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I. Historique
Les véritables cultures apparaissent en 1952 avec la culture de cellules cancéreuses de Madame
Henrietta Lacks qui donna la lignée HeLa et la mise en place des techniques de culture cellulaire.
Avant cette date plusieurs expériences ont vu le jour.
1885 Roux démontre que des cellules d'embryons de poulets peuvent être maintenues en vie dans
une solution saline,
1907 Harrison cultive des fragments de moelle épinière de grenouille dans un caillot de lymphe,
1913 Alexis Carrel mise en culture de cellules animales sur de longues périodes lorsque nourries
aseptiquement,
1916 Rous et Jones introduisent la trypsine pour la sous-culture de cellules adhérentes,
1940 Usage des antibiotiques, pénicilline et streptomycine réduisent les contaminations
1941 Fisher étudie l’ajout de sérum aux milieux,
1948 Earle et al isolent des cellules de souris (lignée L),
1955 Eagle mise au point du milieu de base défini + sérum,
1960 Barski et al technique de la fusion cellulaire,
1961 Hayflick et Moorhead les fibroblastes humains sénescent puis meurent après un nombre
déterminé de divisions en culture,
1965 Ham introduit un milieu sans sérum pour la culture de fibroblastes,
1970 Sato définit les facteurs de croissance et hormones de plusieurs cellules,
1975 Köhler et Milstein production d'anticorps monoclonaux par des lignées d'hybridomes
II. Introduction aux cultures
cellulaires
La culture cellulaire est un ensemble de techniques de biologie utilisées pour faire croître des
cellules hors de leur organisme (ex-vivo) ou de leur milieu d'origine. Cet outil devient de plus en
plus nécessaire pour valider des protocoles avant l’étape d’expérimentation animale
La culture cellulaire est un outil précieux pour les chercheurs dans de nombreux domaines. Elle
facilite l'analyse des propriétés biologiques et des processus qui ne sont pas facilement accessibles
au niveau de l'organisme intact. Le maintien des cellules en culture, qu'elles soient primaires ou
immortalisées, nécessite la maîtrise pratique de quelques techniques essentielles.
De nos jours, les cultures cellulaires et tissulaires ne sont pas seulement utilisées dans la recherche
fondamentale, elles le sont également dans les biotechnologies appliquées et jusque dans la
recherche clinique. Les plus grandes puretés et qualités sont requises dans les tests de toxicité, les
contrôles de qualité de produits chimiques et biologiques et en tant que systèmes de production dans
l’industrie (par exemple dans la fabrication d’anticorps monoclonaux, etc.) Le respect des normes
de qualité appliquées à la culture cellulaire et tissulaire est une condition préalable au caractère
comparable et reproductible des tests.
I. Conditions de culture cellulaire
Il existe quatre conditions de base pour une culture cellulaire réussie. Pour plus d’informations on
peut se référer à l'une des nombreuses ressources précieuses qui fournissent les informations
nécessaires à la création d'un laboratoire de culture tissulaire, ainsi que la description des principes
de base de la technique stérile.
1.1. Laboratoire de culture cellulaire équipé.
C’est une installation de culture cellulaire bien établie et bien équipée. Le niveau de confinement
biologique requis (niveaux 1 à 4) dépend du type de cellules cultivées et du risque que ces cellules
contiennent et transmettent des agents infectieux. Par exemple, la culture de cellules de primates,
de lignées de cellules humaines transformées, de lignées de cellules contaminées par des
mycoplasmes et de cellules humaines non testées nécessite au minimum une installation de
confinement de niveau 2.
Toutes les installations devraient être équipées des éléments suivants:
1
une enceinte de sécurité
biologique certifiée (PSM)
qui protège à la fois les
cellules en culture et le
technicien des contaminants
biologiques.
2
une centrifugeuse, de
préférence capable de
réfrigération et équipée de
supports de confinement
appropriés, dédiée à la culture
cellulaire
3 un microscope pour l'examen
des cultures cellulaires et le
comptage des cellules
4 un incubateur humidifié réglé
à 37 ° C avec 5% de CO2
dans l'air
5 Un bain-marie à 37 ° C
Jusqu’ici, il s'agisse d’exigences de base. D’autres considérations concernent l'emplacement de
l'installation, la circulation de l'air et d'autres caractéristiques de conception facilitant une culture
sans contamination. Pour plus d’information, on doit consulter les exigences de l’installation et les
consignes de sécurité des laboratoires disponibles dans des agences gouvernementales appropriées.
https://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/LabBiosMan3rdFrenchweb.pdf
1.2. Le respect de l’asepsie
Pour qu’une culture cellulaire réussisse, il faut respecter la stérilité. Avant de commencer tout
travail :
l'enceinte de sécurité biologique (PSM2) doit être allumée et laissée fonctionner pendant au
moins 15 minutes pour purger l'air contaminé.
Toutes les surfaces de travail doivent être décontaminées avec une solution appropriée.
L'éthanol à 70% ou l'isopropanol sont couramment utilisés à cette fin.
Tous les matériaux nécessaires à la procédure doivent être décontaminés de la même
manière et placés dans ou à proximité de la hotte. Ceci est particulièrement important si les
solutions ont été chauffées au bain-marie avant utilisation.
Le travailleur doit porter une blouse (ou combinaison) de protection individuelle adaptée au
type de cellule en question. Il s’agit généralement d’une blouse de laboratoire dont les
poignets sont fixés avec du ruban adhésif pour empêcher le déplacement de contaminants
biologiques et de gants en latex ou en vinyle recouvrant toute la peau exposée pénétrant
dans l’enceinte de biosécurité.
Il faut vaporiser le décontaminant sur les mains gantées avant de les mettre dans la hotte et
les gants doivent être changés régulièrement si quelque chose à l'extérieur du cabinet est
touché.
Il convient de veiller à ce que tout ce qui entre en contact avec les cellules d'intérêt ou les réactifs
nécessaires à leur culture et à leur manipulation soit stérile (autoclavé ou stérilisé sur filtre). Deux
mises en garde sont essentielles :
o Premièrement, les boîtes de culture stériles peuvent être sous forme de flacon de
culture tissulaire ou en style de boite de Petri. Bien que l'un ou l'autre puisse être
utilisé pour la croissance de cellules non adhérentes, les cellules adhérentes
nécessitent des boîtes traitées pour la culture de tissu pour une adhérence et une
croissance appropriées.
o Deuxièmement, il est possible d'utiliser du verre plutôt que du plastique jetable.
Cependant, il est essentiel qu’il soit bien nettoyé par un détergent. Cependant, ce
dernier peut persister dans les boites et inhiber la croissance des cellules, il doit être
totalement éliminé et qu'une, puis bien stérilisé (121 °C pendant au moins 15 min
dans un autoclave).
1.3. Réactifs
Il faut qu’il ait des réactifs et des fournitures appropriés, de qualité contrôlée :
Il existe de nombreux fournisseurs de milieux de culture de tissus (de base et spécialisés) et
de suppléments, comme Invitrogen (www.invitrogen.com), Sigma–Aldrich
(www.sigmaaldrich.com), BioWhittaker (www.cambrex.com) et StemCell Technologies
Inc. (www.stemcell.com). Sauf indication contraire dans les protocoles accompagnant vos
cellules d'intérêt, toute source de réactifs de qualité culture cellulaire devrait être acceptable
pour la plupart des objectifs de culture cellulaire.
De même, il existe de nombreux fournisseurs de la vaisselle en plastique nécessaires pour
la plupart des applications de culture cellulaire (c'est-à-dire des boîtes de culture et / ou des
flacons, des tubes, des pipettes jetables). Les sources de ces fournitures incluent Corning
(www.corning.com/lifesciences/), Nunc (www.nuncbrand.com) et Falcon
(www.bdbiosciences.com/discovery_labware).
1.4. Les bonnes pratiques
Il s’agit de la maîtrise pratique des techniques fondamentales de culture du type cellulaire d'intérêt.
Diverses lignées cellulaires existent, à croissance continue, non adhérentes (exemple P815, EL-4)
ou adhérentes (exemple STO, NIH 3T3). Ces lignées cellulaires peuvent être obtenues auprès de
fournisseurs réputés tels que la American Tissue Type Collection (ATCC; www.atcc.org) ou la
DSMZ (collection allemande de microorganismes et de cultures cellulaires) (www.dsmz.de/mutz /
mutzhome.html). Alternativement, elles peuvent être obtenues auprès d’autres laboratoires
collaborateurs. Quelle que soit la source des cellules, il est conseillé de vérifier l'identité de la lignée
cellulaire et de s'assurer qu'elle est exempte de contamination par les mycoplasmes.
Eventuellement on a besoin de cellules primaires. Deux principaux défis confrontent l’utilisation
de ces types de cellules sont les contaminations bactériennes, conséquence de la procédure
d'isolement, et la sénescence cellulaire.
III. Milieux & matériels de culture cellulaire
La Culture Cellulaire regroupe un ensemble de techniques permettant de reproduire aussi
fidèlement que possible in vitro (hors de l’organisme), les conditions d’environnement que la cellule
trouve in vivo (dans son milieu naturel). De ce fait, il est possible d’étudier, à l’échelle de la cellule,
les effets de certains virus, de traitement médicamenteux ou cosmétiques, de leur faire produire des
anticorps (substances aidant à la défense de l’organisme), de comprendre leur fonctionnement.
1. Besoins nutritifs et types trophiques
Toutes les cellules, qu’elles soient eucaryotes (animales, végétales, fongiques) ou procaryotes
(bactéries), ont des besoins nutritifs plus ou moins nombreux.
Dans le cadre de la culture d’organismes unicellulaires (bactéries, levures), ces exigences sont la
plupart du temps limitées. En revanche, dans le cadre de la culture de cellules eucaryotes
supérieures, les besoins nutritifs sont plus nombreux :
eau : indispensable à la vie ;
éléments de construction :
– macroéléments organiques (g·L−1 ou mg.L−1) : C, H, O, N, P, S
– macroéléments ioniques = ions minéraux (g·L−1 ou mg · L−1) : phosphates, sulfates, nitrates,
K+, Ca2+ , Cl−, Mg2+…
– oligoéléments (µg·L−1 ou ng·L−1) : Cu2+, Zn2+, Mn2+, Co3+, I–…
énergie : venant de l’oxydation des molécules organiques ou minérales, ou de la lumière
(photons) ;
facteurs de croissance : acides aminés particuliers, vitamines, hormones…
Remarques :
– Les cellules végétales faisant la photosynthèse n’ont pas forcément besoin de carbone
organique pour se développer : elles peuvent se contenter de CO2 (carbone minéral).
– L’oxydation des molécules organiques lors du catabolisme peut être complète ou
incomplète, et peut concerner une ou plusieurs sources organiques.
– Les cellules n’ayant aucune exigence en facteurs de croissance sont rares dans le cas des
cellules eucaryotes.
Les types trophiques (correspondant aux sources en carbone, énergie et facteurs de croissance) sont
rappelés dans le tableau suivant :
Source de Carbone Source d’Énergie Facteurs de croissance
C. végétale CO2 Autotrophe Lumière Phototrophe Non exigeant Prototrophe
C. animale Organique Hétérotrophe Oxydation Chimiotrophe Exigeant Auxotrophe
2. Milieux de culture
Préparations qui contiennent toutes les substances nutritives (sels minéraux, acides aminés, lipides,
glucides, vitamines) nécessaires aux cellules, en quantités suffisantes et dans des conditions de vie
favorables. Cela implique une composition qui répond aux besoins nutritifs des cellules étudiées,
mais également de présenter des conditions optimales de croissance (pH, force ionique…).
2.1. Caractéristiques
Les milieux de culture pour cellules eucaryotes doivent assurer :
la nutrition et le support des cellules : ils peuvent être liquides ou gélifiés (présence
d’agarose entre 5 et 15 g·L−1) ;
un pH optimal (pH entre 7,2 et 7,4 pour les cellules animales) : système tampon
CO2/hydrogénocarbonate (avec une étuve dont le taux de CO2 est contrôlé), ou tampon
organique (HEPES par exemple) ;
la tonicité : milieu isotonique au fluide extracellulaire des animaux, et atmosphère saturée
en vapeur d’eau (pour éviter l’évaporation qui conduirait à une augmentation de
l’osmolarité) ;
l’asepsie : le milieu doit être stérile, on y ajoute des antibiotiques à 1 %.
2.2. Composition et préparation
Il existe différentes compositions, mais qui assurent toutes les besoins nutritifs des cellules qu’on
y cultive. Les milieux sont en général composés comme suit :
une base minimale = milieu minimum, contenant les éléments indispensables, de
composition parfaitement maîtrisée (synthétique) : solution saline tamponnée, acides
aminés, substrat énergétique, vitamines, coenzymes et éventuellement nucléotides. ex :
MEM, DMEM, RPMI, HAM…
un additif complexe (la plupart des cellules ne se contentant pas de ce milieu minimum) : le
sérum (sérum de veau fœtal SVF, ou sérum de veau nouveau-né SVNN), à raison de 5 à 10
% (V/V) en général, et dont le rôle est multiple : adhérence, apport d’oligo-éléments et de
facteurs de croissance cellulaires, inhibition de la trysine... Après ajout de sérum, dont la
composition peut varier d’un lot à l’autre, le milieu est dit semi-synthétique. Lors de la
croissance contrôlée de certaines lignées cellulaires, on doit parfaitement maîtriser la
composition du milieu : on remplace alors le SVF/SVNN par des substituts totalement
synthétiques.
2.3. Stérilisation
Elle est nécessaire, avant utilisation, d’éliminer toute forme de vie (y compris les spores
bactériennes). Elle se fait par différents moyens physiques : filtration (pour les molécules fragiles),
irradiation ou autoclavage.
3. Conditions de culture
3.1. Température
Elle est en général de 37 °C pour les cellules animales, maintenue par un appareillage de type
étuve. Elle est plutôt de 22-25 °C pour les cellules végétales en serre thermostatée (avec
parfois un cycle journalier de températures).
3.2. pH
Le pH est maintenu relativement constant grâce au système tampon, qui utilise notamment le
CO2 de l’atmosphère de culture. Il sera aux alentours de 7,2-7,4 pour les cellules animales, mais
légèrement plus acide (5,5 à 6) pour les cellules végétales.
L’indicateur coloré (rouge de phénol) est important : rouge si basique (contamination fongique),
jaune si acide (contamination bactérienne ou mort cellulaire), rose pour un pH normal.
Système tampon CO2 /hydrogénocarbonate
Un tampon est constitué par l’association d’un acide faible et d’un sel de base forte, ou d’une
base faible et d’un sel d’acide fort, et qui empêche ou limite la variation de pH d’une
solution lorsqu’on lui ajoute un acide ou une base forte.
Le système CO2/hydrogénocarbonate est un tampon naturel du sang et du liquide interstitiel
(mais pas le seul). Malgré leur pKa de 6,10, les hydrogénocarbonates sont efficaces car ils sont
fortement concentrés dans le sang et le CO2 s’échange avec l’atmosphère : on parle de système
tampon « ouvert ».
En culture cellulaire, le CO2 de l’atmosphère de culture se dissout partiellement dans l’eau du
milieu pour former un acide et un couple tampon, selon l’équilibre suivant :
CO2 + H2O H2CO3 H+ + HCO−
3
Rappel : équation d’Henderson-Hasselbach appliquée au couple ci-dessus
pH = pKa +
log
[BASE] = 6, 1 + log
[HCO3−]
[ACIDE] [H2CO3]
3.3. Atmosphère (gaz et hygrométrie)
En général, on utilise une pression de CO2 (pression partielle pCO2 = 5-15 %, exprimée en %
de pression totale). En outre, l’air doit être humide (84-85 %), ce qui évite l’évaporation du
milieu. Certains types cellulaires nécessitent également une atmosphère enrichie en N2.
3.4. Lumière
Pour les cellules végétales, on peut contrôler l’illumination des cultures, en utilisant une serre
dont le cycle lumineux est défini, en intensité et en durée (photopériode mimant l’alternance
jour/nuit).
IV Matériel et équipement Un matériel spécifique et un équipement adaptés sont attendus pour ces cultures.
4.1. Contenants (flacons, flasks, boîtes, plaques tubes...)
On regarde la nature du support, la présence de bouchons à filtre (assurant les échanges gazeux
dans le cadre d’un système de culture semi-clos), la surface de contact avec l’air, la surface
d’adhérence…
La nature du support est très importante pour les cultures stationnaires : il peut s’agir de verre,
de plastique, ou même de supports organiques (collagène, fibronectine…).
4.2. Enceintes thermostatées et/ou éclairées
Il peut s’agir d’étuves à CO2 (cellules animales) ou de serres (cellules végétales), dans
lesquelles on contrôle également un cycle de température et d’illumination.
4.3. Hottes à flux laminaire
Elles assurent la stérilité des manipulations sur les cellules en culture, en préservant la surface
de travail de l’arrivée de tout micro-organisme ou autre contaminant porté par des poussières.
Un flux d’air vertical continu et filtré joue le rôle de barrière.
Le travail sous hotte doit être précis et minutieux, afin de ne pas être vecteur de conta-minations.
4.4. Cytoculteurs (bioréacteurs cellulaires)
Dans le cadre de production d’un métabolite par une culture cellulaire donnée, les flasks ne
suffisent en général plus, de par leur volume limité. On utilise alors des bioréacteurs pour cellules
eucaryotes, sortes d’enceintes complexes de volume plus important, permettant alors le contrôle et
la régulation de nombreux paramètres de façon précise (température, pH, agitation, oxygénation…).
Ils conviennent bien pour des cultures en suspension à grande échelle. On peut les utiliser :
en système clos = culture discontinue = batch : le milieu n’est pas renouvelé au cours de
la culture, l’appauvrissement en éléments nutritifs et l’accumulation de déchets aboutissent
à la fin de la croissance cellulaire ;
en système semi-clos = culture discontinue renouvelée = fed-batch : du milieu frais (ou
des gaz) est ajouté régulièrement au milieu (perfusion), dans la limite du volume du
cytoculteur ;
en système ouvert = culture continue : l’ajout continuel de milieu frais (et de gaz
appropriés) et l’élimination des déchets assurent une culture sur la durée et donc une plus
grande production du métabolite d’intérêt ; l’étape délicate reste alors la purification de ce
produit, sans oublier de conserver la stérilité du procédé.
VI. Entretien des lignées cellulaires
1. Évolution d’une lignée
La croissance d’une lignée cellulaire présente plusieurs phases, caractérisées notamment par la
vitesse spécifique de croissance µ (voir figure et tableau suivants).
Quand la « densité cellulaire » (nombre volumique de cellules par mL, nombre surfacique de
cellules en cm−2) devient trop importante et que les cellules recouvrent entièrement la surface de
culture (cas de cellules adhérentes), on parle de confluence : il se produit alors une inhibition de
contact qui se traduit par la phase de plateau (voire la phase de décélération) observée ci-dessous.
Les lignées cancéreuses ont en général perdu cette inhibition de contact, et prolifèrent de manière
non contrôlée avec un nombre de passages infini.
La courbe permet de déterminer le temps de doublement, ou temps de génération, ou encore temps
de division cellulaire (voir exercice).
Figure : Cinétique de croissance des cellules en culture.
La légende de la figure est présentée dans la tableau suivant.
Phases Phénomènes µ
1 Adaptation
(latence)
Courte durée en général : les cellules se fixent au plastique,
réorganisent leur cytosquelette et s’étalent Nulle
2 Accélération Les cellules commencent à se multiplier Augmente
3 Croissance
exponentielle
Croissance rapide et importante, dont la vitesse peut être ralentie
artificiellement (milieu pauvre sans sérum, moins de passages,
température réduite...)
Maximale
et constante
4 Décélération Courte ; certaines cellules meurent, le milieu s’étant appauvri et/ou
devenant hostile (déchets) Diminue
5 Stationnaire Équilibre entre morts et multiplications cellulaires Nulle
6 Déclin Plus de morts que de multiplications, le milieu devenu trop toxique
(déchets) et trop peu nutritif (carences) Négative
2. Changement de milieu et repiquage
On peut éviter les deux dernières phases de la courbe de croissance en changeant le milieu (ajout
de milieu neuf par exemple), ou en repiquant la culture à temps (passage). En effet, la croissance
cellulaire entraîne une consommation des substrats, et l’accumulation de déchets métaboliques qui
acidifient le milieu et peuvent aboutir à la mort cellulaire. De plus, l’augmentation de la « densité
» cellulaire entraîne l’arrêt de la croissance, et même la mort (nombre surfacique de cellules
maximal ≈ 105 à 106 cm−2 en général).
Les indices de cet état sont le jaunissement du milieu (indicateur de pH) et la modification
morphologique des cellules (arrondissement, décollement...).
2.1. Changement de milieu
Pour les cellules adhérentes non encore confluentes, on peut se contenter de changer le milieu
appauvri par du milieu neuf : les cellules continuent de se multiplier.
2.2. Repiquage ou passage
La périodicité du repiquage dépend du type cellulaire et de la vitesse de croissance. Il s’agit cette
fois de changer le milieu et le contenant, en transférant les cellules dans un contenant plus grand ou
en les diluant pour que la croissance continue. Les étapes sont les suivantes (travailler stérilement)
:
élimination de l’ancien milieu : aspiration à la pipette ;
lavage des cellules (au PBS par exemple) : élimination des traces de SVF qui inhibent
l’activité trypsique ;
décollement des cellules = trypsination : utilisation de trypsine, une protéase qui
rompt les liaisons cellules/support pour les décoller du support, en présence d’EDTA
(éthylène-diamine-tétra-acétate) qui chélate les cations divalents normalement
nécessaires aux intégrines pour l’adhésion ;
ajout de milieu complet avec SVF : il contient de l’antitrypsine qui arrête l’action de
la trypsine, et permet de remettre les cellules en suspension ;
numération cellulaire (et test de viabilité cellulaire) : afin de déterminer la
concentration cellulaire et de diluer correctement la culture ;
inoculation d’un nouveau flask de culture : ajout d’une quantité définie de cellules dans
un volume défini de milieu, sur une surface définie.
3. Conservation
Les lignées cellulaires sont initialement issues d’explants, c’est-à-dire de tissus animaux ou
végétaux dissociés ou broyés : on obtient alors une culture primaire, qu’il est possible de repiquer
pour obtenir une ou des cultures secondaires.
Dans le cas de cellules normales (non transformées), le nombre de passage est limité, et il devient
difficile de conserver longtemps ce genre de cultures.
Pour les cellules transformées en revanche, le nombre de passage est théoriquement infini,
puisqu’elles sont immortelles. Cependant, la multiplicité des repiquages peut aboutir à un
changement phénotypique des cellules, et on peut avoir besoin de conserver des échantillons des
différents passages.
Il existe différentes techniques de conservation des cellules eucaryotes.
3.1. Conservation par le froid
Les cellules peuvent être conservées en azote liquide (–196 °C) pendant de longues périodes, à
condition d’avoir été correctement congelées et dans une solution cryo-protectrice appropriée
(DMSO par exemple). On utilise pour cela des cryotubes en plastique spécial, qui résistent à cette
température. La congélation se fait en général en deux étapes :
congélation progressive jusqu’à –80 °C,
puis congélation rapide après immersion dans l’azote liquide (–196 °C). La revivification
des cultures est une étape délicate, car :
le retour à 37 °C doit être rapide (bain thermostaté),
le DMSO doit être rapidement éliminé par lavage-centrifugation (le DMSO est toxique à
37 °C).
3.2. Conservation sur milieu pauvre
Comme pour les bactéries, on peut utiliser des milieux pauvres pour la conservation des lignées
cellulaires. L’avantage est qu’il est plus facile de faire repartir une telle culture que de repartir d’une
culture congelée. L’inconvénient est que la conservation n’est pas forcément optimale, puisque les
cellules continuent de se multiplier, à un rythme très ralenti.
VII. Les contaminants des cellules
La qualité des résultats de recherche dépend de la santé des cultures cellulaires.On doit être
vigilant face aux divers contaminants, soit d’origine biologique ou chimique.
Qu’ils soient visibles ou non, destructeurs ou non, les contaminants agissent sur la croissance,
altèrent les caractéristiques et les fonctions cellulaires et influent sur la qualité des résultats.
Parfois, certains agents ne sont pas toxiques individuellement mais peuvent le devenir, soit par
leur forte concentration ou combinés avec un autre agent. Également, certains types cellulaires
sont plus sensibles que d’autres. Voici quatre bonnes raisons de s’y attarder :
Perte d’argent et de temps
Résultats expérimentaux erronés ou inappropriés
Perte de produits importants
Embarras personnel (réputation dû à des résultats erronés)
1. Contaminants chimiques Les contaminants chimiques sont définis comme étant une présence de produits non vivants ayant
un effet indésirable sur la culture cellulaire. Ils peuvent être une source de variabilité des résultats.
Ions métalliques, endotoxines et autres impuretés du milieu, du sérum ou de l’eau.
Qualité du plastique jetable (pétris, tubes, bouteilles)
Radicaux libres et peroxyde d’hydrogène présents dans le milieu causés par la photo
activation du tryptophane ou de la riboflavine exposé à la lumière. Ammoniaque dans le cas
de la dégradation de la L-glutamine.
Reste de détergent sur le verre ou sur les pipettes, résidu qui vient du papier aluminium.
Résidu de germicides ou pesticides utilisés lorsqu’on désinfecte les incubateurs, comptoirs
ou autres instruments.
Impureté de CO2 de l’incubateur.
1.1. Milieu
La qualité de l’eau qu’on utilise pour préparer le milieu. On devrait utiliser de l’eau ultra-pure.
Les réactifs achetés doivent être de qualité supérieure (degré de pureté) et toujours testés pour la
culture cellulaire.
L’entreposage et le chauffage du milieu peuvent affecter ce dernier. GARDEZ VOS MILIEUX
A L’ABRI DE LA CHALEUR ET DE LA LUMIERE. La L-Glutamine contenue dans le
milieu se dégrade en ammoniaque au fur et à mesure que votre milieu baigne dans le bain-marie
ou sous la hotte. En 7 jours d’exposition, il ne reste plus de L-Glutamine. D’autres ingrédients
tels que la riboflavine, le tryptophane et l’HEPES se transforment en peroxyde d’hydrogène et
en radicaux libres.
Solution
Invitrogen offre un produit de remplacement : le GlutaMax plus stable à la lumière et à la
chaleur.
Achetez du milieu sans L-Glutamine et le rajouter au besoin
Préparez de plus petites quantités de milieu
Laissez votre bouteille de milieu sortie le moins longtemps possible, évitez la chaleur et la
lumière.
Solution extrême et difficile à réaliser : mettez du papier d’aluminium sur vos bouteilles et
travaillez sous la hotte à la noirceur.
1.2. Sérum La composition d’un sérum est variable d’un lot à l’autre pour sa quantité d’hormones de
croissance, de facteurs de croissance et de matières toxiques. Cette variation peut ainsi causer des
changements à vos cultures. Il est préférable de le décongeler au frigo plutôt qu’à 37°C. On voit
souvent de petits débris dans le sérum causés par le gel-dégel, ce n’est pas contaminé mais ce
sont des protéines précipitées et c’est normal.
Notons que certaines protéines du sérum ont une affinité avec les contaminants chimiques tels
que les métaux lourds.
1.3. Eau
Pour la préparation des solutions (milieu, PBS, autres) le système MILLI-Q RO est un bon choix,
tant qu’il est bien entretenu.
1.5. Endotoxines
Ce sont des lipolysaccarides produits par les déchets des bactéries gram- dans l’eau, aussi appelés
pyrogène.
Certains types cellulaires qui expriment des produits de sécrétions tels que les hybridomes (Ac),
vaccin ou lignée stables (protéines), ont déjà un taux élevé de toxicité.
1.6. Entreposage de la vaisselle
On peut retrouver dans les bouteilles utilisées, des métaux lourds, des composantes organiques,
des colorants, des solvants, des pesticides. La même chose peut se retrouver dans les bouchons,
sur les pipettes.
On peut retrouver également des résidus de désinfectant, savon, détergent, papier aluminium…
1.7. Lumière
Certaines composantes du milieu exposées à la lumière, ainsi qu’à la chaleur, produisent du
peroxyde hydrogène (HEPES), de l’ammoniaque (L-Glutamine) et des radicaux libres, toxiques
pour les cellules. Notez que plus il est exposé, plus il est toxique.
1.8. Incubateur
Les produits utilisés pour nettoyer l’incubateur peuvent être toxiques. Il est important de bien
rincer.
Le CO2 peut contenir d’autres composantes telles que de l’huile ou autres gaz (CO). La qualité
du gaz (CO2) MEDICAL est supérieure au gaz (CO2) INDUSTRIEL. Pour les culture, il est
préférables d’utiliser le dernier même si son prix est plus cher.
2. Contaminants biologiques
Ces derniers sont plus facilement détectables et souvent visibles à l’œil nu (bactéries, levures,
moisissures, etc.). La croissance rapide de ses micro-organismes (surtout en absence
d’antibiotique) permet de les détecter en peu de temps : turbidité, changement de pH, mort
cellulaire. Cependant, l’utilisation fréquente d’antibiotiques contribue à garder un faible taux
d’infection, difficile à percevoir et persistante dans l’entourage. Ce sont les bactéries qui
résistantes! Une contamination insidieuse persistante peut causer des altérations significatives et
compromettre vos résultats.
D’autres bactéries sont moins perceptibles au microscope comme les bactéries de petites
dimensions ou intracellulaires.
2.1. Bactéries
Elles sont connues soit par leurs mobilités, leurs formes définies. Elles pousse rapidement et
perturbe le pH du milieu et cause la turbidité. Soyez vigilant. Les bactéries anaérobies poussent
beaucoup plus lentement.
2.3. Levures, moisissures
Plus gros, les cellules fongiques poussent en colonies, signes de bourgeonnement. Les spores qui
sont invisibles donnent parfois des maux de tête… On sait quand ça commence mais on ne sait
pas quand ça fini. Les spores restent latentes et éclosent sous l’effet d’un stress.
Une des souches fréquentes, Candida ressemble à des ballons de Football, un contour très défini
et l’intérieur brillant en contraste de phase. Ne pas ouvrir les boites de Pétris dans la salle de
culture, vous risqueriez de libérer les spores dans l’air ambiant.
2.4. Virus
Trop petits pour être détectables à moins de tests sophistiqués.
Les virus sont souvent spécifiques à certaines espèces ou à certains tissus
Plusieurs donnent un effet cythopatique (mort des cellules)
Attention aux cultures primaires humaines, sources de virus (HIV, HBV, EBV…)
Source : Le sérum peut contenir des virus bovin.
2.5. Protozoaire
La plupart sont unicellulaires, tel que les amibes
Certains peuvent former des spores
Certains ont un effet cythopatique (cellules détruites en moins de 10 jours).
Source : poussière, saleté, air, occasionnellement des tissus (tissu de gorge)
2.6. Invertébré
Araignées ou insectes (mites)
Source : boîtes de cartons, pieds, chariot
2.7. Mycoplasmes
Le mycoplasme est le plus dévastateur et le plus répandu des contaminants. On le surnomme
le cancer des cellules. Aussi appelé PPLO (PleuroPneumonialike Organisme), il en existe de
nombreuses souches. Ils agissent sur les cellules soit par la production de substances codées par
le génome bactérien ou soit par l’utilisation de constituants du milieu de culture. Les
mycoplasmes ont la capacité d’affecter leur cellule hôte dans leur fonction, croissance,
métabolisme, morphologie, attachement membranaire, propagation de virus, causent des
dommages au niveau des chromosomes et enfin provoquent la mort cellulaire.
Description
procaryote 0.15 à 0.8 µm de diamètre (passe à travers 0.2 µm)
Dépourvu de paroi cellulaire
Bactéries-likes, se comporte un peu comme un virus
Leur ADN bicaténaire est circulaire et riche en A-T.
Intracellulaire, se réplique de façon indépendante
Poussent à forte densité 107 à 109 UFC/ml
Autres souches associés : acholeoplasma et les uréoplasma
Résistantes a plusieurs antibiotique et au gel-dégel
Division intervient après 6 heures
Apparence
Ne sont pas visibles au MO, seul des tests spécifiques (PCR) peuvent en détecter la présence.
Leur présence est suspectée lorsqu’on observe un changement dans le métabolisme, une
diminution de croissance, un milieu plus acide ou plus alcalin selon la variété, perte d’adhérence
ou des débris cellulaires dû à une mort cellulaire.
Conséquences
Les cellules infectées peuvent donner des résultats erronés qui sont causés soit par des produits
des mycoplasmes ou soient ils sont cachés par ceux-ci.
L’infection réduit la productivité, le taux de croissance et la viabilité des cellules.
Cette même infection produit des altérations membranaires (caractéristique antigénique). Il affecte
la synthèse des protéines, RNA, DNA... Les mycoplasmes peuvent interférer avec le métabolisme
des AA et des acides nucléiques des cellules hôtes.
Exemple : Augmente la dégradation des acides nucléiques. Les mycoplasmes utilisent L’Arg et
diminuent de 2 logs le titre de la production virale.
Source
Les sources principales sont la flore orale humaine, les bactéries en suspension dans l’air, aérosol
soit sous la hotte ou par les incubateurs, le sérum animal, le milieu et les diverses solutions. La
contamination se propage aussi par des nouvelles cultures cellulaires provenant des compagnies,
des labos extérieurs ou de nouvelles souches décongelées récemment. Selon les normes, il
faudrait attendre 20 min entre chaque type cellulaire, mais la pratique étant ce qu’elle est!
Traitement
Plusieurs compagnies développent des produits d’élimination
Plasmocin (InvivoGen) 25µg/ml pendant 2 semaines
Mynox (Minerva Biolab)
Ciprofloxacin : 10 jours à 10µg/ml (Bayer)
Clean Cell
Mycoplasma-Ex et Biomyc-3 (Promokine)
Les fluoroquinolones tels que MRA (agent Suppression Mycoplasme ) utilisés 7jrs dans un milieu
contenant 1% de MRA à 50µg/ml (ICN) combiné à la Tylosine utilisée pendant 3jrs dans un
milieu contenant 1% tylosine à 6mg/ml.
Attention même les compagnies qu’on croit exemptes de mycoplasmes…
DA (Food and Drug Administration) 15%
Bionique Testing Laboratories 11%
Microbiological Associates 13%
ATCC 14%
Curieusement plus on fait l’emploi d’antibiotiques, plus il y a de chances que vos cellules soient
contaminées. De cette façon, on contribue à cacher le problème qui semble très répandu à travers
le monde…
USA 15%
Europe 25%
Japon 80%
3. Contamination par d’autres cellules
Le plus répandu de ces cas est sans doute la cellule HeLa. Des chercheurs ont
démontré qu’environ 25% des cellules humaines sont contaminées par les cellules de types
HeLa.
Prévention : n’utiliser qu’une bouteille de milieu par lignée cellulaire
Même chose pour la trypsine, PBS…
Bien désinfecter la hotte entre chaque type cellulaire
Idéalement, on suggère d’attendre 20 minutes
Utilisez des filtres sur le pipette-aid
Si vous avez plusieurs types de cellules, finissez par les cellules Hela
Utilisez des embouts (pointes) avec filtres quand on se sert des pipettes-
mans
4. Source de contamination
4.1. Solution, vaisselle
Autoclave : Le choix du cycle approprié, le volume parfois critique (>500ml)
o La forme, la grosseur et la nature des objets à autoclaver.
Entreposage : endroit propre et sans poussière.
Vaisselle jetable : garder les pétris stériles une fois le sac ouvert, fermer le sac…
Tout produit biologique : milieu, sérum (bien que filtré sur 1 micron, il n’est pas rare
que le sérum commercial soit contaminé avec des mycoplasmes.)
4.2. Particules aérosols, poussières en suspension
Une partie des contaminants microbiens se retrouvent dans l’air accrochés à de fines
particules de poussière en suspension.
Sources
souliers, vêtements, cheveux, pompes aspirateurs, centrifugeuses, pipetage, sonicateurs,
radiateurs (chauffage), four, réfrigérateurs, congélateurs…
Les peaux mortes ou sèches (attention aux poignets, cette partie du corps doit être
propre, même si vous portez des gants et un sarreau propre)
Ne pas passer au-dessus des pétris ouverts, car les contaminants retombent dans vos
pétris. Travaillez avec un angle, pas droit au-dessus de vos vaisselles.
Une personne malade (problème de maladie fongique…)
Limitez l’entrée de chariot, boîte poussiéreuse, manteau…
Tenez le labo le plus propre possible : microscope, hotte, incubateurs…
Entreposage; les boites de carton devraient être proscrit, les moisissures poussent bien
sur le carton avec un peu d’humidité.
Sources humides
Réservoir d’eau dans l’incubateur
Tablettes souillées par de pétris renversés
Bain-marie
Ventilateur au plafond de l’incubateur
Transport des cellules d’un labo à un autre
Mycoplasme sous la hotte
Des personnes ont volontairement travaillé sous la hotte avec deux types de cellules dont un
infecté avec des mycoplasmes. Après 6 semaines, les cellules saines étaient devenues
positives aux mycoplasmes. Suite à ces études, certains pensent que les mycoplasmes peuvent
rester vivants de 4 à 6 jours sous la hotte.
Conseils
Ne pas éternuer ou parler sous la hotte
Évitez d’entraver la circulation de l’air de la hotte (le grillage avant ne doit pas servir à
accrocher votre feuille de protocole ou pour poser vos matériels)
Passez toutes vos choses à l’éthanol (ou autre) avant de les amener sous la hotte.
Limitez les mouvements brusques sous la hotte
Limitez les mouvements derrière la hotte
Testez de façon régulière la présence de mycoplasmes.
Insertion, pénétration
Une bouteille mal fermée, entrouverte,
Une goutte de milieu entre le couvercle et le côté extérieur du pétris est une bonne porte
d’entrée pour les micro-organismes. Éviter les mouvements brusques.
Bouchons souillés remplis de milieu, même raison que ci-haut. Ne pas mélanger vos
bouteilles.
Les étagères sales dans l’incubateur : prenez le temps de bien les laver si vous renversez
du milieu. N’oubliez pas le dessous de la tablette de l’incubateur…
Attention aux transports des pétris de l’incubateur au microscope…
Accident
Une autre source de contamination reliée à la négligence humaine :
Le symptôme du vendredi, la fatigue, la course avant de partir en vacances, surcharge
de travail, nouvelle technique…
Avoir une bonne méthode d’identification, être clair dans ses explications
Observez le niveau d’azote liquide
Observez le CO2, température de l’incubateur
Réduisez les accidents : l’identification, information complète lors du passage des
cellules à une autre personne
5. Comment contrôler la contamination
Avoir une bonne formation de technique aseptique
Tenez un inventaire des problèmes survenus dans le
Gardez en tête le niveau de risque ou danger pour vous et aussi pour les autres,
particulièrement lorsque vous travaillez avec des virus, des cellules dérivées humaines
ou primates. Laissez les gants avant de sortir de la salle.
L’argent et le temps que vous perdez quand vos cellules sont contaminées
Matériel : hotte certifiée, bon usage (pas de flamme, turbulence de l’air...)
Autres conseils
Utilisez des flacons ventilés
Lors du versement de milieu d’une bouteille à l’autre, essuyez la goutte sur le goulot avec
un papier propre ethanolé, avant de refermer le bouchon.
Même chose si vous échappez du milieu entre le couvercle et le pétris. Sinon le milieu
restant est un pont favorable à la pousse bactérienne.
Quand vous utilisez des pétris, refermez bien le sac pour qu’il n’y ait pas de contact avec
l’air, la poussière. Le sac risque de s’ouvrir en tombant sur le côté. Ne laissez pas vos
pétris sans protection sur le comptoir.
La hotte n’est pas un endroit de stockage. Plus vous entrez de matériels sous la hotte, plus
il y de chances que l’air soit mal distribué…
Ne pas pipetter à la bouche. Utilisez des Tips avec filtres pour les pipette-mans.
Utilisez une blouse propre, uniquement pour la culture et pas ailleurs.
Utilisez une bouteille par lignée cellulaire, désinfectez la hotte entre chaque lignée.
Travaillez sans antibiotique.
Aliquotez vos solutions (Trypsin, L-glutamine, autres…)
Réduisez les accidents, voir ci-haut
Il est important d’être vigilant, d’observer ses cellules régulièrement.
Gardez un environnement propre
o Lavez les incubateurs, hotte, microscope et bain-marie de façon régulière
o Nettoyez régulièrement la surface de la hotte, des gouttelettes ou
éclaboussures tombent souvent sans que vous ne les voyiez.
o Changez l’eau des récipients qui contient les pipettes sales régulièrement et
ne pas oublier d’y mettre du javel.
o Nettoyez le rebord des portes de frigos et congélateurs (moisissures)
o Portez des gants élimine la possibilité que les micro-organismes qu’on a sur
nos mains, sous nos ongles se retrouvent dans nos pétris. Les gants ne doivent
pas sortir du labo.
Faites des tests de stérilité
o Vérifiez le bon fonctionnement de l’autoclave
o Testez vos milieux une fois complétés avant de les utiliser 2 semaines à
30°C et 37°C sur gélose ( trypticase Soy, Blood agar, Sabouraud…)
Détection de mycoplasmes s’il s’agit de cellules qui viennent d’un autre labo. Testez un
nouveau numéro de lot du sérum.
Congélation : les cellules congelées viennent à la rescousse des contaminées. Pour
s’assurer qu’elles ne le sont pas, laissez-les 2 semaines sans antibiotique. Congelez vos
cellules à bas passage avant qu’il n’arrive un problème.
6. Stratégie d’usage d’antibiotiques
Les antibiotiques sont indirectement responsables de la contamination, ils empêchent de faire
ressortir rapidement la contamination.
Avec antibiotiques : on trouve 72% des cellules qui ont des problèmes.
Sans antibiotique : on a trouvé 7% des cellules qui sont contaminées
Travailler sans antibiotique permet vraiment de savoir s’il y a le moindre risque de
contamination. Les situations qui font exceptions sont : dans le cas de culture primaire, lors
de transfections transitoires ou lorsqu’on a besoin d’une grosse quantité de pétris (pour
récolter).
Les antibiotiques ne remplacent pas de bonnes techniques aseptiques
Évitez la résistance aux antibiotiques
80% des mycoplasmes sont résistants à la gentamicine
15% des mycoplasmes sont résistants au ciprofloxacin
28% des mycoplasmes sont résistants à la lincomycin
21% des mycoplasmes sont résistants à la Tyrosine
Quoi faire ?
Il est préférable de jeter ce qui est contaminé et de recommencer le tout avec des cellules
congelées (saines). Le traitement à l’aide d’autres antibiotiques peut modifier les
caractéristiques des cellules. Notez que la fongizone ne permet pas de se débarrasser des
levures mais d’arrêter leur croissance. L’utilisation massive d’antibiotique peut occasionner
des problèmes de résistance.
Ne pas jeter vos contaminants dans l’évier de la salle de culture. Allez plutôt dans un
autre labo.
7. Stratégie de contamination
Il se peut que pour diverses raisons vous ne sachiez jamais d’où vient réellement la
contamination. S’il s’agit d’un mauvais mouvement sous la hotte, d’une pipette du canon qui
était souillée par un collègue précédent, d’un pétris qui a pris un peu trop l’air ou que la
bouteille que vous avez utilisée est terminée… Cependant, les solutions utilisées sont assez
dispendieuses et avant de tout jeter, il est bon de vérifier la source.
Prévenez les autres utilisateurs, surtout ceux qui partagent le même incubateur. Dans le
cas où il s’agirait de levures, il est important de stopper ou même de prévenir une
épidémie. Par contre, si d’autres gens ont le même problème, voyez s’il y a un lien
commun (cellules, HEPES, etc.).
Vérifiez tous les ingrédients individuellement
Exemple : bouteille milieu complet X, trypsin, L-glut, FBS (aliquote du même no lot, PBS,
autres… Prenez un ml de chaque item mentionné et déposez-les dans 6 ml (environ) d’un
autre milieu sans antibiotique Y dans un petit flacon fermé hermétiquement. Prenez soin de
faire un contrôle négatif avec le milieu Y seul. Le test s’effectue à 37°C durant 1 à 2 semaines
et observez régulièrement et voyez s’il pousse quelque chose. Le type de flacon et l’endroit
pour faire votre test peuvent varier. Si on fait le test dans l’incubateur habituel, vous pouvez
utiliser un flacon ventilé. Contamination ou pas, ça ne sortira pas du flacon.
Mais comme ça prend un certain espace, on peut aussi utiliser n’importe quel incubateur
pourvu que votre flacon soit bien fermé. À cause de l’échange d’air qui se fait (si le flacon
est ventilé et aucun CO2), le pH risque de changer vers un milieu tellement basique que les
protéines vont se dénaturer et flotter à la surface du milieu comme une nappe d’huile. Aussi,
les bactéries préfèrent un pH acide… L’idéal est d’utiliser des milieux propices à la pousse
bactériennes tels que : LB, gélose sang, etc. Variez les températures, ex : 30°C pour les
levures…
Par contre, la contamination peut provenir des cellules comme tel. Vérifiez si d’autres
collègues qui ont les mêmes cellules ont le même problème que vous. Sinon décongelez un
autre vial et recommencer. Vous pouvez aussi donner un vial en parallèle à un collègue pour
voir…
Si le problème persiste, voyez d’autres possibilités, les appareils…
Un petit ménage s’impose des lieux communs : poignées de portes, le microscope, les
poignées du frigo, la porte et le bain-marie, le téléphone, et tout ce que le monde touche en
général… Un bon nettoyage des hottes s’impose! Il est possible de faire analyser le type de
contaminant par des experts et ces spécialistes peuvent nous faire des suggestions selon les
bactéries ou levures en cause. Voir les antibiotiques à utiliser (résistance). Dans certains cas,
il s’agit d’une source extérieure, une boulangerie à proximité, les conduits d’alimentation
d’air, de la construction dans un local voisin…
