Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie ... · Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département de Biochimie et Biologie Cellulaire etMoléculaire ... de l’Université

Rpublique Algrienne Dmocratique et Populaire

Ministre de lEnseignement Suprieur et la Recherche Scientifique

Universit des Frres MENTOURI Constantine

Facult des Sciences de la Nature et de la Vie

Dpartement de Biochimie et Biologie Cellulaire etMolculaire

N srie:

N ordre:

THESE DE DOCTORATEN SCIENCES

par

LABBANI Fatima-Zohra-Kenza

Option :Microbiologie Applique

Spcialit:Biotechnologies Microbiennes

Soutenue le : 28/10/2015 Constantine

Devant le jury :

Prsident : Mr. KACEM-CHAOUCH N. Prof. Universit Frres MENTOURI, Constantine

Directrice de thse : Mme. MERAIHI Z. Prof. Universit Frres MENTOURI, Constantine

Examinateurs : Mme BENDJEMANA K. M.C.A., Universit LAGHROUR A., Khenchela

Mr. HARZALLAH Prof. Universit FERHAT A.,Stif

Mr.SAKA S. Prof. Universit BADJI M., Annaba

Anne universitaire : 2014/2015

Activit Killer chez des levures isoles des sols du Nord-Est Algrien :

Purification, caractrisation et effet sur les souches de levures indsirables.

Remerciements

Le travail prsent dans cette thse a t ralis au Laboratoire de Gnie Microbiologiqueet

Applications de lUniversit frres MENTOURI Constantine et au Dpartement dAgriculture,

des Sciences de lAlimentation etdelEnvironnement, Collection des Levures Industrielles

(DBVPG), lUniversit degliStudi di Perugia en Italie.

Jadresse mes plus sincres remerciements Madame le professeur MERAIHI Zahia, ma

directricede thse,pour lencadrement scientifique, lescritiques et les suggestions pertinentes

quellea apportes au prsent travail afin de le rendre beaucoup meilleur. Merci pour sacomptence,

sa patience et sa franchise mon gard.Je lui dois toute ma profonde gratitude.

Je remercie galement Monsieur BUZZINI Pietro, Professeur et directeur du Laboratoire de la

Collection des Levures Industrielles (DBVPG) de lUniversit degliStudi di Perugiapour mavoir

accueillie chaleureusement au sein de son quipe de recherche et ma permis la ralisation dune

grande partie de ce travail dans son laboratoire. Merci pour ses nobles discussions et ses judicieux

conseils et pourson intrt ce travail.

Je me fais galement un immense plaisir dadresser mes remerciements MonsieurKACEM-

CHAOUCH N., Professeur lUniversit des Frres MENTOURI Constantine, pour le grand

honneur de prsider le jury de cette thse.

Je tiens galement remercier les membres du jury, Madame BENDJEMANA K., Maitre de

Confrence lUniversit LAGHROUR Abbes de Khenchela ; Messieurs HARZALLAH D.,

Professeur lUniversit FERHAT Abbes de Stif ; SAKA S., Professeur lUniversit BAJI

Morkhtar de Annaba davoir accept d'valuer ce travail.

Mes remerciements vont aussi au Professeur ROBERTI Rita et Professeur CORAZZI

Lanfranco du Dpartement de Mdecine Exprimentale de lUniversit degliStudi di Perugia pour

mavoir aid raliser les parties purification de la toxine killer et SDS-PAGE . Merci pour

leur gentillesse et leur disponibilit. Je remercie galement le technicien RICCI Carlo pour son aide

et sa bonne humeur.

Ma profonde gratitude au Docteur TURCHETTI Benedetta et audoctorante GORETTI Marta

du Laboratoire de la Collection des Levures Industrielles DBVPG pour leur prcieuse aide et leur

collaboration scientifique et amicale.

Jaimerais pouvoir dire un grand merci mes chres collgues et amies, BENNAMOUN Leila

et DAKHMOUCHE Scheherazadpour leur gentillesse, leurs conseilsetleursencouragements.

Le bouquet de mes remerciements je le prsente affectueusement ma famillepour leur

patience et leur confiance en moi. Merci mes parents qui mont toujours soutenue au cours de mes

tudes, mais aussi pour leur amour, leur sacrifice et leur comprhension au cours de toutes ces

annes dtudes depuis ma scolarit jusqu ce jour. Je leur dois toutes mes sincres

reconnaissances.

Ddicaces

Je ddie ce travail mes chers parents,

pour tout votre amour, votre soutien et votre stimulante fiert.

Que Dieu vous garde et vous procure sant et longue vie

A mes chers frresMohamed-lamine, Souheil, ZoheirZine Eddine et Djellel pour leur confiance et

leur disponibilit

Ames nicesAssala, Salsabil, Lina, Ranim et Sajaet mes neveux Younes et Abdelmouiz pour la joie

quils apportent dans ma vie

A mon mariMohamed-lamine pour son soutien moral, sa gnrosit, sa patience et ses

encouragements

A toutes mes belles surs,jespre que vos rves se raliseront !

A toute la famille et la belle famille LABBANI

A tous ceux que jaime

LABBANI Fatima-Zohra Kenza

SOMMAIRE

INTRODUCTION .... 1

CHAPITRE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE....3

1. Gnralits sur les levures3

2. Phnomne killer des levures...9

3. Ecologie du phnomne killer10

4. Bases gntiques du systme killer des levures.12

4.1. Gnomes viraux cytoplasmiques ARNdouble brins13

4.2. Plasmides linaires ADN double brins.13

4.3.Gnes chromosomiques codant pour le phnotype killer13

5. Caractristiques des toxines killer..14

6. Mode daction des toxines killer18

6.1. Fixation..18

6.2. Action toxique.19

7. Paramtres dterminant lintensit de linteraction21

7.1. Sensibilit21

7.2. Quantit de toxine...21

7.3. Etat physiologique....21

7.4. Environnement...22

8. Applications22

8.1. Industries alimentaire et de fermentation23

8.2. Taxonomie......23

8.3. Mdecine.....24

CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES...25

1. Echantillonnage..25

2. Isolement des levures.25

3. Purification et conservation des levures isoles.....27

4. Mthodes didentification des souches de levures.....27

4.1. Mthode conventionnelle....27

4.1.1. Etude des caractres culturaux.27

Sommaire

4.1.2. Etude des caractres morphologiques..27

4.1.3. Etude des caractres biochimiques et physiologiques..28

4.2. Mthode didentification molculaire..29

4.2.1. Extraction dADN...30

4.2.2. Amplification de lADN extrait par PCR.30

4.2.3. Squenage de lADN..31

5. Test de la mise en vidence de lactivit killer chez les souches isoles...32

6. Production de la toxine killer brute.33

6.1. Souche killer dintrt..33

6.2. Milieu de production....33

6.3. Pr-culture....33

6.4. Culture principale ....33

7. Test dactivit killer de la toxine brute....................33

8. Traitement protasique de la toxine killer brute......34

9. Cintique de production de la toxine killer.....35

10. Purification de lextrait brute de la toxine killer par gel filtration..35

11. Electrophorse sur gel de polyacrylamide-sodium dodcyl sulfate (SDS-PAGE).36

12. Effet du pH et de la temprature sur lactivit de la toxine killer purifie...........37

13. Dtermination de la CMI de la toxine killer purifie..........37

14. Dtermination de la CMI du mtabisulphate de potassium, du sorbate de potassium

et de lthanol.38

15. Dtermination de la concentration inhibitrice fractionnaire (CIF) et de lindice

CIF ( CIF) de la protine killer purifie associe avec le mtabisulfate de potassium

lesorbate de potassium ou lthanol...39

16. Evaluation de lactivit killer de la toxine killer purifie sur des contaminants

de boissons..40

17. Etude de la stabilit de la toxine killer purifie dans des boissons.41

CHAPITRE III : RESULTATS ET DISCUSSION..42

1. Isolementdes souches de levures...........42

2. Identification des souches isoles.....43

Sommaire

2.1. Identification molculaire43

2.2. Identification conventionnelle..48

2.2.1. Caractres culturaux..48

2.2.2. Caractres morphologiques...51

2.2.3. Caractres biochimiques et physiologiques....54

3. Mise en vidence de lactivit killer....56

4. Spectre daction de la protine killer de P. kluyveri........58

5. Cintique de production de la protine killer brute par P. kluyveri (L5).62

6. Purification de la protine killer brute ....63

7. Effets du pH et de la temprature sur lactivit killer de la protine purifie..67

8. Dtermination des concentrations minimales inhibitrices (CMIs), des concentrations

inhibitrices fractionnaires (FICs) et lindice FIC ( FIC)de la protine killer purifie

seule et en association avec le mtabisulfate de potassium le sorbate de potassium

ou lthanol...69

9. Evaluation de lactivit de la toxine killer purifie sur des contaminants

deboissons .73

CONCLUSION ....76

RESUMES.78

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...81

ANNEXES.91

Sommaire

Liste des abrviations

YMA :Yeast Malt Agar

YPGA :Yeast Peptone Glucose Agar

PDA : Potato Dextrose Agar

YNB :YeastNitrogen Base

YCB :YeastCarbon Base

YP :YeastExtract Peptone

rpm :Rotation per minute

PCR :PolymerasechainReaction

TAE : Tris Actate EDTA

EDTA :thylne Diamine Ttra-Actique

dNTPs :Dsoxynuclotides triphosphates

BET : Bromure dEthidium

BLAST : Basic Local AlignmentSearchTool

YPG-MB :Yeast Peptone Glucose-Methylene Blue

Ua : Unit arbitraire

UI : Unit Internationale

PEG : Polythylne glycol

DO : Densit Optique

HR : High Resolution

SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Electrophorse sur gel

de polyacrylamide-sodium dodcyl sulfate)

CMI : Concentration Minimale Inhibitrice

CLSI :Clinical and Laboratory Standard Institute

RPMI :Roswell Park Memorial Institut

MOPS :3-(N-morpholino)propanesulfonic acid

CIF : Concentration Inhibitrice Fractionnaire

UFC : Unit Formant Colonie

Liste des figures

Figure 1. Prsentation dune cellulede levure.3

Figure 2.Filamentisation des levures. (A) :Pseudomyclium. (B) : Vrai myclium.

Barre = 10 m....4

Figure 3. Reproduction sexue des levures...........4

Figure 4. Bourgeonnement dune cellule de levure. Barre = 500 nm...5

Figure 5.Mise en vidence sur milieu glos du phnotype killer contre deux isolats

deCandida albicans..9

Figure 6. Structure dimre de la toxine killer SMKT produite par Millerozyma

farinosa(Pichiafarinosa) KK1...14

Figure 7. Voie de scrtion de la toxine K28 chez Saccharomyces cerevisiae...17

Figure 8. Structure de la paroi cellulaire des levures18

Figure 9.Mode daction de la toxine K1 de Saccharomyces cerevisiae.20

Figure 10. Localisation gographique de deux rgions de rcolte des chantillons

de sol (A). (H.B : Hamma Bouziane ; C.N.T : Constantine). Images satellite du site

dchantillonnage du sol agricole (B) et du sol forestier (C)26

Figure 11. Schma reprsentatif du gne de lARNr 26S et la localisation de la rgion

hypervariable D1/D2.29

Figure 12.Courbe dtalonnage de Srum Albumine Bovine avec une solution mre

de 2 mg/ml36

Figure 13. Dtermination de la CMI de la protine killer sur la microplaque.

(TC : Tmoin de culture)..38

Figure 14. Arbre phylogntique base sur lanalyse des squences du gne de lARNr,

et montrant la relation des isolats L14 et L15 (Ordre des Filobasidiales) avec les espces

types du genre Cryptococcus et Filobasidium.Les nombres figurant au niveau des nuds

indiquent les taux de Bootstrap (1000 rplicas), la barre 0.005 indique le nombre de substitution

par position de nuclotide.46

Figure 15. Arbre phylogntique base sur lanalyse des squences du gne de lARNr

26S, et montrant la relation des isolats L1-L13 (ordre des Saccharomyctales) avec les

espces types des genres Candida, Hanseniaspora, Pichia, Meyerozyma, Nadsonia

etSaccharomyces. Les nombres figurant au niveau des nuds indiquent les taux de

Bootstrap(1000 rplicas), la barre 0.01 indique le nombre de substitution par position

de nuclotide.47

Figure 16. Mise en vidence de lactivit killer chez la Pichiakluyveri (L5) aprs une

incubation de 5 jours sur milieu YPG-BM (pH 4.5) 25C. Dveloppement de zones

dinhibition dans les boites ensemences avec Dekkerabruxellensis DBVPG 6706 (A) ;

Saccharomyces cerevisiae DBVPG 6500 (B) et S. cerevisiae DBVPG 6173 (C).57

Figure 17.Effet de lextrait brut de la protine brute contre les dix souches sensibles

retenues.(A) : Dekkera anomala DBVPG 3766 ; (B) : Dekkera anomala DBVPG 4075 ;

(C) : Dekkerabruxellensis DBVPG 6704 ; (D) : Dekkerabruxellensis DBVPG 6705 ;

(E) : Dekkerabruxellensis DBVPG 6710 ; (F) : Saccharomyces cerevisiae DBVPG 6173 ;

(G) : Saccharomyces cerevisiaeDBVPG 6500 ; (H) : Zygosaccharomycesbisporus DBVPG

6382 ; (I) : Zygosaccharomycesbisporus DBVPG 6382. (J) : Dekkerabruxellensis DBVPG

6706 (la souche la plus sensible)..61

Figure 18. Production de la protine killer brute par Pichiakluyveri (L5). Les histogrammes

gris indiquent la zone dinhibition de Dekkerabruxellensis DBVPG 6706 (la souche cible)

par la mthode de diffusion en puits. La courbe reprsente la DO580. Les donnes sont

exprimesen moyenne SD, n = 3......63

Figure 19.Effet killer de la protine purifie contre la souche daltration des aliments et des boissons, D.

bruxellensis DBVPG 6706. 100 l de la protine killer purifie sont introduits

dans le puits puis incubs pendant 5 jours 25C.64

Figure 20.Profil lectrophortique en SDS-PAGE : rvlation dune seule bande de

la protine killer purifie, par le nitrate dargent (A) et par le bleu de Coomasie(B),

obtenue aprs filtration sur Sephacryl S-200. (C) : Dtermination de la masse molculaire

de la protine killer purifi66

Figure 21.Effet du pH (A)et de la temprature(B)sur lactivit killer de la protine

purifie, teste contre Dekkerabruxellensis DBVPG 6706 (souche sensible). Les donnes

sont exprimes en moyenne cart-type, n = 3....68

Figure 22.Effet dose de la toxine killer sur la croissance de Dekkerabruxellensis

DBVPG 6706 (A) aprs 7 jours dincubation dans la boisson gazeuse et Saccharomyces

cerevisiae DBVPG 6500 (B) aprs 3 jours dincubation dans le jus de poire. Les donnes

sont exprimes en moyenne cart-type, n = 374

Figure 23. Stabilit de la toxine killer dans la boisson gazeuse rafraichissante (A)

et dans le jus de poires(B). Les souches sensibles utilises dans le test de diffusion

parpuits sur glose : Dekkerabruxellensis DBVPG 6706 pour la boisson gazeuse et

Saccharomycescerevisiae DBVPG 6500 pour le jus de poire. Les donnes sont exprimes

en moyenne cart-type,n = 3.74

Liste des tableaux

Tableau 1. Classification des levures Ascomyctes et Basidiomyctes .6

Tableau 2. Diffrents domaines dutilisation industrielle des levures.8

Tableau 3.Espces de levures pour lesquelles lactivit killer a t rapporte...11

Tableau 4. Bases gntiques de lexpression du phnotype killer chez les levures....12

Tableau 5. Comparaison entre les caractristiques de diffrentes toxines killer15

Tableau 6. Provenance des chantillons de sol utiliss pour lisolement des levures.25

Tableau 7. Couples damorces utiliss dans la PCR..31

Tableau 8. Couples damorces utilises dans le squenage de la rgion D1/D2

du gne codant pour lARNr 26S de la grande sous-unit ribosomique..31

Tableau 9.Isolement des souches de levures..42

Tableau 10. Rsultats du squenage des amplicons obtenus aprs PCR, de la rgion D1/D2

du gne de lARNr 26S et comparaison aux squences de la base de donnes GenBank..45

Tableau 11. Caractres culturaux des souches de levures isoles aprs une culture de 3 jours

sur YPGA 25C.49

Tableau 12. Caractres culturaux sur milieu YPG liquide aprs 14 jours dincubation

25C...51

Tableau 13. Caractres morphologiques des souches de levures cultives pendant 3 jours

25C...52

Tableau 14. Rsultats des tests dassimilation des glucides et des sources azotes des

souches de levures isoles.....54

Tableau 15. Rsultats du test de fermentation de diffrents sucres par les isolats

de levures......55

Tableau 16. Effet de la temprature sur la croissance des levures isoles. .............56

Tableau 17.Effet de lextrait brut de la protine killer sur les souches de levures daltration

des aliments et de boissons (testpar la technique de diffusion par puits sur glose)...59

Tableau 18.Purification de la toxine killer produite par la souche Pichiakluyveri (L5).

Les tapes de la purification sont dcrites en dtail dans la partie Matriel et Mthodes .

....65

Tableau 19. Dtermination de la CMI de la toxine killer contre les souches sensibles

Dekkeraanomala, Dekkerabruxellensis, Saccharomyces cerevisiaeetZygosaccharomyces

bisporus.......70

Tableau 20.Dtermination de la CMI de mtabisulfate de potassium,

de lthanol et de sorbate de potassium....71

Tableau 21.CMI, CIFetlindice CIF ( CIF) de la protine killer enprsence

demtabisulfate de potassium, de sorbate de potassium et lthanol, vis--vis des

levures test: Dekkerabruxellensis DBVPG 6706 etSaccharomyces cerevisiae DBVPG

6500...72

INTRODUCTION

Les levures constituent un groupe important et htrogne de microorganismes qui suscitent

actuellement un intrt grandissant de la part des scientifiques et des diffrents acteurs des secteurs

bioalimentaire et mdical (HATOUM, 2013). En plus de leur contribution majeure au dveloppement

du got dans les aliments ferments, leurs activits antagonistes envers certaines levures indsirables

sont maintenant bien connues, type toxines killers de nature protique ou appeles galement

protines killer (GUO et al., 2013 ; ORO, 2013).

Ces dernires annes, un intrt grandissant des levures killer et leurs toxines a suscit la curiosit

de recherches pour tre une alternative efficace aux agents antifongiques chimiques classiques

(ORO, 2013). Par leurs proprits antimycotiques de ces protines killer, elle vont avoir des

retombes certaines dans la lutte contre les infections provoques par des microorganismes

pathognes, en particulier, la levure pathogne type Candida albicans (ZG et al., 2007a ;

LACHANCE et STARMER, 2011 ; LIM et TAY, 2011).

Dans les industries alimentaires et de fermentation, les levures killer et leurs toxines sont utilises

dans la lutte contre la contamination par les levures indsirables telles que Dekkera bruxellensis,

Zygosaccharomyces bisporus ainsi que Saccharomyces cerevisiae (GORETTI et al., 2009 ; LIU et

TSAO, 2009 ; COMITINI et CIANI, 2010 ; SANTOS et al., 2011). Leur effet fongicide permet de

prserver la qualit des produits et donc des pertes conomiques consquentes (STARTFORD, 2006 ;

SANTOS et al., 2009).

Pour la conservation des aliments manufacturs et des boissons, certains additifs chimiques sont

ajouts comme les drivs dacide benzoques et dacide sorbique et de dioxyde de soufre (SO2)

boissons (GORETTI et al., 2009 ; TSERENNADMID et al., 2011). Cependant, certaines souches de

levures se montrent rsistantes de nombreux conservateurs chimiques (PAPADIMITRIOU et al.,

2007). De plus, la tendance actuelle de consommateurs utiliser des produits dorigine biologiques

sans aucun additif chimique a incit la recherche dans ce sens (PAPADIMITRIOU et al., 2007 ;

TSERENNADMID et al., 2011 ; HATOUM, 2013).

Ainsi, les levures killer et leurs toxines constituent une des approches proposes parmi les plus

prometteuses utilise dans la lutte biologique contre les levures pathognes ou indsirables (GORETTI

et al., 2009 ; LIU et TSAO, 2009 ; COMITINI et CIANI, 2010 ; SANTOS et al., 2011).

Cependant, peu dtudes sont publies dans la littrature sur la recherche de levures killer

partir dun biotope comme le sol. Ce dernier prsente une importance gnrale dans les processus

cosystmiques et peut constituer un rservoir de souches killer de levures dont la distribution est

assure par diffrents facteurs tels que la dcomposition de la matire organiques vgtale et les

Introduction

1

insectes, vecteurs visiteurs des fruits et des fleurs (MAGLIANI, 1997 ; STARMER et LACHANCE,

2011).

Par ailleurs, un grand nombre de levures communment utilises en biotechnologie est obtenu

partir de niches cologiques par leur facult dadaptation due leurs proprits physiologiques trs

caractristiques (RESKI-BEKKI, 2014). Lingnierie de ces levures trouve donc des champs

dapplications dans plusieurs domaines pour produire mtabolites varis comme les protines killer.

La recherche de souches productrices de protines killer partir dun cosystme naturel comme le

sol, est un enjeu important en biotechnologie. Pour cela, nous avons cibl des sols dans la rgion de

Constantine (Nord-Est Algrien). Dans le prsent travail, nous avons cherch isoler et identifier des

levures possdant un caractre de production de toxine killer par le test sur des levures indsirables.

Lvaluation de lactivit de la toxine killer produite par la levure slectionne. La purification de la

toxine killer produite est imprative pour sa caractrisation.

Nous avons ensuite procd des tests de sensibilit in vitro la protine killer purifie :

dtermination de la concentration minimale inhibitrice et la concentration inhibitrice fractionnaire.

Enfin, lvaluation in vitro du potentiel de la toxine killer purifie comme agent de biocontrle des

levures indsirables.

Introduction

2

CHAPITRE I

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

1. Gnralits sur les levures

La levure est lorganisme modle de rfrence, sur lequel le plus dexprience ont t

conduites, et donc le plus de donnes ont t fournies. En 1996, le gnome Saccharomyces

cerevisiae est entirement squenc. Par son mtabolisme fermentaire des glucides, elle est utilise

plus de huit millnaires dans le brassage des bires dans Sumeria et Babylone, dans la culture du

raisin en Gorgie et pour lever la pte en Egypte (SMIDTAS, 2007). Le terme levure vient du

latin levare , faisant rfrence la capacit de faire lever le pain en produisant du CO2 en

conditions anarobiques et de fermenter le sucre (KUTZMAN et al., 2011a). En 1860, les levures

ont t observes, pour la premire fois, au microscope par VAN LEEUWENHOEK Antoni. Vers

1860, Pasteur a identifi les levures comme agents des fermentations. En 1881, HANSEN Emile, a

dcrit lisolement des premires souches pures de Saccharomyces partir de mots. Plus tard,

dautres espces de levures ont t identifies entre 1950 et 1970 (BASMAJI, 2005).

Les levures sont des champignons microscopiques unicellulaires eucaryotes (Figure 1).

Nanmoins, de nombreuses espces sont capables de former un pseudomyclium comme lespce

Candida albicans, voir un vritable myclium comme lespce Lindnera bimundalis Candida

ontarioensis (Figure 2) (NADEEM, 2013 ; KURTZMAN, 2011a).

Figure 1. Prsentation dune cellule de levure (MANYRI, 2005).

ChapitreI Etude Bibliographique

3

Figure 2. Filamentisation des levures. (A) : Pseudomyclium. (B) : Vrai myclium. Barre = 10 m

(KURTZMAN et al., 2011a).

La morphologie des levures est dune grande importance taxonomique. Elle est sphrique,

ovode, globuleuse, cylindrique, ellipsode, allonge, apicule, ogivale, triangulaire ou en forme de

bouteille (WALKER, 2009 ; KUTZMAN et al., 2011a). Certaines levures comme S. cerevisiae ont

une reproduction sexue qui correspond une phase de leur cycle biologique avec une alternance de

phase haplode et diplode (Figure 3).

Figure 3. Reproduction sexue des levures (COSMA, 2004).

Le bourgeonnement, le mode de reproduction vgtative le plus frquent, est reprsent par une

vagination qui apparait un point de la cellule mre (Figure 4). Un autre mode de reproduction

A B


4

vgtative peut tre rencontr : la fission, caractristique du genre Schizosaccharomyces, qui se

manifeste par la formation dune paroi transversale au grand axe de la levure (REZKI-BEKKI,

2014).

Figure 4. Bourgeonnement dune cellule de levure (KLEI et al., 2011). Barre = 500 nm.

Groupe complexe et htrognes, les levures sont classes en deux grands groupes : les

Ascomyctes et les Basidiomyctes, dont chacun comporte des tats anamorphiques et

tlomorphiques. Les Ascomyctes sont principalement classs en Saccharomyctes et

Schizosaccharomyctes, tandis que les Basidiomyctes sont distribus dans les classes suivantes :

Hymenomyctes, Urediniomyctes et Ustilaginomyctes (Tableau 1) (SCORZETTI et al., 2002;

KURTZMAN et FELL, 2006).

Les levures sont des microorganismes ubiquitaires qui peuvent coloniser plusieurs niches

cologiques : lair, le sol, leau, le tube digestif de certains animaux et les galeries dinsectes

(LACHANCE et al., 2001 ; LACHANCE et al., 2006 ; WALKER, 2009 ; STARMER and

LACHANCE, 2011). Certaines levures ont t isoles partir denvironnements extrmes comme

lAntarctique (SATYANARAYANA et KUNZE, 2009). Dautres vivent principalement sur les

vgtaux riches en sucres, en particulier les fruits (MAGLIANI et al., 1997 ; Walker, 2009), dans

des produits alimentaires (STRATFORD, 2006) ainsi que dautres niches cologiques.


5

Tableau 1. Classification des levures Ascomyctes et Basidiomyctes (KURTZMAN et FELL, 2006 ; SUH et al., 2006).

Ascomyctes

Schizosaccharomycetes Dipodascopsis Saccharomycodaceae Komagataella

Schizosaccharomycetales Lipomyces Hanseniaspora Kuraishia

Schizosaccharomycetaceae Myxozyma Kloeckera Lodderomyces

Schizosaccharomyces Zygozyma Saccharomycodes Lindnera

Metschnikowiaceae Saccharomycopsidaceae Macrorhabdus

Saccharomycetes Clavispora Saccharomycopsis Meyerozyma

Saccharomycetales Metschnikowia Trichomonascaceae Millerozyma

Ascoideaceae Pichiaceae Spencermartinsiella Nakazawaea

Ascoidea Brettanomyces Trichomonascus Ogataea

Cephaloascaceae Dekkera Wickerhamiella Pachysolen

Cephaloascus Peterozyma Saccharomycetales incertae sedis Phaffomyces

Dipodascaceae Pichia Aciculoconidium Priceomyces

Dipodascus Saturnispora Ambrosiozyma Scheffersomyces

Galactomyces Saccharomycetaceae Arxula Schizoblastosporion

Geotrichum Kazachstania Ascobotryozyma Schwanniomyces

Endomycetaceae Kluyveromyces Babjeviella Sporopachydermia

Endomyces Lachancea Barnettozyma Starmerella

Helicogonium Nakaseomyces Blastobotrys Starmera

Myriogonium Naumovia Botryozyma Sympodiomyces

Phialoascus Saccharomyces Candida Trigonopsis

Eremotheciaceae Tetrapisispora Citeromyces Wickerhamia

Coccidiascus Torulaspora Cyniclomyces Wickerhamomyces

Eremothecium Vanderwaltozyma Debaryomyces Yamadazyma

Lipomycetaceae Zygosaccharomyces Hyphopichia Yarrowia

Babjevia Zygotorulaspora Kodamaea Zygoascus


6

Tableau 1. Classification des levures Ascomyctes et Basidiomyctes daprs Kurtzman et Fell (2006) et Suh et al. (2006) (la suite).

Basidiomyctes

Hymenomycetes Bulleribasidium Sterigmatomyces Ustilaginomycetes

Cystofilobasidiales Bulleromyces Microbotryales Malassezia

Cystofilobasidiaceae Cryptococcus Microbotryaceae Pseudozyma

Cystofilobasidium Cuniculitrema Bensingtonia Rhodotorula

Cryptococcus Dioszegia Curvibasidium Sympodiomycopsis

Guehomyces Fellomyces Leucosporidiella Tilletiopsis

Itersonilia Filobasidiella Leucosporidium

Mrakia Holtermannia Mastigobasidium

Phaffia Kockovaella Reniforma

Tausonia Sirobasidium Rhodosporidium

Udeniomyces Sterigmatosporidium Rhodotorula

Xanthophyllomyces Tremella Sporobolomyces

Filobasidiales Trimorphomyces Naohideale

Filobasidiaceae Tsuchiyaea Bannoa

Cryptococcus Erythrobasidium

Filobasidium Uredinomycetes Naohidea

Trichosporonales Agaricostilbales Rhodotorula

Trichosporonaceae Agaricostilbaceae Sakaguchia

Cryptococcus Agaricostilbum Sporobolomyces

Cryptotrichosporon Bensingtonia Sporidiobolales

Trichosporon Chionosphaera Sporidiobolaceae

Tremellales Kondoa Rhodosporidium

Tremellaceae Kurtzmanomyces Rhodotorula

Auriculibuller Sampaio Sporidiobolus

Bullera Sporobolomyces


7

Le rle historique des levures dans le domaine de lagroalimentaire ne sest pas dmenti et elles

interviennent de nos jours dans la fabrication de nombreux produits alimentaires (brasserie,

vinification, fromagerie, etc.). Elles participent aussi la revalorisation des dchets agricoles et

industriels et la production de protines, denzymes, de lipides, de vitamines et de biocarburants

(Tableau 2).

Actuellement, les levures sont largement utilises dans les secteurs de la recherche biomdicale

et des biotechnologies en raison de leur double tat de microorganismes et deucaryotes. En effet,

contrairement aux bactries, les levures ont la capacit de produire des protines glycosyles. Des

levures, modifies gntiquement, produisent lantigne de surface du virus de lhpatite B utilis

dans le vaccin anti-hpatite. Dautres produisent la srum- albumine humaine, des hormones, des

facteurs de croissance et dautres protines thrapeutiques (WALKER, 2009 ; REZKI-BEKKI,

2014).

Tableau 2. Diffrents domaines dutilisation industrielle des levures (Walker ; 2009 ; Rezki-Bekki,

2014).

Utilisation industrielle des levures

Boissons alcoolises Vin, bire, cidre, sak, etc.

Protines recombinantes

Hormones (p. ex. linsuline), vaccins anti-viraux (p. ex. le vaccin

contre lhpatite B), facteurs de croissance (p. ex. facteur de

ncrose tumorale), protines sanguines (p. ex. srum albumine

bovine), interfrons (p. ex. interfrons leucocytaires) anticorps (p.

ex. rcepteurs aux IgE), enzymes (p. ex. lipase gastrique et

chymosine).

Alcools industriels Cosmtique, industrie chimique, industrie pharmaceutique,

biothanol, glycrol.

Enzymes Alpha-amylase, glucoamylase, protase, invertase, pectinase,

lipase, inulinase.

Biomasse Levure de boulangerie, levure-aliment, extrait de levure, pigments

alimentaires.

Vitamines Vitamines B, vitamine D, etc.


8

2. Phnomne killer des levures

Les antibiotiques et les bactriocines ont t dcouverts dans la premire moiti du XXme sicle,

alors quil a fallu attendre les annes 1960 pour mettre en vidence un principe quivalent chez

certaines levures. En 1963, BEVAN et MAKOVER ont mis en vidence le phnomne killer

partir dune souche de S. cerevisiae isole de contaminants de brasserie (BEVAN et MAKOVER,

1963). Ce phnomne est bas sur la scrtion par une souche dite tueuse ou killer dune

protine ou une glycoprotine de faible poids molculaire, ayant une action ltale sur des micro-

organismes voisins qualifis de sensibles , sans contact direct de cellule cellule (interaction

indirecte). Les souches killer sont immunises contre leur propre toxine, mais peuvent tre sensibles

aux toxines produites par dautres souches killer (MUSHTAQ et al., 2010). On qualifie de neutre

une souche qui nest pas sensible une toxine et qui nen produit pas. Il est noter que les

qualificatifs phnotypiques killer , sensible , neutre sappliquent toujours en rfrence

une toxine particulire (POMMIER, 2003 ; MAQUEDA et al., 2011).

Laction dune souche killer sur une souche sensible est facile mettre en vidence au

laboratoire, par culture sur milieu glos pH 4.2 4.7 20 - 25 C. Dans la plupart des cas, le

milieu glucose-extrait de levure-peptone agar avec un tampon citrate-phosphate (0.1 M, pH 4.5) est

utilis (GOLUBEV, 2006). La souche sensible est inocule dans la masse de la glose avant

solidification ; la souche tester est inocule en stries ou en spots sur le milieu solidifi ; si elle est

killer, une zone claire dans laquelle la souche sensible ne pousse pas entoure la culture de la souche

tester (Figure 5) (RIBEREAU-GAYON, 2004).

Figure 5. Mise en vidence sur milieu glos du phnotype killer contre deux isolats de Candida

albicans (POLONELLI et CONTI, 2009).


9

Aprs la premire dcouverte du phnomne killer chez S. cerevisiae, il est vite devenu vident

que le caractre killer est largement distribu parmi les genres de levures. Au prsent, lactivit

killer a t observe dans plus de 100 espces appartenant plus de 20 genres de levures

ascomyctes et basidiomyctes tels que Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Hanseniaspora,

Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Torulaspora, Ustilago, Williopsis et Zygosaccharomyces

(Tableau 3) (SCHMITT et BREINIG, 2002 ; VADKERTIOV et SLVIKOV, 2006 ; WANG et

al., 2007 ; EL-BENNA et al., 2011).

3. Ecologie du phnomne killer

Les souches killer des levures peuvent tre isoles partir de sources varies, mais elles sont

beaucoup plus frquentes dans les habitats o les populations de levures atteignent des densits

relativement leves, de sorte que la comptition est beaucoup plus forte.

Le phnomne killer prsente un impact remarquable sur la comptition entre les levures

apparentes vis--vis de leur niche cologique privilgi. Ce cest parce que la sensibilit aux

toxines killer est spcifique et seules les cellules de levures contenant un rcepteur pour ces toxines

sont sensibles aux elles (GOLUBEV, 2006).

Les levures isoles partir des habitats particuliers prsentent une plus grande activit killer

contre des levures provenant dautres habitats que celles appartenant leur propre habitat. Ainsi,

lactivit killer des souches de Pichia kluyveri tait de 12 % dans les fruits, tandis que son activit

contre des levures de diffrentes localits tait 64 % (STARMER et al., 1987). De plus, seulement

9 % de levures provenant des fruits taient sensibles des souches killer de P. kluyveri, tandis que

42 % de souches provenant dautres habitats taient sensibles aux souches testes de P. kluyveri

(STARMER et al., 1992). Dune manire analogue, presque tous les isolats du sol sont sensibles

aux toxines killer produites par des levures provenant de la phyllosphre. Cependant, de nombreux

isolats des plantes sont rsistants, indiquant ainsi une slection au sein des communauts la toxine

prsente (GOLUBEV et GOLUBEVA, 2004).

Clairement, la production de toxines killer par les levures reprsente une fonction importante

pour les cellules killer, en dfendant leur niche cologique contre les cellules microbiennes

invasives qui possdent les mmes besoins nutritionnels. En dautres termes, le phnomne killer

joue un rle important dans la maintenance de la composition de la communaut par lexclusion des

levures comptitives trangres des habitats particuliers (GOLUBEV, 2006).


10

Tableau 3. Espces de levures pour lesquelles lactivit killer a t rapporte (BUZZUNI et al., 2004 ; GOLUBEV, 2006 ; BUZDAR et al., 2011 ; COMITINI et

CIANI, 2011 ; SANTOS et al., 2011 ; BAJAJ et al., 2012 ; LIU et al., 2012 ; GUO et al., 2013).

Espce de levure Rfrence Espce de levure Rfrence

Bullera alba Candida versatilis Kluyveromyces dobzhanskii Rhodotorula lignophila

Bullera hannae Cryptococcus aerius Kluyveromyces lactis

(Candida sphaerica)

Rhodotorula mucilaginosa

Bullera sinensis Cryptococcus albidus Kluyveromyces marxianus

(Candida pseudotropicalis)

Saccharomyces cerevisiae

Bullera unica Cryptococcus laurentii Kluyveromyces siamensis Saccharomyces exiguus

(Candida holmii)

Candida albicans Cryptococcus luteolus Kluyveromyces wickerhamii Saccharomyces paradoxus

Candida berthetii Cryptococcus nemorosus Meyerozyma guilliermondii

(Pichia guilliermondii)

Schizosaccharomyces pombe

Candida diversa Cryptococcus perniciosus Millerozyma farinosa (Pichia

farinosa)

Sporidiobolus pararoseus

Candida freyschussi Cryptococcus podzolicus Mrakia frigida Schwanniomyces occidentalis

Candida glabrata Curvibasidium pallidicorallinum Pichia cactophila Tetrapisispora phaffii

Candida. homilentoma Cystofilobasidium bisporidii Pichia kluyveri Torulaspora delbrueckii

Candida maltosa Debaryomyces hansenii Pichia membranifaciens Torulaspora microellipsoides

(Zygosaccharomyces microellipsoides)

Candida naeodendra Fellomyces penicillatus Pichia kudriavzevii Trichosporon asteroides

Candida oleophila Filobasidium capsuligenum Pseudozyma antarctica Trichosporon jirovecii

Candida parapsilosis Hanseniaspora uvarum (Kloeckera apiculata) Rhodotorula dairenensis Ustilago maydis

Candida silvae Hanseniaspora valbyensis (Kloeckera japonica) Rhodotorula glutinis Wickerhamomyces anomalus (Pichia

anomala)

Candida sonorensis Hanseniaspora. vineae (Kloeckera africana) Rhodotorula graminis Williopsis Saturnus

Candida stellata Kluyveromyces aestuarii Rhodotorula lactosa Zygosaccharomyces bailii


11

Lnergie ainsi que la machinerai cellulaire utilises pour la production des toxines killer ne

peuvent pas galement tre utilises pour la reproduction cellulaire. Par consquent, la synthse des

toxines killer peut rduire le taux de croissance et la comptitivit des organismes producteurs

(PINTAR et STARMER, 2003). Probablement, le cout de la production des toxines, ainsi que

lhtrognit spatiale et temporelle des habitats, rend possible la coexistence de populations killer

et sensibles, comme il est observ dans les communauts naturelles (GOLUBEV, 2006).

4. Matriels gntiques du systme killer des levures

Les dterminants gntiques du phnotype killer sont la fois cytoplasmiques et nuclaires. Ils

peuvent tre ports par des particules virales cytoplasmiques ARN double brin (ARNdb), appeles

VLPs (Virus Like Particles), ou par des plasmides cytoplasmiques forms dADN double brin

(ADNdb) linaire ou bien par un ADN chromosomique (Tableau 4) (SCHMITT et BREINIG,

2006 ; El-BENNA et al., 2011 ; STARMER et LACHANCE, 2011 ; HATOUM, 2013).

Tableau 4. Bases gntiques de lexpression du phnotype killer chez les levures (MARQUINA,

2002 ; SCHMITT et BREINIG, 2006 ; EL-BENNA et al., 2011).

Base gntique

Espce productrice de toxine killer Gne codant pour la toxine

killer

Virus ARNdb

Hanseniapora uvarum M- ARNdb

Saccharomyces cerevisiae M1 ; M2 ; M28

Ustilago maydis M- ARNdb

Zygosaccharomyces bisporus M- ARNdb

Plasmide linaire

ADNdb

Babjeviella inositovora (Pichia

inositovora) pPin 1-1 ; pPin 1-3

Kluyveromyces lactis pGkL 1 ; pGkL 2

Millerozyma acaciae (Pichia acaciae)

pPac 1-1 ; pPac12

Chromosome

Candida glabrata -

Debaryomyces hansenii -

Kluyveromyces fragilis -

Milleromzyma farinosa (Pichia farinosa) SMK 1

Pichia kluyveri -

Saccharomyces cerevisiae KHR ; KHS

Schwanniomyces occidentalis -

Wickerhamomyces anomalus (Pichia

anomala) -

Williopsis mrakii HMK

Williopsis saturnus -


12

4.1. Gnomes viraux cytoplasmiques ARN double brins

Le systme killer cod par les particules virales cytoplasmiques ARNdb a t largement

tudi chez S. cerevisiae, mais il a t aussi dcrit pour Hanseniaspora uvarum,

Zygosaccharomyces bailli et Ustilago maydis. Ces particules virales sont classes dans le genre

Totivirus qui appartient la famille des Totiviridae (GOLUBEV, 2006 ; SCHMITT et BREINIG,

2006 ; MAQUEDA et al., 2011). Contrairement la plupart des virus des vgtaux et des animaux,

les virus des levures ne sont pas infectieux et ils sont transmis par division cellulaire vgtative ou

par fusion sexuelle des gamtes. Les gnomes viraux ARNdb sont entours par une capside

protique ce qui leur permet de persister dans le cytoplasme des cellules infecte et ainsi leur

donner le nom de virus des levures ou bien virus like particles (VLPs) (SCHMITT et

BREINIG, 2006).

Les virus ARNdb de type M sont responsables de la production des toxines killer et de

limmunit. Chez S. cerevisiae, il existe trois types de virus killer ARNdb M : M1, M2 et M28 qui

codent respectivement pour les toxines killer : K1, K2 et K28 (MARQUINA, 2002 ; SCHMITT et

BREINIG, 2006). Les gnomes viraux de type M sont dpendants dun autre groupe de virus

ARNdb, nomm L-A helper , qui code pour leur encapsidation et pour leur rplication

(MAGLIANI, 1997 ; MAQUEDA et al., 2011).

4.2. Plasmides linaires ADN double brins

Des plasmides linaires cytoplasmiques ADNdb ont t identifis dans certaines espces des

genres Babjeviella, Kluyveromyces et Millerozyma (Tableau 4). Lexemple le plus connu est celui

des plasmides linaires nomms pGKL1 et pGKL2 qui sont prsents dans le cytoplasme des

cellules killer de Kluyveromyces lactis (MAGLIANI, 1997 ; El-BENNA et al., 2011). La toxine

killer de K. lactis est code par le plasmide pGKL1, tandis que le plasmide pGKL2 semble jouer un

rle dans la rplication du pGKL1 (SCHRNDER et MEINHARDT, 1995 ; MEINHARDT et

SCHAFFRATH, 2001 ; STARMER et LACHANCE, 2011).

4.3. Gnes chromosomiques codant pour le phnotype killer

Chez des souches killer de certaines espces appartenant aux genres Candida, Debaryomyces,

Kluyveromyces, Millerozyma, Pichia, Saccharomyces, Schwanniomyces, Wickerhamomyces et

Williopsis, les dterminants gntiques du systme killer semblent tre ports par des gnes

chromosomiques (Tableau 4). Ceci est d labsence, dans ces souches killer, de virus ARNdb

ou bien dautres lments gntiques cytoplasmiques comme les plasmides linaires qui ne sont pas

communs chez plusieurs espces de levures (HODGSON et al., 1995).


13

Chez la levure halotolrante, Millerozyma farinosa (Pichia farinosa), le gne (SMK1), localis

sur un chromosome, code pour une prprotoxine qui subit, par la suite, un processus de maturation

similaire celui de la toxine K1 de S. cerevisiae. De plus, la protine killer produite par Pichia

kluyveri et Williopsis mrakii sont probablement codes par des gnes nuclaires (STARMER et

LACHANCE, 2011 ; ORO, 2013). Chez W. mrakii, au moins deux toxines killer diffrentes sont

synthtises dont la premire est dsigne comme HM-1 ou HMK et la seconde est nomme K-500

(MAGLIANI, 1997). En outre, les toxines killer KHR et KHS synthtises par S. cerevisiae sont

codes par deux gnes diffrents localiss sur les chromosomes IX et V (GOTO et al., 1990 ;

GOTO et al., 1990b ; GOTO et al., 1991 ; MARQUINA et al., 2002).

5. Caractristiques des toxines killer

Les toxines killer produites par les levures sont des protines ou des glycoprotines et peuvent

tre des monomres, des htrodimres ou bien des htrotrimres (Figure 6) (STARMER et

LACHANCE, 2011). La plupart des levures killer scrtent des toxines avec un poids molculaire

denviron 10 30 kDa, bien que celles produites par K. lactis, Millerozyma acaciae (Pichia

acaciae), Wicherhamomyces anomalus (Pichia anomala) et Babjeviella inositovora (Pichia

inositovora) prsentent des poids molculaires beaucoup plus levs, denviron 100 kDa ou plus

(Tableau 5) (MENEGHIN et al., 2010).

Figure 6. Structure dimre de la toxine killer SMKT produite par Milleromzyma farinosa (Pichia

farinosa) KK1 (KASHIWAGI, 1997).


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Tableau 5. Comparaison entre les caractristiques de diffrentes toxines killer.

Espce ou souche killer Toxine killer Structure Poids molculaire

(kDa)

Nature Rfrence

Babjeviella inositovora - - 100 Glycoprotine MAGLIANI et al. (1997)

Debaryomyces hansenii CYC 1021 - - 23.0 - MARQUINA et al. (2001)

Kluyveromyces lactis - Trimre (99) ; (30) ; (27.5) - MAGLIANI et al., (1997)

Kluyveromyces marxianus

(Kluyveromyces fragilis) NCYC 587 K6 - 42.3 Protine ZG et al. (1999)

Kluyveromyces wickerhamii

DBVPG 6077 Kwkt - 72.0 Protine

COMITINI et al. (2004) ;

COMITINI et CIANI (2010)

Millerozyma acaciae - Trimre (97) ; (31) ; (28) - MAGLIANI et al. (1997)

Millerozyma farinosa KK1 SMKT Dimre (6.6) ; (7.9) Glycoprotine SUZUKI et NIKKUNI

(1994)

Pichia kluyveri 1002 - Monomre 19.0 Glycoprotine MIDDLEBEEK et al. (1979)

Pichia membranifaciens CYC 1106 PMKT - 18.0 Protine SANTOS et al. (2000)

Pichia membranifaciens CYC 1086 PMKT2 - 30.0 Protine SANTOS et al. (2009)

Saccharomyces cerevisiae

K1 Dimre (9.5) ; (9.0) Protine MARQUINA et al. (2002)

K2 Dimre (21.5) Glycoprotine MARQUINA et al. (2002)

KT28 Dimre (10) ; (11) Glycoprotine MARQUINA et al. (2002)

KHR - 20.0 Protine GOTO et al. (1990a)


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Tableau 5. Comparaison entre les caractristiques de diffrentes toxines killer (la suite).

Schawnniomyces occidentalis

ATCC 44252 - Dimre 7.4 ; 4.9 Protine CHEN et al. (2000)

Wickerhamomyces anomalus YF07b - - 67.0 Protine GUO et al. (2013)

Wickerhamomyces anomalus WC65 - Monomre 83.3 - MARQUINA et al. (2002)

Wickerhamomyces anomalus NCYC

434 K5 - 49.0 Glycoprotine ZG et ALTINBAY (2004)

Williopsis saturnus DBVPG 4561 KT4561 - ~ 62 Protine BUZZNI et al. (2004)

Williopsis saturnus WC91-2 - - 11.0 Protine WANG et al. (2012)

Zygosaccharomyces bailii 412 KT412 - 10.0 Protine RADLER et al. (1993)


16

Les voies de scrtion des toxines killer sont compltement identifies pour les toxines K1

et K28 de S. cerevisiae (GOLUBEV, 2006 ; EL-BENNA et al., 2011). Malgr que les deux

toxines se diffrent dans leur composition en acides amins et dans leur mode daction, leur

synthse et maturation ainsi que leur scrtion montrent une grande homologie. Les protines

killer K1 et K28 sont codes par des virus ARNdb et sont composes de deux sous-units,

nommes et . Ces toxines, sont dabord traduites en prprotoxine qui subit, par la suite, des

modifications post-traductionnelles dans le rticulum endoplasmique et dans lappareil de Golgi

conduisant enfin sa scrtion sous forme dune protine mature htrodimrique (/) (Figure

7). Les deux sous-units sont lies dune manire covalente par un ou bien plus dun pont

disulfure (SCHMITT et BREINIG, 2006). En effet, la prprotoxine pntre le rticulum

endoplasmique laide dun peptide signal hautement hydrophobe au niveau de la rgion N-

terminale. Ce dernier est limin dans le rticulum endoplasmique par une enzyme signal

peptidase et la glycosylation de la sous-unit centrale aura lieu. Dans lappareil de Golgi,

lendopeptidase Kex2p, qui est le produit du gne KEX2, clive la pro-rgion et limine la

squence intramolculaire N-glycosyle. Ensuite, une carboxypeptidase Kex1p, produite par

le gne KEX1, limine la rgion dipeptidique sur lextrmit C-terminale de la sous-unit . La

toxine mature est transfre donc dans une vsicule de scrtion et scrte lextrieur de la

cellule (Figure 7) (SCHMITT et BREINIG, 2002 ; MOHAMUDHA PARVEEN et AYESHA

BEGUM, 2010).

Figure 7. Voie de scrtion de la toxine K28 chez Saccharomyces cerevisiae (SCHMITT et

BREINIG, 2006).


17

6. Mode daction des toxines killer

Bien que leur mcanisme daction killer contre les cellules sensibles montre des diffrences

significatives, les protines killer des levures prsentent un mode daction en deux tapes (DE

INGENIIS et al., 2009 ; GUO et al., 2013).

6.1. Fixation

La premire tape de laction toxique des protines killer consiste en une fixation sur la

paroi cellulaire des cellules sensibles cibles. Cette tape est rapide et dpendante du pH

(MARQUINA, 2002 ; GUO et al., 2013).

La paroi cellulaire des levures prsente quatre classes des macromolcules qui sont les

suivantes dans lordre de leur emplacement, de lextrieur vers lintrieur : les mannoprotines

sont retrouves dans la couche externe. Ce sont des glycoprotines fortement glycosyles qui

comportent 95% de glucides. La couche interne, constitue de plusieurs sous-couches, est

compose majoritairement de deux classes de -glucanes, le -(1,3) et le -(1,6) glucanes avec

une quantit mineure de chitine (Figure 8) (BASMAJI, 2005).

Figure 8. Structure de la paroi cellulaire des levures (BASMAJI, 2005).


18

Ces composs servent comme sites de fixation primaire pour les toxines killer des levures.

Les -(1,6) glucanes sont des rcepteurs primaires pour les protines killer de D. hansenii, H.

uvarum, P. membranifaciens, S. cerevisiae (K1, K2), W. anomalus et W. saturnus. Les

mannoprotines sont des rcepteurs pour S. cerevisiae (K28), S. occidentalis et Z. bailii, tandis

que les rsidus de chitine constituent un site de liaison spcifique pour les toxines killer de K.

lactis et M. acaciae (POMMIER, 2003 ; GOLUBEV, 2006 ; SANTOS et al., 2009 ; EL-

BENNA et al., 2011).

6.2. Action toxique

Laction toxique des protines killer commence avec la migration des protines killer

fixes travers la paroi, vers la membrane plasmique. Cette seconde tape est un processus

nergie-dpendant qui implique la translocation des toxines fixes vers la membrane

cytoplasmique et linteraction avec les rcepteurs membranaires.

Les protines killer exercent leur action toxique contre les cellules sensibles par diffrents

mcanismes. Les toxines killer K1 et K2 produites par S. cerevisiae ont un mode daction trs

similaire, bien quelles soient deux protines diffrentes (MARQUINA, 2002). La toxine K1

lie au glucane rcepteur est ensuite transfre sur un site rcepteur membranaire (Kre 1p, une

protine O-glycosyle), selon un mcanisme ncessitant une fourniture dnergie (SCHMITT et

BREINIG, 2006 ; STARMER et LACHANCE, 2011). Ainsi, les cellules en phase de croissance

sont plus sensibles leffet killer que les cellules en phase stationnaire. Les membranes

plasmiques des cellules sensibles, exposes la toxine, manifestent aprs une phase de latence

de quarantaine de minutes, de graves altrations fonctionnelles se traduisant par linterruption

du transport coupl des acides amins et des protons, lacidification du contenu cellulaire et des

fuites des ions potassium (K+) et dATP (Figure 9). Ces dgts, dus la formation de pores

dans la membrane plasmique, entrainent la mort de la cellule qui survient aprs deux ou trois

heures de contact avec la toxine (RIBEREAU-GAYON, 2004 ; GOLUBEV, 2006 ; SCHMITT

et BREINIG, 2006).

Laction de la toxine killer scrte par P. kluyveri est trs similaire celle de K1. Elle

induit donc une perturbation dans le transport des protons et des acides amins. Par la suite, la

synthse de certaines protines et acides nucliques est inhibes. Enfin, une fuite dATP

intracellulaire et une perte de potassium accompagne dune diminution du pH intracellulaire se

produisent, ce qui conduit la mort de la cellule sensible (MARQUINA, 2002 ; El-BANNA et

al., 2011).


19

Figure 9. Mode daction de la toxine killer K1 de Saccharomyces cerevisiae (MARQUINA,

2002).

Pareillement, la levure halotolrante M. farinosa synthtise une toxine killer qui semble

galement tre implique dans laugmentation de la permabilit membranaire et provoque la

perte des ions (SUZUKI et al., 2001).

La toxine killer K28 de S. cerevisiae se diffre des toxines K1 et K2 du fait quelle agit sur

le cycle cellulaire de diffrentes faons. La toxine K28 se fixe initialement aux rsidus -(1,3)

mannose dune mannoprotines (185 kDa) de la paroi cellulaire et ensuite un rcepteur dans

la membrane plasmique. La protine killer pntre dans la cellule par endocytose et suit, en

sens inverse, la voie de scrtion pour entrer dans le cytosol et finalement le noyau. Elle

provoque donc linhibition du cycle cellulaire dans la phase G2 et simplique dune manire

directe ou indirecte dans linhibition de la synthse dADN (STARMER et LACHANCE,

2011).

La protine killer produite par K. lactis provoque un arrt du cycle cellulaire dans la phase

G1, tandis que la toxine de Lindnera mrakii (Williopsis saturnus var. mrakii) inhibe la synthse

des -(1,3) glucanes ce qui conduit la perte du matriel cellulaire et ventuelle mort cellulaire

(STARMER et LACHANCE, 2011 ; SANTOS et al., 2013).


20

7. Paramtres dterminant lintensit de linteraction

Lintensit de linteraction killer dpend de la sensibilit propre de la souche considre, de la

quantit de toxine fixe, de ltat physiologique des cellules et des conditions environnementales.

7.1. Sensibilit

Les premiers lments dterminant la fois la vitesse et lamplitude de laction ltale dans les

systmes killer/sensible sont la nature de la protine killer en jeu et celle de la souche sensible.

Ainsi, une hirarchisation des souches de levures peut tre tablie selon leur sensibilit une

mme toxine. Pour ce faire, diffrentes techniques de quantification de linteraction ont t

dveloppes. On distingue deux catgories : les techniques en milieu solide bases sur le principe

des antibiogrammes (JANDEROVA et al., 1999), et les techniques en milieu liquide, bases sur un

suivi cintique de la viabilit de cellules sensibles en contact avec la toxine (RAMON-

PORTUGAL et al., 1994).

7.2. Quantit de toxine

Leffet killer est dpendant de la concentration en toxine dans le milieu (KLASSEN et

MEINHARDT, 2005 ; SANTOS et MARQUINA, 2011). Au-del de la concentration absolue en

protine killer, cest plus prcisment le rapport entre la quantit de toxine et la quantit de cellules

sensibles qui est fondamental. Plusieurs auteurs suggrent ainsi que pour provoquer la mort dune

levure, il est ncessaire quun nombre minimum de molcules de toxine soient fixes sur ses

parois. Ce nombre minimum est un taux doccupation limite, qui est variable dune souche

sensible une autre. PALFREE et BUSSEY (1979) annoncent par exemple un chiffre de 6000

molcules pour une souche sensible S. cerevisiae S6, BUSSEY et al. (1979) un chiffre de 28000

molcules pour une souche sensible S. cerevisiae S14a. Il est noter que mme en conditions de

large excs de toxine, il existe un temps minimum avant dobserver leffet killer. Ce temps, court,

correspond aux tapes de migration de la toxine vers la membrane plasmique et de formation de

spores autorisant la fuite de composs intracellulaires (ltape de fixation sur la paroi tant quasi-

instantane). Il a t estim 20 minutes pour la toxine K1 sur des cellules sensibles

Saccharomyces cerevisiae S6 (KURZWEILOVA et SIEGLER, 1995).

7.3. Etat physiologique

Probablement en raison du lien existant entre les besoins nergtiques des cellules sensibles et

lampleur des dgts causs par la toxine killer, on constate que des levures en phase exponentielle


21

de croissance sont plus sensibles que des levures en phase stationnaire (BUSSEY, 1972 ;

MAGLIANI et al., 1997).

7.4. Environnement

De nombreux facteurs environnementaux ont une influence parfois majeure sur lexpression

du phnomne killer. On cite ici les principaux, daprs la revue bibliographique propose par

ALFENORE (1999) :

La temprature : lactivit optimale des protines killer se situe gnralement entre

15C et 25C. Au-del de 30C, la plupart des toxines sont totalement dsactives ;

Le pH : la gamme dexpression de lactivit killer est assez restreinte, puisque quelle se

situe entre pH = 2,5 et pH = 7 pour la plupart des toxines ;

La prsence de sels ou dions mtalliques : il a t montr que les cations mtalliques

Ca2+

et Mg2+

ou le NaCl sont susceptibles daugmenter lactivit de la protine K1. En

revanche, le KCl prsent en quantit trop importante est nfaste l'expression de lactivit

killer ;

La prsence de composs organiques : lthanol en concentration leve attnue parfois

leffet killer, alors que les polyols assurent le maintien de lactivit toxique ;

La prsence de composs spcifiques : la bentonite, les dbris de parois cellulaires et les

polyphnols, possdent une capacit dadsorption des protines killer et peuvent rduire

considrablement la toxicit au sein des milieux des milieux de fermentation.

8. Applications

Les levures killer et leurs toxines trouvent des applications dans diffrents domaines. En

biologie cellulaire, le systme killer des levures fournit un excellent modle pour ltude des

parois et des membranes plasmiques chez les champignons et les levures, des mcanismes de

transcription protique et de linteraction virus-hte dans les cellules eucaryotes (RIFFER et al.,

2002 ; POMMIER et al., 2003). Par ailleurs, les systmes killer peuvent avoir des applications

biotechnologiques, la fois dans les industries alimentaires et de fermentations ainsi que dans

le domaine de la mdecine. Dans la technologie de lADN recombinant, les plasmides killer de

K. lactis prsente un potentiel dutilisation comme vecteurs de clonage pour la scrtion

efficace des protines htrologues (MARQUINA et al., 2002).


22

8.1. Industries alimentaire et de fermentation

De nombreuses souches de levures commerciales utilises dans la production du vin, de la

bire et du pain, se sont rvles tre sensibles aux toxines killer. Par consquent, les souches

killer sauvages peuvent provoquer des fermentations prolonges et affecter ngativement la

qualit des produits. Des souches nologiques killer peuvent tre utilises comme des cultures

starter afin de contrler la croissance des souches de contamination durant les premiers stades de

fermentation. En effet, avec le dveloppement de la gntique molculaire et de la

biotechnologie, la construction de souches nologiques modifies pour un ou plusieurs

caractres killer est possible. On peut y parvenir par cytoduction, cest--dire par introduction

dans une souche nologique sensible des dterminants cytoplasmiques (mitochondries,

plasmides) issus dune souche killer, sans altrer le caryotype de la souche nologique initiale

(RIBEREAU-GAYON, 2004 ; GOLUBEV, 2006). Dautre part, SANTOS et al. (2009) ont

report que la toxine killer PMKT2 de P. membranifaciens peut tre utilise dans la production

du vin pour contrler la croissance des levures de dtrioration. La toxine PMKT2 est capable

dinhiber Brettanomyces /Dekkera bruxellensis tandis que S. cerevisiae sest avre tre

rsistante.

Le systme killer des levures est galement pris pour la conservation alimentaire. Ainsi, la

toxine killer HMK produite par L. mrakii trouve des applications potentielles dans la protection

densilages de mas ou encore de yaourts contre les contaminations par des levures (LOWES et

al., 2000). En outre, L. mrakii prsente un potentiel dutilisation comme agent de bioprservation

pour le contrle de la dtrioration des fromages (LIU et TSAO, 2009). Les proprits killer des

souches de Tetrapisispora phaffii (Kluyveromyces phaffii) sont galement tudies, pour le

dveloppement dagents de bioprservation contre les contaminations du raisin par des levures

apicules du genre Hanseniaspora ou Kloeckera (CIANI et FATICHENTI, 2001 ; COMITINI et

CIANI, 2011).

Du leur grande tolrance au pression osmotique, les levures killer du genre Kluyveromyces

prsentent ont t values comme agent de prservation naturel dans les aliments ferments

sals (HERNANDEZ et al., 2008 ; STARMER et LACHANCE, 2011). En outre, des attentions

considrables ont t donne aux espces killer de M. farinosa, une levure halotolrante avec de

nouvelles proprits killer (SUZUKI et al., 2001).

8.2. Taxonomie

Les levures forment un groupe de microorganismes eucaryotes trs htrogne. Bien que

plusieurs critres discriminants permettent de caractriser et de diffrencier des levures ascomyctes

et basidiomyctes, la distinction de levures diffrentes est souvent difficile. Les tudes molculaires


23

ont montr que plusieurs caractristiques classiques utilises pour dfinir les taxons : la

fermentation et lassimilation des sucres, la prsence des spores et la morphologie. A ce stade, la

recherche pour des tests simples, qui peuvent tre largement utiliss, est dune grande importance.

Un de ces tests peut consister trouver les diffrences de sensibilit aux toxines produites par les

levures killer, qui sont actives contre des levures taxonomiquement apparentes aux producteurs de

toxines killer. Selon les diffrentes sensibilits aux toxines, il est possible de regrouper en catgories

qui sont reproductibles, mme si dautres caractristiques sont diffrentes (MARQUINA et al.,

2002 ; FARKAZ et al., 2012).

8.3. Mdecine

Le systme killer trouve des applications dans le domaine mdical, en particulier, dans le

biotypage des levures pathognes Candida albicans et Cryptococcus neoformans (OCHIGAVA et

al., 2011 ; FARKAZ et al., 2012). Le potentiel dutilisation des toxines killer dans le domaine de la

protection et le traitement des infections fongiques a t galement suggr (GUO et al., 2013). Les

protines killer sont protase-sensibles, antigniques et trs labiles aux tempratures et pH

physiologiques. Leur utilisation comme nouveaux agents antimycotiques peut tre seulement

efficace dans le traitement des lsions superficielles. Par leur nature protique, les protines killer ne

peuvent pas tre administres par voie orale ou intraveineuse (GOLUBEV, 2006). Cependant, il a

t possible de dvelopper une vaccination idiotypique fournissant une immuno-protection qui

reflte une toxine microbicide (POLONELLI et al., 1993 ; 1994 ; 1997, 2003). La mthode utilise

des anticorps anti-idiotypiques qui semblent partager le site actif de la protine killer produite par

W. anomalus. Ils imitent, par consquent, leffet killer de la toxine scrte contre C. albicans,

responsable des infections vaginales et difficile radiquer (MARQUINA et al., 2002 ; GOLUBEV,

2006 ; STARMER et LACHANCE, 2011).


24

CHAPITRE II

MATERIEL ET METHODES

1. Echantillonnage

Lchantillonnage est effectu partir de deux biotopes dans la rgion de Constantine (Nord-

Est Algrien) : 1- chantillon sol agricole situ dans la localit de Hamma Bouziane (Nord- Est

Constantine, 15 Km) 2- chantillon sol forestier localis dans le campus Chaab-Erssas de

lUniversit Frres MENTOURI Constantine.

La rgion de Constantine se caractrise par un climat de type continental (http://www.algerie-

monde.com/villes/constantine), une temprature moyenne annuelle de 15C et une pluviomtrie

annuelle de 560 mm (http://fr.wikipedia.org/wiki/Constantine).

La liste des chantillons et de leurs rgions dorigine est reprsente dans le tableau 6 et la

figure 10.

Tableau 6. Provenance des chantillons de sol utiliss pour lisolement des levures.

Echantillons Localisation Profondeurs

Sol agricole Hamma Bouziane (Constantine).

10, 15, 20, 25, 30 et 35 cm Sol forestier

Campus Chaab-Erssass, Universit

des Frres Mentouri (Constantine).

Les diffrents chantillons sont dposs sur des papiers d'aluminium striles soigneusement

envelopps dans des sacs en papiers striles. Ils sont ensuite gards au frais (4C) puis transfrs

au laboratoire pour une analyse immdiate.

2. Isolement des levures

1g de sol est introduit dans 9 ml deau distille strile (solution mre). La suspension est

agite pendant 10 minutes laide dun agitateur Vortex. Une srie de dilutions dcimales (10-1

jusqu 10-5

) est ensuite prpare partir de la solution mre. Un chantillon de 0.1 ml de chaque

dilution, est ensuite tal sur milieu YMA (Annexe 1), rendu slectif par un pH acide 3.7

(KURTZMAN et al., 2011a ; HASHEM et al., 2014). La gentamicine (0.04 mg/ml), un

antibiotique, est ajoute pour inhiber la croissance des bactries gram positif et ngatif (Bouix et

Leveau, 1991 ; Tarr, 2004).

Les boites de Ptri sont incubes 25C pendant 5 jours. Les colonies bien isoles, sont

observes au microscope lobjectif 40, pour vrifier la morphologie et lhomognit des cellules.

ChapitreII Materiel et mthodes

25

http://www.algerie-monde.com/villes/constantinehttp://www.algerie-monde.com/villes/constantinehttp://fr.wikipedia.org/wiki/Constantine

Figure 10. Localisation gographique des deux rgions de rcolte des chantillons de sol (A).

(H.B : Hamma Bouziane ; C.N.T : Constantine). Images satellite du site dchantillonnage du sol

agricole (B) et du sol forestier (C) (Images obtenues de Google Earth, Avril 2015).

B

C


26

3. Purification et conservation des levures isoles

Aprs isolement, les isolats de levures sont purifis par la technique dpuisement sur le milieu

YPGA (Annexe 1). Lincubation est ralise 25C pendant 72h. Laspect macroscopique et

microscopique est, ensuite, examin afin de vrifier la puret de la souche. Les cultures pures sont

conserves sur le mme milieu en glose incline puis stocke 4C.

4. Mthodes didentification des souches de levures

4.1. Mthode conventionnelle

Lidentification des levures isoles, selon les mthodes conventionnelles, repose sur la

dtermination de divers caractres culturaux, morphologiques et physiologiques (KURTZMAN et

al., 2011a). La composition des milieux de cultures utiliss figure dans lannexe 1.

4.1.1. Etude des caractres culturaux

Les caractres culturaux des souches isoles sont tudis en milieu liquide et sur milieu solide.

Caractres culturaux en milieu liquide

Laspect des cultures en milieu liquide est tudi dans des tubes essai contenant le milieu

YPG liquide (Annexe 1). Les cultures sont incubes 25C et observes aprs 3, 14 et 28 jours.

Laspect de la culture de chaque isolat est soigneusement not: la prsence de dpt au fond du tube

(sdimentation des cellules) ainsi que la prsence de voile ou de pellicule en surface.

Caractres culturaux sur milieu solide

Cette tude est faite sur milieu YPG glos. Lensemencement se fait en stries. Aprs

incubation pendant 1 - 7 jours 25C, des observations sur la forme, la couleur, laspect et la

pigmentation des colonies sont notes.

4.1.2. Etude des caractres morphologiques

Morphologie cellulaire normale et mode de reproduction vgtative

Cette tude a pour but lexamen microscopique de la forme, la taille, larrangement et le mode

de reproduction vgtative des cellules. Lexamen est ralis ltat frais (grossissement x 40) de

frottis prpars partir de cultures fraiches en bouillon YPG.


27

Aptitude la filamentation

Laptitude la filamentation est observe partir dune culture sur milieu PDA (Annexe 1) en

boite de Ptri. La levure examiner est ensemence en une strie longitudinale la surface du milieu

glos. Une lamelle strile est ensuite place sur le centre de la strie. Lobservation microscopique

(grossissement x 40) se fait sur une priode allant de 3 7 jours. La bordure de la culture, sa

filamentation ainsi que la nature de myclium (pseudomyclium ou vrai myclium) sont notes.

4.1.3. Etudes des caractres biochimiques et physiologiques

Les caractristiques biochimiques et physiologiques tudies, sont lassimilation de sources de

carbone et dazote, la fermentation de sucres et la croissance des tempratures diffrentes.

Assimilation de substrats carbons

Ltude de lassimilation des sources carbones est ralise sur milieu minimum YNB (Annexe

1), additionn de 0.5 % de source de carbone. Ce milieu est strilis par filtration (diamtre, =

0.22 m), puis rparti dans des tubes contenant 4.5 ml deau distille strile (0.5 ml/tube). Les

substrats carbones sont: le D-glucose, le D-galactose, le saccharose, le D- maltose, le ,

trhalose, le lactose et le raffinose. Lassimilation de la source carbone se traduit par une

croissance de la souche dans le milieu aprs incubation 25C pendant 01 03 semaines.

Assimilation de substrats azots

Les sources azotes testes sont le nitrate de potassium (KNO3) et le nitrite de sodium (NaNO2).

Le milieu utilis dans cette tude est YCB (Annexe 1) additionn dune quantit du substrat azot

quivalente 0.078% de KNO3 (0.026% pour le NaNO2), puis strilis par filtration. Lincubation

se fait 25C pendant 01 03 semaines. Lassimilation de la source azote se traduit par un trouble

dans le milieu de culture. La confirmation des rsultats positifs est ralise par transfert dun

inoculum (0.1 ml) de la culture prcdente dans un nouveau tube contenant le mme milieu culture

sans la source azote (mme priode et mme temprature dincubation).

Fermentation de substrats carbons

Les sucres tests sont : le D-glucose, le D-galactose, le D- maltose, le saccharose, le ,

trhalose et le lactose. La solution de base utilise pour la fermentation de sucres est le milieu YP

(Annexe 1), rparti dans des tubes de Durham (contenant une cloche de Durham). Des solutions

striles de sucres sont ajoutes au milieu raison de 2%. Les tubes sont ensemencs avec 0.1 ml


28

dune suspension de levures. Les cultures sont incubes 25C sous agitation et observes aprs 3,

7, 14 et 28 jours. La fermentation du sucre est mise en vidence avec la prsence du gaz dans la

cloche de Durham.

Test de croissance des tempratures diffrentes

Cette tude est ralise dans un milieu YPG liquide. Les tubes sont ensemencs avec 0.1 ml

dune suspension de levure (absorbance 580 = 0.5 ou 106/ml). Les cultures sont incubes

diffrentes tempratures : 4C, 20C, 25C, 30C, 37C et 40C. La croissance des levures est

suivie chaque semaine pendant 28 jours.

Lensemble des tests de la mthode conventionnelle sont praticables mais ne sont pas

satisfaisants pour la dlimitation et l'identification des espces de levures. De plus, leur mise en

uvre est longue et difficile, les lectures stendant parfois sur plusieurs semaines. Ainsi, les

mthodes didentification molculaire sont largement rpandues (VANHEE et al., 2009 ; MOREL,

2013).

4.2. Mthode didentification molculaire

Cette identification ncessite l'extraction de l'ADN d'une culture pure. Elle repose sur

l'amplification de la rgion D1/D2 du gne de lARN ribosomique 26S (ARNr 26S) (Figure 11) et

ensuite sur le squenage de l'amplicon obtenu (KURTZMAN et ROBNETT, 1998 ; LOPEZ et al.,

2010). Cette rgion comporte des squences fortement conserves et des squences qui prsentent

un fort degr de variabilit gntique entre les espces de souches levuriennes.

Figure 11. Schma reprsentatif du gne de lARNr 26S et la localisation de la rgion

hypervariable D1/D2 (MOREL, 2013).

Gne de lARNr 26S


29

4.2.1. Extraction dADN

La mthode de BOLANO et al. (2001) est utilise pour lextraction de lADN gnomique total

des isolats obtenus de cultures fraiches incubes pendant 48-96 h 25C sur milieu YPG agar. Les

cellules sont collectes la surface des boites de Ptri, puis mlanges 500 l de tampon de lyse

[Tris-HCl (pH 8.0) 50 mM/L, EDTA 50 mM/L, NaCl 250 mM/L, SDS 0.3% w/v], dans un

microtube vis. 150 l de billes de verre (de diamtre entre 0.25 0.30 mm) sont ajoutes ainsi que

500 l de solution phnol chloroforme (1 :1, v/v, pH 8.0). Le mlange est agit vigoureusement au

Vortex pendant 3 min afin de casser les cellules. Une centrifugation (30 min, 12000 rpm) permet de

sparer 4 phases : les billes de verre (en culot), la phase phnolique (contenant les protines et les

lipides), les dbris cellulaires et la phase aqueuse (en surnageant contenant lADN et lARN). Cette

dernire (environ 400 l) est transfre dans un nouveau microtube, laquelle est ajout un volume

gal dthanol glac (96%). Le mlange est homognis par inversion du tube, puis maintenu -

20C pendant 30-60 min, ce qui permet la prcipitation de lADN. Aprs une centrifugation (15

min, 12000 rpm, 4C) et llimination du surnageant, le culot dADN est dissout dans 100 l deau

distille strile avec 4 l de RNase afin dliminer les ARNs. Aprs une incubation de 30 min

37C, 11 l dactate de sodium (0.3 M) sont ajouts ainsi que 200 l dthanol glac (96%). Aprs

une centrifugation (15 min, 12000 rpm, 4C), le culot dADN est mlang 500 l dthanol (70%).

Le mlange est agit au Vortex pendant 30 secondes au minimum. Une dernire centrifugation (15

min, 13000, 4C) permet de rcuprer le culot dADN gnomique qui est ensuite parfaitement sch

avant dtre dissout dans 100 l deau distille strile. La solution dADN est maintenu -20C.

2.4.2. Amplification de lADN extrait par PCR

Cette exprience consiste multiplier, par la technique de PCR, la quantit dADN extraite de

chaque isolat. La raction de PCR se fait dans un volume final de 50 l : 5 l de tampon Taq

polymrase (10X) ; 4 l de MgCl2 (25 mM) ; 10 l de dNTPs (1.25 mM) ; 0.2 l de Taq polymrase

(5 U/l) ; 2.5 l de chaque amorce (Tableau 7) ; 5 l dADN gnomique. La raction

damplification est faite dans le thermocycleur (Biometra GmbH, Goettingen, Germany) selon le

programme dcrit en annexe 2.


30

Tableau 7. Couples damorces utiliss dans la PCR.

Nom des amorces Squence des amorces

RLR3R 5-GGTCCGTGTTTCAAGAC-3

V9 5-TGCGTTGATTACGTCCCTGC-3

2.4.3. Squenage de lADN

Le squenage des produits PCR est confi la socit Macrogen Inc. (Amsterdam, Pays-Bas).

Ainsi, une rgion de 600 650 paires de bases (domaine D1/D2) est squence par lutilisation des

amorces NL1 et NL4 (Sigma) (Tableau 8) (LOPEZ et al., 2010 ; TURCHETTI et al., 2013). Les

souches sont identifies par une recherche BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) de

squences D1/D2 dposes dans la base de donnes GenBank (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ).

Lalignement des squences est effectu par le logiciel Vector NTI Suite 8 ContigExpress

(Informax, Invitrogen, Camarillo, CA).

Lanalyse phylogntique permet la comparaison et le rapprochement des squences en se

basant la fois sur des paramtres purement mathmatiques et statistiques et sur des donnes

biologiques dvolution. Les comparaisons phylogntiques des squences de mme taille sont

ralises partir du logiciel Molecular Analysis Evolutionary Genetics Analysis (MEGA)

version 4.1 selon la fonction des plus proches voisins (Tamura et al., 2007). Les distances

phylogntiques sont consolides par 1000 rptitions de bootstrap (Turchetti et al., 2013).

Tableau 8. Couples damorces utilises dans le squenage de la rgion D1/D2 du gne codant

pour lARNr 26S de la grande sous-unit ribosomique.

Nom des amorces Squence des amorces

NL1 5-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3

NL4 5-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3


31

http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST

5. Test de la mise en vidence de lactivit killer chez les souches isoles

Les essais prliminaires de la mise en vidence de lactivit killer chez les isolats de levures

sont faits sur le milieu solide YPG agar additionn de 0.003 % de bleu de mthylne (YPG-BM

agar) et tamponn pH 4.5 avec un tampon citrate-phosphate (0.1 M) (19.2 g/L dacide citrique,

28.4 g/L de Na2HPO4 dans 1 litre deau distille) (BUZZINI et al., 2004 ; COMITINI et al., 2004 ;

GUO et al., 2013).

Un total de 43 souches de levures et dorganismes ressemblant des levures appartenant aux

24 espces dintrt alimentaire et mdical de Candida albicans (nombre de souches 4), C. glabrata

(5), C. parapsilosis (1), C. tropicalis (4), C. zeylanoides (1), Clavispora lusitaniae (2),

Cryptococcus laurentii (3), Debaryomyces hansenii (1), Dekkera anomala (1), D. bruxellensis (1),

Filobasidiella bacillispora (1), F. neoformans (4), Hanseniaspora uvarum (1), Kazachstania exigua

(1), Kluyveromyces lactis (1), K. marxianus (1), Meyerozyma guilliermondii (1), Pichia kudriavzevii

(1), Saccharomyces cerevisiae (3), S. pastorianus (1), Yarrowia lipolytica (1), Zygosaccharomyces

bisporus (1), Prototheca wickerhamii (1) et Prototheca zopfii (2) sont utilises pour le test de

sensibilit (La liste dtaille est reprsente dans lannexe 3). Ces souches proviennent de la

collection internationale des levures Industrial Yeast Collection DBVPG (www.dbvp.unipg.it)

de lUniversit de Prouse (Italie).

Une suspension de cellules (en eau distille strile) de chaque souche sensible, est prpare

partir dune culture en glose incline de YPG agar, incube pendant 48 h 25C. 100 l de

suspension sont ensuite mlanges avec le milieu YPG-BM agar (maintenu 45C dans un bain

marie), afin dobtenir une concentration finale de 105 cellules/ ml, puis coule dans des boites de

Ptri striles.

Les isolats de levures, testes pour leur activit killer, sont cultivs pendant 24 h 25C sur

glose incline du milieu YPG agar, puis ensemencs en surface du milieu YPG-BM agar aprs

solidification. Les cultures sont incubes pendant 5 jours 25C. Lapparition dune zone claire

dinhibition, autour des colonies des souches potentiellement killer, entoure par de petites cellules

colores en bleu fonc rvle la prsence dune activit killer.


32

http://www.dbvp.unipg.it/

6. Production de la toxine killer brute

6.1. Souche killer dintrt

Le test prliminaire de la mise en vidence de rvle la prsence du caractre killer chez la

souche L5 isole partir dun sol agricole dans la rgion de Hamma Bouziane (Constantine, Nord-

Est Algrien). La souche L5 est identifie comme tant Pichia kluyveri par squenage du domaine

D1/D2 du gne codant pour lARNr 26S de la grande sous-unit ribosomique.

6.2. Milieu de production

Le milieu utilis pour la production de la toxine killer par la souche P. kluyveri (L5) est YPG

liquide tamponn pH 4.0 avec un tampon citrate-phosphate (0.1 M) (SANTOS et MARQUINA,

2004 ; da Silva et al., 2008). Auparavant, le milieu est strilis par autoclavage pendant 15 minutes

121C.

6.3. Pr-culture

Une pr-culture de la souche killer P. kluyveri (L5) 105 cellules/ ml est prpare dans un

erlenmeyer de 500 ml contenant 250 ml de milieu de production et inocule partir dune colonie

isole de la boite de conservation. La culture se droule pendant 24 h 20C avec une agitation de

100 rpm.

6.4. Culture principale

Un inoculum de 10 ml de pr-culture est transfr dans un erlenmeyer de 2L contenant 1L du

milieu de production. La culture se droule pendant 24 h 20C avec une agitation de 100 rpm.

Aprs centrifugation (12 000 rpm, 15 min, 4C), un volume dthanol glac (concentration finale

80%) est ajout au surnageant contenant la protine killer (BUZZINI et al., 2044). Le mlange est

incub 4C pendant une nuit, le prcipit rsultant est rcupr par centrifugation (12 000 rpm, 30

min, 4C) puis re-solubilis dans 36.5 ml du tampon citrate-phosphate 0.1 M (pH 4.0). La solution

obtenue reprsente lextrait brut de la toxine killer de P. kluyveri.

7. Test dactivit killer de la toxine brute

Un total de 121 souches de levures (provenues de la collection DBVPG) appartenant aux 24

espces de dtrioration des aliments (Statford, 2004) sont utilises comme souches sensibles


33

laction toxique de la protine killer. Il sagit de Candida parapsilosis (nombre des souches 5),

Debaryomyces fabryi (3), Debaryomyces hanseni (1), Debaryomyces nepalensis (1), Dekkera

anomala (3), Dekkera bruxellensis (8), Hanseniaspora uvarum (5), Kazachistania exigua (5),

Kluyveromyces lactis (6), Kluyveromyces marxianus (3), Meyerozyma guilliermondii (2), Pichia

kudriavzevii (5), Pichia membranifaciens (5), Rhodotorula mucilaginosa (5), Saccharomyces

bayanus (5), Saccharomyces cerevisiae (15), Saccharomyces pastorianus (3), Schizosaccharomyces

pombe (5), Torulaspora delbrueckii (5), Torulaspora microellipsoides (5), Wickerhamomyces

anomalus (4), Yarrowia lipolytica (4), Zygosaccharomyces bailii (5) et Zygosaccharomyces

bisporus (13). La liste dtaille est reprsente dans lannexe 3.

Lvaluation de lactivit killer de lextrait brut de la protine killer est faite par la mthode de

diffusion par puits sur glose pour la dtermination des diamtres des zones dinhibition telle que

dcrite par Woods et Bevan (1968) (BUZZINI et al., 2004 ; COMITINI et al., 2004). Des puits de 8

mm de diamtre sont creuss sur le milieu YPG-BM agar (pH 4.5), pralablement inocul avec 105

cellules/ml de souche sensible puis, 100 l de lextrait brut de la protine killer sont introduits dans

chaque puits. Aprs une pr-diffusion pendant une nuit 4C, les boites de Ptri sont incubes

pendant 5 jours 25C. Les essais sont rpts 2 fois. La superficie de la zone dinhibition autour

des puits est utilise comme une valuation semi-quantitative de lactivit killer de lextrait brut.

Une unit arbitraire (Ua) est dfinie par la quantit de protine killer, ncessaire pour la production

dune zone dinhibition avec une superficie de 10 mm2 (BUZZINI et al., 2004 ; LIU et al., 2012).

8. Traitement protasique de la toxine killer brute

100 l de la toxine killer brute (0.45 mg de protine/ml) est mlang avec 100 l de lenzyme

protolytique pronase (100 UI/ml) (Sigma). Le mlange est ensuite incub 25C pendant 24 h.

Une inactivation par la chaleur (choc thermique) est ralise en parallle.

Lactivation killer rsiduelle est value par la technique de diffusion par puits sur glose

comme dcrit ci-dessus.


34

9. Cintique de production de la toxine killer

La cintique de production de la toxine killer par la souche P. kluyveri (L5) est ralise dans des

erlenmeyers de 250 ml contenant 50 ml de milieu de production. 5 ml dune pr-culture de la

souche productrice L6, cultive 20C pendant 24 h sous agitation (100 rpm) dans le milieu de

production, sont inoculs dans un erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml du mme milieu de

culture. Les erlens ensemencs sont ensuite incubs 20C sous agitation (100 rpm) pendant 3

jours. Les prlvements sont effectus toutes les 08 heures afin de dterminer la biomasse par

mesure spectrophotomtrique (DO = 580nm). Aprs centrifugation (12 000 rpm, 15 min, 4C), le

surnageant est rcupr pour lvaluation de lactivit killer par la technique de diffusion en puits

sur glose. Les exprimentations sont effectues en trois essais.

10. Purification de lextrait brut de la toxine killer par gel-filtration

Aprs la production de la toxine killer par P. kluveri L5, lextrait brut (36.5 ml) de la toxine est

dialys (12 14 kDa ; Medicell) contre le tampon citrate-phosphate 0.01 M (pH 4.0) pendant 3

jours 4C et le tampon est chang quotidiennement. Ce processus est effectu 4C, laquelle la

plupart des protines killer maintiennent leur activit (BUZZINI et al., 2004 ; SANTOS et al.,

2009). La fraction protique obtenue est ensuite concentre avec le polythylne glycol (PEG) un

volume final de 2.4 ml.

Le concentr (3.84 mg de protine, 2.4 ml) est appliqu une colonne Sephacryl S-200 (HR,

1.5 50 cm) (Pharmacia, Uppsala, Sweden) qui est pralablement quilibre par un tampon citrate-

phosphate 0.01 M (pH 4.0) contenant 0.15 M de NaCl .Llution (dbit 0.24 ml/min) est faite 4C

en utilisant le mme tampon et lactivit protique est dtecte par mesure de labsorbance 260

nm. Des fractions de 0.6 ml sont collectes en sortie toutes les 2.5 min, regroupes puis dialyses

4C contre le tampon citrate-phosphate 0.01 M (pH 4.0). Les fractions de dialyses sont ensuite

concentres avec le PEG un volume final de 2.0 ml. Lactivit killer des fractions concentres est

vrifie par la technique de diffusion en puits contre D. bruxellensis DBVPG 6706 (la souche la

plus sensible).


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11. Electrophorse sur gel de polyacrylamide-sodium dodcyl sulfate (SDS-PAGE)

Aprs la gel-filtration, les fractions concentres obtenues (au nombre de 9) sont analyses par

lectrophorse en conditions dnaturantes (SDS-PAGE) selon la technique dcrite par LAEMMLI

(1970). Llectrophorse est ralise sur un gel 10% dacrylamide (Bio-rad) de 1.5 mm

dpaisseur. Aprs migration, les gels sont colors la fois par le bleu de Coomasie R-250 (Sigma

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