinase ERK2

[8-10]. Moreover, A-RAF, Mos and PAK phosphorylate only MEK1 suggesting divergent

mechanisms of regulation of the MEK1 and MEK2 activities [11,12]. The site of PAK1

phosphorylation in MEK1 is Ser 298. The phosphorylation of Ser 298 by PAK1 does not

97

regulate MEK1 activity but prime MEK1 for activation by Raf-1. The phosphorylation of

MEK by Cyclin B-CDC2 and CDK5 at Thr 286 represses MEK activity [13,14]. In the case

of cyclin B-CDC2, the regulation of MEK activity also involves a cyclinB-CDC2

dependent proteolytic cleavage of the N-terminal ERK docking site [13]. The major

phosphorylation site of ERK on MEK are Thr 292 and Thr 386 but their role in regulation

of MEK activity are not clear [12,15]. More recently, the phosphorylation of Ser 212 of

MEK has been shown to be involved in the negative regulation of MEK activity [16].

Yeast two-hybrid system, as well as genetic screen, has allowed the identification of other

MEK partners involved in the regulation of its activity or in its activation. These are Grb10,

KSR (kinase suppressor of ras-1) and MP1 (MEK partner 1) [17-22]. The scaffolding

protein MP1 has been reported to facilitate the specific interaction and activation of ERK1

by MEK1 whereas KSR associates independently with RAF and MEK to facilitate the

phosphorylation of MEK by RAF [18,23]. Grb10 can bind RAF1 and MEK1; however the

binding to MEK1 seems to require the phosphorylation of Thr 386 by ERK [17-20,22,24].

Finally, the Rac-PAK pathway has been shown to be involved in the activation of the

MAP/ERK kinase cascade by regulating the formation of a specific MEK1-ERK signaling

complex, which is dependent on phosphorylation of Ser 298 by PAK, a site exclusively

present in MEK1 [25]. The regulation of ERK/MAP kinase signaling involved a cascade of

phosphorylation that is facilitated by specific molecular interaction with activators,

substrates and adaptor or scaffolding proteins.

In the present study we show using the yeast two-hybrid system that two non-contiguous

regions of MEK1 and MEK2 proteins can interact together. One of the regions corresponds

to the activation loop whereas the second is located at the carboxyl-terminal end of MEK.

This interaction has also been observed in mammalian cells and seems to be dependent on

the phosphorylation state of the protein. Our results suggest that this interaction is

intramolecular. However, the elimination of this interaction by truncation is not sufficient

to activate the catalytic activity of MEK. Phosphorylation of the activation loop is still

required indicating that this interaction does not act as an intramolecular inhibitory

interaction modulated by phosphorylation of the activation loop.

98

3.2.3. Experimental procedures

Yeast two-hybrid Assays

The yeast strain used in this study is S. cerevisiae L40 (MATa trp1 leu2 his3 LYS2 : lexA-

HIS3 URA3 : lexA-lacZ). Yeast strain was grown in rich medium (1% yeast extract, 2%

Bacto-Peptone, 2% glucose, and 0.1 mg/ml adenine) or in synthetic minimal medium with

appropriate supplements as described by Gietz et al. [26]. Yeast cells were transformed by

the lithium acetate method as described in [26]. A human MEK1 cDNA BamHI-BglII

fragment of a kinase dead form of MEK1 (S218A/S222A; kindly provided by Dr K.L.

Guan) coding for amino acid 1 to 362 was inserted in frame into the BamHI site of pFBL23

vector in order to generate a fusion protein in amino-terminus of the DNA binding domain

(DBD) of LexA (MEK1 C362 AA-DBD LexA vector; Figure 1; [27]. Two hybrid

screening of 3.5 x 106 primary transformants from a mouse brain cDNA library fused to

the transcriptional activation domain (AD) of GAL-4 (Clonetech #ML4008AH) were

performed as previously described in [27]. Briefly, L40 cells were transformed with the

MEK1 C362 AA-DBD LexA vector. Yeast transfectants were isolated in minimal medium

without Trp then the cDNA libraries were transfected in this population and selected in

minimal medium without Trp, Leu and His but supplemented with 1 mM 3-amino-1,2,4-

triazole (3-AT) for a week at 30oC.

β-galactosidase activity assay was performed on positive clones, essentially as described in

[26]. Briefly, the positive colonies were replicated on minimal medium without Trp and

Leu and grown for 3 to 5 days. The colonies were lift off on nitrocellulose filter and lysed

by freeze/thaw procedure. The filter soaked into the X-gal staining buffer was incubated at

30oC. Blue color in a few hours is indicative of β-galactosidase activity. The strength of

interaction between the two proteins is determined in term of intensity of staining and time

to reveal the staining. His+/LacZ+ clones were grown in minimal medium -Leu for 48 hrs.

The cells were lyzed in 200 µl of lysis buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM

EDTA, 2% (v/v) Triton X-100 et 1% SDS) containing 200-600 µm glass beads using 3

cycles of freeze (10 sec) / thaw (90 sec at 37oC) / vortex (1 min). The plasmid DNA was

99

recovered from the supernatant by ethanol precipitation and introduced into HB101 LeuB-

allowing selection for the cDNA library vector in minimal medium without Leu. Primary

positive clones analyzed were confirmed for targeted specificity by co-transformation with

different LexA DNA-binding domain fusions (lamine and Hsp27; kindly provided by Steve

Charette and Jacques Landry). Clones containing MEK1 specific interacting proteins were

further analyzed. The length of the cDNA inserted was determined and the sequence

established.

Mammalian expression vectors

Wild-type, constitutively active and inactive MEK1 expression vectors were obtained for

various sources. Recombinant Flag-MEK1 wt (pCMV-Tag2-MEK1 wt; Flag-tagged at

NH2-terminus) was kindly provided by Drs A. Colanzi and V. Malhotra (University of

California, San Diego, CA), whereas constitutively active and inactive MEK1 mutant

S218/S222A, (AA), S218/222D (DD) and S218E/S222D (ED), which are HA or Glutamic

acid-tagged, were kindly provided by Dr R. Erikson (Harvard University, Cambridge, MA),

Dr H.L. Guan (University of Michigan, Ann Arbor, MI) and Tom Moss (Université Laval,

Québec, Canada). The hamster ERK-HA tagged expression vector was provided by Dr J.

Landry (Université Laval, Québec, Canada [28]. pCMV-Tag2-MEK1 AA , DE or DD were

obtained by exchange of restriction enzyme fragment in pCMV-Tag2-MEK1 wt by the

corresponding fragment carrying the constitutively active and inactive mutation. MEK1 C-

terminal deletion mutants C380 wt, AA and DD were generated by PCR using the 5' primer

5'-CAGCGGGCAGCTCAT-3' and the 3' primer 5'-

AAGCTTTTAGCCGATGGTGGAGCA-3'. The 3' primer contains a stop codon after the

triplet encoding the amino acid 380 of MEK1 and a HindIII site. A BsgI-HindIII fragment

encoding the amino acid 242 to 380 was isolated from the PCR product and cloned in

pCMV-Tag2-Mek1 wt, AA and DD vectors between the BsgI-HindIII sites in order to

interrupt the translation of MEK1 protein after amino acid 380 in the pCMV-Tag2-Mek1

C380 wt, AA and DD vectors. The pEGFP-HA-MEK1 N324 expression vector was

generated by the insertion of the HA-N324 encoding sequence, which has been isolated

100

from a yeast two-hybrid cDNA library clones identified during the yeast two-hybrid screen

(Figure 1), in the pEGFP-C2 mammalian expression vector (Clonetech Laboratories Inc.).

The pEGFP-HA control vector was generated by transferring only the HA epitope tag from

the cDNA library vector (pACT11, Clonetech Laboratories Inc.).

Cell culture and transfection

HEK 293 cells were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)

supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 100 units of penicillin, 100 µg of

streptomycin and 2 mM glutamine (Invitrogen, Burlington, ON). Cells were transfected at

70 to 80% confluence. Transfections were performed by the calcium phosphate method in

culture dishes coated with polylysine as described [29] and analyzed 40 to 48 hours after

transfection. When specified the cells were serum starved 24 hours before harvesting by

replacing the medium by DMEM containing only 0.1% of FBS.

Coimmunoprecipitation assays

HEK 293 transfected cells were harvested 40 hours after transfection in 400 µl of hypotonic

lysis buffer ( 20 mM Tris {pH7.5}, 2 mM MgCl2, 2 mM EGTA, 10mg/ml leupeptin and 10

mM PMSF) or MGM lysis buffer (20 mM Tris {pH 7.5}, 10 % glycerol, 150 mM NaCl, 5

mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 2 mM MgCl2, 50 mM NaF, supplemented by

10 µg/ml leupeptin and 10 mM PMSF) for ERK or MEK coimmunoprcipitation,

respectively. Extracts were clarified at 14,000 X g for 20 min at 4oC. Protein extract from

one 60mm diameter tissue culture dish were incubate with 8 µg of monoclonal anti-Flag

antiserum M2 (Sigma-Aldrich Inc. # F3165; Oakville, ON) for 2 hours at 4oC. Then 40µl of

protein A-Sepharose (50% vol/vol; Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC) was added

and the incubation prolonged an additional hour. Immunoprecipitates (IP) were washed

three times with 200 µl of hypotonic lysis buffer, resuspended in SDS-PAGE sample buffer

and resolved by SDS-PAGE. Gels were transferred to nitrocellulose and probe with

monoclonal anti-HA antiserum HA.11 (BabCo, Richmond, CA). Antibody binding was

101

revealed with the ECL-Plus Western blotting detection system (Amersham Biosciences,

Baie d'Urfé, QC).

Cell stimulation, extraction and immunoprecipitation for ERK kinase assay

Serum starved cells were stimulated with 50 ng/ml of epidermal growth factor (EGF; Gibco

Invitrogen Corporation, Burlington ON) for 5 min at 37oC. 60-mm-diameter tissue culture

dishes were washed with iced cold phosphate buffer saline before extraction in 300 µl of

MGM lysis buffer (20 mM Tris {pH 7.5}, 10 % glycerol, 5 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 %

Triton X-100, 2 mM ß-glycerol phosphate, 50 mM NaF, 10 µM Na3VO4, 5 mM

Benzamidine 5 mM DTT, 10 µg/ml leupeptin and 0.2 mM PMSF). Extracts were clarified

at 14,000 X g for 20 min at 4oC. Proteins from a 60-mm-diameter tissue culture dishes were

mixed with 600 µl of MIKI buffer (20 mM Tris {pH=7.5}, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA,

1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100 and 1 mM PMSF)

containing 8 µg of monoclonal anti-Flag antiserum M5 (Sigma # F4042) and incubated for

2 hours at 4oC. Subsequently, 40µl of protein A-Sepharose was added and the incubation

prolonged an additional hour. Immunoprecipitate (IP) were washed three times with 200 µl

of MIKI buffer, resuspended in kinase buffer (20 mM Tris {pH=7.5}, 10% glycerol, 120

mM pNPP, 30 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 1 µM leupeptin, 100 µM ATP, 3

µCi [γ32P] ATP, 1 µg of inactive ERK2 (K52R) (Cell Signaling Technology, Pickering,

ON)) and incubated 20 min at 30oC. Reactions were terminated with addition of SDS-

PAGE sample buffer and products were resolved by SDS-PAGE. Incorporation into K52R

was determined by autoradiogram.

Immunofluorescence

Cells were grown on 35-mm plates and transfected as described above. Cells were fixed

with 4% paraformaldehyde (Electron Microscopy Sciences) for 5 min and permeabilized

with 0.2% Triton X-100 for 2 min. Localization of MEK1 proteins was identified by

102

immunostaining for the Flag tag followed by ALEXA-594- or ALEXA-488-labeled goat

anti-mouse IgG (Molecular Probes) and counterstained for cellular DNA with 4',6-

diamidino-2-phenylindole (DAPI, 0.2 µg/ml in phosphate-buffered saline). Cells were

identified using a Nikon TE-300 fluorescence microscope and a Micromax 1300YHS

(B/W) cooled CCD camera (-30°C; Princeton Instruments). The Flag-MEK1 pattern of

staining in cells was examined in 3 different assays. Normal cells displayed a diffuse

homogenous Flag pattern throughout the cytoplasm and sometimes in nucleus. The

punctuate pattern of staining was characterized as many distinct spots located throughout

the cytoplasm.

103

3.2.4. Results

Interaction of MEK1 and MEK2 with truncated MEK1 protein in Yeast Two-hybrid

Screen

The COOH-terminal region of MEK1 and MEK2 was isolated from the two-hybrid screen

of a mouse brain cDNA library using a constitutively inactive truncated form of MEK1

(amino acids (aa) 1-362 S218/222A) fused at the amino-terminus of the DNA binding

domain of LexA (Figure 3-1A). This approach keeps the amino terminus end of MEK1 free

of any exogenous a.a sequences and available for interaction with new substrates or any

other interaction. The Screening of 3.2 x 106 transformants from the mouse brain cDNA

library results in the isolation of 3 independent genes. Among the 53 positive clones

identified, 37 correspond to 18 individual Mek1 cDNA clones, 16 correspond to 12

individual Mek2 cDNA clones and one corresponds to catalytic domain of c-Raf. The 5'

ends of all Mek1 and Mek2 cDNA isolated are located between the sequences encoding the

codons 175 and 332 and they all extend to the end of the coding sequences. As shown in

Figure 3-1B, some of the clones has deleted the phosphorylation loop as well as the proline

rich region also known as the MEK specific sequence (MSS).

104

Figure 3-1

105

Figure 3-1 : Structure of MEK protein regions recover from yeast two-hybrid screen

against MEK1.

A, The schematic diagram depicts the MEK1 (1-362 a.a) N-terminal fusion of LexA DNA

binding domain used as bait in the yeast two-hybrid screen. EDS, ERK docking site; MSS,

MEK specific sequence (proline rich sequence); NES, nuclear exclusion sequences; the two

stars represent the phosphorylation site in the activation (or phosphorylation) loop. B,

Schematic representation of the various clones isolated from the two-hybrid study. The N-

terminus of the different clones are grouped according to the specific domain of MEK;

N175 (174 or 175); N195 (195 or 211); N247 (231 to 262); N295 (270 to 296); N324 (319

to 332).

106

COOH-terminal region of MEK interacts with the activation loop-

To identify the interacting region involved in this binding, deletion mutant have been tested

in two-hybrid assay. We used the N324 portions of the MEK1 protein (a.a 324-394) as a

bait in frame with one of the two-hybrid expression vector and various COOH- and NH2-

terminal portions of the MEK protein in frame with the complementary vector. The GAL-4

AD construct and LexA DBD constructs were co-transfected in yeast containing the His3

and LacZ reporter genes. Transformants were then tested for their ability to grow in the

absence of histidine and for β-galactosidase activity.

Results presented in Figure 3-2 show that the full-length MEK1 interacted with the

carboxyl-terminal domain of MEK1 (N324) in the two-hybrid assay. Deletion of 32, 44 or

94 amino acids in the carboxyl terminus of MEK1 (construct C362, C350 and C300,

respectively; Figure 3-2 and Table 2-1) does not have any effect on the interaction with the

carboxyl domain of MEK1. As the fusion protein N324 MEK1 can interact with the fusion

protein C300 MEK1, and since this two proteins do not contain common MEK1 amino

acids sequences we conclude that the interaction take place between two adjacent regions

of MEK1.

Amino terminal deletion of 175 and 195 residues of MEK1 do not also affect the

interaction to N324 MEK1 (construct N175 and N195; Figure 3-2). However, deletion of

247 amino acids or more at the amino terminus of MEK1 abolished interaction with the

carboxyl domain of MEK1 (construct N247, N295 and N324: Figure 3-2). This absence of

interaction with some of the construct tested (N247, N295 and N324) is not an artefact of

the two-hybrid assay, since these construct were able to generate interaction with other

MEK construct (see Table 3-1 and Figure 3-1). Altogether these results suggest that the

region of the phosphorylation loop of MEK can interact with the COOH-terminus of MEK

protein. However, the use of the amino acids 195-247 in the two-hybrid assay does not

show interaction with MEK1 carboxyl-terminal region (wt, N175 and N324; data not

shown). Either, the fusion protein between MEK1 amino acids 195-247 and the LexA DBD

is unstable (rapidly degraded or its solubility is impair) or the interaction domain extends

107

outside of this amino acids sequence. Thus the region of interaction in the activation loop

with the MEK1 carboxyl terminal region might not be restricted to amino acids 195-247.

To confirm the interaction of MEK to the carboxyl-terminal domain (a.a 342-394) of MEK

observed in the two-hybrid assay and to determine whether this interaction also occur in

vivo, we performed co-immunoprecipitation in Triton-soluble protein extracts of HEK 293

cells in which both Flag-C380 MEK1 and HA-GFP-N324 MEK1 or HA-ERK were

transiently expressed. In this experiment Flag- and HA-GFP tagged truncated form of

MEK, Flag-C380 MEK1 and HA-GFP-N324 were used in order to produce soluble protein.

We have shown that the C362 and the N324 are produced but are barely soluble and not

suitable for immunoprecipitation protocol. In HEK 293 cells, HA-ERK and HA-GFP-N324

MEK1 proteins were co-immunoprecipitated by the anti-Flag antibody (Figure 3-3A, lane 2

and 5 to 7, respectively). Thus, this interaction appears to occur in vivo, which is consistent

with the results that have been obtained in two-hybrid assay.

108

Figure 3-2

109

Figure 3-2 : Mapping of the MEK1-binding sites by the two-hybrid assay.

Full-length, COOH-terminal (∆C) or NH2-terminal deletion (∆N) of MEK1 proteins were

fused to the LexA DNA-binding domain or the Gal-4 transcriptional activation domain and

tested in the two-hybrid assay against the COOH-terminal domain of MEK1 N324 (a.a

324-394). Binding was detected by the growth of colonies on histidine-deficient media (+)

and confirmed by the β–galactosidase straining (+ staining in 4 to 8 hours; ++ staining in

less than 4 hours). EDS, ERK docking site; MSS, MEK specific sequence (proline rich

sequence); NES, nuclear exclusion sequences; the two stars represent the phosphorylation

site in the activation (or phosphorylation) loop.

110

Table 3-1

MEK1 C350

MEK1 C362

MEK1 wt

MEK1 N324 c-Raf Lamine Hsp27

MEK1 N324 +/++ +/+ +/+ -/- -/- -/- -/-

MEK1 C350 -/- -/- +/+ +/++ -/- -/- -/-

MEK1 C350 (DD) nd nd nd -/- -/- nd nd

MEK1 C362 -/- -/- +/+ +/++ +/+++ -/- -/-

MEK1 wt +/+ +/+ -/- +/+ +/+++ -/- -/-

MEK1 (DD) nd nd -/- -/- +/+++ nd nd

111

Table 3-1 : Intra-molecular interaction of the carboxyl terminal with the activation loop

is dependent on the phosphorylation state.

Full-length, COOH-terminal (∆C) or NH2-terminal deletion (∆N) of MEK1 proteins were

fused to the LexA DNA-binding domain and tested in the two-hybrid assay against Full-

length, COOH-terminal (∆C) or NH2-terminal deletion (∆N) of MEK1 proteins, c Raf,

lamine or Hsp27 protein fused to the Gal-4 activation domain. Binding was detected by the

growth of colonies on histidine-deficient media (+) and confirmed by the β–galactosidase

straining (+ staining in 4 to 8 hours; ++ staining in less than 4 hours).

112

Internal interaction of MEK1 carboxyl terminal domain with the activation loop-

To decipher whether the MEK1 carboxyl terminal domain interacts with the activation loop

via an intramolecular or intermolecular interaction, we return to the two hybrid system to

determine whether two full-length MEK1 protein can interact together. As shown in Table

3-1, the amino terminal and carboxyl terminal deletion of MEK1 (N320, C350 and C362)

are able to bind to full-length MEK1 protein. However, in the same experiment the full-

length MEK1 is not able of interacting to the full-length MEK1 suggesting that the

interaction was intramolecular. The truncated forms of MEK1, lacking one of the

interacting domains can compete with the interacting domain of the MEK1 full-length to

generate intermolecular interaction whereas two full-length MEK1 proteins cannot most

likely due to the stability of the intramolecular interaction or to limited access in the context

of the full-length protein.

Since one of the domains implicated in this intramolecular interaction involves the

activation loop of MEK1 region that is normally phosphorylated at serine 218 and 222

during MEK1 activation, we have taken advantage of the two-hybrid system to determine if

phosphorylation of the activation loop had any effect on binding. To address this question

we have introduce a charged residue which mimic phosphorylation by changing serine 218

and serine 222 in aspartic acid in the full-length MEK1 and in MEK1C350- LexA DBD

(MEK1 (DD) and MEK1 C350(DD), respectively). As bait the MEK1∆N324- Gal-4 AD

has been used. Both the MEK1 wt and the MEK1 C350 are capable of interacting with the

MEK1 N324 whereas the MEK1 (DD) and MEK1 C350 (DD) forms do not form a stable

interaction with the MEK1 N324 suggesting that the phosphorylation state of the MEK1

can regulate this interaction (Table 3-1).

113

Figure 3-3

114

Figure 3-3: MEK1 C-terminal domain bind to a truncated form of MEK1 in vivo.

HEK 293 cells were transfected with expression vectors for Flag-MEK1-C380 and HA-

GFP, HA-ERK or HA-MEK1-N324. Upper panel: After serum starvation for 16 hrs, cells

were harvested and immunoprecipitations were carried out with α-Flag antibody and

immunoblot were probed with α-HA antibody. Lower panels: Total cell lysates were

resolved on SDS-PAGE and immunoblots were probed with the antibodies indicated to the

left of each panel. The proteins detected are indicated to the left of the panels. Lanes 1-5

and 6-7 are from the same gel but transferred on different membranes.

115

Is there a functional role for the carboxyl-terminal / phosphorylation loop interaction?

Our results suggest that the carboxyl-terminal region of MEK1 interacts with the

phosphorylation loop when this latter is not phosphorylated. This data raises the possibility

that the MEK carboxyl-terminal region can be involved in an intramolecular inhibitory

interaction modulated by phosphorylation of the activation loop. In order to determine the

functional role of the carboxyl terminal region on the regulation of MEK1 activity in intact

cells, we have evaluated the activity of MEK1 truncated mutants.

Various Flag-MEK1 constructs were transiently co-expressed with HA-ERK in HEK 293

cells. The ability of truncated MEK1 protein to phosphorylate ERK in the absence of

activation by EGF was tested. As seen in Figure 3-5A, Flag-MEK1 wt and C380 are unable

to phosphorylate the HA-ERK as well as the endogenous ERKs protein unless the cells

were induced by EGF. In addition, in Flag-MEK1 C380 (AA) transfected cells no

phosphorylation of HA-ERK was detected even after EGF induction. These results indicate

that the truncated MEK1 mutants, Flag-MEK1 C380 and Flag-MEK1 C380 (AA), are

inactive in the absence of induction. Thus the truncation of the carboxyl-terminal region of

MEK1 at position 380 is not sufficient for kinase activation. The catalytic activity is still

dependent on activation by phosphorylation. In order to confirm that Flag-MEK1 C380 was

catalytically inactive in absence of induction by EGF and Flag-MEK1 C380 (AA) was

catalytically even after EGF induction we have performed MEK kinase assay on HEK 293

cell extract expressing various Flag tagged MEK1 mutants. The Flag-MEK1 proteins were

immunoprecipitated with a α-Flag antibody and the catalytic activity tested as described in

Material and Methods. As shown in Figure 3-4B, both mutant Flag-MEK1 C380 and Flag-

MEK1 C380 (AA) are catalytically inactive in the absence of EGF induction and only Flag-

MEK1 C380, which can be phosphorylated, is activated after EGF induction. Use of a

larger carboxyl-terminal deletion such as the C362, in MEK kinase assay has shown that

this deletion lead to a protein that is catalytically inactive (Figure 3-4A). Flag-MEK1 C362,

C362 (AA) and C362 (VV) do not show MEK kinase activity even after EGF induction. In

addition, we have shown that the MEK1 C362 mutant proteins were more difficult to make

soluble and that they were not localize in the cytoplasm like its wild-type counterpart but

116

show an aggregate and punctuated staining (Figure 3-4B). Altogether, these results suggest

that the deletion of the carboxyl-terminal end of MEK1 is not sufficient to activate its

catalytic activity (MEK1 C380) whereas if the deletion includes part of the kinase domain

XI (MEK1 C362) all enzymatic activity is lost.

In order to verify whether phosphorylation of MEK1 at different sites in the C-terminal end

can influence its kinase activity, the ability of some MEK1 mutants to phosphorylate ERK

in absence of activation by EGF was tested in a kinase assay. As seen in Figure 3-6, all

MEK1 mutants S292D, S298D, S292D/S298D (phosphorylation sites by PAK1 that

positively regulate MEK1 activity in vivo), like MEK1 wt, show no activity in the absent of

induction. Active MEK1/S386D seems to be constitutively active. Mutation of S386,

reported to negatively regulate MEK1 activity in vivo, had no effect on the MEK1 DD

mutant activity. Thus phosphorylation at the carboxyl-terminal sites of MEK1 is not

sufficient for kinase activation. The catalytic activity is still dependent on activation by

phosphorylation at the activation loop.

117

Figure 3-4

118

Figure 3-4 : Catalytic activity and cellular localisation of MEK1 C362 mutants.

A. MEK1 C362 mutants are inactive even after EGF stimulation. HEK 293 cells were

transfected with expression vectors for Flag-MEK1 and truncated, constitutively active or

inactive mutants as indicated. After serum starvation for 16 hrs, cells were harvested and

immunoprecipitation were carried out with α-Flag antibody and a kinase reaction was

performed as described in Material and Methods. An autoradiogram of the electrophoresed

kinase reaction is shown. B. Cellular localisation of MEK1 and truncated forms, C380 and

C362. HEK 293 cells were transfected with expression vectors for Flag-MEK1 and

truncated. Experiment was done as described in Material and methods.

119

Figure 3-5

120

Figure 3-5 : Deletion of the carboxyl-terminal domain of MEK1 does not affect the

regulation of MEK1 activity.

A, Activation of MEK1 C380 mutant is still required for kinase activity. HEK 293 cells

were transfected with expression vectors for HA-ERK and, Flag-MEK1, truncated,

constitutively active or inactive MEK1 mutants as indicated. After serum starvation for 16

hrs, cells were harvested and activation of the MAP kinase cascade assess by immunoblot

using α-P-ERK antibody. B, MEK1 C380 mutant is still catalytically active after induction

with EGF. HEK 293 cells were transfected with expression vectors for Flag-MEK1 and

truncated, constitutively active or inactive mutants as indicated. After serum starvation for

16 hrs, cells were harvested and immunoprecipitation were carried out with α-Flag

antibody and a kinase reaction was performed as described in Material and Methods. An

autoradiogram of the electrophoresed kinase reaction is shown. Lanes 1-5 and 6-7 are non-

adjacent lanes from the same blot whereas lanes 1-3, 4-5 and 6 are non-adjacent lanes from

another experiment.

121

Figure 3-6

WTS292D DD/386D

EGF 50ng/ml - - +- - - + + + +

S298D

S292D/S298DWT

S292DS298D

S292D/S298D

122

Figure 3-6 : MEK1 activity is not affected by point mutations in the proline-rich

sequence in vitro.

A, Activation of MEK1 C380 mutant is still required for kinase activity. HEK 293 cells

were transfected with expression vectors for HA-MEK1; WT, WT with point mutations in

the proline-rich sequence; either S292D, S298D or both, constitutively active MEK1 DD-

S386D mutants as indicated. After serum starvation for 16 hrs, cells were treated with EGF

as indicated and harvested and immunoprecipitation were carried out with α-HA antibody.

A kinase reaction was performed as described in Material and Methods. An autoradiograph

of the electrophoresed kinase reaction is shown.

123

3.2.5. Discussion

There is increasing interest in the regulation mechanisms and functions of the MEK/ERK

cascade. There are several molecules that can modulate the localisation of MEK 1 and its

interactions with the MEK/ERK pathway. In this study, we have used the yeast double

hybrid system to identify new MEK interacting molecules that might be involved in the

regulatory function of MEK1 in the ERK MAPK pathway. Unlike several investigators

who have used, as a bait, MEK 1 fused at the C-terminal end of the DNA binding domain

(DBD) of LexA (or Gal4), we have used a MEK1 fused at the N-terminal of LexA-DBD

(Figure 3-1). This construction allowed us to obtain new interacting proteins (probably new

substrates of MEK1), that, just like ERK1/2, interact specifically with the N-terminal of

MEK1. However, it is important to note that the MEK1 bait used was devoided of the last

amino acids at the C-terminal (a.a 362 to 393). These amino acids were deleted in order to

allow the correct fusion with the DNA binding domain of LexA. To our surprise, the

majority of the molecules that were able to interact with MEK1 correspond to peptides of

various length from the C-terminal end of MEK1 and MEK2 themselves (Figure 3-1).

Furthermore, we showed by several deletion mutations that the intermolecular interactions

take place between two specific regions of MEK1 and MEK2 (figure 3-2). The carboxy-

terminal sequences of MEK1 between residues 324 and 393 can interact with the

phosphorylation loop of MEK1, residues 195 to 247. Our data suggest that this interaction

is intramolecular. We and other investigators have shown that MEK1, 2 are unable to form

dimers in double hybrid assays (Table 3-1 and [30]). In addition, the intramolecular

interaction seems to be dependent on the phosphorylation state of MEK1/2. The interaction

observed between the N324 and the C362 SS (Ser 218 and Ser 222) regions is lost when the

serine residues of the activation loop are replaced by aspartate residues which mimic the

phosphorylation in the C362 DD mutant.

These results indicate that there is an intramolecular interaction between the C-terminal

region and the activation loop in MEK1 and MEK2 and that this interaction is dependent on

the phosphorylation state. These results suggest that the electrostatic variations induced by

124

the phosphorylation of the activation loop can modulate a conformational change at the C-

terminal region of MEK1/2. This conformational change could play a role in the transition

between the active and inactive states of MEK1/2 proteins. In order to verify whether the

C-terminal could play a direct role in the activation of the protein, deletion mutants have

been generated and tested for kinase activity. The deletion of the carboxy region from aa

362 to 393 lead to lost of kinase activity. Furthermore, immunoprecipation experiments

using protein extracts from HEK 293 or CCL39 cell lines overexpressing the MEK1 C362

mutant showed that these proteins was trapped in insoluble fractions of the extracts. More

over, immuncytolocalisation experiment showed that the expression of this truncated form

of MEK1 is localized in restricted cytosolic area and specific cytoplasmic compartments.

Altogether, these results indicate that the C362 mutants might be localized in these cellular

comparments due to an altered conformation. Cha et al (2001) showed that similar mutants

MEK1 C296, C330, and ∆330-379 are localised in lysosomes [31]. The C-terminal region

of MEK1 could be important for a stable configuration allowing its proper expression and

localisation in the cytoplasm.

We have also observed a stable interaction between the deleted mutant C362 and ERK

(data not shown). However, the C362 mutant was unable to phosphorylate ERK even in its

active form, C362DD, suggesting that this portion of C terminal of MEK1 is implicated in

the enzymatic activity. The last kinase domain (XI), characterised by its structure and its

Arg349 residue (conserved in protein kinases) [32], seems to be intact in the C362 mutant.

In order to verify this hypothesis, we have performed another MEK1 deletion mutant,

C380. Our results show that this mutant behave as wild type MEK1 protein. Hence we

observed a cytoplasmic localisation of the C380 mutant (Fig 2-5b). Furthermore, the

enzymatic activity of the MEK1 DD C380 mutant is comparable to that of the full length

protein MEK1 DD. This suggests that the C380 mutant activity is dependent on the

phosphorylation of the 218 and 222 serine residues in the activation loop. Deletion of the

last 13 amino acid residues of MEK1 does not seem to alter the basal activity of the latter.

Our data are not in accord with those of Cha et al (2001) who have shown that in vivo the

MEK1 mutant d379 could activate ERK1 and ERK2 by phosphorylation even in absence of

induction [31].

125

Hence our results suggest that the amino acid sequence between the 362 and 380 residues

of MEK1 contains important elements for MEK1 activity. Structural and conformational

integrity of the kinase domain seems to be perturbed in the C362 mutants. In order to

elucidate this issue, further studies need to be done.

Immunoprecipitation experiments indicate that there is an in vivo interaction between the

MEK1 C380 SS and the C-terminal fragment N-324 (figure 3-3). We have not been able to

confirm, in vivo, the role of the C-terminal region on MEK1 activity. Nevertheless, all these

results suggest that the residues between the C362 and C380 region may be important for

the activation of the MEK1 kinase. The stability of the inactive form of MEK1 does not

seem to involve any intra-steric competition by an autoinhibition domain or a pseudo

substrate, since deletion of the C-terminal region does not result in a constitutively active

MEK1 protein. However, it is probable that structural rearrangements in different regions

of MEK1 contribute to the latter’s activity. Several studies have shown that there is a

dynamic movement involving diverse secondary structures of MEK1. This could in turn be

important for MEK1 activity [33-35].

Conformational variations in the C-terminal region could be primordial for the stability of

the interactions of MEK1 with its substrates, its activators and also with scaffold proteins.

Lastly, these variations could also be important for the proper localisation of the MEK1

protein in the cytoplasm. Our Two-hybrid experiments have shown that there is a problem

in the interaction of MEK1C350 and RAF-1 (table 2-1). There have been some reports

suggesting that the MEK Specific Sequence (MSS) could be the site of interaction between

RAF-1 and MEK1/2 [4]. Our results indicate that the portion of MEK1 between the C350

and C362 residues could, on one hand, be directly involved in the attachment of RAF to

MEK. On the other hand, the deletion of the C350 region could result in a conformational

change of the MEK1 protein and this could in turn alter the stability of the MEK1-RAF

complex. It would therefore be extremely useful to elucidate the crystal structure of the

MEK1 protein given its highly conserved sequence between the different species. This

would allow us to better understand the activation and inactivation of the MAPKK family.

Could the change in conformation induced by the deletion of the C-terminal region be

directly linked to the phosphorylation/activation state of MEK1? Could there be other

126

phosphorylation events that control such conformational changes? Several phosphorylation

sites are present in the C-terminal region, in particular in the proline rich sequence (PRS),

which seems to play an important role in stabilising the interaction of MEK1 with RAF

[36], with ERK [25] and with several scaffold proteins such as Grb10 and MP-1 [17].

Lastly, there are sites such as Ser298 that regulate positively MEK1 activity [36].

Phosphorylation of MEK1 on the Ser 298 residue by PAK1 could stimulate a

conformational change which stabilise the MEK-ERK interaction [37]. Other residues such

as Ser212, Thr 292 and Thr386 seem to inhibit MEK1 activity in vivo [17,37].

Phosphorylation of the Ser212 residue could perturb the activation loop thereby blocking

the substrate’s access to the active site of MEK1 [16].

127

3.2.6. Acknowledgements

We thank Drs. Robert Faure and Jacques Huot for critical reading of the manuscript, and Dr

Grosse for ERK2 antibody. This work was supported by grants from the Canadian

Institutes of Health Research (MOP-42523) and the Cancer Research Society Inc. to J. C. J.

C. is a Senior Scholar of the Fonds de la Recherche en Santé du Québec.

128

3.2.7. References

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Chapitre 4

4. Résultats complémentaires

Ce chapitre renferme des résultats complémentaires obtenus lors du criblage double hybride

qui a mené à la préparation du l’article présenté au chapitre 3 de la thèse.

132

Au cours de notre criblage double hybride chez la levure, nous avons isolé plusieurs

protéines qui paraissaient intéragir avec MEK1 (Tableau A.1). La plupart des protéines

repêchées se sont avérés des faux positifs ; elles n’interagissent plus avec MEK1 dans les

essais de double hybride ou alors elles intéragissent d’une façon non spécifique avec MEK1

et avec d’autres protéines testées tel que la lamine ou Hsp27. Par contre, certaines

protéines, dont les histones H3 et M96A, ne semblaient pas être des faux positifs et

semblaient intéragir avec MEK1 d’une façon spécifique lors des essais double hybride.

4.1. Interaction MEK1-Histones H3

Le criblage de deux banques d’ADNc, provenant de cerveaux de souris et de placenta

humain (produit par Clonetech.), ne nous a pas permis d’identifier de nouvelles protéines

agissant au sein de la voie de signalisation ERK (Tableau A.1). Ceci dit, nous avons isolé

des variants de remplacement de l’histone H3 (v.r H3) comme protéine pouvant interagir

avec MEK1 (Tableau 4-1). Les histones H3 semblent jouer un rôle important dans la

progression du cycle cellulaire et sont des substrats légitimes de ERK2 et de RSK1, deux

protéines kinases qui agissent en aval de MEK1 dans le sentier ERK/MAPK [430,453,454].

D’autre part, les histones H3 et H4 ne semblaient pas être des artéfacts courants du système

double hybride chez la levure (Tableau A-2). Ainsi, les histones H3 se sont avérées des

candidats potentiels et fort intéressants pouvant élaborer une fonction nucléaire de MEK1

ou tout simplement justifier sa présence au noyau. Malheureusement, nous n’avons pas pu

confirmer, in vitro, l’interaction de MEK1 avec ces histones. Nos tentatives pour produire,

chez la bactérie, la protéine GST-v.r H3 ont échoué à cause de l’instabilité et l’insolubilité

de la protéine recombinante (données non présentées). Par contre, d’autres essais double

hybride ont été effectués en couplant MEK1 au domaine d’activation de Gal4 et les

histones H3 au domaine de liaison à l’ADN de LexA. Alors que les histones peuvent lier

l’ADN d’une façon non spécifique, cette nouvelle combinaison visait à éliminer

l’activation non spécifique de la transcription des gènes rapporteurs par les histones couplés

au domaine d’activation de Gal4. Les résultats obtenus lors de ces essais ont montré que

133

l’interaction H3-MEK1 n’était pas spécifique et que les histones isolées du criblage sont de

faux positifs (Tableau 4-2).

4.2. Interaction MEK1-M96A

Un autre clone isolé lors du criblage double hybride de la banque d’ADNc provenant du

cerveau de souris contient des séquences d’un gène homologue à M96A. M96A est un

facteur de transcription isolé chez l’humain (Holen, T. et Aasland, R., données non

publiées) et qui est homologue à M96 isolé chez la souris [455]. Aucune donnée n’est

présentée pour M96A, mais son homologue M96, isolé en utilisant le système un hybride

chez la levure, semble lier des séquences MREs (metallotheonin response element) du gène

de la métallothéonine-1 [455]. L’analyse de la séquence protéique de M96A a révélé la

présence de site consensus de phosphorylation par MEK1 et 2. Alors que nos premiers

essais de double hybride indiquaient que l’interaction MEK1-M96A est réelle (Tableau 4-

1), le clone M96A s’est avéré, comme ceux des histones H3, un faux positif (Tableau 4-2).

Les gènes rapporteurs His3 et LacZ sont inactifs lorsque MEK1 est fusionnée au domaine

d’activation de Gal4 et M96A est fusionné au domaine de liaison à l’ADN de LexA. Tout

comme les histones, M96A, qui est un facteur de transcription capable de lier l’ADN,

semble avoir stimulé l’activation non spécifique de la transcription des gènes rapporteurs

lorsque il été fusionné au domaine d’activation de Gal4. La présence d’un site du type

MRE sur les promoteurs des gènes rapporteurs pourrait expliquer l’activation non

spécifique observée lors de nos premiers essais.

134

Gal4 -AD-------------

LexA-DBDMEK1 MEK2 H3.3A H3.3B H4 M96A c-RAF PLZF

MEK1 C362 AA (Amino) + + + + + + + +

hsp27 - - - - - - - +

Lamine - - - - - - - +

Gal4 -AD-------------


Gal4 -AD-------------


MEK1 C362 AA (Amino) + + + + + + + +MEK1 C362 AA (Amino) + + + + + + + +

hsp27 - - - - - - - +hsp27 - - - - - - - +

Lamine - - - - - - - +Lamine - - - - - - - +

Tableau 4-1 : Essai d’interaction double hybride chez la levure

Les protéines MEK1, hsp27 et lamine ont été fusionnées au domaine de liaison à l’ADN de

LexA et testées dans un essai double hybride avec les différentes protéines isolées lors du

criblage, MEK1, MEK2, les variants de remplacement de l’histone H3 (H3.3A et H3.3B),

Histone H4, les facteurs de transcription M96A et PLZF et c Raf, fusionnées au domaine

d’activation de Gal-4. L’interaction est déterminée par l’activation des gènes rapporteurs :

His3, qui permet aux levures de pousser sur un milieu sans histidine, et LacZ qui permet de

confirmer l’interaction par un essai β–galactosidase.

135

Gal4 AD------------

LexA DBD

MEK1wt

MEK2wt

Gal4-AD seul

MEK1 D.N (A) + + -

H3.3A - - -

M96A - - -

Gal4 AD------------

LexA DBD

MEK1wt

MEK2wt

Gal4-AD seul

MEK1 D.N (A) + + -

Gal4 AD------------

LexA DBD

MEK1wt

MEK2wt

Gal4-AD seul

MEK1 D.N (A) + + -

H3.3A - - -H3.3A - - -

M96A - - -M96A - - -

Tableau 4-2 : Les histones H3 et M96A sont des faux positifs

Les histones H3.3, M96A et la forme dominante négative de MEK1 C362 ont été fusionnées

au domaine de liaison à l’ADN de LexA et testées dans un essai double hybride avec MEK1

et MEK2 fusionnées au domaine d’activation de Gal-4. L’interaction est déterminée par

l’activation des gènes rapporteurs : His3, qui permet aux levures de pousser sur un milieu

sans histidine, et LacZ qui permet de confirmer l’interaction par un essai β–galactosidase.

Discussion générale

137

Le développement tumoral nécessite la dérégulation des contrôles normaux de la

prolifération et de la différenciation cellulaires. Il est bien connu que la voie de

signalisation ERK/MAP kinase est impliquée dans ces processus. De plus, le rôle de

MEK1, qui est un élément central de la voie, dans la transformation cellulaire a été mis en

évidence par l’utilisation de protéines MEK1 constitutivement actives. L’expression des

formes actives de MEK1 dans les fibroblastes est suffisante pour induire la production de

foyers de transformation, la croissance des fibroblastes en agar et la production de tumeurs

chez les souris nues [421,456]. De plus, la croissance des tumeurs et leur progression vers

l’état métastatique nécessite la vascularisation de la tumeur primaire par angiogenèse

[2,456]. La tumeur ainsi vascularisée n’est pas restreinte dans sa croissance. En outre, si les

cellules acquièrent une certaine mobilité, elles peuvent utiliser les vaisseaux formés pour

coloniser des sites secondaires. Les travaux antérieurs faits au laboratoire du Dr. Charron

ont permis de montrer le rôle essentiel et unique de MEK1 lors du développement

embryonnaire [77]. L’analyse du phénotype placentaire en cours dans le laboratoire tente

de mettre en évidence son rôle dans la morphogenèse du placenta et la migration cellulaire

(Bissonauth et Charron, en préparation). Une meilleure compréhension du rôle de MEK1

dans des voies de transduction devrait donc nous permettre de mieux contrôler ces

processus lors de la transformation cancéreuse.

La voie de signalisation ERK/MAPK est impliquée dans une panoplie de processus

cellulaires complexes permettant aux cellules de proliférer, de survivre, de se différencier,

ou encore de migrer. Les recherches récentes visent à éclaircir l’importance des variations

spatio-temporelle dans l’activité et la distribution subcellulaire des composantes

signalétiques. Les travaux de plusieurs groupes de recherche soulignent l’importance des

interactions protéiques comme un moyen puissant de coordination des processus

signalétiques.

Dans ce sens, mon projet de recherche effectué dans le cadre de mes études de doctorat

tente d’identifier et comprendre les divergences fonctionnelles et structurales qui existent

entre MEK1 et MEK2 et qui permettent de répondre de façon spécifique à des signaux

uniques.

138

Mes premiers travaux, dont les résultats les plus pertinents sont décrits dans le chapitre 2,

ont montré que la signalisation induite par la bombésine emprunte une voie spécifique à

MEK1 au dépend de son homologue MEK2. Alors que la plupart des facteurs de croissance

testés ne présentent pas cette spécificité, l’effet de la bombésine s’est présenté comme un

moyen intéressant pour étudier la divergence fonctionnelle entre MEK1 et MEK2 et mieux

comprendre la spécificité de la réponse.

La voie de signalisation conventionnelle Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2, activée par des

signaux mitogénique via des récepteurs RTKs, ne semble pas présenter une divergence

fonctionnelle entre les modules homologues MEK1 et MEK2 ou ERK1 et ERK2 [462,463].

Cette voie, dite proliférative pourrait être considérée comme une voie principale dont

l’issue pourrait être modulée par des signaux provenant d’autres récepteurs; tels que les

récepteurs couplés aux protéines G ou des intégrines, ou par des voies annexes qui font

appel à d’autres modules signalétiques et au phénomène de cross-talk.

La divergence fonctionnelle entre MEK1 et MEK2 telle qu’observée lors de l’induction par

la bombésine pourrait provenir d’alternative à la voie de signalisation conventionnelle Ras-

ERK et préconiserait l’existence de chevauchement entre plusieurs voies de signalisation

via le module MEK. Ce module formé de deux protéines bien que très homologue et

généralement équivalent de point de vue fonctionnel permettrait, dans un contexte unique,

de médier une réponse spécifique.

L’élément ou la séquence protéique dans MEK1 qui semble médier la réponse spécifique à

la bombésine se retrouverait dans la région C-terminale. Nos résultats indiquent que la

réexpression d’une protéine chimérique MEK2/1; (a.a 1-116)/MEK1 (a.a 117-393), dans

les MEFs Mek1-/- rétablit l’activation de ERK. La région C-terminale, tout particulièrement

la région MSS, semble jouer un rôle essentiel dans la régulation de l’activité catalytique de

MEK1 et MEK2. La MSS semble prendre part dans la modulation de l’activité de MEK1

ainsi que dans le cross-talk du sentier ERK avec d’autres voies de signalisation [391].

En somme, ces résultats fournissent de nouveaux éléments démontrant le rôle unique que

peut jouer MEK1 dans la cascade ERK/MAPK pour accomplir certains processus

139

cellulaires spécifiques. Ces résultats suggèrent que seul MEK1 et non pas MEK2 peut

répondre à des signaux provenant de l’induction par la bombésine.

Dans le but de comprendre cette divergence dans la fonction de MEK1 et MEK2, nous

avons tenté d’identifier de nouvelles protéines interagissant spécifiquement avec MEK1. En

fait, la découverte de substrats spécifiques à MEK1 et/ou une meilleure compréhension du

mode de régulation de MEK1 pourraient bien expliquer cette divergence. Pour atteindre

notre objectif, nous avons utilisé le criblage et l’étude des intéraction protéine-protéine du

système double hybride chez la levure.

Bien de recherches faites avant ou en même temps que la nôtre ont utilisé, comme appât,

MEK1 fusionné en carboxy terminal du domaine de liaison à l’ADN de LexA (ou de Gal4).

L’originalité de nos travaux était de démasquer la région N-terminale de MEK1, clairement

identifiée comme importante et suffisante pour lier ERK, en mettant MEK1 en amino

terminal du domaine de liaison à l’ADN de LexA.

Le criblage de deux banques d’ADNc, provenant de cerveaux de souris et de placenta

humain (produit par Clonetech.), ne nous a pas permis d’identifier de nouveaux éléments

agissant au sein de la voie de signalisation ERK (Annexe A). En outre, presque 70 % des

clones isolés lors de notre criblage double hybride contiennent des séquences de longueurs

variables tous provenant de la région C-terminale de Mek1 et de Mek2 (Annexe A.1 et

chapitre 3). La région repêchée contient le dernier domaine kinase de MEK1 et 2 ainsi que

la région C-terminale dont la fonction est encore inconnue. La séquence la plus courte qui a

été isolée code pour le peptide N324 (résidu 324-393 de MEK1). Des essais double hybride

nous ont permis d’identifier la région entourant la boucle d’activation (a.a 195-241) comme

étant l’autre région impliquée dans l’interaction.

Parce que les protéines MEKs ne forment pas de multimères (Tableau 3-1), l’interaction

observée dans notre étude serait de type intramoléculaire. De plus, cette interaction serait

dépendante de l’état de phosphorylation/activation de MEK1 et MEK2, puisque dans la

présente étude, il y a perte d’interaction entre la région minimale isolée, N324 et la forme

dominante positive de MEK1, MEK1 C350 DD (Tableau 3-1).

140

En somme, ces résultats indiquent qu’il existe une interaction intramoléculaire entre la

région C-terminale et la région de la boucle d’activation de MEK1 et MEK2 et que cette

interaction serait dépendante de l’état de phosphorylation de ces protéines kinases. Elles

suggèrent que les variations électrostatiques induites par la phosphorylation de la boucle

d’activation peuvent contribuer à un changement de la conformation de la région C-

terminale de MEK1 qui, par conséquence, pourrait jouer un rôle dans la transition de l’état

inactif à l’état actif.

À ce stade des travaux, nous avons émis l’hypothèse que la région C-terminale serait un

domaine d’autoinhibition ou un pseudo substrats de MEK1/2 dont le rôle serait de réguler

leur l’activité enzymatique. Lorsque la voie ERK/MAPK est au repos, ce domaine garderait

la protéine kinase dans sa conformation inactive. Cette inhibition serait levée grâce à

l’activation/phosphorylation de MEK1 (ou MEK2) par son activateur. Plusieurs

mécanismes d’autorégulation par l’intermédiaire d’un domaine d’autoinhibition ont été

décrits, entre autres, chez les protéines kinases Raf, Mos, MAPKAPK-2 et WNK1 [457-

460]. Cette inhibition est levée soit par phosphorylation directe par un activateur soit par

autophosphorylation. MEK1 est capable de s’autophosphoryler mais peu est connu sur le

rôle de cette phosphorylation dans la régulation de son activité [461].

Pour vérifier si la région C-terminale pourrait jouer un rôle direct dans l’activation de la

protéine, nous avons entamé des essais d’activation en utilisant des mutants de délétions

MEK1 dépourvus de cette région. Nos résultats ont indiqué que MEK1 perd complètement

son activité kinase lorsque écourtée au résidu 362. Ces mutants MEK1 semblent aussi se

retrouver dans une fraction insoluble lorsque surexprimés chez les cellules HEK 293

(Figure 3-4) ou CCL39 (données non présentées). Des expériences d’immunocytochimie

ont indiqué que ces mutants s’expriment dans des compartiments cellulaires spécifiques (en

occurrence dans les lysosomes) comparativement à l’expression cytoplasmique du type

sauvage. Les délétants C362 seraient produits chez les cellules avec des conformations

altérées qui les mènent à se localiser dans les compartiments endosomales/lysosomaux. Les

travaux de Shapiro et ces collaborateurs ont indiqué que des mutants semblables, MEK1

C296, C330 et ∆330-379 se retrouveraient dans des compartiments

endosomales/lysosomaux [136]. Ces résultats suggèrent que la région C-terminale pourrait

141

être importante pour que la protéine MEK1 adopte une conformation physiologique et

stable lui permettant de s’exprimer convenablement et de se localiser dans la fraction

soluble du cytoplasme.

Alors qu’il était possible d’observer une interaction stable entre les mutants de délétion

C362 et ERK (données non présentées), ces mutants MEK1 semblent être incapables de

phosphoryler ERK même dans leur forme active, C362DD. L’altération de l’activité des

mutants C362 pourrait s’expliquer par la perte d'une région ou d'une structure importante

dans MEK1 qui serait impliquée dans l'activité enzymatique. Le dernier domaine kinase, le

domaine XI qui est caractérisé par sa structure et sa séquence conservée, principalement, le

résidu Arg 349 conservé chez les différentes protéines kinases [86,132], semble être intact

chez les mutants de délétion C362. Ces résultats suggèrent que la région comprise entre les

résidus 362 et 393 est importante pour l’activité de MEK1.

Pour vérifier cette hypothèse, nous avons repris nos expériences en utilisant de nouveaux

mutants de délétion, les MEK1 C380. Nos résultats ont montré que ces délétants se

comportaient comme les protéines de type sauvage. Ainsi, nous avons observé une

localisation cellulaire des mutants C380 identique à celle de la protéine de type sauvage

(Figure 3-5b). De plus, l’activité enzymatique du mutant MEK1 DD C380 est comparable à

l’activité du mutant pleine longueur MEK1 DD (données non présentées), ce qui suggère

que l’activation des mutants C380 est dépendante de la phosphorylation des résidus sérines

218 et 222 de la boucle d’activation. La délétion des 13 deniers résidus de MEK1 ne

semble donc pas avoir d’effet sur son activité basale. Nos résultats vont à l’encontre de

ceux obtenus par le groupe de Shapiro qui démontrait in vivo, qu’un mutant MEK1 d379

stimulait la phosphorylation de ERK1 et ERK2 en absence d’induction [136].

La perte d’activité des mutants de délétion C362 comparée aux mutants C380 laisse croire

que la séquence d’acides aminés comprise entre 362 et 380 dans MEK1 contient des

éléments importants pour l’activité enzymatique de MEK1. L’intégrité ou la conformation

adéquate du domaine kinase semble être perturbée chez les mutants C362 ce qui même à

leur inactivation. Une étude plus poussée sur l’activité des mutants de délétion MEK1 qui

142

sont tronqués à des résidus entre 362 et 380 pourrait nous éclairer quant à l’importance de

cette région dans l’activité de MEK1.

L’ensemble des résultats d’activité et d’interaction suggèrent que la région C-terminale est

impliquée dans une variation conformationnelle du domaine kinase qui se produit entre

l’état inactif et l’état actif de la protéine MEK1. La stabilité de la conformation inactive ne

semble pas impliquer une compétition intra-stérique par un domaine d’autoinhibition ou de

pseudo substrat, puisque la délétion de la région C-terminale ne met pas la protéine dans

une forme active ou constitutivement active. Par contre, il est possible que des

réarrangements structuraux dans différentes régions de MEK1 coopèrent pour mettre

l'enzyme dans un état actif. D’autres études ont indiqué qu’un mouvement dynamique

subtil impliquant diverses structures secondaires peut également être important pour

l’activation complète de MEK1 [128,133,134].

Les variations conformationnelles de la région C-terminale pourraient aussi être

primordiales pour la stabilité des interactions de MEK1 avec ses substrats, activateurs et

protéines d’échafaudage et/ou nécessaires pour la localisation intracellulaire adéquate de

MEK1. Nos expériences de double hybride ont indiqué un défaut d’interaction de MEK1

C350 et RAF-1 (tableau 3-1), Alors que la région MSS semble être désigné comme le site

d’interaction RAF-MEK1/2 [71,102], nos résultats suggèrent une implication directe du

fragment MEK1 compris entre 350 et 362 dans l’attachement à Raf ou une déformation

conformationnelle du mutant C350 qui altère la stabilité de l’interaction MEK1-Raf.

Sachant la nature conservée de la famille de MAPKK des protozoaires jusqu’aux

mammifères, l'élucidation de la structure en cristal de MEK1 dans ses conformations

actives et inactives permettra de mieux comprendre les mécanismes contrôlant l'activation

de cette famille d’enzymes.

D’une façon générale, l’identification et la caractérisation d’une voie de signalisation qui

serait dépendante de MEK1 mais indépendante de MEK2 permettront éventuellement de

développer de nouveaux inhibiteurs spécifiques qui pourront servir dans la lutte contre

certaines maladies, notamment le cancer.

Annexe

144

A. Criblage double hybride chez la levure

A.1. Tableaux récapitulatifs des clones isolés lors du criblage

double hybride

N° Clone Gène/protéine Région identifiée Remarques DNC1 1 Mek2 a.a 296--> Confirmé 2 hybride

2 Mek1 Confirmé 2 hybride 3 Mek1 Confirmé 2 hybride 4 Mek1 a.a 253--> Confirmé 2 hybride 5 Mek1 a.a 253--> Confirmé 2 hybride 6 Mek2 a.a 313--> Confirmé 2 hybride 7 Mek1 a.a 323--> Confirmé 2 hybride 8 Mek1 a.a 322--> Confirmé 2 hybride 9 Mek1 a.a 322--> Confirmé 2 hybride 10 Mek1 a.a 322--> Confirmé 2 hybride 11 Mek2 a.a 296--> Confirmé 2 hybride 12 Mek1 Confirmé 2 hybride 13 Mek1 a.a 319--> Non confirmé 14 Mek1 a.a 279--> Confirmé 2 hybride 15 Mek1 a.a 323--> Confirmé 2 hybride 16 Mek1 a.a 247--> Confirmé 2 hybride 19 Mek2 a.a 296--> Confirmé 2 hybride 20 alpha-2 globin

(HBA1) Négatif 2 hybride

22 Mek1 a.a 291--> Confirmé 2 hybride 23 Mek2 a.a 211--> Confirmé 2 hybride 28 N/D Négatif 2 hybride 30 N/D Négatif 2 hybride

Mauvaise séquence 33 elongation factor

1-alpha Négatif 2 hybride

35 Mek1 a.a 247--> Confirmé 2 hybride

145

38 ? Négatif 2 hybride 39 N/D Négatif 2 hybride 42 Mitochondrial DNA Négatif 2 hybride 45 Replacement variant

of histone H3.3 Essai 2 hybride

séquencé 2 côtés 46 Replacement variant

of histone H3.3 Confirmé 2 hybride

56 Histone H3.3A Confirmé 2 hybride séquencé 2 côtés

58 Mek1 a.a 179--> Confirmé 2 hybride 60 Mek1 a.a 244--> Confirmé 2 hybride 61 H. Sapiens BTF3 Négatif 2 hybride

séquencé 2 côtés 63 prostaglandin

D synthase Négatif 2 hybride

65 ? Négatif 2 hybride 66 Mek2 a.a 332--> Confirmé 2 hybride

Placenta 23 Mek2 a.a 329--> Confirmé 2 hybride

N° Clone Gène/protéine Région identifiée Remarques DNC2 1 Mek1 a.a 323--> Confirmé 2 hybride

2 Mek1 Non confirmé 3 c-Raf Domaine catalytique Confirmé 2 hybride 4 Mek2 a.a 272--> Confirmé 2 hybride 5 Mek1 a.a 211--> Confirmé 2 hybride 6 Mek1 a.a 322--> Confirmé 2 hybride 7 Mek1 a.a 324--> Confirmé 2 hybride 8 Mek2 a.a 270--> Confirmé 2 hybride 9 Mek2 a.a 246--> Confirmé 2 hybride 10 Mek1 a.a 215--> Confirmé 2 hybride 11 Mek1 a.a 259--> Confirmé 2 hybride 12 Mek2 a.a 211--> Confirmé 2 hybride 13 Mek2 a.a 295--> Confirmé 2 hybride 14 Mek2 a.a 273--> Confirmé 2 hybride 15 ? Négatif 2 hybride 16 Mek1 a.a 324--> Confirmé 2 hybride

séquencé 2 côtés

146

17 Mek2 a.a 289--> Confirmé 2 hybride 18 Mek1 a.a 253--> Confirmé 2 hybride 19 Mek1 a.a 327--> Confirmé 2 hybride 20 ? Négatif 2 hybride 22 Mek1 a.a 253--> Confirmé 2 hybride 25 Mek1 a.a 324--> Confirmé 2 hybride 33 Mek1 a.a 324--> Confirmé 2 hybride 35 Mek2 a.a 274--> Confirmé 2 hybride 36 PLZF a.a 416--> Négatif 2 hybride 37 Mek1 a.a 231--> Confirmé 2 hybride 41 Mek1 a.a 231--> Non confirmé 43 Mek1 a.a 231--> Non confirmé 44 Histone H3.3A Essai 2 hybride

séquencé 2 côtés 46 Replacement variant

of histone H3.3 Essai2 hybride

séquencé 2 côtés 50 Gène homologue à

M96A humain a.a 65 –> prot : 594 a.a.

homologue à M96 de souris. 2X séquencé. 2 côtés

55 Mek1 a.a 231--> Non confirmé 60 ? mauvaise séquence 62 Mek1 a.a 323--> Confirmé 2 hybride

séquencé 2 côtés 65 ? Négatif 2 hybride 66 Mek1 a.a 252--> Non confirmé 67 Mouse histone 4 Essai double hybride 69 Mek1 séquencé. 2 côtés 75 ? Négatif 2 hybride 84 EST MDB1180 Mouse

brain, Stratagene Mus musculus cDNA

3'end

Négatif 2 hybride

90 ? Négatif 2 hybride

147

A.2. Vue d’ensemble des faux positives courrament isolés lors

des criblages double hybride chez la levure

Protéines Identifiées comme faux positives

Interactions protéiques réelles

Protéines hsp 16 5 Protéines ribosomales 14 1 Cytochrome oxidase 5 - Protéines mitochondriales 3 1 Sous-unités protéasomales 4 3 ferritine 4 - ARNt synthase 3 - Protéines reliées au collagène 3 - Protéines doigt de Zn 3 4 vimentine 2 -

Adapté du site internet de Golemis E., [464].

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