Implication des levures du genre Candida et des amibes

THÈSE

Pour l'obtention du grade deDOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS

UFR de médecine et de pharmacieLaboratoire de chimie et microbiologie de l eau - LCME (Poitiers)

(Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)

École doctorale : Biologie-santé - Bio-santé (Limoges)Secteur de recherche : Physiologie, biologie des organismes, populations et interactions

Présentée par :Vanessa Barbot

Implication des levures du genre Candida et des amibes libresdans le risque infectieux lié à l'eau - contexte des soins dentaires

Directeur(s) de Thèse :Christine Imbert, Marie Deborde

Soutenue le 30 octobre 2012 devant le jury

Jury :

Président Thierry Bergès Professeur des Universités, Université de Poitiers

Rapporteur Loïc Favennec Professeur des Universités, Université de Rouen

Rapporteur Martine Bonnaure-Mallet Professeur des Universités, Université de Rennes 1

Membre Christine Imbert Professeur des Universités, Université de Poitiers

Membre Marie Deborde Maître de conférences, Université de Poitiers

Membre Raymond Robert Professeur des Universités, Université d'Angers

Pour citer cette thèse :Vanessa Barbot. Implication des levures du genre Candida et des amibes libres dans le risque infectieux lié à l'eau contexte des soins dentaires [En ligne]. Thèse Physiologie, biologie des organismes, populations et interactions.Poitiers : Université de Poitiers, 2012. Disponible sur l'Intranet de l'Université de Poitiers <http://theses.univ-poitiers.fr>

false

THESE

Pour l’obtention du Grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS

Faculté de Médecine et de Pharmacie (Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)

Ecole Doctorale : « Sciences pour l’environnement » Gay Lussac

Secteur de Recherche : Physiologie, Biologie des organismes, populations et Interactions

Présentée par :

Vanessa BARBOT

************************

IMPLICATION DES LEVURES DU GENRE

CANDIDA ET DES AMIBES LIBRES DANS LE

RISQUE INFECTIEUX LIE A L’EAU – CONTEXTE DES SOINS DENTAIRES

************************

Directrices de Thèse : Christine IMBERT et Marie DEBORDE

Soutenue le 30 octobre 2012 devant la Commission d’Examen

************************

JURY

Président : M. Thierry BERGES Professeur, Université de Poitiers Rapporteurs : Mme Martine BONNAURE-MALLET Professeur, Université de Rennes 1 M. Loïc FAVENNEC Professeur, Université de Rouen Examinateurs : M. Raymond ROBERT Professeur, Université d’Angers Mme Christine IMBERT Professeur, Université de Poitiers Mme Marie DEBORDE Maitre de Conférences, Université de

Poitiers

Thèse réalisée au Laboratoire d’Ecologie, Biologie des Interactions

EBI, UMR CNRS 7267

Equipe Microbiologie de l’Eau

Université de Poitiers, 6 Rue de la Milétrie, BP 199

86034 Poitiers cedex

Cofinancement

Ce projet a également bénéficié d’un soutien financier de l’IFRO (Institut Français de

Recherche en Odontologie) et des structures du CHU de Poitiers, nous les

remercions.

REMERCIEMENTS

« Le meilleur ami de ‘merci’ est ‘beaucoup’ » (M. Bouthot), et l’aboutissement de ce projet de

recherche étant lié à de nombreuses personnes, j’ai beaucoup de ‘merci’ à distribuer.

En premier lieu, je remercie les professeurs Jacques Frère et Didier Bouchon,

directeurs successifs du laboratoire LCME (Laboratoire de Chimie et de Microbiologie de

l’Eau) devenu récemment EBI (Ecologie, Biologie des Interactions), pour m’avoir accueillie

dans leur équipe et m’avoir permis de réaliser ce projet de recherche.

Je remercie également Yann Héchard, responsable de l’équipe Microbiologie de

l’Eau, pour sa gestion dynamique de l’équipe et son aide, directe ou indirecte, mais

indispensable.

Je tiens à remercier mes deux directrices de thèse, Christine Imbert et Marie

Deborde pour leur encadrement, leur présence, leur accompagnement continu, de près ou

de loin. Un merci particulier à Christine pour son écoute et son optimisme durant ces trois

années de recherche.

J’aimerai remercier les autres membres du jury : Martine Bonnaure-Mallet, Loïc

Favennec, Raymond Robert et Thierry Bergès pour avoir accepté de lire et de corriger

mon travail.

Je remercie tous ceux qui m’ont apporté leur expérience, leurs connaissances et qui

m’ont permis d’avancer dans ce projet de recherche : Jérôme Labanowsky (UMR CNRS

7285 Poitiers) pour les analyses de GC-MS, Nathalie Quellard et Béatrice Fernandez pour

les observations en microscopie électronique (Unité de pathologie ultrastructurale et

expérimentale ; Service d’anatomie et cytologie pathologique, CHU Poitiers), Virginie

Migeot pour les analyses statistiques (CHU Poitiers), Adriana Delwail (laboratoire LITEC,

plateforme ImageUp) pour les expériences de cytométrie en flux ainsi que le laboratoire

SR²B (Société de Recherche et de Réalisations Biotechnologiques) d’Angers dont fait partie

le Pr Raymond Robert, pour leurs conseils et leur participation aux marquages

immunocytochimiques.

Un grand merci à Nathalie Ranger et Karine Demangeau pour leur gestion efficace

de tout le côté logistique de l’équipe. Merci également à Alain, Christophe et Marie-Claude

pour leur aide quotidienne et indispensable.

Je remercie chaleureusement l’ensemble des techniciennes du service de

Parasitologie du CHU de Poitiers : Dominique, Michelle, Gyslaine, Marylène, Anne et

Sophie, ainsi que Nadine et Dominique au service de distribution. Merci également au Dr

Jacques Berthonneau, alias Mimile pour sa décoration particulière du bureau et sa

convivialité permanente. Un grand merci à Marie-Hélène Rodier, chef du service de

Parasitologie pour son accueil et surtout son aide précieuse. Merci à Anne Bousseau et

Amélie Robert pour leur participation au projet.

J’aimerai remercier les membres du CIMES (Cellule d’Initiation aux Métiers de

l’Enseignement Supérieur) et surtout Anne Brouard pour l’organisation des formations de

monitorat et Dominique Proudhon pour ses cours passionnants.

Merci à Charles Bodet et Nicolas Bellin pour m’avoir conseillée et encadrée durant

les TP de Bactériologie, rendant mon premier contact avec le domaine de l’enseignement

agréable et très motivant.

Merci également à mes stagiaires Armance et Jonathan, pour leur participation au

projet et leur motivation.

Un grand merci à Marion Girardot et Damien Costa pour leur amitié et l’ambiance

agréable qu’ils ont apporté dans le laboratoire du CHU.

Merci à Jean-Marc Berjeaud pour ses conseils et son optimisme, et merci à tous les

autres membres de l’équipe pour leur présence, leurs conseils divers et variés, sans oublier

leur participation volontaire pour les échantillonnages de salive. Un merci particulier à Aïcha

Gharbi pour m’avoir aiguillée et soutenue au début de ma thèse et à Julien Verdon pour

m’avoir initiée à la recherche et motivée à réaliser une thèse.

Enfin, un grand merci à mes parents Brigitte et Daniel, à toute ma famille pour leur

soutien et leurs encouragements, merci à tous mes amis, et plus particulièrement à Julien

et enfin Nicolas qui, en plus de son appui, m’a aidée à la réalisation de mon affiche de

thèse.

SOMMAIRE

Liste des abréviations 1

Liste des figures 2

Liste des tableaux 6

Introduction générale 7

Etude bibliographique 10

Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés 11

I. Les levures du genre Candida 11

1) Présentation 11

a) Taxonomie 11

b) Morphologie 11

2) Pathogénicité 12

a) Incidence et porteurs sains 12

b) Facteurs de pathogénicité 13

3) Adhérence et biofilm 14

a) Définition d’un biofilm 14

b) Etapes de formation d’un biofilm 15

c) Architecture 17

d) Régulation et QS 18

e) Résistances 18

4) Infections orales à Candida 19

a) Infections oropharyngées 19

b) Prévention 20

II. Les amibes libres 21

1) Présentation 21

a) Taxonomie 21

b) Morphologie 21

c) Environnement et prédation 23

d) ARB et endosymbiotes 24

2) Principaux genres amphizoïques 25

a) Acanthamoeba 26

b) Balamuthia 26

c) Naegleria 27

d) Sappinia 27

e) Vahlkampfia – Hartmannella 28

3) Infections amibiennes 29

a) Principales infections amibiennes 29

b) Modes de contamination 30

c) Traitements et prévention 31

Chapitre 2 : La salive 32

I. Généralités 32

1) Origine et formation 32

2) Caractéristiques et composition 33

a) Composants inorganiques 33

b) Composants organiques 33

3) Fonctions et applications 34

a) Goût 35

b) Protection et lubrification 35

c) Dilution et nettoyage 35

d) Barrière 36

e) Digestion 36

f) Réparation des tissus 36

g) Activité antimicrobienne 36

h) Diagnostic 36

4) Facteurs influents 36

a) L’hydratation 37

b) Le cycle circadien et rythme annuel 37

c) L’âge 37

d) Le sexe 37

e) Les stimuli 37

f) Les médicaments 37

g) Les infections 38

II. Micro-organismes et interactions 38

1) Flore commensale buccale 38

a) Flore bactérienne 38

b) Flore fongique 39

c) Interactions entre micro-organismes 39

2) Interactions des micro-organismes avec la salive 41

a) La salive favorise l’adhérence 42

b) La salive a une activité antimicrobienne 43

Chapitre 3 : Les units de soins dentaires 45

I. Définition et structure du circuit d’eau 45

1) Définition de l’unit de soins dentaires 45

2) Circuit d’eau de l’USD 46

II. Revues de la littérature 47

1) Revue nationale : Le Chirurgien Dentiste de France (2011) 48

2) Revue internationale : FEMS Immunology and Medical Microbiology

(2012) 57

Matériel et méthodes 67

Chapitre 1 : Milieux et réactifs 68

I. Le milieu de culture 68

II. Les micro-organismes 68

1) Souches utilisées 68

a) Souches de levures 68

b) Souches d’amibes libres 68

2) Culture et entretien 68

a) Culture des levures 68

b) Culture des amibes libres 68

3) Préparation des micro-organismes 71

a) Préparation des levures 71

b) Préparation des amibes libres 71

c) Préparation des surnageants de culture d’amibes libres 72

III. La salive 72

1) Obtention des échantillons 72

2) Préparation des salives 72

a) Salive centrifugée 72

b) Salive filtrée 72

c) Salive filtrée et traitée au DTT 73

d) Salive filtrée et chauffée 73

e) Salive filtrée et fractionnée 73

Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive 74

I. L’analyse de la salive 74

1) Préparation de la salive 74

2) Analyse par chromatographie 74

II. La survie dans l’eau 75

1) Survie des levures 75

a) Gamme de concentrations en salive 75

b) Préparation des suspensions 75

c) Suivi de la survie 75

d) Analyse de la viabilité 75

2) Survie des amibes libres 76

a) Gamme de concentrations en salive 76

b) Préparation des suspensions 76

c) Suivi de la survie 76

d) Analyse de la viabilité 76

Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures 78

I. Préparation des micro-organismes 78

II. Analyse de la viabilité 78

III. Observations microscopiques 79

1) Microscopie électronique à transmission 79

a) Préparation des cocultures 79

b) Fixation 1 79

c) Pré-enrobage 79

d) Fixation 2 79

e) Déshydratation 79

f) Inclusion en résine 80

g) Coupes et observations 80

2) Marquage immunocytochimique 81

a) Oxydation 81

b) Saturation 82

c) Anticorps primaire 82

d) Anticorps secondaire 82

e) Contraste 82

3) Microscopie électronique à balayage 82

a) Stérilisation des coupons 82

b) Préparation des cocultures 83

c) Fixation 83

d) Déshydratation 83

e) Dessiccation par méthode Point Critique 83

f) Métallisation et observations 84

IV. Analyse par cytométrie en flux 84

1) Cytométrie en flux : principe 84

2) Cytométrie en flux : application 85

a) Préparation des cocultures 85

b) Marquage par des fluorochromes 85

c) Analyse en cytométrie en flux 85

Chapitre 4 : Les traitements chimiques 86

I. Produits chimiques utilisés 86

II. Traitements des micro-organismes 87

1) Préparation des suspensions 87

a) Préparation des levures 87

b) Préparation des amibes libres 87

c) Préparation des cocultures 87

2) Traitements chimiques 87

3) Analyse de la viabilité 88

a) Analyse de la survie des levures 88

b) Analyse de la survie des amibes libres 88

Résultats et discussion 89

Chapitre 1 : Analyse de la salive 90

I. Objectif de l’étude 90

II. Chromatogramme obtenu par GC-MS 90

Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive 92

I. Survie des levures 92

1) Objectif de l’étude 92

2) Article : FEMS Microbiology Letters (2011) – Influence de la présence de

salive 92

3) Influence du type d’eau utilisée 97

4) Influence de la composition de la salive utilisée 98

a) Salive centrifugée VS salive filtrée 98

b) Salive filtrée VS salive DTT 100

c) Salive filtrée VS salive chauffée 102

d) Salive filtrée VS salives fractionnées 104

5) Influence de la température utilisée 106

II. Survie des amibes libres 110

1) Objectif de l’étude 110

2) Influence de la présence de salive 110

a) Sur la survie d’A. castellanii 110

b) Sur la survie de H. vermiformis 111


Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures 114

I. Cocultures A. castellanii-Candida 114

II. Cocultures H. vermiformis-Candida 116

1) Article : Water Research (2012) – Interactions entre H. vermiformis et

Candida spp. 116


3) Influence de la présence d’un surnageant d’amibes libres 126

III. Observations microscopiques 127

1) Microscopie électronique à transmission 128

a) Observations des cocultures en suspension 128

b) Marquage immunocytochimique 129

2) Microscopie électronique à balayage 131

IV. Cytométrie en flux 133

1) Analyse des suspensions de levures 134

2) Analyse des suspensions d’amibes libres 135

3) Analyse des cocultures 137

Chapitre 4 : Les traitements chimiques 139

I. Survie des microorganismes en mono-culture – Article en cours de soumission (2012) 139

II. Survie des microorganismes en cocultures 157

1) Viabilité des levures 157

2) Viabilité des amibes libres 159

Conclusion et perspectives 161

Références bibliographiques 166

- Liste des abréviations -

1

Liste des abréviations

Ag : Antigène

ARB : Amoeba-Resistant Bacteria

ATCC : American Type Culture Collection

DMSO : DiméthylSulfoxyde

DTT : DiThiolThréitol

ES : Elastomère de Silicone

FEMS : Federation of European Microbiological Societies

FSC : Forward Scatter

GC-MS : Gaz Chromatography – Mass Spectrometry

H2O2 : Peroxyde d’hydrogène

Ig : Immunoglobuline

IHEM : BCCM-IHEM, Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms

IP : Iodure de Propidium

MEB : Microscopie Electronique à Balayage

MEC : Matrice Extracellulaire

MET : Microscopie Electronique à Transmission

MOI : Multiplicity Of Infection

NaOCl : Hypochlorite de sodium

NNA : Non-Nutrient Agar

NPP : Nombre le Plus Probable

PIR : Porte-Instruments Rotatifs

PMA : Polymétacrylate

Ppm : parties par million

PRP : Protéines Riches en Proline

PVC : PolyChlorure de Vinyle

PYG : Peptone - Yeast extract - Glucose

PYNFH : milieu ATCC 1034 modifié

QS : Quorum-Sensing

SSC : Side Scatter

SVF : Sérum de Veau Fœtal

UFC : Unité Formant Colonie

USD : Unit de Soins Dentaires

VIH : Virus d’Immunodéficience Humaine

- Liste des figures -

2

Liste des figures

(Hors articles)

Figure 1 : Observations en microscopie électronique à balayage (MEB) des différentes

morphologies de C. albicans (Hawser and Douglas, 1994). 12

Figure 2 : Pourcentages des espèces de Candida retrouvées dans les candidoses

systémiques (entre 1991 et 2008). Le groupe « autres espèces » inclus C. lusitaniae, C.

krusei, C. guilliermondii, C. dubliniensis, et C. rugosa (Trofa et al., 2008). 13

Figure 3 : Représentation schématique des trois phases de développement d’un biofilm

de Candida spp. sur différents supports : PMA (polyméthacrylate) (a, b) et ES (élastomère

de silicone) (c, d). MEC : matrice extracellulaire (Chandra et al., 2001). 15

Figure 4 : Observations en MEB des différentes étapes de formation d’un biofilm de C.

albicans (1-5). * : blastospores, b : cellule en bourgeonnement, m : MEC, : hyphes

(Paulitsch et al., 2009). 16

Figure 5 : Images de microscopie confocale illustrant l’architecture en 3D d’un biofilm

mature de C. albicans (a, b). : hyphes (Chandra et al., 2001). 17

Figure 6 : Observations en MEB d’un biofilm de Candida spp. retrouvé sur la prothèse

dentaire d’un patient atteint de stomatite (A-C) (Ramage et al., 2004). 20

Figure 7 : Observations en microscopie optique de différents genres d’amibes libres :

Playtamoeba (A), Acanthamoeba (B, D et K), Vanella (C), Glaeseria (E), Hartmannella (F

et I), Naegleria (G et H) et Echinamoeba (J) (Thomas et al., 2008). 22

Figure 8 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (a) et de kystes (b)

d’Acanthamoeba castellanii (x1000). n : noyau, cv : vacuole. (Visvesvara et al., 2007). 22

Figure 9 : Observations en microscopie électronique à transmission (MET) de la

phagocytose de Legionella pneumophila par Hartmannella vermiformis (A-D) et de sa

réplication à l’intérieur de l’amibe (E-F) (Greub and Raoult, 2003). 23

Figure 10 : Schéma du rôle des amibes libres en tant que réservoir et vecteur de

transmission de bactéries (Greub and Raoult, 2004). 25

Figure 11 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (a) et d’un kyste (b) de

Balamuthia mandrillaris (x850) (Visvesvara et al., 2007). 26

Figure 12 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (a), d’un flagellé (b) et

d’un kyste (c) de Naegleria fowleri (x1000). n : noyau et u : partie postérieure (Visvesvara

et al., 2007). 27

Figure 13 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (b), et de kystes (c) de

Sappinia diploidea (x1000). n : noyaux (Visvesvara et al., 2007). 27


3

Figure 14 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (1), et d’un kyste (4) de

Hartmannella vermiformis. cv : vacuole (Smirnov and Michel, 1999). 28

Figure 15 : Kératite amibienne à Acanthamoeba (Scat et al., 1995). 29

Figure 16 : Encéphalite amibienne à Balamuthia (Schuster and Visvesvara, 2004). 30

Figure 17 : Schéma de la localisation des glandes salivaires majeures. 1 : glande parotide,

2 : glande sous-mandibulaire, 3 : glande sublinguale

(http://coproweb.free.fr/pagphy/physioan/ch5s1.htm; 04/08/2012). 32

Figure 18 : Les différentes fonctions de la salive (Crielaard, 2011). 34

Figure 19 : Schéma des interactions mutualistes entre C. albicans et Streptococcus

gordonii dans la cavité orale (a-e). QS : Quorum Sensing (Morales and Hogan, 2010). 41

Figure 20 : Schéma des différentes interactions entre la salive et les micro-organismes

oraux (A-D). K+ : potassium, exemple d’ions intracellulaires (Scannapieco, 1994). 42

Figure 21 : Adhérence de différentes souches de C. albicans sur un support de PMA, en

absence (A) ou en présence (B) de salive (Elguezabal et al., 2008). 43

Figure 22 : Effet de différentes salives sur la transition blastospores-hyphes de C. albicans

(Leito et al., 2009). 44

Figure 23 : Photographies de différentes parties de l’USD. (a) vue d’ensemble, (b) vue

intérieure du circuit d’arrivée d’eau (ici un réservoir interne), (c) le plateau supportant les

PIR, (e) le crachoir et le circuit d’évacuation d’eau (O'Donnell et al., 2006). 45

Figure 24 : Photographie de tubulures d’USD. (a) tubulure entière, (b) section de tubulure

(Porteous, 2010). 46

Figure 25 : Vue intérieure de l’USD : un réseau complexe de circulation d’eau (Wirthlin et

al., 2003). 46

Figure 26 : Section longitudinale d’une tubulure d’USD, recouverte de biofilm (Coleman et

al., 2007). 47

Figure 27 : Aérosols visibles, produits par une turbine d’USD lors d’un acte de soins

dentaires (Harrel and Molinari, 2004). 48

Figure 28 : Protocole de tyndallisation de bactéries. 71

Figure 29 : Inclusion des échantillons dans une résine époxy (A, B) (Unité de pathologie

ultrastructurale et expérimentale ; Service d’anatomie et cytologie pathologique, CHU

Poitiers). 80

Figure 30 : Coupes ultra-fines déposées sur des grilles de cuivre (A) et porte-échantillon

permettant l’insertion des grilles dans le MET (B) (Unité de pathologie ultrastructurale et

expérimentale ; Service d’anatomie et cytologie pathologique, CHU Poitiers). 81

Figure 31 : Schéma du principe de la cytométrie en flux (http://bentleyinstruments.com/

wp-content/uploads/2010/12/Somacount_FCM-300x254.jpg, 4/08/2012). 84


4

Figure 32 : Chromatogramme de la salive filtrée, analysée par GC-MS (n=2). 91

Figure 33 : Survie de C. albicans dans l’eau distillée (A) et dans l’eau filtrée (B), en

présence de différentes concentrations de salive centrifugée (0, 2, 5 et 10% v/v) à 27°C

(n=2). 97

Figure 34 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B), et C. parapsilosis (C), dans l’eau

filtrée en présence de 5% (v/v) de salive centrifugée ou filtrée à 27°C (n=2). 99


filtrée en présence de 5% (v/v) de salive filtrée ou de salive DTT à 27°C (n=2). 101


filtrée en présence de 5% (v/v) de salive filtrée (n=2) ou chauffée à 27°C (n=1). 103


filtrée en présence de 5% (v/v) de salive filtrée, de salive <5 K ou <30 K à 27°C (n=2). 105

Figure 38 : Survie de C. albicans à 27°C (A), 20°C (B), et 10°C (C), dans l’eau filtrée en

présence de 2% (v/v) de salive filtrée (n=2). 107

Figure 39 : Survie de C. glabrata à 27°C (A), 20°C (B), et 10°C (C), dans l’eau filtrée en

présence de 2% (v/v) de salive filtrée (n=2). 108

Figure 40 : Survie de C. parapsilosis à 27°C (A), 20°C (B), et 10°C (C), dans l’eau filtrée

en présence de 2% (v/v) de salive filtrée (n=2). 109

Figure 41 : Survie d’A. castellanii dans l’eau filtrée en présence de 2, 5 ou 10% (v/v) de

salive filtrée à 20°C (n=1). 111

Figure 42 : Survie de H. vermiformis dans l’eau filtrée en présence de 2, 5 ou 10% (v/v)

de salive filtrée à 20°C (n=2). 111

Figure 43 : Survie de H. vermiformis à 27°C (A), 20°C (B), et 10°C (C), dans l’eau filtrée

en présence de 2% (v/v) de salive filtrée (n=2). 113

Figure 44 : Survie d’A. castellanii (A) (n=1) et de C. albicans (B) (n=2), en coculture dans

l’eau filtrée en présence de 2% (v/v) de salive filtrée, à 20°C. 115

Figure 45 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B) et C. parapsilosis (C), en coculture

avec H. vermiformis, dans l’eau filtrée avec 2% (v/v) de salive filtrée, à 20, 27 et 10°C

(n=2). 125

Figure 46 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B) et C. parapsilosis (C), en présence

de surnageant de culture amibienne ou de H. vermiformis, dans l’eau filtrée, à 20°C

(n=2). 127

Figure 47 : Observations en MET de C. albicans (A) et de H. vermiformis (B) en coculture

dans de l’eau filtrée avec 2% de salive filtrée (v/v) après 24 h (C-D) et 168 h (E-F)

d’incubation à 20°C (n=2). 129


5

Figure 48 : Observations en MET de C. albicans et de H. vermiformis en coculture dans

de l’eau filtrée avec 2% de salive filtrée (v/v) après 72 h d’incubation à 20°C et marquage

immunocytochimique (A-D) (n=2). 130

Figure 49 : Observations en MEB de coupons de PVC incubés dans de l’eau filtrée,

après 72 h d’incubation à 20°C (A-B) (n=1). 131

Figure 50 : Observations en MEB de C. albicans et de H. vermiformis en coculture sur

coupons de PVC, dans de l’eau filtrée avec 2% de salive filtrée (v/v) après 3 jours (A-B),

15 jours (C-D) et 42 jours (E-F) d’incubation à 20°C (n=1). 132

Figure 51 : Résultats de cytométrie en flux (A-B) d’une suspension de C. albicans après

72 h d’incubation dans de l’eau filtrée avec 5% de salive filtrée (v/v) à 20°C (n=2). 135

Figure 52 : Résultats de cytométrie en flux (A-B) d’une suspension de H. vermiformis

après 72 h d’incubation dans de l’eau filtrée avec 5% de salive filtrée (v/v) à 20°C (n=1). 137

Figure 53 : Résultats de cytométrie en flux (A-B) d’une suspension de C. albicans et de

H. vermiformis en coculture, après 72 h d’incubation dans de l’eau filtrée avec 5% de

salive filtrée (v/v) à 20°C (n=1). 138

Figure 54 : Survie de C. albicans en coculture avec H. vermiformis, dans l’eau filtrée, à

20°C et après 15 min de mise en présence de chlore (A), d’H2O2 (B) ou d’Oxygenal 6©

(C) (n=1). 158

Figure 55 : Survie de H. vermiformis en coculture avec C. albicans, dans l’eau filtrée, à

20°C et après 15 min de mise en présence de chlore (A), d’H2O2 (B) ou d’Oxygenal 6©

(C) (n=1). 160

- Liste des tableaux -

6

Liste des tableaux

(Hors articles)

Tableau 1 : Les trois principales fonctions des protéines de la salive (Rudney, 2000). 35

Tableau 2 : Espèces fongiques retrouvées dans la cavité orale de 20 individus sains

(Ghannoum et al., 2010). 40

Tableau 3 : Préparation du milieu PYG. 69

Tableau 4 : Préparation du milieu PYNFH (ATCC 1034). 70

Tableau 5 : Tableau statistique pour la méthode du NPP à 3 géloses par dilution

(http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalytical

ManualBAM/ucm109656.htm, 4/08/2012). 77

7

Introduction

générale

- Introduction générale -

8

La contamination microbienne des units de soins dentaires (USD) est connue et

étudiée depuis les années 1960. De nombreux travaux ont été menés depuis sans aboutir à

des solutions satisfaisantes. L’origine de cette contamination est multiple.

D’une part l’eau arrivant au sein de l’USD, provenant du réseau d’eau potable ou d’un

réservoir indépendant, peut transporter des micro-organismes qui vont coloniser le circuit

d’eau de l’USD, se déposer sur les parois des tubulures et y former un biofilm. Ce biofilm

pourra par la suite se décrocher, et ainsi contaminer l’eau délivrée aux patients par le biais

des porte-instruments rotatifs (PIR).

D’autre part, la contamination du circuit d’eau de l’USD peut être le résultat d’un reflux de

micro-organismes provenant de la bouche d’un patient. Durant un soin dentaire, les PIR en

contact avec la muqueuse buccale du patient peuvent être en effet contaminés par contact

direct ou par le biais des aérosols contenant des micro-organismes oraux. Ces derniers se

retrouvent donc dans le circuit d’eau de l’USD et peuvent s’intégrer au biofilm formé sur les

parois des tubulures, dans le cas d’un dysfonctionnement ou de l’absence de valves anti-

reflux au niveau des PIR.

De nombreux micro-organismes ont été isolés dans l’eau des USD, et parmi eux

certains peuvent être impliqués de façon directe et/ou indirecte en pathologie humaine.

Suivant les recommandations en vigueur en France, l’eau qui entre dans l’USD doit

respecter les critères de potabilité de l’eau destinée à la consommation humaine.

Cependant, il n’existe pas de législation concernant l’eau en sortie de l’USD, et le passage à

l’intérieur des tubulures potentiellement recouvertes de biofilm augmente la charge

microbienne de l’eau, exposant ainsi les patients et les praticiens à une eau pouvant être

contaminée. Pas ou peu de cas d’infections sont recensés. Toutefois quelques cas de

pathologies respiratoires ou encore de kératites amibiennes sont rapportés dans la

littérature ; un lien direct avec un acte de soin dentaire a dans ces cas plus ou moins été mis

en évidence. Ce risque infectieux ne représente peut-être pas un problème de santé

publique, mais il existe et concerne plus particulièrement les personnes fragiles ou

immunodéprimées, de plus en plus nombreuses (ex. : personnes âgées, fumeurs,

diabétiques, VIH+, …). Fournir un environnement exempt de micro-organismes pathogènes

durant un soin dentaire reste donc un objectif à atteindre.

Par ailleurs, de nombreux moyens de lutte contre cette contamination peuvent être mis

en œuvre tels que la filtration de l’eau, l’utilisation de désinfectants, la présence et l’entretien

des valves anti-reflux, ou encore la purge des flexibles. Malheureusement, ces

recommandations sont souvent mal connues et de ce fait insuffisamment suivies par les

praticiens. Ce manque d’information conduit à une prise de conscience insuffisante du

risque infectieux. C’est dans une démarche de prévention et de sensibilisation au risque

infectieux que ce projet de recherche a été initié.

- Introduction générale -

9

Les principaux objectifs de ce travail ont été de mieux connaitre le comportement de

micro-organismes d’intérêt pouvant être présents dans l’eau des USD, étudier les

interactions mises en jeu entre ces micro-organismes potentiellement pathogènes pour

l’Homme et ainsi mieux évaluer le risque infectieux lié à leur présence dans l’eau circulant au

sein de l’USD.

Les micro-organismes qui ont été choisis pour cette étude sont, d’une part, trois espèces de

levures appartenant au genre Candida, commensales et pathogènes opportunistes de

l’Homme, très fréquemment impliquées dans des infections nosocomiales. Suite à une

défaillance ou à l’absence de valves anti-reflux au niveau des PIR, elles peuvent se

retrouver à l’intérieur des tubulures de l’unit, accompagnées par un reflux de salive

provenant du patient, durant un soin dentaire.

D’autre part, des micro-organismes environnementaux issus du réseau d’eau potable ont été

étudiés : les amibes libres Acanthamoeba castellanii et Hartmannella vermiformis. Ces

protozoaires sont ubiquitaires dans l’environnement, peuvent être à l’origine d’infections

chez l’Homme et ont la capacité de servir d’hôte pour le développement intracellulaire de

certains micro-organismes potentiellement pathogènes (ex : Legionella pneumophila).

Enfin, dans un but de prévention et de lutte contre le risque infectieux que ces micro-

organismes peuvent représenter, l’efficacité de différents traitements chimiques

communément utilisés a été étudiée sur les différentes espèces de Candida et d’amibes

libres. De nombreux produits chimiques ont été développés pour la désinfection des USD,

ainsi que différentes méthodes de traitement. Selon le type d’USD et le fournisseur associé,

le traitement peut être réalisé avec l’utilisation de désinfectants de façon périodique ou

continue, ou encore en combinant plusieurs désinfectants. Les produits disponibles ne sont

que peu ou pas étudiés en termes d’efficacité contre des micro-organismes adhérés à des

surfaces ou de toxicité pour les patients. De plus, leur effet corrosif sur les matériaux n’est

pas toujours évalué. Dans cette étude, l’activité antimicrobienne de trois produits a été

analysée : le chlore (NaOCl), le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et l’Oxygenal 6© (peroxyde

d’hydrogène avec des ions argent).

10

Etude

bibliographique

- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -

11

Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés

I. Les levures du genre Candida

1) Présentation

Les levures du genre Candida sont des organismes eucaryotes, d’une taille de 4 à 10

µm et qui se multiplient par bourgeonnement (Odds, 1988). Ce sont des micro-organismes

commensaux et pathogènes opportunistes pour l’Homme (Akpan and Morgan, 2002; Hube,

2004). Le commensalisme est une association entre deux organismes dont seul un

organisme (le commensal) tire profit sans pour autant nuire au deuxième (l’hôte). Candida

est principalement isolé dans les muqueuses telles que la cavité orale, le tractus gastro-

intestinal, le tractus uro-génital ou la peau (Ghannoum et al., 2010; Odds, 1988). Candida a

pour la première fois été isolé en 1884 dans l’expectoration d’un patient atteint de

tuberculose (Akpan and Morgan, 2002). Sous certaines conditions, par exemple un système

immunitaire fragilisé (VIH+, âge, chimiothérapie, …) ou une flore commensale réduite suite à

un traitement antibiotique, Candida peut devenir pathogène pour son hôte : on parle donc de

pathogène opportuniste.

a) Taxonomie

Les levures du genre Candida appartiennent au règne fongique, plus précisément au

phylum des Ascomycètes, à la classe des Saccharomycètes, à l’ordre des

Saccharomycétales et à la famille des Saccharomycétacées. Le genre Candida dénombre

plus de 300 espèces parmi lesquelles seule une minorité, dont C. albicans, C. tropicalis, C.

glabrata, C. krusei, C. parapsilosis et C. dubliniensis, se retrouve impliquée en pathologie

humaine (Akpan and Morgan, 2002). L’espèce la plus fréquente et de ce fait la plus étudiée

est C. albicans.

b) Morphologie

Candida est une levure dimorphique (Douglas, 2003), qui peut exister sous une forme

ovoïde unicellulaire, la blastospore (Figure 1) appelée encore « type levure » et sous une

forme filamenteuse pluricellulaire, l’hyphe, caractéristique des champignons (Figure 1). Une

troisième forme intermédiaire est retrouvée, le pseudo-hyphe. Les pseudo-hyphes

ressemblent à des blastospores allongées, restant attachées entre elles (Figure 1). Ces

formes cellulaires possèdent des propriétés différentes, notamment en terme de fonction ;

les blastospores seraient plus adaptées pour la dissémination et la survie commensale, alors


12

que les hyphes favoriseraient l’invasion et la pénétration des tissus (Cannon et al., 1995a).

La transition morphologique se fait en réponse à différents stimuli environnementaux

(Cannon et al., 1995a; Leito et al., 2009), tels que le pH, la température ou encore la

présence de nutriments.

Figure 1 : Observations en microscopie électronique à balayage (MEB) des différentes

morphologies de C. albicans (Hawser and Douglas, 1994).

2) Pathogénicité

a) Incidence et porteurs sains

Les levures du genre Candida sont isolées de la cavité orale de 20 à 75% de la

population générale, sans symptômes associés. En cas de dysfonctionnement du système

immunitaire de l’hôte, ces levures sont capables de développer leur caractère pathogène et

de causer une grande variété d’infections, nommées candidoses. Ces infections peuvent

être superficielles au niveau de la peau et des muqueuses, systémiques au niveau des

organes profonds (comme le foie ou les reins), ou encore septicémiques (Douglas, 2003;

Trofa et al., 2008). L’incidence des infections fongiques a fortement augmenté depuis les

années 1980, notamment dans le milieu hospitalier : les candidoses sont considérées

comme la quatrième cause d’infections nosocomiales (Trofa et al., 2008). Avec une mortalité


13

associée de plus de 45%, les infections à Candida spp. sont devenues un réel problème de

santé publique (Hawser and Douglas, 1994; Trofa et al., 2008).

C. albicans, C. parapsilosis et C. glabrata représentent plus de 80% des espèces

isolées en cas de candidoses nosocomiales ; C. albicans étant impliquée à elle seule dans

50% des cas (Figure 2) (Akpan and Morgan, 2002; Trofa et al., 2008).

Figure 2 : Pourcentages des espèces de Candida retrouvées dans les candidoses

systémiques (entre 1991 et 2008). Le groupe « autres espèces » inclus C. lusitaniae, C.

krusei, C. guilliermondii, C. dubliniensis, et C. rugosa (Trofa et al., 2008).

b) Facteurs de pathogénicité

L’ampleur de l’infection fongique dépend d’une part de facteurs liés à l’hôte dont :

-des facteurs intrinsèques tels que l’âge, le sexe ou un affaiblissement général de l’immunité

dû à certaines maladies comme le diabète, le VIH ou les cancers (Akpan and Morgan, 2002;

Daniluk et al., 2006).

-des facteurs extrinsèques tels que des traitements médicamenteux ou chirurgicaux. Une

antibiothérapie à long terme altère la flore microbienne commensale et favorise le

développement des candidoses, alors que les procédures invasives comme la pause de

cathéters ou de sondes offrent aux levures une porte d’entrée vers la circulation sanguine

(Akpan and Morgan, 2002; Daniluk et al., 2006; Trofa et al., 2008).

D’autre part, les levures du genre Candida possèdent un arsenal de facteurs de

pathogénicité ; leur combinaison conduira au développement d’une infection chez un hôte

affaibli. Les facteurs les plus importants sont :


14

-le dimorphisme,

-la sécrétion d’enzymes lytiques (ex : protéases, phospholipases), qui faciliteront le passage

des levures au niveau des tissus,

-l’adhérence, qui représente l’étape initiale de la colonisation des surfaces (vivantes ou

inertes).

3) Adhérence et biofilm

Les levures du genre Candida sont capables de se fixer aussi bien à des surfaces

vivantes, telles que les cellules épithéliales (buccales ou vaginales), les kératinocytes ou les

composants tissulaires (fibronectine, fibrinogène, …), qu’à des surfaces synthétiques

comme les plastiques (silicone, chlorure de polyvinyle (PVC), acrylique, …). L’étape

d’adhérence, initiatrice de la colonisation fongique, contribue à la formation d’un biofilm.

a) Définition d’un biofilm

La définition d’un biofilm a beaucoup évolué depuis ces 30 dernières années.

Actuellement, il est défini comme étant une communauté de micro-organismes attachés de

manière irréversible à un substrat (micro-organismes dits sessiles), ancrés dans une matrice

de substances polymériques extracellulaires (MEC) qu’ils ont sécrétées, et présentant un

phénotype modifié par rapport à leur équivalent planctonique (libres, en suspension)

notamment en termes de taux de croissance ou de transcription génique (Donlan and

Costerton, 2002). Le biofilm est un système biologique complexe, structuré et dynamique, et

représente la forme d’existence microbienne la plus répandue dans la nature (Baillie and

Douglas, 1999; Douglas, 2003). Le premier exemple reconnu de biofilm naturel est la plaque

dentaire (Douglas, 2003). Il a depuis été démontré qu’un nombre important d’infections

humaines étaient liées au développement d’un biofilm microbien (Douglas, 2003).

Les recherches sur les biofilms, après s’être longtemps focalisées sur les exemples

bactériens (Baillie and Douglas, 1999), commencent à se concentrer de plus en plus sur les

biofilms fongiques, et différents modèles d’étude in vitro commencent à se développer. C.

albicans, espèce la plus impliquée dans les infections, est souvent choisie comme modèle

de référence.


15

b) Etapes de formation d’un biofilm

La formation d’un biofilm fongique est un processus complexe se déroulant en

plusieurs phases dont 3 principales peuvent être distinguées : la phase précoce, la phase

intermédiaire et la phase de maturation (Figure 3) (Chandra et al., 2001).

Figure 3 : Représentation schématique des trois phases de développement d’un biofilm de

Candida spp. sur différents supports : PMA (polymétacrylate) (a, b) et ES (élastomère de

silicone) (c, d). MEC : matrice extracellulaire (Chandra et al., 2001).

-phase précoce : les levures, sous forme de blastospores, arrivent à proximité de la surface

et vont s’y associer (Figure 3) par l’intermédiaire de facteurs non-spécifiques (forces

électrostatiques, hydrophobicité de surface) et spécifiques (reconnaissance ligands-


16

récepteurs de surface). Cette étape, d’environ 11 h, est rapidement suivie par des divisions

cellulaires aboutissant à la formation de micro-colonies à la surface du support (Figure 4-1)

(Chandra et al., 2001; Paulitsch et al., 2009; Ramage et al., 2005).

-phase intermédiaire : lors de cette phase, les formes hyphes commencent à apparaitre, et

la matrice extracellulaire (MEC) est sécrétée (Figure 3). Cette étape se déroule entre 12 et

30 h après l’adhérence initiale des blastospores (Figure 4-2 ; 4-3).

Figure 4 : Observations en MEB des différentes étapes de formation d’un biofilm de C.

albicans (1-5). * : blastospores, b : cellule en bourgeonnement, m : MEC, : hyphes

(Paulitsch et al., 2009).


17

-phase de maturation : au cours de cette phase tardive (31 à 72 h), la matrice

polysaccharidique s’épaissit et englobe un réseau fongique (Figure 3) composé de

blastospores, d’hyphes et de pseudo-hyphes (Figure 4-4 ; 4-5). Au-delà de 72 h, une

quatrième phase débute, avec le détachement de levures seules ou en amas, se retrouvant

à l’état planctonique.

c) Architecture

Le biofilm fongique est décrit comme une structure bi-phasique tridimensionnelle

composée d’une couche basale de blastospores recouverte d’une couche plus ou moins

épaisse constituée de formes filamenteuses et de MEC (Figure 5) (Baillie and Douglas,

1999; Chandra et al., 2001; Paulitsch et al., 2009). La couche basale, peu épaisse (10-12

µm ; environ ¼ de l’épaisseur du biofilm) joue un rôle primordial dans la solidité de l’ancrage

du biofilm à la surface (Baillie and Douglas, 1999; Douglas, 2003). La couche plus externe,

composée d’hyphes et de MEC est beaucoup plus volumineuse (environ ¾ de l’épaisseur du

biofilm) et peut atteindre 450 µm d’épaisseur (Baillie and Douglas, 1999; Chandra et al.,

2001).

Figure 5 : Images de microscopie confocale illustrant l’architecture en 3D d’un biofilm mature

de C. albicans (a, b). : hyphes (Chandra et al., 2001).

Lors de la maturation du biofilm, des canaux aqueux se forment, permettant de faire circuler

les nutriments jusqu’aux couches profondes du biofilm et d’évacuer les déchets

métaboliques (Baillie and Douglas, 1999).


18

d) Régulation et QS

La formation d’un biofilm dépend de plusieurs facteurs dont d’une part des facteurs

environnementaux tels que la nature de la surface (rugosité, hydrophobicité). En effet les

surfaces lisses comme le silicone favorisent beaucoup moins le développement de biofilms

que des surfaces plus rugueuses telles que le PVC (chlorure de polyvinyle) (Douglas, 2003;

Hawser and Douglas, 1994). Les surfaces peuvent également être recouvertes d’un film de

conditionnement protéique qui favorisera l’adhérence des micro-organismes en apportant

des ligands supplémentaires et en modifiant les caractéristiques physiques et chimiques de

la surface (charge, hydrophobicité, …) (Donlan, 2002; Douglas, 2003). Dans l’exemple de la

formation de la plaque dentaire, les dents ou encore les surfaces acryliques des prothèses

dentaires sont rapidement recouvertes d’une fine couche de salive appelée pellicule

exogène acquise, et qui favorise l’adhérence des micro-organismes (Scannapieco et al.,

1995; Zijnge et al., 2010). Le pH du milieu environnant, ainsi que les nutriments et l’oxygène

disponibles vont également influer sur la formation du biofilm (Mukherjee et al., 2005).

D’autre part, de nombreuses études ont montré que les micro-organismes à l’intérieur des

biofilms présentaient un profil transcriptionnel très différent de celui de cultures

planctoniques (Chandra et al., 2001; Donlan, 2002). La voie de régulation génétique de la

formation des biofilms de C. albicans, complexe et récemment élucidée, ne sera pas

développée dans cette étude bibliographique.

Enfin, la communication intercellulaire, appelée « quorum-sensing » (QS), joue un rôle

important dans la formation et le maintien du biofilm (Podbielski and Kreikemeyer, 2004).

Les cellules sont capables de communiquer par le biais de molécules qu’elles sécrètent en

fonction de la densité cellulaire de la population. Une réponse physiologique et génétique est

initiée une fois que la concentration seuil en ces molécules est atteinte (Podbielski and

Kreikemeyer, 2004). Deux molécules ont été identifiées pour C. albicans : le tyrosol, qui

favorise la formation d’hyphes et de biofilm, et le farnesol qui exerce l’effet inverse

(Mukherjee et al., 2005; Ramage et al., 2005).

e) Résistances

Comparé à la croissance planctonique, le développement des micro-organismes au

sein d’un biofilm leur procure une meilleure survie. Englobés dans ce micro-environnement,

ils se retrouvent protégés contre de nombreuses agressions extérieures telles que les

variations de pH, de concentration en nutriments, la dessiccation ou encore la prédation

(Donlan, 2002). La croissance sous forme de biofilm permet une proximité entre micro-

organismes favorisant les échanges plasmidiques et les coopérations, aboutissant à une

forte augmentation de la résistance aux traitements antimicrobiens ou encore aux défenses

immunitaires de l’hôte (El-Azizi et al., 2004; Ghigo, 2001).


19

Les micro-organismes sessiles peuvent être mille fois moins sensibles à un traitement

antimicrobien que les cellules planctoniques (Chandra et al., 2001). Plusieurs mécanismes

de résistance ont été identifiés chez C. albicans (Douglas, 2003; Ramage et al., 2005), par

exemple :

-la présence de la MEC constitue une barrière diffusive et permet de ralentir l’accès des

molécules antifongiques aux couches profondes du biofilm,

-un état de croissance ralentie, dû à un accès parfois limité en nutriments, surtout dans les

couches les plus internes du biofilm, engendre des changements du métabolisme, et

notamment dans la composition de la membrane fongique,

-l’expression modifiée de certains gènes durant la formation du biofilm, telles que des gènes

codant pour des pompes à efflux qui se retrouvent alors surexprimées à la surface des

levures.

4) Infections orales à Candida

a) Infections oropharyngées

Une grande proportion de la population générale est colonisée par C. albicans au

niveau de la cavité buccale (Cannon and Chaffin, 1999), mais seulement une partie de ces

individus développeront une candidose orale. Le développement de l’infection est lié à divers

facteurs tels que l’âge de l’individu ou encore un état affaibli du système immunitaire ; ainsi

dans la population générale, 30-45% des adultes sont des porteurs sains, contre 75% en ne

considérant que les personnes ayant une prothèse dentaire (Daniluk et al., 2006), ou 95%

en ne considérant que les personnes atteintes du VIH (Akpan and Morgan, 2002). La

prothèse dentaire représente un support propice à l’adhérence de micro-organismes oraux

tels que les levures du genre Candida, sur lequel ils pourront plus facilement former un

biofilm (Figure 6), augmentant ainsi la possibilité de développement d’une infection orale.

Il existe de nombreuses formes cliniques de candidoses oropharyngées, dont les

principales sont (Akpan and Morgan, 2002; Bichot, 2012):

-la forme pseudomembraneuse ou « muguet » ; forme la plus commune, retrouvée surtout

chez des individus au système immunitaire fragile (nouveau-nés et personnes âgées), des

patients atteints de diabètes ou du VIH, sous chimiothérapie ou radiothérapie. Elle se

caractérise par l’apparition d’efflorescences blanchâtres, composées de cellules épithéliales

desquamées et de cellules fongiques, retrouvées au niveau des muqueuses buccales et

labiales, de la langue et du palais,


20

-la forme hyperplasique chronique, caractérisée par des lésions cutanées de la muqueuse

buccale et de la langue et fréquemment retrouvée chez les fumeurs,

-la forme atrophique chronique, ou « stomatite » ; retrouvée chez plus de 60% des individus

porteurs de prothèses dentaires (O'Sullivan et al., 2000), et caractérisée par des érythèmes

localisés au niveau de la prothèse,

-la glossite losangique médiane ; érythème en losange sur la langue atrophiant les papilles,

souvent associé au diabète et au tabac,

-la chéilite angulaire ou « perlèche » ; inflammation des commissures des lèvres, souvent

bilatérale et récidivante et associée à une carence en fer, en vitamine B12 ou une anémie.

Toutes ces infections entraînent un inconfort permanent au niveau buccal, des brûlures, une

altération de la sensation de goût et une nutrition compromise (Coco et al., 2008).

Figure 6 : Observations en MEB d’un biofilm de Candida spp. retrouvé sur la prothèse

dentaire d’un patient atteint de stomatite (A-C) (Ramage et al., 2004).

b) Prévention

Dés son introduction dans la cavité buccale, la prothèse dentaire se retrouve

recouverte de salive et représente un support idéal pour la formation inévitable de biofilms.

La prévention des candidoses orales commence par une bonne hygiène de la cavité

buccale ; un nettoyage quotidien des dents, de la langue et des prothèses dentaires est

fortement recommandé (Akpan and Morgan, 2002). De plus, certains facteurs favorisant le

développement de micro-organismes à la surface des prothèses comme le port prolongé

des prothèses ou encore pendant la nuit, peuvent être évités (Daniluk et al., 2006).


21

II. Les amibes libres

1) Présentation

Les amibes libres sont des protozoaires mobiles, organismes unicellulaires eucaryotes

se nourrissant par phagocytose, c’est-à-dire par ingestion d’autres micro-organismes. Les

amibes libres sont distinguées des amibes dites parasitaires ; la survie de ces dernières

dépend de la présence d’un hôte (Schuster and Visvesvara, 2004). Les amibes libres sont

capables de se développer et de se disséminer de façon autonome dans l’environnement.

a) Taxonomie

Les amibes libres sont classées dans l’embranchement des Amoebozoa des

protozoaires (Thomas et al., 2008). Le groupe des amibes regroupe une grande diversité

d’unicellulaires ayant des caractéristiques morphologiques et comportementales communes

(Loret and Greub, 2010). Plus de 11000 espèces ont été recensées, dont seule une minorité

est responsable d’infections chez l’Homme.

b) Morphologie

Les amibes libres ont une taille variable allant de quelques dizaines de micromètres à

plusieurs centaines (Figure 7).

Elles existent sous deux formes principales : le trophozoïte, forme végétative

métaboliquement active, qui est capable de se nourrir de micro-organismes, de se déplacer

et de se multiplier, (Figure 8-a) et le kyste, forme de résistance (Figure 8-b) (Greub and

Raoult, 2004; Thomas et al., 2008). Le kyste est de forme arrondie et est composé de deux

parois, l’endokyste et l’ectokyste (Greub and Raoult, 2004; Smirnov and Michel, 1999). Cette

structure explique la résistance élevée des kystes à de nombreuses agressions, telles que

les traitements chimiques ou les changements de température.


22

Figure 7 : Observations en microscopie optique de différents genres d’amibes libres :

Playtamoeba (A), Acanthamoeba (B, D et K), Vanella (C), Glaeseria (E), Hartmannella (F et

I), Naegleria (G et H) et Echinamoeba (J) (Thomas et al., 2008).

Lorsque les conditions de culture deviennent défavorables (manque de nutriments,

température ou pH non optimaux), les trophozoïtes sont capables de s’enkyster. Ce

processus est réversible ; le kyste pourra redonner un trophozoïte après désenkystement,

lorsque l’environnement redeviendra plus clément (Greub and Raoult, 2004).

Figure 8 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (a) et de kystes (b)

d’Acanthamoeba castellanii (x1000). n : noyau, cv : vacuole. (Visvesvara et al., 2007).


23

c) Environnement et prédation

Les amibes libres sont des protozoaires ubiquitaires de l’environnement. Elles sont

retrouvées dans l’air, les sols, les eaux naturelles (lacs, rivières, mers) et les eaux

artificielles (systèmes de distribution, tours aéro-réfrigérantes, piscines, …) (Greub and

Raoult, 2004; Horn et al., 2000; Rohr et al., 1998; Wadowsky et al., 1991). Ces prédateurs

ont un rôle important au sein des écosystèmes qu’ils colonisent ; en se nourrissant de micro-

organismes, ils participent au maintien et au contrôle des populations microbiennes

(Hoffmann and Michel, 2001; Weekers et al., 1993). Les amibes libres sont capables de se

nourrir de bactéries, de champignons, de levures (Steenbergen et al., 2001), d’algues et

même d’autres protozoaires (Horn et al., 2000) par phagocytose (Figure 9A-D). Les

trophozoïtes ont tendance à mieux se déplacer sur les surfaces plutôt qu’en suspension, et

vont donc préférer les micro-organismes sessiles (Pickup et al., 2007) ; les biofilms

représentent une source idéale pour le grignotage des amibes (Huws et al., 2005; Pickup et

al., 2007). Par exemple, A. castellanii est capable de digérer 90 bactéries

sessiles/amibe/heure (Huws et al., 2005).

Figure 9 : Observations en microscopie électronique à transmission (MET) de la

phagocytose de Legionella pneumophila par Hartmannella vermiformis (A-D) et de sa

réplication à l’intérieur de l’amibe (E-F) (Greub and Raoult, 2003).


24

d) ARB et endosymbiotes

Certains micro-organismes ont développé la capacité de résister d’une part à la

prédation, en adoptant une forme morphologique plus indigeste (micro-colonies ou filaments

de grande taille), ou en augmentant leur mobilité pour échapper aux protozoaires (Matz and

Jürgens, 2005).

D’autre part certains micro-organismes sont capables de résister à la phagocytose, et de se

multiplier à l’intérieur des amibes (Figure 9E-F) (Brown and Barker, 1999; Greub and Raoult,

2003; Molmeret et al., 2005) : ils sont appelés ARB (amoeba-resistant bacteria) (Greub and

Raoult, 2004). Certains ARB sont des bactéries intracellulaires obligatoires, d’autres

facultatives et beaucoup d’entre eux sont pathogènes pour l’Homme (Greub and Raoult,

2004; Horn et al., 2000; Molmeret et al., 2005).

Les amibes libres sont considérées comme de véritables « Chevaux de Troie » du monde

microbien (Figure 10) (Brown and Barker, 1999; Molmeret et al., 2005) car elles peuvent

héberger dans leur cytoplasme, et surtout protéger des traitements et des conditions

défavorables de croissance, de nombreux micro-organismes potentiellement pathogènes

pour l’Homme (Kuchta et al., 1993; Rohr et al., 1998).

Les ARB se multiplient à l’intérieur de l’amibe et finissent par lyser la cellule hôte afin de se

disséminer dans l’environnement (Figure 10) (Greub and Raoult, 2004); l’exemple le plus

étudié jusqu’à présent est le cas de Legionella pneumophila, bactérie pathogène qui est

capable de se multiplier à l’intérieur de différentes espèces d’amibes libres (Figure 9E-F)

(Kuchta et al., 1993; Molmeret et al., 2005). Le développement intra-amibien de levures est

beaucoup moins étudié, cependant un exemple d’interaction levures-amibes a été démontré

avec le cas de Cryptococcus neoformans, capable de se multiplier dans le cytoplasme

d’Acanthamoeba castellanii (Steenbergen et al., 2001).

L’amibe joue le rôle de réservoir à bactéries mais également de terrain d’entrainement

(Molmeret et al., 2005) : capables de résister à la phagocytose des amibes, les bactéries

seront plus facilement capables de résister aux macrophages humains par exemple (Figure

10) (Greub and Raoult, 2004; Molmeret et al., 2005).


25

Figure 10 : Schéma du rôle des amibes libres en tant que réservoir et vecteur de

transmission de bactéries (Greub and Raoult, 2004).

D’autres ARB sont considérés comme étant des endosymbiotes ; l’endosymbiose est

définie comme une cohabitation harmonieuse de deux micro-organismes dans laquelle l’un

des partenaire se multiplie à l’intérieur de l’autre (Greub and Raoult, 2004). Environ 20% des

souches d’Acanthamoeba isolées de l’environnement abritent des endosymbiotes bactériens

(Molmeret et al., 2005).

2) Principaux genres amphizoïques

Les amibes libres amphizoïques sont des protozoaires ubiquitaires dans

l’environnement qui peuvent également vivre occasionnellement dans les tissus humains et

animaux en tant que parasites (Visvesvara et al., 2007). Ces amibes peuvent alors être


26

responsables d’infections. Quatre genres principaux ont été décrits (Schuster and

Visvesvara, 2004; Visvesvara et al., 2007).

a) Acanthamoeba

Isolé pour la première fois dans un échantillon de poussière, le genre Acanthamoeba

dénombre aujourd’hui plus de 24 espèces différentes réparties en trois groupes selon des

critères morphologiques des kystes (Gravel, 2009; Visvesvara et al., 2007). La principale

caractéristique du genre est la présence d’acanthopodes à la surface du trophozoïte (Figure

8-a) ; ces prolongements cytoplasmiques en forme d’épines permettent à l’amibe de

phagocyter ses proies. Le trophozoïte mesure entre 15 et 50 µm et le kyste entre 10 et 25

µm (Visvesvara et al., 2007). Les amibes du genre Acanthamoeba sont isolées dans une

grande variété d’habitats tels que les sols, les eaux de mer, les réseaux d’eau, les systèmes

de ventilation ou encore les appareils de dialyse (Hoffmann and Michel, 2001; Schuster and

Visvesvara, 2004). La double paroi du kyste leur permet de résister à des températures

extrêmes et même aux traitements de décontamination de l’eau (chloration ou filtration) ;

elles peuvent ainsi être retrouvées dans l’eau de distribution à une concentration de 1000 à

10000 amibes/L (Scat et al., 1995).

Ce genre amibien est particulièrement étudié car il est connu pour être capable d’héberger

dans son cytoplasme des bactéries pathogènes telles que L. pneumophila ou encore Vibrio

cholerae (Axelsson-Olsson et al., 2010; Kuchta et al., 1993; Laskowski-Arce and Orth, 2008;

Schuster and Visvesvara, 2004).

b) Balamuthia

Ce genre amibien, assez proche d’Acanthamoeba, a été isolé pour la première fois

dans les années 1980, chez un mandrill (babouin) ; d’où l’appellation de la principale espèce

de ce genre, B. mandrillaris (Visvesvara et al., 2007). Le trophozoïte est pléomorphique et

mesure entre 12 et 60 µm, alors que le kyste arrondi possède une paroi externe ondulée et

mesure environ 15 µm (Figure 11). Cette amibe est beaucoup moins étudiée et difficilement

isolée ; elle est principalement retrouvée dans les sols (Schuster and Visvesvara, 2004).

Figure 11 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (a) et d’un kyste (b) de

Balamuthia mandrillaris (x850) (Visvesvara et al., 2007).


27

c) Naegleria

Cette amibe a la particularité de posséder, en plus des formes trophozoïte (10-25 µm)

et kyste (10 µm), une troisième forme flagellée d’environ 10-16 µm et très mobile (Figure

12). Le kyste possède une paroi assez fine et percée de pores, ce qui le rend beaucoup plus

fragile que d’autres genres amibiens.

Ce genre compte plus de 30 espèces mais la seule espèce pathogène est N. fowleri

(Schuster and Visvesvara, 2004; Visvesvara et al., 2007). Beaucoup moins ubiquitaire

qu’Acanthamoeba, Naegleria est isolée dans les sols et les eaux et peut survivre jusqu’à une

température de plus de 45°C (Gravel, 2009; Hoffmann and Michel, 2001; Visvesvara et al.,

2007).

Figure 12 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (a), d’un flagellé (b) et

d’un kyste (c) de Naegleria fowleri (x1000). n : noyau et u : partie postérieure (Visvesvara et

al., 2007).

d) Sappinia

Ce genre amibien, dont la principale espèce est S. diploidea, a été isolé des sols, des

eaux douces et de matières fécales animales. Le trophozoïte (40-80 µm) ainsi que le kyste

(15-30 µm) ont la particularité d’être diploïdes, c’est-à-dire d’avoir deux noyaux (Figure 13).

Un seul cas d’infection impliquant cette amibe a été recensé chez l’Homme (Schuster and

Visvesvara, 2004; Visvesvara et al., 2007).

Figure 13 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (b), et de kystes (c) de

Sappinia diploidea (x1000). n : noyaux (Visvesvara et al., 2007).


28

e) Vahlkampfia – Hartmannella

D’autres genres amibiens ont été isolés chez l’Homme et l’animal (cavité nasale,

muqueuses intestinale et vaginale, …), toutefois leur adaptation à la température du corps

humain ne signifie pas que ces amibes soient pathogènes (Mat Amin et al., 2004; Schuster

and Visvesvara, 2004). Parmi ces genres, certains tels que Vahlkampfia et Hartmannella ont

été isolés dans des cas de co-infections (Aimard et al., 1998; Aitken et al., 1996; Inoue et

al., 1998; Kinnear, 2003). Leur caractère de pathogènes opportunistes est depuis très

controversé (De jonckheere and Brown, 1998).

Le genre Hartmannella, dont la principale espèce est H. vermiformis, a été décrit pour

la première fois en 1967 (Page, 1967). Le trophozoïte est pléomorphique et mesure 20-30

µm (Figure 14), alors que le kyste, très arrondi et ayant une double paroi, mesure 10-15 µm

(Figure 14) (Smirnov and Michel, 1999). Ce protozoaire thermotolérant est principalement

retrouvé dans les milieux aquatiques, et peut survivre jusqu’à une température de 55°C

(Kuiper et al., 2006; Rohr et al., 1998). 71% des amibes retrouvées dans l’eau de réseau ou

des tours aéro-réfrigérantes appartiennent à l’espère H. vermiformis (Breiman et al., 1990;

Cateau et al., 2008). Cette amibe a même été retrouvée dans des circuits de

décontamination des eaux, après avoir résisté à différents traitements physiques et

chimiques (Hoffmann and Michel, 2001; Thomas et al., 2008). H. vermiformis, tout comme

Acanthamoeba, est capable de permettre à de nombreuses bactéries, dont certaines

pathogènes, de se développer à l’intérieur de son cytoplasme (Figure 9) (Axelsson-Olsson et

al., 2010; Cateau et al., 2008; Horn et al., 2000; Santic et al., 2011; Wadowsky et al., 1991).

Figure 14 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (1), et d’un kyste (4) de

Hartmannella vermiformis. cv : vacuole (Smirnov and Michel, 1999).


29

3) Infections amibiennes

Les amibes libres sont associées à quelques infections chez l’Homme, surtout au

niveau du système nerveux central. Ces infections concernent principalement les personnes

immunodéprimées et fragiles, mais quelques cas ont été recensés chez des individus

immunocompétents (Schuster and Visvesvara, 2004; Visvesvara et al., 2007). Ces infections

sont rares mais graves, dû à un diagnostic assez difficile, à la rapidité du développement de

l’infection et surtout aux traitements problématiques ; les amibes libres sont résistantes à de

nombreux agents antimicrobiens et leur capacité d’enkystement les rend d’autant plus

difficile à éradiquer (Gravel, 2009; Thomas et al., 2009).

a) Principales infections amibiennes

-Kératite : La kératite amibienne est une infection aiguë de la cornée, caractérisée par une

inflammation, un œdème et une photophobie (Figure 15) (Schuster and Visvesvara, 2004).

Le premier cas de kératite amibienne a été recensé en 1973 et depuis, les cas sont de plus

en plus nombreux (Scat et al., 1995).

Figure 15 : Kératite amibienne à Acanthamoeba (Scat et al., 1995).

-Encéphalite granulomateuse amibienne : Cette infection, principalement causée par

Acanthamoeba et Balamuthia, occasionne une inflammation granulomateuse du

parenchyme qui se traduit par des hémorragies, des thromboses, des œdèmes et enfin des

nécroses tissulaires (Figure 16). Le sujet infecté présente des nausées, des fièvres, des

confusions, des déficits neurologiques ainsi que des léthargies (Visvesvara et al., 2007).


30

Figure 16 : Encéphalite amibienne à Balamuthia (Schuster and Visvesvara, 2004).

-Méningoencéphalite amibienne primitive : Cette méningite est fulminante et rapidement

fatale. L’amibe, qui traverse l’épithélium nasal, migre le long du nerf olfactif et se retrouve

directement dans le cerveau, où elle cause de nombreux dommages tissulaires, notamment

au niveau des espaces périvasculaires (Schuster and Visvesvara, 2004; Visvesvara et al.,

2007).

b) Modes de contamination

Le principal mode de contamination est le contact avec de l’eau contaminée (Centeno

et al., 1996; Hoffmann and Michel, 2001; Scat et al., 1995; Visvesvara et al., 2007) ; des cas

sont recensés parmi des pêcheurs, des agriculteurs ou simplement des baigneurs. 85% des

kératites amibiennes surviennent chez des individus porteurs de lentilles de contact (Scat et

al., 1995). En effet, certaines personnes utilisent à tort l’eau du robinet pour le lavage des

lentilles de contact. Cette eau de lavage peut alors être souillée (Aitken et al., 1996), et les

amibes peuvent ainsi se retrouver hébergées dans les boîtiers de lentilles de contact (Scat

et al., 1995). Acanthamoeba a été également montrée comme capable de résister aux


31

solutions de nettoyage des lentilles (Thomas et al., 2009). Différentes espèces d’amibes

libres ont également été isolées de réseaux d’eau potable (20-30% des réseaux) ainsi que

dans l’environnement hospitalier (70% des échantillons provenant de douches ou de

réservoirs d’eau chaude) (Thomas et al., 2009). Les amibes libres possèdent une grande

résistance aux chocs thermiques ainsi qu’à certains désinfectants comme le chlore, ce qui

les rend très difficile à éradiquer à l’aide des traitements communs dans les réseaux d’eau

(Loret and Greub, 2010; Thomas et al., 2008; Thomas et al., 2009).

c) Traitements et prévention

Le traitement médical est souvent très peu efficace contre les formes

évoluées d’infections amibiennes ; le diagnostic doit être fait le plus tôt possible pour

augmenter les chances de guérison (Scat et al., 1995). Plusieurs antibiotiques sont efficaces

contre les formes trophozoïtes, mais n’ont qu’un effet statique sur les kystes ; tant que des

kystes survivent dans un foyer infectieux, l’infection peut subsister (Schuster and

Visvesvara, 2004). Une thérapie combinant plus d’un agent antimicrobien semble être la

solution de choix (ex : kétoconazole, fluconazole, pentamidine, amphotéricine B, rifampicine,

itraconazole, sulfadiazine, …) (Schuster and Visvesvara, 2004; Visvesvara et al., 2007).

Les infections amibiennes endommagent les tissus de l’hôte, ce qui rend le traitement

d’autant plus difficile à mettre en place ; la prévention reste la mesure la plus efficace (Mat

Amin et al., 2004). En ce qui concerne les patients immunodéprimés, les plus touchés par

les infections amibiennes, peu de méthodes de prévention sont établies (Visvesvara et al.,

2007). En revanche, pour le cas des porteurs de lentilles par exemple, le respect de règles

d’hygiène et de désinfection des lentilles s’impose (Scat et al., 1995).

- Etude bibliographique – Chapitre 2 : La salive -

32

Chapitre 2 : La salive

I. Généralités

La cavité buccale est une porte d’entrée, facile d’accès, reliant l’extérieur aux organes

plus profonds ; la muqueuse et le fluide buccal représentent donc une première barrière

indispensable et sont couramment exposés aux infections (Scannapieco, 1994). Le fluide

buccal est un mélange complexe de sécrétions produites par les glandes salivaires (salive),

de résidus alimentaires, de fluide gingival, de cellules épithéliales desquamées, de

bactéries, de transsudat, de la muqueuse orale, des substances issues des sécrétions

bronchiques ou nasales ainsi que de nombreux organites d’origine plasmatique (Bichot,

2012; Dodds et al., 2005). Seule la salive, qui participe essentiellement au maintien de la

santé bucco-dentaire et au bon déroulement de nombreuses fonctions orales, sera détaillée

dans cette étude bibliographique.

1) Origine et formation

Le terme salive regroupe en réalité un mélange de plusieurs fluides sécrétés par

différentes glandes salivaires. Deux catégories de glandes salivaires sont distinguées selon

leur taille : les glandes majeures et les glandes mineures (Dodds et al., 2005). Les glandes

majeures correspondent à la glande parotide (Figure 17-1), à la glande sous-mandibulaire

(Figure 17-2) et à la glande sublinguale (Figure 17-3). Les glandes salivaires mineures sont

présentes un peu partout dans la bouche, au niveau de la lèvre inférieure, des joues, de la

langue, … Leur nombre et leur localisation varient selon les individus (de Almeida et al.,

2008; Dodds et al., 2005).

Figure 17 : Schéma de la localisation des glandes salivaires majeures. 1 : glande parotide,

2 : glande sous-mandibulaire, 3 : glande sublinguale

(http://coproweb.free.fr/pagphy/physioan/ch5s1.htm; 04/08/2012).


33

La sécrétion salivaire est déclenchée par des stimuli qui peuvent être mécaniques (l’action

de mâcher), gustatifs ou olfactifs. D’autres facteurs peuvent affecter la sécrétion de salive

comme la douleur, certains médicaments ou encore des maladies locales ou systémiques

qui affectent les glandes salivaires (Humphrey and Williamson, 2001).

2) Caractéristiques et composition

L’Homme produit en moyenne entre 1 et 1,5 litres de salive par jour ; ce volume varie

notamment en fonction du type de stimulation ou encore du rythme circadien. Le volume

moyen de salive constamment présent dans la cavité buccale est de 1 mL (de Almeida et al.,

2008; Humphrey and Williamson, 2001). La salive est constituée à 99% d’eau, et les 1%

restants correspondent aux composés organiques et inorganiques. Le pH moyen de la salive

est compris entre 5,3 et 7,8 (Göcke et al., 2002; Humphrey and Williamson, 2001).

a) Composants inorganiques

Les constituants inorganiques de la salive sont des ions : hydrogène (donnant le

caractère acide à la salive), sodium, potassium, calcium, phosphates, halogènes (dont l’iode

et le fluor), ainsi que des métaux : fer, cuivre (de Almeida et al., 2008; Humphrey and

Williamson, 2001).

b) Composants organiques

Parmi les constituants organiques, des sucres, des facteurs de croissance, de

l’insuline, des cytokines, du cholestérol ou encore des cellules épithéliales peuvent être

retrouvés. Mais ce sont les protéines qui sont retrouvées majoritairement, quelques

protéines extrinsèques, provenant du sérum (immunoglobulines (Ig) et autres protéines du

système immunitaire) et représentant 20% des protéines totales de la salive, et surtout des

protéines intrinsèques, synthétisées par les glandes salivaires (Bichot, 2012; de Almeida et

al., 2008; Dodds et al., 2005; Göcke et al., 2002; Scannapieco, 1994) :

-l’alpha-amylase, qui participe à la digestion en dégradant les amidons alimentaires,

-la lipase, qui hydrolyse les lipides,

-le lysozyme, qui possède un pouvoir antimicrobien et représente environ 10% des protéines

totales,

-les mucines (16% des protéines totales), glycoprotéines qui participent à la lubrification de

la cavité buccale et participent à l’élaboration de la pellicule exogène acquise sur les dents

et la muqueuse, réceptrice potentielle de micro-organismes colonisateurs (O'Sullivan et al.,

1997),


34

-les protéines riches en proline (PRP) et les stathérines qui ont également un rôle de

lubrifiant et qui participent à la formation de la pellicule exogène acquise (O'Sullivan et al.,

1997),

-les cystatines, qui protègent les tissus buccaux contre les protéases à cystéine et

participent à la formation de la pellicule,

-les histatines, petites protéines riches en histidine qui ont des propriétés antimicrobiennes

et notamment antifongiques (Xu et al., 1991), et qui se retrouvent également dans la

pellicule acquise,

-la lactoferrine, protéine de transport du fer qui possède une activité antimicrobienne,

-les défensines, ayant également des activités antibactériennes, antifongiques et antivirales,

-les immunoglobulines sécrétoires, principalement les Ig A sécrétoires. Elles ont un rôle

antimicrobien.

3) Fonctions et applications

La salive est impliquée dans de nombreux processus tels que la digestion ou la

minéralisation, et possède de nombreuses fonctions de protection ou d’antimicrobien (Figure

18) (Bichot, 2012; de Almeida et al., 2008; Humphrey and Williamson, 2001).

Figure 18 : Les différentes fonctions de la salive (Crielaard, 2011).


35

Les composants salivaires sont dits amphifonctionnels, multifonctionnels et redondants

(Tableau 1), c’est-à-dire qu’une même molécule peut avoir différents rôles et que plusieurs

molécules peuvent être impliquées dans un même processus (Humphrey and Williamson,

2001; Rudney, 2000).

Tableau 1 : Les trois principales fonctions des protéines de la salive (Rudney, 2000).

a) Goût

La salive est hypotonique, c’est-à-dire que sa concentration en sodium est plus faible

que dans le plasma, ce qui permet aux papilles de percevoir les différents goûts (Humphrey

and Williamson, 2001).

b) Protection et lubrification

La salive, principalement grâce aux mucines, est capable de former une protection

séromuqueuse qui va lubrifier et protéger les tissus oraux des agents irritants et de la

déshydratation (de Almeida et al., 2008). Les mucines, glycoprotéines retrouvées en grande

quantité dans la salive, peuvent retenir de grandes quantités d’eau et former un gel visqueux

recouvrant les tissus de la cavité buccale (Humphrey and Williamson, 2001).

c) Dilution et nettoyage

Le flux salivaire, en moyenne de 0,1 mL/min, permet le nettoyage permanent de la

cavité buccale (Humphrey and Williamson, 2001). La salive élimine les résidus présents

dans la bouche tels que les micro-organismes non-adhérés, ou les débris cellulaires et

alimentaires (de Almeida et al., 2008).


36

d) Barrière

La salive module les processus de déminéralisation et de reminéralisation de l’émail

dentaire. En effet, elle constitue la première barrière contre la colonisation des tissus oraux

par d’éventuels micro-organismes pathogènes et est capable de neutraliser les acides

produits par ces micro-organismes qui attaquent l’émail (de Almeida et al., 2008; Silva et al.,

2012).

e) Digestion

Les enzymes salivaires, principalement l’alpha-amylase, sont impliquées dans la

première étape de la digestion ; ces enzymes dégradent les nutriments tels que l’amidon. La

salive favorise ainsi la formation et la lubrification du bol alimentaire, ce qui aide à avaler (de

Almeida et al., 2008; Humphrey and Williamson, 2001).

f) Réparation des tissus

La salive est capable d’accélérer le processus de coagulation, ce qui rend le temps de

saignement des tissus oraux plus court que pour les autres tissus (de Almeida et al., 2008).

g) Activité antimicrobienne

Comme mentionné précédemment (voir Etude bibliographique Chapitre 2

I. 2) b) Composants organiques), de nombreuses protéines salivaires exercent un rôle

antibactérien, antifongique et même antiviral (de Almeida et al., 2008; Rudney, 2000; Silva et

al., 2012).

h) Diagnostic

La salive, facile à prélever, représente une source non invasive d’informations.

L’analyse des composants de la salive pourrait permettre de renseigner sur différents

paramètres de l’état de santé d’un patient, tels que le statut émotionnel, hormonal,

immunologique ou nutritionnel, ou encore de doser certaines substances comme des

anticorps, des stéroïdes ou des drogues (de Almeida et al., 2008; Humphrey and

Williamson, 2001).

4) Facteurs influents

Différents facteurs, endogènes ou exogènes, peuvent influencer le flux salivaire ou

encore la composition de la salive d’un individu (Bichot, 2012; de Almeida et al., 2008;

Dodds et al., 2005).


37

a) L’hydratation

L’hydratation individuelle est le facteur le plus important qui interfère avec la sécrétion

de salive (Dawes, 1987; de Almeida et al., 2008). En cas de déshydratation, les glandes

salivaires stoppent la sécrétion de salive afin de conserver l’eau.

b) Le cycle circadien et rythme annuel

Le flux salivaire et la composition de la salive ne sont pas constants et varient chez un

individu en fonction de son cycle circadien. Ainsi, le flux salivaire est maximal en fin de

journée alors qu’il est réduit au minimum pendant le sommeil. De plus, la production de

protéines a lieu plutôt en fin de journée alors que celle de sodium ou de chlorure a lieu en

début de matinée (de Almeida et al., 2008; Edgar, 2004).

De même le rythme annuel influerait sur la sécrétion de salive ; par exemple en été, les

glandes salivaires sont moins productives qu’en hiver.

c) L’âge

Chez une personne âgée, il est courant d’observer une détérioration des glandes

salivaires ainsi qu’une xérostomie (sécheresse de la cavité buccale liée à une diminution du

flux salivaire) (de Almeida et al., 2008; Dodds et al., 2005). La composition en salive peut

également être altérée (Dodds et al., 2005).

d) Le sexe

Une différence de sécrétion salivaire a été notée entre les femmes et les hommes ; de

part la taille plus faible de leurs glandes salivaires et de leur profil hormonal, les femmes

produiraient moins de salive que les hommes (de Almeida et al., 2008; Dodds et al., 2005).

e) Les stimuli

Différents stimuli gustatifs et olfactifs (voir, sentir de la nourriture ou encore l’action de

mâcher) augmentent la production de salive. La consommation de tabac ou d’alcool a aussi

des conséquences sur la salive. D’autres paramètres comme la position du corps ou

l’exposition à la lumière auraient également un effet sur la sécrétion de salive (de Almeida et

al., 2008; Edgar, 2004). Ainsi une personne debout sécrète plus de salive qu’une personne

assise ou allongée ; de même l’absence de lumière diminue la production de salive de 30 à

40% (de Almeida et al., 2008).

f) Les médicaments

Différentes classes de médicaments ont un impact sur la production de salive. Par

exemple les antidépresseurs, les antihistaminiques ou encore les antihypertenseurs


38

réduisent le flux et altèrent la composition de la salive (de Almeida et al., 2008; Edgar,

2004). Certaines thérapies, notamment les radiothérapies qui endommagent les glandes

salivaires, vont modifier la sécrétion de salive (Dodds et al., 2005).

g) Les infections

Certaines maladies chroniques telles que le diabète, l’insuffisance rénale, l’anorexie, la

boulimie, certaines maladies psychologiques et certaines carences nutritionnelles vont

influer sur le flux et la composition salivaires (de Almeida et al., 2008; Dodds et al., 2005).

II. Micro-organismes et interactions

La salive intervient dans le maintien et la modulation de la flore buccale bactérienne et

fongique (Hoffman and Haidaris, 1993). Elle est également impliquée dans le processus de

formation de la plaque dentaire ; elle exerce une sélection aussi bien positive que négative

sur la colonisation bactérienne de la cavité buccale (Rudney, 2000; Scannapieco, 1994). Les

recherches sur les interactions entre la salive et les micro-organismes oraux donnent des

observations parfois contraires, qui montrent la complexité du rôle de la salive et de ses

constituants (principalement protéiques). Ces derniers, dits amphifonctionnels et

multifonctionnels (Tableau 1), aident à la fois pour la clairance des micro-organismes, par

exemple en les agrégeant pour mieux les éliminer, pour l’adhérence de certaines micro-

organismes aux surfaces de la cavité buccale (pellicule exogène acquise) mais également

pour la protection des tissus oraux en exerçant une activité antimicrobienne (Hoffman and

Haidaris, 1993; Rudney, 2000; Scannapieco, 1994). Ainsi, la fluctuation des concentrations

en certains de ces constituants peut influencer la balance écologique entre bonne santé et

infection orale (Scannapieco, 1994).

1) Flore commensale buccale

a) Flore bactérienne

Dans la cavité orale, plus de 700 espèces microbiennes ont été isolées (Paster et al.,

2006; Zijnge et al., 2010) ; 400 sont spécifiquement retrouvées dans la poche parodontale

(l’espace entre les dents et les gencives), et 300 se trouvent dans d’autres sites tels que la

langue, les muqueuses ou encore les sites infectieux. Chez un individu donné, entre 100 et

200 espèces sont capables de cohabiter dans le micro-environnement buccal (Rudney,

2000; Thein et al., 2007), ce qui montre la grande diversité possible de la flore commensale

buccale de deux individus distincts (Paster et al., 2006). Parmi ces nombreux micro-


39

organismes oraux, beaucoup de bactéries sont retrouvées (streptocoques, staphylocoques),

dont certaines sont potentiellement pathogènes (ex : Porphyromonas gingivalis,

Streptococcus gordonii, Staphylococcus aureus) (Bamford et al., 2009; Morales and Hogan,

2010; Paster et al., 2006).

b) Flore fongique

De nombreuses espèces de levures et de champignons font également partie de la

flore commensale orale (Tableau 2) ; la majorité de ces espèces fongiques sont

environnementales et généralement peu pathogènes. On note ainsi la présence possible

d’Aspergillus spp., Cladosporium spp., Saccharomyces spp. ou encore de Penicillium spp.

Plusieurs espèces de Candida, dont certaines pathogènes opportunistes sont également

recensées (Tableau 2) (Ghannoum et al., 2010).

c) Interactions entre micro-organismes

Entre les micro-organismes de la cavité orale se mettent en place différentes

interactions mutualistes ou antagonistes, qui contribuent au développement de biofilm

polymicrobien (Bamford et al., 2009; Douglas, 2003; El-Azizi et al., 2004; Morales and

Hogan, 2010). Certaines espèces sont capables d’interagir physiquement ou

métaboliquement afin d’assurer leur croissance et leur survie au sein du micro-

environnement. La co-adhérence ou encore le QS inter-espèces sont les principaux

mécanismes d’interactions entre micro-organismes (Bamford et al., 2009).


40

Tableau 2 : Espèces fongiques retrouvées dans la cavité orale de 20 individus sains

(Ghannoum et al., 2010).

Un exemple bien étudié est celui de la co-adhérence entre Streptococcus gordonii et

Candida albicans (Figure 19) (Holmes et al., 1995; Morales and Hogan, 2010; O'Sullivan et

al., 2000) : S. gordonii est un colonisateur primaire, capable de s’accrocher aux molécules

salivaires adsorbées sur les surfaces (Figure 19-a) ; la surface bactérienne apporte ainsi des

sites de fixation potentiels supplémentaires pour les autres micro-organismes (Holmes et al.,

1995). Candida peut ensuite adhérer directement aux récepteurs protéiques de la salive ou

par l’intermédiaire d’interactions spécifiques avec des protéines de la surface de S. gordonii

(Figure 19-b). De plus, S. gordonii est également capable de sécréter des molécules de QS

qui inhibent l’effet négatif du farnesol sur la formation du biofilm fongique (voir Etude

bibliographique Chapitre 1 I. 3) d) Régulation et QS) (Figure 19-c). Enfin, S.


41

gordonii sécrète aussi des produits métaboliques qui pourront être utilisés par Candida pour

assurer sa croissance (Figure 19-d). Le biofilm mixte bactérien-fongique ainsi formé attirera

d’autres micro-organismes qui viendront adhérer à leur tour aux surfaces orales (Figure 19-

e) (Morales and Hogan, 2010).

Figure 19 : Schéma des interactions mutualistes entre C. albicans et Streptococcus gordonii

dans la cavité orale (a-e). QS : Quorum Sensing (Morales and Hogan, 2010).

2) Interactions des micro-organismes avec la salive

Les principales interactions possibles entre les constituants de la salive et les micro-

organismes, peuvent être séparées en quatre classes (Figure 20) (Scannapieco, 1994) :

-les micro-organismes (via leurs adhésines) peuvent se lier à des récepteurs, de façon

spécifique, sur les surfaces orales recouvertes de la pellicule salivaire (Figure 20-A),

-ces mêmes molécules réceptrices, en solution, peuvent se lier aux adhésines, parfois

même de plusieurs micro-organismes simultanément, favorisant ainsi l’agrégation et la

clairance de ces micro-organismes (Figure 20-B),

-certains composants salivaires sont toxiques pour les micro-organismes (ex : histatines)

(Xu et al., 1991). Ils peuvent s’insérer dans la membrane microbienne, former des canaux

par lesquels des ions intracellulaires (ex : le potassium K+) peuvent s’échapper, provoquant

la mort cellulaire (Figure 20-C),

-enfin, des composants de la salive peuvent être transportés dans le micro-organisme pour y

être métabolisés afin de produire de l’énergie (ex : acides aminés) ; dans ce cas la salive

devient une source de nutriments (Figure 20-D).


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Figure 20 : Schéma des différentes interactions entre la salive et les micro-organismes

oraux (A-D). K+ : potassium, exemple d’ions intracellulaires (Scannapieco, 1994).

a) La salive favorise l’adhérence

La fine couche de salive qui recouvre les surfaces orales, appelée la pellicule exogène

acquise, composée principalement de protéines, favorise l’accrochage des micro-

organismes aux surfaces en offrant différents sites de fixation. Beaucoup d’études se sont

intéressées à la composition de cette pellicule (Göcke et al., 2002; Holmes et al., 2002;

Rudney, 2000; Scannapieco, 1994). Ainsi les mucines (Hoffman and Haidaris, 1993), les

PRP (Cannon et al., 1995b; O'Sullivan et al., 1997) ou encore les Ig A sécrétoires (San

Millán et al., 2000) sont reconnus par les adhésines bactériennes ou fongiques et permettent

l’adhérence des cellules.

Mais les interactions entre salive et micro-organismes sont beaucoup plus complexes.

En effet, de part leur amphifonctionnalité, les molécules salivaires sont à la fois capables de

favoriser l’adhérence et d’entraîner l’agrégation des micro-organismes en suspension, ce qui

favorisera leur clairance. De plus, certaines de ces molécules salivaires ont également une

action antimicrobienne. L’interaction salive-micro-organismes dépend également du micro-

organisme lui-même. Par exemple, l’effet de la salive sur l’adhérence de C. albicans a été

montré comme dépendant de l’état morphologique des levures (Figure 21) (Elguezabal et

al., 2008).


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Figure 21 : Adhérence de différentes souches de C. albicans sur un support de PMA, en

absence (A) ou en présence (B) de salive (Elguezabal et al., 2008).

Sur ces graphiques, la souche de C. albicans représentée en noir est une souche produisant

uniquement la forme hyphe, celle en blanc est un isolat oral type « sauvage », et celle en

gris est un mutant déficient pour la filamentation (donc sous forme blastospores). Ainsi la

salive diminue l’adhérence des levures sous forme d’hyphes mais n’a pas d’effet sur les

levures sous forme blastospores (Elguezabal et al., 2008).

b) La salive a une activité antimicrobienne

Le rôle de la salive dans la défense de la cavité orale contre les micro-organismes est

loin d’être complètement élucidé. Certains composants ont une influence positive sur

l’adhérence, mais sous certaines conditions ; ils peuvent également favoriser la clairance

des micro-organismes. D’autre part, certains composants possèdent une activité

antimicrobienne directe ou indirecte. Le lysozyme, la lactoferrine, les Ig A sécrétoires ou

encore les histatines sont capables d’inhiber la croissance microbienne par différents

mécanismes altérant leur métabolisme (Elguezabal et al., 2008; Leito et al., 2009; Rudney,

2000; San Millán et al., 2000; Scannapieco, 1994; Ueta et al., 2000). Par exemple les

histatines inhibent la respiration mitochondriale ; l’histatine 5, fongicide, détruit C. albicans


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sous forme de blastospores, alors que l’histatine 3, fongistatique, inhibe simplement la

filamentation des Candida spp. (Xu et al., 1991).

L’inhibition de la filamentation est l’un des principaux effets de la salive sur les levures ; les

histatines ou encore les stathérines, produites en majorité par la glande parotide, permettent

de bloquer les levures au stade blastospores et empêchent ainsi le développement de

biofilm fongique (Figure 22) (Leito et al., 2009). Les auteurs ont montré dans cette étude que

la salive totale (mélange des sécrétions des différentes glandes) ainsi que la salive parotide

inhibaient la filamentation de C. albicans, comparativement à un tampon salive (milieu de

culture utilisé, servant de témoin négatif) (Leito et al., 2009).

Figure 22 : Effet de différentes salives sur la transition blastospores-hyphes de C. albicans

(Leito et al., 2009).

Cependant, certaines levures du genre Candida, comme également d’autres micro-

organismes, sont capables de résister à l’action antimicrobienne de la salive, notamment par

l’intermédiaire de leurs facteurs de virulence (Bichot, 2012). Par exemple les protéases

aspartiques de C. albicans vont lui permettre de dégrader des protéines de défense de

l’hôte, telles que les histatines (Meiller et al., 2009).

- Etude bibliographique – Chapitre 3 : Les units de soins dentaires -

45

Chapitre 3 : Les units de soins dentaires

I. Définition et structure du circuit d’eau

1) Définition de l’unit de soins dentaires

Le terme d’unit de soins dentaires (USD) désigne l’équipement du cabinet dentaire qui

regroupe en un bloc la plupart des appareils nécessaires à la réalisation des soins dentaires

et de stomatologie (Figure 23): un fauteuil inclinable, un scialytique (éclairage médical fixé

sur un bras mobile), un crachoir, un bras mobile supportant un plateau doté de porte-

instruments rotatifs (PIR) tels que les turbines ou les seringues à air et à eau, une aspiration

chirurgicale, des circuits d’arrivée et d’évacuation de l’eau, … (Comité technique national

des infections nosocomiales et des infections liées aux soins, 2006; O'Donnell et al., 2005).

Figure 23 : Photographies de différentes parties de l’USD. (a) vue d’ensemble, (b) vue

intérieure du circuit d’arrivée d’eau (ici un réservoir interne), (c) le plateau supportant les

PIR, (e) le crachoir et le circuit d’évacuation d’eau (O'Donnell et al., 2006).


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2) Circuit d’eau de l’USD

L’USD est alimenté par le réseau d’eau potable ou par un réservoir indépendant,

interne au cabinet dentaire. L’eau circule à l’intérieur de l’USD via un réseau complexe de

longs tubes en polyuréthane ou en PVC, appelés tubulures, d’environ 2 mm de diamètre

(Figure 24) (Figure 25) (O'Donnell et al., 2011; Porteous, 2010).

Figure 24 : Photographie de tubulures d’USD. (a) tubulure entière, (b) section de tubulure

(Porteous, 2010).

Figure 25 : Vue intérieure de l’USD : un réseau complexe de circulation d’eau (Wirthlin et al.,

2003).


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II. Revues de la littérature

La problématique de contamination du circuit d’eau des USD est connue depuis les

années 60 (Blake, 1963; Sciaky and Sulitzeanu, 1962). Depuis, de nombreuses études se

sont intéressées :

-aux sources de contamination de l’USD ; les sources principalement étudiées étant l’eau du

réseau et la rétro-contamination par des micro-organismes provenant des patients et du

personnel dentaire (Pankhurst and Philpott-Howard, 1993; Rowland, 2003). Le

développement d’un biofilm à l’intérieur du circuit d’eau de l’USD est un phénomène

particulièrement étudié (Barbeau, 2000; Szymanska, 2003; Williams et al., 1993). Favorisés

par le micro-environnement de l’USD, les biofilms microbiens peuvent se former sur les

parois des tubulures (Figure 26).

Figure 26 : Section longitudinale d’une tubulure d’USD, recouverte de biofilm (Coleman et

al., 2007).

-aux contaminants environnementaux et pathogènes retrouvés dans l’eau des USD ;

différentes études se sont intéressées à la composition ainsi qu’à la concentration en

différents micro-organismes retrouvés dans les USD (Shearer, 1996; Szymańska, 2005;

Walker et al., 2000; Walker et al., 2004). Certains micro-organismes d’intérêt, tels que L.

pneumophila ou encore les mycobactéries ont été particulièrement ciblés (Atlas et al., 1995;

Schulze-Röbbecke et al., 1995).

-au risque infectieux potentiel pour les patients et le personnel dentaire. Les effets de

l’exposition des patients et du personnel dentaire à l’eau et l’air contaminés, aux aérosols

produits lors des soins (Figure 27), ainsi que les risques de contamination croisée ont été

étudiés (Barbeau, 2007; Castiglia et al., 2008; Pankhurst, 2010).


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Figure 27 : Aérosols visibles, produits par une turbine d’USD lors d’un acte de soins

dentaires (Harrel and Molinari, 2004).

-aux méthodes de prévention et de décontamination des USD. Différentes méthodes

physiques et chimiques ont été développées depuis la découverte de la contamination des

USD ; de la technique la plus simple (purge des tubulures) aux désinfections chimiques

automatisées, de nombreuses études d’efficacité ont été réalisées sur ces méthodes (Abel

et al., 1971; Bagga et al., 1984; Fiehn and Henriksen, 1988; O'Donnell et al., 2006; Ozcan et

al., 2003; Schel et al., 2006). Toutefois il apparaît que ces procédés de désinfection des

USD ne sont pas toujours bien connus ou du moins sont souvent utilisés de façon inadaptée

par les praticiens, principalement du fait d’un manque d’information (Oosthuysen et al.,

2010; Robert, 2010).

Dans le but de faire un bilan des connaissances acquises en terme de contamination des

USD, du développement de biofilms dans les tubulures, et de décontamination des USD,

ainsi que d’augmenter la prise de conscience du risque infectieux lié à l’eau des USD, deux

revues de la littérature ont été rédigées et publiées en 2011 et 2012.

La première revue est parue dans la rubrique « formation continue » d’un journal à diffusion

nationale : Le Chirurgien Dentiste de France ; en effet cette revue est destinée aux

praticiens chirurgiens dentistes, dans le cadre de leur exercice quotidien. Certains aspects

ont été simplifiés afin de répondre à la demande de l’éditeur.

D’autre part une deuxième revue, plus complète, a plus récemment été publiée dans un

journal international à comité de lecture : Federation of European Microbiological Societies

(F E M S) - Immunology and Medical Microbiology.

1) Revue nationale : Le Chirurgien Dentiste de France (2011)

Cet article a été écrit dans le but de sensibiliser les praticiens dentistes au risque

infectieux existant dans leur milieu professionnel ; risque infectieux pour eux-mêmes ainsi


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que pour leurs patients, lié à l’exposition à de l’eau et de l’air contaminés. Dans cet article,

les données concernant le développement de biofilms ainsi que les méthodes de

décontamination ne sont pas très détaillées ; une vision générale de la problématique étant

suffisante pour le public visé.


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2) Revue internationale : FEMS Immunology and Medical

Microbiology (2012)

Cette deuxième revue, plus complète et précise que la version française, avait pour

objectif de synthétiser les connaissances scientifiques acquises au cours des dernières

années au sujet de la contamination et de la décontamination des USD ; la sensibilisation au

risque infectieux lié aux USD étant toujours le but visé.

Dans cette version, la partie désinfection a été plus développée, afin d’obtenir une vision

plus détaillée des différentes approches et méthodes utilisées pour la décontamination des

USD.


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Matériel et

méthodes

- Matériel et méthodes – Chapitre 1 : Milieux et réactifs -

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Chapitre 1 : Milieux et réactifs

I. Le milieu de culture

Afin de se rapprocher le plus possible des conditions retrouvées au sein de l’USD,

toutes les expériences de ce travail sont réalisées dans de l’eau de réseau filtrée sur

membrane 0,22 µm (Fisher Scientific Stéricup). De façon ponctuelle, pour des études

comparatives, certaines analyses sont également réalisées en eau distillée.

II. Les micro-organismes

1) Souches utilisées

a) Souches de levures

Trois espèces de levures du genre Candida sont utilisées :

-Candida albicans ; souche ATCC 3153.

-Candida glabrata ; souche IHEM 9556.

-Candida parapsilosis ; souche ATCC 22019.

b) Souches d’amibes libres

Deux genres amibiens sont choisis pour ce travail : Acanthamoeba et Hartmannella.

Une espèce de chacun de ces genres est utilisée :

-A. castellanii ; souche ATCC 30234.

-H. vermiformis ; souche ATCC 50802.

2) Culture et entretien

a) Culture des levures

Pour la culture et l’entretien des levures du genre Candida, le milieu gélosé Sabouraud

est utilisé supplémenté en chloramphénicol (Sabouraud GC, Fluka) afin d’éviter le

développement de contaminants bactériens. Les souches sont repiquées tous les mois et

incubées 24 h à 37°C puis à température ambiante. 48 h avant chaque utilisation, les

souches sont repiquées sur gélose et incubées à 37°C.

b) Culture des amibes libres

Pour la culture et l’entretien des amibes libres, deux milieux liquides sont utilisés :


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-le milieu PYG (Peptone, Yeast extract, Glucose), composé de peptones (BD), d’extrait de

levures (BD) et de glucose (Sigma) (Tableau 3). Le milieu ainsi préparé est stocké à 4°C

jusqu’à utilisation. Afin d’éviter le développement de micro-organismes contaminants, des

antibiotiques sont ajoutés : pénicilline G (500 U/mL final) et streptomycine (2 µg/mL final).

Les antibiotiques sont stockés en aliquots à -30°C jusqu’à utilisation.

Ce milieu est utilisé pour les amibes du genre Acanthamoeba.

Tableau 3 : Préparation du milieu PYG.

-le milieu ATCC 1034 (ou milieu PYNFH modifié), composé de peptones (BD), d’extrait de

levures (BD), d’acide ribonucléique (Sigma), d’acide folique (Sigma), d’un tampon composé

de sels minéraux et de Sérum de Veau Fœtal (SVF) (Tableau 4). Le milieu ainsi préparé est

stocké à 4°C jusqu’à utilisation. Afin d’éviter le développement de micro-organismes

contaminants, des antibiotiques sont ajoutés : pénicilline G (500 U/mL final), streptomycine

(2 µg/mL final) et gentamicine (2,5 µg/mL final). Les antibiotiques sont stockés en aliquots à

-30°C jusqu’à utilisation.

Ce milieu est utilisé pour les amibes du genre Hartmannella.


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Tableau 4 : Préparation du milieu PYNFH (ATCC 1034).

Les souches d’amibes libres sont repiquées une fois par semaine, dans leur milieu

liquide respectif, en flasque de culture de 25 cm² (Sarsted, USA) et incubées à température

ambiante. Cinq jours avant chaque utilisation, les amibes sont repiquées dans une nouvelle

flasque à partir de la souche stockée à température ambiante, et incubées à température

ambiante.

Afin de conserver les souches d’amibes libres à plus long terme, une cryoconservation est

réalisée (adaptation du protocole ATCC), dans du DMSO (Diméthylsulfoxyde) à 7,5% final.

Les cryotubes sont conservés à -80°C.

La culture des amibes libres est également réalisée, pour certaines expériences, sur

milieu gélosé NNA (Non-Nutrient Agar, gélose à 2% d’agar, Sigma) recouvert d’une fine

couche (environ 50 µL) d’Enterobacter tués par tyndallisation (Figure 28). Dans ce cas, un

volume d’amibes libres, déterminé selon l’expérience, est déposé au centre de la gélose.

Les géloses sont ensuite incubées à 37°C pour une durée maximale de 15 jours. Les

amibes, se nourrissant des bactéries étalées sur la gélose, se déplacent peu à peu sur la


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surface du milieu ; un front de migration, visible à l’œil nu, apparait à l’endroit où les amibes

se sont arrêtées.

Figure 28 : Protocole de tyndallisation de bactéries.

3) Préparation des micro-organismes

a) Préparation des levures

Pour chaque expérience, la préparation des suspensions de Candida spp. est réalisée

en dispersant quelques colonies de levures dans de l’eau filtrée, et en dénombrant les

levures par microscopie optique, sur cellule de Kova® (Hycor, Biomedical) ; la concentration

finale choisie est de 5.105 levures/mL d’eau.

b) Préparation des amibes libres

Pour chaque expérience, la préparation des suspensions d’amibes libres est réalisée

en éliminant le surnageant de culture des flasques et en récupérant les amibes adhérées à

l’aide d’un grattoir de cellules (Greiner Bio-one), dans de l’eau filtrée. Deux centrifugations

de 7 min à 300 g sont réalisées dans de l’eau filtrée, afin de laver les amibes et d’éliminer le

milieu de culture. Les amibes sont ensuite remises en suspension dans de l’eau filtrée et

dénombrées par microscopie optique, sur cellule de Kova® ; la concentration finale choisie

est de 5.105 amibes/mL d’eau.


72

c) Préparation des surnageants de culture d’amibes libres

Pour la préparation des surnageants d’amibes, le surnageant de culture des flasques

est éliminé, et les amibes adhérées sont récupérées à l’aide d’un grattoir de cellules, dans

de l’eau distillée. Deux centrifugations de 7 min à 300 g sont réalisées dans de l’eau distillée,

afin de laver les amibes et d’éliminer le milieu de culture. Les amibes sont ensuite remises

en suspension dans de l’eau distillée et incubées 3 jours en flasque à température ambiante.

Après cette incubation, le surnageant de culture est récupéré et centrifugé 10 min à 800 g

afin d’éliminer les éventuelles cellules en suspension. Le nouveau surnageant est prélevé et

stocké à -80°C jusqu’à utilisation.

III. La salive

1) Obtention des échantillons

11 échantillons de salive totale, provenant de 11 donneurs volontaires sains, sont

collectés après rinçage de la bouche à l’eau distillée pour diminuer la charge bactérienne.

Les donneurs n’ont ni mangé, ni fumé au cours des deux heures précédant la collecte. Les

différents échantillons sont déposés sur glace ou à -80°C jusqu’à utilisation.

2) Préparation des salives

a) Salive centrifugée

Le même volume de chaque échantillon de salive est poolé, et le mélange ainsi obtenu

est centrifugé 15 min à 4000 g à une température de 4°C (Jin et al., 2004), afin d’éliminer les

éventuels débris cellulaires ou alimentaires. Le surnageant est récupéré et stocké en

aliquots à -80°C jusqu’à utilisation.

b) Salive filtrée

Pour certaines expériences, la salive est utilisée centrifugée et filtrée ; la filtration

permet d’éliminer les micro-organismes éventuellement présents dans le surnageant. Après

lavage par centrifugation (voir Matériel et méthodes Chapitre 1 III.2) a) Salive

centrifugée), la salive est filtrée sur membrane 0,22 µm (filtres pour seringue AC 30 mm 0,2

µm, Millipore) puis stockée à -80°C jusqu’à utilisation.


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c) Salive filtrée et traitée au DTT

Pour certaines expériences, la salive est utilisée centrifugée, filtrée et traitée au

dithiolthréitol (DTT) ; le DTT permet de dénaturer les protéines, en coupant les ponts

disulfures des acides aminés. Le mélange des différents échantillons de salive est mis en

présence de DTT à 2,5 mmol/L final, pendant 10 min sur glace avec une agitation douce. La

salive est ensuite centrifugée 15 min à 4000 g à une température de 4°C. Le surnageant est

récupéré et filtré sur membrane 0,22 µm (filtres pour seringue AC 30 mm 0,2 µm, Millipore)

puis stocké à -80°C jusqu’à utilisation.

d) Salive filtrée et chauffée

Pour certaines expériences, la salive est utilisée centrifugée, filtrée et chauffée ; le

traitement par chauffage permet de dénaturer certaines molécules thermosensibles telles

que les enzymes. Après lavage par centrifugation puis filtration (voir Matériel et

méthodes Chapitre 1 III.2) a) Salive centrifugée et b) Salive filtrée), la salive est

chauffée à 100°C pendant 30 min. Après refroidissement, la salive ainsi obtenue est stockée

à -80°C jusqu’à utilisation.

e) Salive filtrée et fractionnée

Pour certaines expériences, la salive est utilisée centrifugée, filtrée et fractionnée ; le

fractionnement sur membrane permet d’obtenir des filtrats contenant des molécules avec

une taille inférieure ou égale à la taille des pores de la membrane. Deux membranes sont

utilisées : 5 KDa et 30 KDa (Amicon Centriplus, Millipore). Après lavage par centrifugation

puis filtration (voir Matériel et méthodes Chapitre 1 III.2) a) Salive centrifugée

et b) Salive filtrée), la salive est fractionnée en déposant 5 mL sur les membranes filtrantes,

et en centrifugeant 2 fois 20 min à 3500 g (protocole Millipore). Les deux filtrats ainsi

obtenus, l’un composé de molécules ayant une taille < 5 KDa et l’autre une taille < 30 KDa,

sont stockés à -80°C jusqu’à utilisation.

Ainsi, pour les expériences suivantes, six salives différentes sont utilisées :

-la salive centrifugée.

-la salive centrifugée et filtrée (par la suite appelée « salive filtrée »).

-la salive centrifugée, filtrée et traitée au DTT (par la suite appelée « salive DTT »).

-la salive centrifugée, filtrée et chauffée (par la suite appelée « salive chauffée »).

-la salive centrifugée, filtrée et fractionnée < 5 KDa (par la suite appelée « salive < 5 K »).

-la salive centrifugée, filtrée et fractionnée < 30 KDa (par la suite appelée « salive < 30 K »).

- Matériel et méthodes – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -

74

Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive

I. L’analyse de la salive

1) Préparation de la salive

Un volume d’environ 100 mL, obtenu à partir d’un mélange de 11 échantillons de

salives (environ 10 mL de chaque échantillon), est centrifugé et filtré selon le protocole

précédemment décrit (voir Matériel et méthodes Chapitre 1 III. 2) Préparation

des salives). Le filtrat est ensuite lyophilisé à -55°C, jusqu’à obtention d’un résidu solide

(Lyophilisateur Christ). Le résidu est conservé à température ambiante jusqu’à utilisation.

2) Analyse par chromatographie

Le lyophilisat de salive obtenu est analysé par chromatographie gazeuse couplée à un

spectromètre de masse (GC-MS). L’échantillon lyophilisé est volatilisé par pyrolyse. Pour

cela, environ 1 mg de lyophilisat est disposé dans un tube en quartz de 100 µL ; le tube est

refermé à l’aide de laine de quartz. La pyrolyse est réalisée à l’aide d’un filament de platine

chauffé jusqu’à 650°C avec une vitesse de 20°C/ms (pyrolyseur Pyroprobe 2000, Chemical

Data Systems, Oxford). Le système de pyrolyse étant relié au port d’injection du

chromatographe (HP G1800A), les fragments de l’échantillon volatilisé sont directement

injectés dans la colonne capillaire de silice (DBWAX 30 m, 0,25 mm, J&W Scientific). Après

séparation sur la colonne (programme de température allant de 50 à 220°C en 3°C/min), les

fragments sont analysés par un spectromètre de masse de type quadripolaire (Hewlett

Packard) après ionisation par impact électronique à 70 eV.

Dans ces conditions, l’identification des principales molécules contenues dans la salive est

possible grâce à la base de données intégrée au logiciel du GC-MS.


75

II. La survie dans l’eau

1) Survie des levures

a) Gamme de concentrations en salive

L’influence de la présence de différentes salives (voir Matériel et méthodes

Chapitre 1 III. 2) Préparation des salives) sur la survie des levures du genre

Candida dans l’eau est étudiée, en utilisant une gamme de 3 concentrations : 2%, 5% et

10% de salive (v/v).

b) Préparation des suspensions

Les suspensions de Candida spp., numérées et ajustées à 5.105 levures/mL d’eau

filtrée ou d’eau distillée, sont réparties dans les puits de microplaques de 96 puits (Costar®,

Fisher Scientific) ; le volume utilisé est déterminé en fonction du pourcentage final de salive

souhaité (v/v), le volume total final du puits devant être de 200 µL.

Pour chaque expérience, un témoin eau ainsi qu’un témoin salive sont réalisés en parallèle ;

le puits témoin eau contenant 200 µL d’eau filtrée, et le puits témoin salive contenant 200 µL

d’eau avec 5% de salive (v/v).

c) Suivi de la survie

Les microplaques sont incubées à 10, 20 ou 27°C selon les expériences. La survie des

levures est analysée après des temps d’incubation compris entre 0 et 360 h (soit une durée

totale de 15 jours).

d) Analyse de la viabilité

Après chaque temps d’incubation choisi, la survie des levures est analysée par

dénombrement des Unités Formant Colonies (UFC), méthode permettant de dénombrer les

levures viables sur milieu gélosé de Sabouraud + chloramphénicol. Pour cela, 50 µL des

puits testés sont dilués dans 450 µL d’eau filtrée. Les dilutions au 1/10e, 1/100

e et 1/1000

e

sont utilisées selon les conditions expérimentales, et étalées à hauteur de 100 µL sur

géloses Sabouraud + chloramphénicol. Les colonies sont dénombrées après 48 h

d’incubation à 37°C ; les résultats sont exprimés en log UFC/mL.


76

2) Survie des amibes libres

a) Gamme de concentrations en salive

L’influence de la présence de salive centrifugée (voir Matériel et méthodes

Chapitre 1 III. 2) Préparation des salives) sur la survie des amibes libres dans l’eau

est étudiée, en utilisant une gamme de 3 concentrations : 2%, 5% et 10% de salive (v/v).

b) Préparation des suspensions

Les suspensions d’amibes libres, dénombrées et ajustées à 5.105 amibes/mL d’eau

filtrée, sont réparties dans les puits de microplaques de 96 puits ; le volume utilisé est

déterminé en fonction du pourcentage final de salive souhaité (v/v), le volume total final du

puits devant être de 200 µL.

Pour chaque expérience, un témoin eau ainsi qu’un témoin salive sont réalisés en parallèle ;

le puits témoin eau contenant 200 µL d’eau filtrée, et le puits témoin salive contenant 200 µL

d’eau avec 5% de salive (v/v).

c) Suivi de la survie

Les microplaques sont incubées à 10, 20 ou 27°C selon les expériences. La survie des

amibes libres est analysée après des temps d’incubation compris entre 0 et 360 h (soit une

durée totale de 15 jours).

d) Analyse de la viabilité

Après chaque temps d’incubation choisi, la survie des amibes libres est analysée

d’une part par dénombrement en microscopie optique (cellule de Kova®), en diluant 50 µL

des puits testés au ½ dans du bleu Trypan (Sigma) ; ce colorant vital permet de différencier

les cellules vivantes rejetant le colorant des cellules perméabilisées dans lesquelles le bleu

pénètre. Ainsi les cellules vivantes sont incolores tandis que les cellules mortes sont

colorées en bleu. Cette méthode permet d’obtenir la proportion d’amibes libres survivant

dans l’eau en présence ou non de salive ; les résultats sont exprimés en log amibes

vivantes/mL. Selon les expériences, la proportion de formes trophozoïtes et de formes

kystes peut également être déterminée.

D’autre part, pour certaines expériences, le dénombrement des amibes libres est réalisé

suivant une méthode statistique (d’après le protocole « Food and Drug Administration »,

USA) : la méthode du Nombre le Plus Probable (NPP). Une dilution au 1/100e des puits

testés est réalisée dans de l’eau filtrée, et étalée sur géloses NNA recouvertes

d’Enterobacter : trois géloses sont ensemencées avec 100 µL (dilution 1/10e), trois géloses


77

avec 10 µL (dilution 1/100e) et trois géloses avec 1 µL (dilution 1/1000

e) de cette dilution. Les

9 géloses ainsi obtenues sont incubées à 37°C pour une durée maximale de 15 jours,

jusqu’à observation des fronts de migration. Les géloses sur lesquelles un front de migration

est visible sont notées positives, et les autres négatives. Le nombre de géloses positives

pour chacune des trois dilutions permet d’obtenir un code à trois chiffres : exemple, si les

trois géloses de la dilution 1/10e sont positives, deux géloses de la dilution 1/100

e, ainsi que

deux géloses de la dilution 1/1000e, le code obtenu serait 3.2.2.

Le code généré permet, à l’aide du tableau statistique (Tableau 5), d’avoir une estimation de

la concentration en amibes libres (exprimée en NPP/mL) avec un intervalle de confiance de

95%. Dans l’exemple ci-dessus, le code étant de 3.2.2, la concentration correspondante

serait de 210 NPP/mL (Tableau 5) dans la dilution initiale faite au 1/100e, soit une

concentration dans le puits de 2,1.104 NPP/mL.

Tableau 5 : Tableau statistique pour la méthode du NPP à 3 géloses par dilution

(http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalMan

ualBAM/ucm109656.htm, 4/08/2012).

- Matériel et méthodes – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -

78

Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures

I. Préparation des micro-organismes

Des suspensions de levures et d’amibes libres sont préparées comme décrit

précédemment (voir Matériel et méthodes Chapitre 2 II. 1) b) et 2) b)

Préparation des suspensions), ainsi qu’une solution de surnageant de culture amibienne

(voir Matériel et méthodes Chapitre 1 II. 3) c) Préparation des surnageants de

culture d’amibes). Un rapport levures/amibes ou MOI (Multiplicity Of Infection) de 1 est choisi

; des volumes équivalents de levures (5.105/mL) et d’amibes (5.105

/mL) ou de surnageant de

culture amibienne, sont donc mis en présence.

Pour les cocultures, les amibes sont incubées en premier dans les puits de microplaques,

seules dans l’eau filtrée, pendant 2 h à la température souhaitée (10, 20 ou 27°C). Le même

volume de levures est ensuite ajouté, ainsi que de la salive à 2% (v/v) selon les

expériences ; le volume final dans les puits devant être de 200 µL.

Pour chaque expérience de coculture, un témoin eau ainsi qu’un témoin salive sont réalisés

en parallèle ; le puits témoin eau contenant 200 µL d’eau filtrée, et le puits témoin salive

contenant 200 µL d’eau avec 2% de salive (v/v). Un témoin amibes (suspension d’amibes

seulement) ainsi qu’un témoin levures (suspension de levures seulement) sont également

réalisés.

II. Analyse de la viabilité

La survie des levures et des amibes libres est analysée après des temps d’incubation

compris entre 0 et 360 h (soit une durée totale de 15 jours). Les microplaques sont incubées

à 10, 20 ou 27°C selon les expériences.

La viabilité des levures et des amibes libres est analysée comme décrit précédemment (voir

Matériel et méthodes Chapitre 2 II. 1) d) et 2) d) Analyse de la viabilité). Après

chaque temps d’incubation choisi, la survie des levures est analysée par dénombrement des

UFC. Les colonies sont dénombrées après 48 h d’incubation à 37°C ; les résultats sont

exprimés en log UFC/mL. La survie des amibes libres est analysée d’une part par

dénombrement en microscopie optique, sur cellule de Kova®, en présence de bleu Trypan ;

les résultats sont exprimés en log amibes vivantes/mL. D’autre part, pour certaines

expériences, le dénombrement d’amibes libres est réalisé par la méthode du NPP ; cette

méthode permet d’avoir une estimation de la concentration en amibes libres (exprimée en

NPP/mL) avec un intervalle de confiance de 95%.


79

III. Observations microscopiques

1) Microscopie électronique à transmission

a) Préparation des cocultures

Les suspensions de levures et d’amibes libres sont préparées comme décrit


Préparation des suspensions). Un rapport levures/amibes de 1 est choisi. Une flasque de

culture de 25 cm² est préparée avec 50 mL de suspension d’amibes libres en eau filtrée et

incubée 5 jours à 20°C. 50 mL de suspension de levures en eau filtrée sont ensuite ajoutés

dans la flasque, ainsi qu’un volume déterminé de salive filtrée afin d’obtenir 2% final (v/v).

Cette coculture est ensuite incubée 24, 72 ou 168 h à 20°C.

b) Fixation 1

Le surnageant de culture est éliminé, et le tapis cellulaire est fixé rapidement par

immersion dans un volume de glutaraldéhyde à 2,5% (fixateur 1) pendant au moins 1 h à

température ambiante. Les cellules adhérées et fixées sont récupérées à l’aide d’un grattoir

de cellules, puis centrifugées 10 min à 400 g. Le fixateur 1 (contenu dans le surnageant) est

ensuite éliminé et remplacé par du tampon phosphate (v/v).

c) Pré-enrobage

Après quelques minutes, le tampon de lavage est à son tour éliminé et remplacé (v/v)

par du milieu gélosé Histogel® (LabStorage) chauffé à 60°C afin de le liquéfier. Après

homogénéisation puis centrifugation pendant 10 min à 3000 g, du tampon phosphate très

froid est ajouté par-dessus la gélose et le tout est stocké à 4°C pendant quelques heures,

jusqu’à solidification totale du bloc de gélose contenant le culot de centrifugation de la

coculture.

d) Fixation 2

Une seconde fixation est ensuite réalisée avec du tétraoxyde d’osmium à 1%; ce

composé étant capable de figer les phospholipides. L’échantillon est incubé pendant 1 h à

4°C en présence de ce fixateur 2, puis lavé en tampon phosphate.

e) Déshydratation

L’échantillon est ensuite déshydraté à l’acétone, par bains successifs en concentration

croissante :

-2 fois 1 min dans un bain à 50% acétone-50% eau distillée.


80



-4 fois 15 min dans un bain à 100% acétone.

A ce stade, les prélèvements apparaissent durcis et colorés en noir.

f) Inclusion en résine

L’eau des tissus cellulaires est ensuite substituée par une résine époxy : l’araldite

(TAAB). L’échantillon est placé au fond d’une capsule en plastique et enrobé de résine

(Figure 29). La polymérisation dure quelques jours à 60°C.

Figure 29 : Inclusion des échantillons dans une résine époxy (A, B) (Unité de pathologie

ultrastructurale et expérimentale ; Service d’anatomie et cytologie pathologique, CHU

Poitiers).

g) Coupes et observations

Une fois les échantillons correctement durcis, les coupes microscopiques peuvent être

réalisées. D’une part, le pyramitome permet d’entailler la résine et de se placer au niveau de

l’échantillon, et d’autre part le microtome (couteau en verre) permet d’obtenir des coupes

semi-fines. Ces coupes sont colorées au bleu de toluidine et observées au microscope

optique, afin de vérifier la présence de l’échantillon analysé. Enfin, des coupes ultra-fines

sont réalisées à l’aide d’un couteau en diamant. Les différentes coupes ainsi obtenues sont

triées et récoltées sur des grilles en cuivre (Figure 30). Après au moins 1 h de séchage, les

coupes sont contrastées par de l’acétate d’uranyl (30 s) ainsi que des sels de plomb (4

min) ; ces deux composés permettant d’obtenir des nuances de gris. Les grilles, supportant

les échantillons, sont ensuite lavées à l’eau distillée, séchées, placées sur le porte-

échantillon (Figure 30), puis observées au microscope électronique à transmission (MET)

(Jeol 1010, Japan).


81

Figure 30 : Coupes ultra-fines déposées sur des grilles de cuivre (A) et porte-échantillon

permettant l’insertion des grilles dans le MET (B) (Unité de pathologie ultrastructurale et

expérimentale ; Service d’anatomie et cytologie pathologique, CHU Poitiers).

2) Marquage immunocytochimique

Un marquage immunocytochimique des levures est réalisé pour certaines expériences.

Dans ce cas, les coupes ultra-fines sont déposées non pas sur des grilles en cuivre mais

des grilles en nickel, capables de mieux résister à l’étape d’oxydation.

a) Oxydation

Afin de nettoyer les coupes et de libérer au mieux les sites antigéniques, les grilles

sont oxydées dans du métapériodate de sodium à 5%, 30 min à température ambiante, puis

rincées dans de l’eau distillée.


82

b) Saturation

Les sites non spécifiques sont bloqués en incubant les grilles 30 min à température

ambiante dans une solution tampon de sérum albumine à 3%.

c) Anticorps primaire

Les grilles sont ensuite séchées et trempées dans une solution d’anticorps primaire, le

tout est incubé en chambre humide afin d’éviter toute dessiccation, à 4°C pour une nuit.

L’anticorps utilisé est un Ig M de souris anti-Candida noté 3H8 (Marcilla et al., 1999 ; mis à

disposition par le laboratoire SR²B : Société de Recherche et de Réalisations

Biotechnologiques, Angers). La cible de cet anticorps est intrapariétale, c’est-à-dire localisée

dans la paroi des levures.

d) Anticorps secondaire

Les grilles sont lavées dans une solution de détergents (TRIS et Tween 20), afin

d’éliminer l’anticorps primaire non fixé à sa cible spécifique ; une dizaine de lavages de 5

min chacun est réalisée. Les grilles sont ensuite incubées avec l’anticorps secondaire 1 h à

température ambiante, en chambre humide. L’anticorps secondaire utilisé est un anti-Ig M

marqué à l’or colloïdal ; l’or colloïdal apparaissant au microscope sous forme de billes

noires, permettant de visualiser et de localiser la cible de l’anticorps primaire.

Les grilles sont ensuite rincées à l’eau distillée et séchées sur papier filtre.

e) Contraste

Juste avant observation, les grilles sont contrastées à l’acétate d’uranyl et aux sels de

plombs (voir Matériel et méthodes Chapitre 3 III. 1) g) Coupes et observations).

Les grilles sont lavées à l’eau distillée, séchées, puis observées au MET (Jeol 1010).

3) Microscopie électronique à balayage

a) Stérilisation des coupons

Afin de se rapprocher des conditions retrouvées à l’intérieur des USD, des coupons en

forme de disques d’environ 1,2 cm de diamètre et 0,3 cm de hauteur, en PVC (RD-128PVC ;

Biosurface Technologies Corp, USA), matériau très souvent utilisé pour la fabrication des

tubulures, sont utilisés pour étudier l’adhérence des levures et des amibes libres sur les

surfaces.

Les coupons sont stérilisés avant utilisation par trempage dans une solution d’éthanol à 70%

puis rinçage à l’eau distillée et séchage à la flamme.


83

b) Préparation des cocultures



Préparation des suspensions). Un rapport levures/amibes de 1 est choisi. Pour cette

expérience, les amibes (1 mL) sont pré-incubées une nuit à 20°C dans des puits d’une

microplaque 24 puits (Nunc®, Fisher Scientific) au fond desquels ont été préalablement

déposés des coupons de PVC. Le même volume (1 mL) de suspension de levures en eau

filtrée est ensuite ajouté dans chaque puits, ainsi qu’un volume déterminé de salive filtrée

afin d’obtenir 10% final (v/v). Ces cocultures sont ensuite incubées pendant 3 à 42 jours à

20°C, afin de laisser les cellules adhérer à la surface des coupons de PVC.

c) Fixation

Le surnageant de culture est éliminé, et les coupons sont recouverts d’une solution de

glutaraldéhyde à 2,5% pendant au moins 1 h à température ambiante. Les cellules adhérées

et fixées sur les coupons sont ensuite lavées dans du tampon phosphate et rincées à l’eau

distillée.

d) Déshydratation

Les coupons sont ensuite déshydratés à l’acétone, par bains successifs en

concentration croissante :




-1 fois 15 min dans un bain à 100% acétone.

Les coupons sont ensuite placés dans de petits paniers métalliques, trempés dans l’acétone

100% et placés dans la chambre remplie d’acétone de l’appareil à Point Critique (BalTec).

e) Dessiccation par méthode Point Critique

Les cellules adhérées aux coupons sont déshydratées en remplaçant l’acétone par du

CO2 gazeux, en plusieurs étapes :

-tout d’abord, la température est descendue sous 8°C afin d’obtenir du CO2 liquide, miscible

à l’acétone,

-l’acétone remplissant la chambre de dessiccation est alors remplacé progressivement par

du CO2 liquide,

-une fois la chambre vidée de l’acétone et remplie de CO2 liquide, la température est

augmentée jusqu’au Point Critique (31°C, 73 bars) ; ce point correspondant à la transition de

phase du CO2 : à ce stade, un mélange de CO2 liquide et de CO2 gazeux est obtenu,


84

-le Point Critique est ensuite dépassé, et la température augmentée jusqu’à 42°C afin

d’obtenir une chambre de dessiccation remplie de CO2 cette fois gazeux : les cellules sont

ainsi déshydratées,

-le gaz est enfin retiré très lentement de la chambre de dessiccation pour conserver intactes

les structures cellulaires sous vide : la pression est pour cela descendue jusqu’à 0, en

gardant une température constante,

-les paniers métalliques contenant les coupons sont alors sortis de la chambre.

f) Métallisation et observations

Pour la métallisation, étape qui permet de rendre les échantillons conducteurs aux

électrons et donc observables au microscope électronique à balayage (MEB), les coupons

sont installés sur des petits plots métalliques, à l’aide d’adhésif conducteur et de colle

argentée. Ces assemblages sont disposés dans un métalliseur (BalTec) qui permet de

recouvrir les coupons d’une fine couche d’or, par bombardage des électrons dans une

atmosphère d’argon, sous vide (environ 5 min).

Une fois séchés, les coupons sont observés au MEB (Jeol JSM 840A, Japan).

IV. Analyse par cytométrie en flux

1) Cytométrie en flux : principe

La cytométrie en flux est une technique permettant de compter des cellules en

suspension dans un milieu. Les cellules sont présentées une à une devant une source laser

émettant une longueur d’onde précise qui va exciter les cellules. Les cellules excitées

diffractent la lumière ; cette diffraction est captée par un détecteur FSC (Forward Scatter)

(Figure 31), qui renseigne sur la taille des cellules.

Figure 31 : Schéma du principe de la cytométrie en flux (http://bentleyinstruments.com/wp-

content/uploads/2010/12/Somacount_FCM-300x254.jpg, 4/08/2012).


85

D’autres détecteurs, tels que le détecteur SSC (Side Scatter) qui renseigne sur la

granularité des cellules, ou les détecteurs de fluorescence, captent la lumière diffractée avec

un angle plus important (90°) ou la lumière émise (fluorescence) (Figure 31). En utilisant

différents filtres optiques et différents fluorochromes, il est possible d’analyser de nombreux

paramètres. Le collecteur-analyseur de données convertit les données récoltées en valeurs

numériques et peut représenter plusieurs paramètres combinés sur un histogramme.

2) Cytométrie en flux : application

a) Préparation des cocultures



Préparation des suspensions), avec un rapport levures/amibes de 1. Pour cette expérience,

les amibes (1 mL) et les levures (1 mL) sont incubées dans des puits d’une microplaque 24

puits, avec un volume déterminé de salive filtrée afin d’obtenir 5% final (v/v). Ces cocultures

sont ensuite incubées 72 h à 20°C. En parallèle, un témoin levures seules ainsi qu’un témoin

amibes seules ont été réalisés dans les mêmes conditions.

b) Marquage par des fluorochromes

Le marquage fluorescent des cellules est réalisé à l’aide du kit de colorants BacLight®

(Invitrogen), contenant deux fluorochromes : le SYTO 9 et l’Iodure de Propidium (IP). Le

SYTO 9, fluorescent vert, capable de pénétrer dans toutes les cellules, colore l’ensemble

des cellules en vert, alors que l’IP, fluorescent rouge, capable de ne pénétrer dans les

cellules que si la membrane est détériorée, colore uniquement les cellules mortes en rouge

(Boulos et al., 1999; Mogoa et al., 2010).

1 mL de chaque échantillon est prélevé et mis en contact avec 1,5 µL/mL de chacun des

fluorochromes. Les échantillons sont placés 15 min à l’obscurité.

c) Analyse en cytométrie en flux

Après 15 min de marquage fluorescent, les échantillons sont placés sur le portoir du

cytomètre de flux (BD FACSCanto II, BD Biosciences, USA) et analysés sur 4 paramètres :

la taille (FSC), la granularité (SSC), ainsi que l’émission de fluorescence due au SYTO 9 et

celle due à l’IP. Les données sont collectées et analysées à l’aide du logiciel d’acquisition

BD FACSDiVa 6 (BD Biosciences, USA).

- Matériel et méthodes – Chapitre 4 : Les traitements chimiques -

86

Chapitre 4 : Les traitements chimiques

I. Produits chimiques utilisés

Toujours dans le but de reproduire les conditions se rapprochant de celles trouvées

dans les USD, trois produits chimiques, couramment utilisés dans les procédés de

désinfection des eaux et des USD, sont testés sur les différentes souches de levures et

d’amibes libres. Pour chacun des trois désinfectants, l’effet antimicrobien d’une gamme de

concentrations choisies est analysé :

-pour le chlore, utilisé sous forme d’hypochlorite de sodium (NaOCl, Sigma), quelques

études ont montré une efficacité très variable de ce désinfectant, qu’il soit utilisé en continu

ou en traitement périodique. Des temps de contact différents ainsi que des concentrations

allant de 1 à 50 ppm (parties par million ou mg/L) ont été testés (Fiehn and Henriksen, 1988;

Karpay et al., 1999).

-concernant le peroxyde d’hydrogène (H2O2, Sigma), ce désinfectant a été montré comme

agent antimicrobien et notamment antifongique, avec un temps de contact de 15 à 30 min et

une concentration de 0,25% pour un traitement périodique ; un traitement à 0,02% en

continu a également été étudié (Zanetti et al., 2003; Szymanska, 2006a).

-enfin, pour ce qui est de l’Oxygenal 6© (KaVo®), produit à base de 6% de H2O2 et d’ions

Argent (Ag), de même que le H2O2, ce désinfectant a été montré efficace pour le traitement

des USD, que ce soit en continu avec une dose de 0,02% ou en périodique à 0,25% (Schel

et al., 2006; Szymanska, 2006b).

Dans le cadre de l’étude, la viabilité des micro-organismes est étudiée 15 min après

l’ajout d’une dose choisie de désinfectant. De plus, les gammes de concentrations

sélectionnées sont :

-de 3 à 118 ppm (3 ; 6 ; 12 ; 26 ; 62 ; 118 ppm) pour le chlore,

-de 0,07% à 0,9% (0,07 ; 0,15 ; 0,3 ; 0,6 ; 0,75 ; 0,9%) pour le H2O2,

-de 0,05% à 2% (0,05 ; 0,1 ; 0,2 ; 0,5 ; 1 ; 2%) pour l’Oxygenal 6©.


87

II. Traitements des micro-organismes

1) Préparation des suspensions

a) Préparation des levures

Les suspensions de Candida spp. sont préparées (voir Matériel et méthodes

Chapitre 2 II. 1) b) Préparation des suspensions) et réparties dans les puits de

microplaques de 96 puits, en présence de 2% de salive filtrée (v/v) ; le volume final de

chaque puits étant de 200 µL.

b) Préparation des amibes libres

Les suspensions d’amibes libres sont préparées (voir Matériel et méthodes

Chapitre 2 II. 2) b) Préparation des suspensions) et réparties dans les puits de

microplaques de 96 puits, en présence de 2% de salive filtrée (v/v) ; le volume final de

chaque puits étant de 200 µL.

c) Préparation des cocultures

Dans le cas des cocultures, des volumes équivalents (rapport levures/amibes : 1) de

suspensions d’amibes libres et de levures sont répartis dans les puits de microplaques de 96

puits, en présence de 2% de salive filtrée (v/v) ; le volume final de chaque puits étant de 200

µL.

2) Traitements chimiques

Les microplaques sont incubées à 20°C. La survie des micro-organismes est analysée

après des temps d’incubation compris entre 0 et 360 h (soit une durée totale de 15 jours).

Pour chaque traitement chimique, à chaque temps d’incubation choisi, un volume déterminé

de désinfectant est ajouté dans le puits, afin d’obtenir la concentration finale voulue dans le

puits contenant déjà 200 µL de suspension microbienne. L’analyse de la viabilité est réalisée

15 min après l’ajout de désinfectant. En parallèle, pour chaque traitement et chaque temps

d’incubation, un témoin correspondant aux micro-organismes non traités est réalisé.


88

3) Analyse de la viabilité

a) Analyse de la survie des levures

A chaque temps d’incubation choisi, 15 min après avoir appliqué le traitement

chimique, la survie des levures (en culture simple ou en coculture avec des amibes libres)

est analysée par dénombrement des UFC (voir Matériel et méthodes Chapitre 2

II. 1) d) Analyse de la viabilité).

Pour cela, 50 µL des puits testés sont dilués dans 450 µL d’eau filtrée, 15 min après le

traitement. Des dilutions au 1/10e, 1/100

e sont utilisées et étalées à hauteur de 100 µL sur

géloses Sabouraud + chloramphénicol. Les colonies sont dénombrées après 48 h

d’incubation à 37°C ; les résultats sont exprimés en log UFC/mL.

b) Analyse de la survie des amibes libres

A chaque temps d’incubation choisi, 15 min après avoir appliqué le traitement

chimique, la survie des amibes libres (en culture simple ou en coculture avec des levures)

est analysée par dénombrement en microscopie optique (cellule de Kova®) (voir Matériel

et méthodes Chapitre 2 II. 2) d) Analyse de la viabilité).

Pour cela, 50 µL des puits testés sont dilués dans 450 µL d’eau filtrée, 15 min après le

traitement, puis dilués au ½ dans du bleu Trypan. Les résultats sont exprimés en log amibes

vivantes/mL.

89

Résultats et

discussion

- Résultats et discussion – Chapitre 1 : Analyse de la salive -

90

Chapitre 1 : Analyse de la salive

I. Objectif de l’étude

La salive, très présente au niveau de la cavité buccale et souvent impliquée dans les

nombreuses pathologies orales, a plusieurs fois fait l’objet d’études de caractérisations

biochimiques. Diverses techniques ont été utilisées afin d’analyser de façons qualitative et

quantitative les différents constituants de la salive, notamment les différentes sécrétions des

glandes salivaires mais aussi et surtout la pellicule exogène acquise. Majoritairement, des

molécules protéiques, enzymatiques, des acides organiques, mais aussi des micro-

organismes ont été identifiés (Humphrey and Williamson, 2001; Scannapieco, 1994).

L’objectif de cette partie du travail a été de caractériser les principaux éléments

moléculaires présents dans la salive après centrifugation et filtration (voir Matériels et

Méthodes Chapitre 1 III. 2) Préparation des salives). Pour cela, une technique

utilisant la chromatographie gazeuse pour séparer les molécules, couplée à une technique

de spectrométrie de masse, pour identifier les molécules fragmentées, a été utilisée (GC-

MS).

II. Chromatogramme obtenu par GC-MS

Lors de l’analyse par GC-MS, la vitesse de décrochage des molécules de la salive

dépendait de leur affinité avec la colonne polaire : ainsi, les solutés plus polaires ont été

élués en premier, et les plus apolaires, plus longtemps retenus par la colonne, sont sortis en

dernier ; la tension de vapeur (pression de vapeur à laquelle une molécule sous forme

gazeuse est en équilibre avec sa phase liquide ou solide), paramètre lié à la température

utilisée lors de l’analyse, entrait également en jeu lors de l’élution des constituants salivaires.

Dans ces conditions, après séparation sur la colonne capillaire du chromatographe, les

différentes molécules sont apparues sur le chromatogramme sous forme de pics (dont la

hauteur, ou l’aire sous la courbe, est proportionnelle à la quantité de la molécule). L’abscisse

du chromatogramme correspond à leur temps de rétention (temps nécessaire pour les

décrocher de la colonne) en minutes, et l’ordonnée donne une abondance relative

(correspondant à la hauteur des pics) (Figure 32).

Le logiciel de base de données pour l’analyse des molécules, relié à l’appareil de GC-MS, a

permis l’identification des principaux pics (Figure 32). La nature la plus probable a alors été

proposée pour chacune des molécules observées. Ces molécules étaient principalement

- Résultats et discussion – Chapitre 1 : Analyse de la salive -

91

des protéines, des glucides, des composés aromatiques (à cycles carbonés complexes),

ainsi que des acides organiques.

Figure 32 : Chromatogramme de la salive filtrée, analysée par GC-MS (n=2).

D’après la base de données, la salive ne contenait que très peu de sucres ; une seule

molécule pouvant provenir de molécules glucidiques a été identifiée : l’acétamide (Figure

32). Quelques acides organiques, ainsi que quelques molécules aromatiques ont été

retrouvés, mais majoritairement, la salive analysée était composée de molécules

caractéristiques des protéines, telles que l’indole ou le toluène (Figure 32).

Les résultats obtenus étaient cohérents avec les données de la littérature (de Almeida et al.,

2008; Humphrey and Williamson, 2001; Gocke et al., 2002; Scannapieco, 1994; Yao et al.,

2001).

- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -

92

Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive

I. Survie des levures

1) Objectif de l’étude

Les levures du genre Candida ont déjà été isolées dans l’eau d’appareils de dialyse ou

encore dans l’eau des USD (Medeiros et al., 2008; Szymanska, 2005; Walker et al., 2000).

Dans le cas des USD, les levures, ainsi que d’autres micro-organismes oraux, peuvent se

retrouver refluées à l’intérieur du circuit d’eau, par le biais de valves anti-reflux défaillantes

ou absentes, accompagnées de salive (Barbeau et al., 1998; Ojajärvi, 1996). De plus, l’eau

de réseau alimentant ces dispositifs médicaux est le plus souvent filtrée.

L’objectif de cette partie du travail a donc été de vérifier la capacité de différentes

espèces de Candida à survivre dans un milieu très pauvre tel que l’eau de réseau filtrée,

ainsi que d’étudier l’influence de la présence de faibles concentrations de salive sur la survie

des levures.

2) Article : FEMS Microbiology Letters (2011) – Influence de la

présence de salive

Dans une première série d’expériences, qui ont fait l’objet d’une publication dans le

journal FEMS Microbiology Letters, la survie de trois espèces de levures du genre Candida

(C. albicans, C. glabrata et C. parapsilosis) a été analysée dans l’eau filtrée en présence de

0, 1, 5 ou 20% (v/v) de salive filtrée, à 27°C pendant 360 h d’incubation.

La viabilité des levures a été mesurée par dénombrement des UFC sur géloses Sabouraud

+ chloramphénicol, après 48 h d’incubation à 37°C.

Les résultats ont montré une influence dose-dépendante et espèce-dépendante : C.

parapsilosis semblait plus résistante que les deux autres espèces, qui ne survivaient dans

l’eau qu’en présence de salive. De plus, plus la concentration en salive était élevée, plus la

croissance des levures persistait dans le temps et pouvait être ainsi observée pendant les

360 h de l’expérience.


93


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97

3) Influence du type d’eau utilisée

Des analyses complémentaires ont été réalisées afin de vérifier si l’eau de réseau

filtrée apportait ou non des éléments essentiels pour la survie des levures, tels que des sels

minéraux. Une comparaison a donc été faite entre la croissance des levures en présence de

salive centrifugée à différentes concentrations (0, 2, 5 et 10% v/v), dans de l’eau distillée

(Figure 33-A) et dans de l’eau de réseau filtrée (Figure 33-B) à 27°C ; seuls les résultats

pour C. albicans sont représentés sur la figure 33.

Figure 33 : Survie de C. albicans dans l’eau distillée (A) et dans l’eau filtrée (B), en présence

de différentes concentrations de salive centrifugée (0, 2, 5 et 10% v/v) à 27°C (n=2).


98

Les résultats, comparables pour les trois espèces de levures, n’ont montré aucune

différence marquée entre les deux eaux : l’eau de réseau filtrée n’apporte donc aucun

élément nutritif aux levures. L’augmentation de la survie des levures du genre Candida est

donc uniquement liée à la présence de salive.

4) Influence de la composition de la salive utilisée

Plusieurs traitements ont été effectués sur la salive, dans le but de déterminer plus

précisément quels constituants salivaires étaient à l’origine de l’augmentation de la survie

des levures. Au total, six salives différentes ont été testées sur les trois espèces de levures :

salive centrifugée, salive filtrée, salive DTT, salive chauffée, salive < 5 K et salive < 30 K

(voir Matériels et Méthodes Chapitre 1 III. 2) Préparation des salives).

a) Salive centrifugée VS salive filtrée

Initialement, la salive utilisée était uniquement centrifugée, et pouvait de ce fait

contenir quelques bactéries orales potentiellement à l’origine de contaminations sur les

géloses, lors du dénombrement des UFC de levures. La salive a donc été par la suite

utilisée centrifugée et filtrée. Afin de vérifier que l’étape de filtration ajoutée ne modifiait pas

l’effet sur la survie des levures préalablement observé avec la salive centrifugée à 27°C, une

étude comparative a été réalisée, avec les mêmes concentrations de chacune des deux

salives sur les trois espèces de levures (seule la concentration 5% de salive (v/v) est

représentée sur la figure 34).

Les résultats ont montré que l’effet de la salive filtrée sur la croissance de Candida spp. était

similaire à l’effet de la salive centrifugée. Après les 360 h de l’expérience, C. albicans

(Figure 34-A) et C. parapsilosis (Figure 34-C) ont vu leur croissance augmentée de 2 logs

UFC/mL, et C. glabrata (Figure 34-B) est passée de log 5 à log 6 UFC/mL, comparé au

témoin sans salive. La filtration sur membrane 0,22 µm n’a donc pas éliminé la ou les

molécule(s) de la salive active(s) sur la croissance des levures dans l’eau.

De plus, comme observé dans l’article (voir Résultats et Discussion Chapitre 2

I. 2) Article : FEMS Microbiology Letters (2011) – Influence de la présence de salive),

les résultats obtenus sur les trois espèces de Candida étaient similaires avec 2, 5 et 10% de

salive (v/v). Pour la suite des analyses, seules les concentrations de 2% et 5% de salive ont

été utilisées (v/v).


99

Figure 34 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B), et C. parapsilosis (C), dans l’eau filtrée

en présence de 5% (v/v) de salive centrifugée ou filtrée à 27°C (n=2).


100

b) Salive filtrée VS salive DTT

La prolifération des levures étant tout aussi favorisée en présence de salive filtrée que

de salive centrifugée, et la salive filtrée n’étant pas chargée en micro-organismes

contaminants, pour la suite des analyses, la salive filtrée a été utilisée comme témoin

référence.

La salive a d’une part été traitée au DTT, agent capable de couper les ponts disulfures des

protéines contenant des acides aminés sulfurés, et générant leur dénaturation. L’étude

comparative de la survie des levures dans l’eau filtrée à 27°C en présence de 5% de salive

filtrée et de 5% de salive DTT (Figure 35) a montré que le traitement au DTT était sans effet

sur la survie de C. parapsilosis en présence de salive (Figure 35-C). En revanche, C.

albicans et surtout C. glabrata semblaient plus sensibles ; leur survie en présence de salive

DTT était plus faible qu’en présence de salive filtrée (Figure 35-A et B). Par exemple après

360 h d’incubation, la concentration de C. albicans en présence de salive DTT était de 4,3

logs, contre 6,8 logs UFC/mL en présence de salive filtrée (Figure 35-A).

Le fait de dénaturer certaines protéines salivaires pourrait diminuer les sources de

nutriments apportés aux levures par la salive. Cependant, les levures survivent toujours

mieux en présence de salive traitée au DTT qu’en absence totale de salive dans l’eau ;

même en dénaturant certaines protéines, la survie des levures reste très élevée

comparativement au témoin levures. L’effet de la salive sur la prolifération des levures dans

l’eau serait donc dû à l’action de plusieurs molécules différentes.


101


en présence de 5% (v/v) de salive filtrée ou de salive DTT à 27°C (n=2).


102

c) Salive filtrée VS salive chauffée

La survie des levures dans l’eau à 27°C, a été comparée en présence de 5% de salive

filtrée et de 5% de salive chauffée 30 min à 100°C (Figure 36).

Comme observé dans le cas de la salive traitée au DTT, le traitement de la salive par la

chaleur n’a eu aucun effet dans le cas de l’espèce C. parapsilosis (Figure 36-C). Ces

résultats confirment l’hypothèse déjà émise : l’espèce C. parapsilosis est plus résistante que

les autres espèces de Candida testées. De même, le traitement de la salive à la chaleur n’a

pas d’effet significatif sur la survie de C. glabrata dans l’eau (Figure 36-B). En revanche, la

croissance de C. albicans est légèrement plus faible en présence de salive chauffée que de

salive filtrée non chauffée (diminution de plus de 1 log UFC/mL) (Figure 36-A).

Dans les deux cas, comme noté précédemment, les levures survivent toujours mieux

dans l’eau en présence de salive traitée par la chaleur qu’en absence de salive ; même en

dénaturant certaines molécules telles que des enzymes, la survie des levures reste très

élevée comparé au témoin levures. Ces résultats confirment l’existence dans la salive de

plusieurs molécules différentes favorisant la survie et/ou la prolifération des levures dans

l’eau.

De plus, il semblerait que les traitements exercés sur la salive aient une influence différente

sur la prolifération des trois espèces de Candida testées ; cela signifierait que les trois

espèces testées n’utilisent pas forcément les mêmes molécules salivaires comme source de

nutriments.


103


en présence de 5% (v/v) de salive filtrée (n=2) ou chauffée à 27°C (n=1).


104

d) Salive filtrée VS salives fractionnées

La salive a été fractionnée sur membranes afin d’obtenir des filtrats contenant des

molécules ayant une taille inférieure à la taille des pores de la membrane. Un filtrat < 5 KDa

et un filtrat < 30 KDa ont ainsi été obtenus et leur effet sur la prolifération des levures dans

l’eau a été comparé à celui de la salive filtrée non fractionnée (Figure 37).

C. parapsilosis, une fois de plus, est l’espèce la plus résistante et la moins exigeante sur les

sources de nutriments disponibles ; la survie de C. parapsilosis est approximativement la

même en présence de salive filtrée et en présence de salive < 5 K ou < 30 K (Figure 37-C).

Pour C. albicans, la même observation que dans le cas de la salive traitée au DTT ou à la

chaleur peut être faite ici : la croissance de C. albicans est plus faible en présence de salives

fractionnées que de salive filtrée, en particulier pour les temps d’incubation ≥ 72 h (Figure

37-A). Toutefois cette croissance est toujours beaucoup plus élevée par rapport au témoin

levures. Par exemple à 168 h d’incubation, une concentration de levures de seulement 0,8

logs UFC/mL est retrouvée en absence de salive, contre : 4,7 logs en présence de salive < 5

K, 5,2 logs en présence de salive < 30 K et 6,1 logs en présence de salive filtrée.

Pour C. glabrata, l’effet est plus marqué : dès 48 h d’incubation, la survie des levures est

plus faible en présence de salives fractionnées qu’en présence de salive filtrée, jusqu’à une

diminution de plus de 2 logs UFC/mL à 168 h d’incubation (Figure 37-B). La croissance de

C. glabrata en présence de salives fractionnées devient même comparable à celle du témoin

levures, pour les temps d’incubation ≥ 72 h (Figure 37-B).

Ces résultats confirment que chaque espèce de Candida utilise plusieurs molécules

salivaires comme source de nutriments, et que les molécules utilisées peuvent être

différentes d’une espèce à l’autre. De plus, cette partie du travail montre que certaines des

molécules salivaires métabolisées par les levures ont une taille > 30 KDa, mais que la

plupart d’entre elles ont une taille < 5 KDa (Figure 37).

L’effet positif de la salive sur la croissance des levures du genre Candida dans l’eau de

réseau filtrée serait donc dû à plusieurs molécules, dont la plupart seraient de nature

protéique, au vue de la grande proportion des protéines entrant dans la composition de la

salive, résistantes au DTT et à la chaleur et auraient une taille moléculaire < 5 KDa.


105


en présence de 5% (v/v) de salive filtrée, de salive <5 K ou <30 K à 27°C (n=2).


106

5) Influence de la température utilisée

La salive filtrée a été utilisée pour la suite des analyses, et dans un premier temps

pour tester l’influence de la température sur la survie des levures dans l’eau. A l’intérieur des

USD, la température moyenne est de 23°C ; toutefois selon le modèle de l’unit et les

conditions environnementales, cette température peut varier de 20 à 30°C (Coleman et al.,

2007; Pankhurst, 2003). Ainsi deux températures moyennes ont été choisies pour les

expériences : 20 et 27°C. De plus, une troisième température a été étudiée : 10°C. Cette

condition pourrait correspondre à un cas plus extrême pouvant être retrouvé à l’intérieur des

tubulures, par exemple en hiver, où l’eau stagnerait à une température plus basse, ou

encore en cas de réfrigération d’une partie du réseau de l’USD. La survie des trois espèces

de Candida a donc été analysée dans l’eau filtrée, après incubation à ces trois températures

pendant 360 h, en présence ou non de 2% de salive filtrée. Les résultats obtenus sont

présentés pour chaque température et pour chacune des espèces de levures (Figures 38,

39 et 40).

Dans le cas de C. albicans, comme observé précédemment, la présence de salive

permet une meilleure survie voire une prolifération des levures à 27°C (Figure 38-A), à 20°C

(Figure 38-B), ou à 10°C (Figure 38-C) ; la concentration en levures est en effet toujours

supérieure ou égale à celle de l’inoculum de départ (log 5 UFC/mL). En revanche, le témoin

levures réagit différemment en fonction de la température : à 20°C, la croissance des

levures est minimale et ralentie (on parle de dormance, ou de quiescence) (Figure 38-B), à

10°C elle semble tout aussi ralentie et diminue au cours du temps (Figure 38-C), enfin à

27°C, C. albicans ne survit pas plus de 48 h dans l’eau en absence de salive (Figure 38-A).

Ces résultats pourraient s’expliquer par le fait que 27°C étant une température relativement

optimale pour leur croissance, les levures consommeraient rapidement le peu de nutriments

trouvés dans l’eau et épuiseraient donc le milieu au bout de quelques heures d’incubation,

ce qui entrainerait leur mort. A 20°C, la température étant moins adaptée, le métabolisme

fongique serait de ce fait ralenti. Les levures consommeraient donc moins rapidement les

nutriments et survivraient, en faible concentration, mais plus longtemps qu’à 27°C. Le cas de

10°C est encore différent : cette température serait peut-être trop basse pour permettre la

survie fongique, même en mode quiescent, les conditions de culture dans l’eau étant déjà

drastiques. Ainsi, la concentration en levures diminue progressivement au cours du temps.


107

Figure 38 : Survie de C. albicans à 27°C (A), 20°C (B), et 10°C (C), dans l’eau filtrée en

présence de 2% (v/v) de salive filtrée (n=2).

Pour C. glabrata, la même observation a été faite : la température n’influence pas

l’effet positif de la salive filtrée sur la survie des levures dans l’eau ; C. glabrata est capable

de maintenir sa concentration entre log 5 et log 6 UFC/mL durant les 360 h de l’expérience

(Figure 39). C. glabrata semble moins sensible à la température que C. albicans : en

absence de salive, C. glabrata peut survivre aussi bien à 27°C (Figure 39-A), qu’à 20°C

(Figure 39-B) ou même à 10°C (Figure 39-C). Toutefois une baisse progressive de la


108

concentration en levures à 20°C et 10°C a été notée ; cette diminution s’explique de la

même façon que pour C. albicans.

Figure 39 : Survie de C. glabrata à 27°C (A), 20°C (B), et 10°C (C), dans l’eau filtrée en


Enfin pour C. parapsilosis, la température a peu d’influence sur l’effet de la salive

(Figure 40) : à 27°C et 20°C la concentration augmente de log 5 à log 7 UFC/mL après 360


109

h d’incubation (Figure 40-A et 40-B), alors qu’à 10°C la croissance est légèrement plus

faible et oscille entre log 5 et log 6 UFC/mL (Figure 40-C).

D’une manière générale, comparé au témoin levures, quelle que soit la température

utilisée, et ce pour les trois espèces de Candida testées, la présence de 2% (v/v) de salive

filtrée permet d’augmenter la survie des levures dans l’eau de réseau filtrée.

Figure 40 : Survie de C. parapsilosis à 27°C (A), 20°C (B), et 10°C (C), dans l’eau filtrée en



110

II. Survie des amibes libres

1) Objectif de l’étude

Les amibes libres, ubiquitaires de l’environnement et notamment des milieux

aquatiques, ont déjà été isolées de l’eau alimentant les USD (Michel and Just, 1984; Rohr et

al., 1998; Thomas et al., 2008; Trabelsi et al., 2010). Le premier objectif de cette partie du

travail a donc été de suivre la survie d’amibes libres de genres communément retrouvés

dans les eaux : Acanthamoeba castellanii et Hartmannella vermiformis. De plus, l’étude se

plaçant dans le contexte des USD, l’influence de la présence de faibles concentrations de

salive sur la survie de ces amibes dans l’eau a été étudiée. A partir des résultats

précédemment décrits sur les levures du genre Candida (voir Résultats et

Discussion Chapitre 2 I. 4) Influence de la composition de la salive utilisée et 5)

Influence de la température utilisée), la salive filtrée a été utilisée pour la suite des

expériences, et les amibes libres ont été incubées à 20°C.

2) Influence de la présence de salive

L’influence de la présence de salive filtrée sur la survie des amibes libres dans l’eau

est présentée sur les figures 41 et 42. Les résultats sont représentés sous forme

d’histogrammes avec en abscisse le temps d’incubation (en heures), et en ordonnée la

concentration en amibes viables (en log amibes/mL). Les amibes considérées comme

viables sont celles qui apparaissaient incolores en microscopie optique, après coloration au

Bleu Trypan.

a) Sur la survie d’A. castellanii

L’étude de la croissance d’A. castellanii dans l’eau de réseau filtrée, illustrée sur la

figure 41, a montré que ce genre amibien était capable de survivre durant les 360 h de

l’expérience, sans apport de nutriments. En effet, la concentration du témoin amibes était

maintenue entre log 5,5 amibes/mL (au début de l’expérience) et log 4,4 amibes/mL (après

360 h d’incubation) (Figure 41). L’addition de salive filtrée dans le milieu de culture, quelle

que soit la concentration utilisée (2, 5 ou 10% v/v), n’a pas modifié la croissance d’A.

castellanii (Figure 41) dans les conditions expérimentales.


111

Figure 41 : Survie d’A. castellanii dans l’eau filtrée en présence de 2, 5 ou 10% (v/v) de

salive filtrée à 20°C (n=1).

b) Sur la survie de H. vermiformis

Figure 42 : Survie de H. vermiformis dans l’eau filtrée en présence de 2, 5 ou 10% (v/v) de

salive filtrée à 20°C (n=2).

L’étude de la croissance de H. vermiformis dans l’eau de réseau filtrée, illustrée sur la

figure 42, a également montré que ce genre amibien, tout comme A. castellanii, était

capable de survivre durant les 360 h de l’expérience. La concentration du témoin amibes

était maintenue entre log 5,2 amibes/mL (au début de l’expérience) et log 3,9 amibes/mL

(après 360 h d’incubation) (Figure 42). L’addition de salive filtrée dans le milieu de culture,


112

quelle que soit la concentration utilisée (2, 5 ou 10% v/v), n’a pas modifié la croissance de

H. vermiformis (Figure 42) dans les conditions expérimentales.


Tout comme pour les levures (voir Résultats et Discussion Chapitre 2 I. 5)

Influence de la température utilisée), l’influence de la température a été testée sur la

survie des amibes dans l’eau. Toujours dans le but de se rapprocher des conditions

retrouvées à l’intérieur des USD, les trois mêmes températures ont été choisies pour les

expériences : 10, 20 et 27°C. La survie des deux espèces amibiennes a été analysée dans

l’eau filtrée à ces trois températures, pendant 360 h, en présence ou non de 2% de salive

filtrée. Les résultats obtenus sont présentés sous forme d’histogrammes avec le temps

d’incubation (en heures) en abscisse et la concentration en amibes viables (en log

amibes/mL) en ordonnée ; seuls les résultats pour H. vermiformis, comparables avec ceux

obtenus pour A. castellanii, sont représentés (Figure 43).

Comme observé dans le paragraphe précédent, l’ajout de 2% de salive filtrée dans l’eau n’a

pas modifié la croissance des amibes (Figure 43). Cette observation est valable pour H.

vermiformis, mais également pour A. castellanii. De même, la température ne semble pas

avoir d’influence sur la survie des amibes ; que ce soit à 27°C (Figure 43-A), à 20°C (Figure

43-B) ou à 10°C (Figure 43-C), la concentration en amibes est restée constante, proche de

log 5 amibes/mL.


113

Figure 43 : Survie de H. vermiformis à 27°C (A), 20°C (B), et 10°C (C), dans l’eau filtrée en


- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -

114

Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures

Les amibes libres, et notamment les genres Acanthamoeba et Hartmannella, sont

capables d’héberger dans leur cytoplasme divers micro-organismes. De nombreux exemples

d’ARB sont connus et décrits dans la littérature ; le cas de L. pneumophila est le plus étudié

(Kuchta et al., 1993; Molmeret et al., 2005; Rohr et al., 1998). Les interactions amibes-

bactéries sont étudiées depuis de nombreuses années par différentes approches, tandis que

les interactions amibes-levures n’ont été envisagées que récemment. Dans l’article de

Steenbergen de 2001, par exemple, le développement d’une levure environnementale et

pathogène opportuniste pour l’Homme, Cryptococcus neoformans, a été étudié à l’intérieur

du cytoplasme d’A. castellanii. Les auteurs se sont également intéressés à l’interaction

potentielle entre cette amibe et C. albicans. Ils ont observé que C. albicans était digérée par

l’amibe, alors que C. neoformans était capable de survivre à l’étape de phagocytose et de se

développer dans le cytoplasme amibien (Steenbergen et al., 2001).

Dans le but de compléter les connaissances sur les interactions amibes-levures, dans

cette partie du travail, des cocultures, avec un rapport levures/amibes (MOI) de 1, ont été

réalisées pour les deux amibes libres : A. castellanii et H. vermiformis, et les trois espèces

de Candida. Les cocultures ont été effectuées dans de l’eau de réseau filtrée, avec ou sans

2% de salive filtrée, et incubées 360 h à 20°C. La concentration en levures est exprimée en

log UFC/mL et la concentration en amibes en log amibes/mL ; les résultats sont illustrés par

des histogrammes, présentant la concentration cellulaire en fonction du temps d’incubation.

I. Cocultures A. castellanii- Candida

Dans cette partie, des témoins amibes seules, levures seules, amibes avec salive

filtrée, ainsi que levures avec salive filtrée ont permis de confirmer les résultats du chapitre

précédent (voir Résultats et Discussion Chapitre 2 I. et II.) : dans ces

conditions, les amibes sont capables de maintenir leur concentration proche de l’inoculum

de départ, dans l’eau avec ou sans salive filtrée (Figure 44-A). En revanche les levures ne

survivent que difficilement dans l’eau durant les 360 h de l’expérience ; l’ajout de 2% de

salive filtrée (v/v) permet d’augmenter fortement leur prolifération (Figure 44-B).

Lors de la réalisation des cocultures, il a été montré que la présence de levures ne

modifiait que très peu le comportement des amibes dans l’eau, à part pour les temps 168 et

360 h d’incubation où leur concentration semblait diminuer (Figure 44-A). Toutefois ces

résultats n’ont pas pu être confirmés (n=1). D’une manière générale, les amibes libres A.


115

castellanii survivent de façon comparable dans l’eau de réseau filtrée, en présence ou non

de salive filtrée, et en présence ou non de C. albicans.

Figure 44 : Survie d’A. castellanii (A) (n=1) et de C. albicans (B) (n=2), en coculture dans

l’eau filtrée en présence de 2% (v/v) de salive filtrée, à 20°C.

En ce qui concerne l’influence de la coculture sur les levures, les résultats sont très

différents. En effet, la présence d’A. castellanii dans le milieu de culture impacte lourdement

sur la survie de C. albicans : la concentration en levures est nulle dès 24 h d’incubation en

présence d’amibes (Figure 44-B). L’ajout de 2% de salive filtrée à la coculture permet une

faible survie à 24 h, mais l’effet ne dure pas et la concentration devient nulle après 48 h.

Ces résultats confirment les travaux décrits dans l’article de 2001 qui ont montré que

A. castellanii était capable de digérer C. albicans (Steenbergen et al., 2001). Les résultats

présentés ici montrent que les levures sont digérées et tuées par A. castellanii après

seulement 24 h de coculture. La figure 44 ne présente que les résultats pour C. albicans, car

seule cette espèce fongique a été mise en présence d’A. castellanii.


116

II. Cocultures H. vermiformis-Candida

Au vue des résultats obtenus avec A. castellanii, les levures étant dégradées très

rapidement, l’étude des cocultures avec cette amibe ne correspondait pas exactement à

l’objectif de cette partie du travail : étudier les interactions amibes-levures. Une autre espèce

amibienne a donc été choisie : H. vermiformis. Cette espèce, beaucoup moins étudiée qu’A.

castellanii, est décrite comme étant moins pathogène (De jonckheere and Brown, 1998;

Kinnear et al., 2003).

1) Article : Water Research (2012) – Interactions entre H.

vermiformis et Candida spp.

Les trois espèces de Candida ont été cultivées en présence de H. vermiformis dans

l’eau filtrée, en présence ou non de 2% (v/v) de salive filtrée à 20 et 27°C : cette partie du

travail a fait l’objet d’un article actuellement en cours de publication dans la revue Water

Research. Les principaux résultats montrent que la présence d’amibes dans le milieu de

culture, tout comme la présence de salive, permet d’augmenter la survie des levures dans

l’eau. A l’inverse d’A. castellanii qui est capable de les dégrader rapidement, H. vermiformis

les aiderait à proliférer, ou du moins ne les empêcherait pas de se multiplier, durant les 360

h d’incubation, quelle que soit la température. Dans le but de visualiser les interactions entre

H. vermiformis et les trois espèces de Candida, des observations en microscopie

électronique à transmission ont été réalisées. Cette technique a permis de mettre en

évidence la capacité des amibes à interagir ainsi qu’à internaliser les levures. Cependant, la

prolifération des levures étant augmentée, cela montre que l’internalisation ne signifie pas

forcément digestion. De plus, une étude préliminaire de la survie des levures en présence de

surnageants d’une culture amibienne a montré que le contact avec les amibes ne semblait

pas nécessaire, mais était plus efficace pour favoriser la survie des levures.

Des analyses complémentaires à celles développées dans cet article ont ensuite été

réalisées : d’une part les cocultures ont été étudiées comparativement à 27, 20 et 10°C,

d’autre part la survie en présence de surnageant a été répétée (voir Résultats et

Discussion Chapitre 3 II.2) Influence de la température utilisée et 3) Influence

de la présence d’un surnageant d’amibes), et enfin les observations microscopiques ont

également été complétées (voir Résultats et Discussion Chapitre 3 III.).


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Tout comme pour les levures (voir Résultats et Discussion Chapitre 2 I. 5)

Influence de la température utilisée) ou les amibes libres (voir Résultats et

Discussion Chapitre 2 II. 3) Influence de la température utilisée), l’influence de la

température d’incubation a été étudiée sur les cocultures amibes-levures, en présence de

salive filtrée (2% v/v) (Figure 45).

Figure 45 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B) et C. parapsilosis (C), en coculture

avec H. vermiformis, dans l’eau filtrée avec 2% (v/v) de salive filtrée, à 20, 27 et 10°C (n=2).


126

Comme observé pour les levures (Figures 38, 39, 40) et les amibes libres (Figure 43),

la température n’a pas d’influence sur la survie des levures du genre Candida dans l’eau en

présence de H. vermiformis et de salive filtrée (Figure 45 A-C). Quelle que soit l’espèce

fongique et quelle que soit la température, la concentration en levures reste égale ou

supérieure à la concentration initiale (log 5 UFC/mL).

Ces résultats démontrent que les levures du genre Candida sont capables de survivre en

présence d’amibes libres telles que H. vermiformis dans l’eau de réseau filtrée, en présence

d’une faible concentration de salive (2% v/v) aussi bien à 20°C qu’à 27°C ou encore 10°C,

pendant au moins 360 h. A l’intérieur des tubulures des USD, où la température moyenne

est comprise entre 20 et 30°C, les levures du genre Candida pourraient donc proliférer dans

le cas d’un reflux de salive ou encore d’une contamination de l’eau par des amibes libres. De

plus, même dans un cas plus extrême de température (10°C), la présence d’amibes libres

et/ou de salive permet de maintenir la croissance de Candida spp.

3) Influence de la présence d’un surnageant d’amibes libres

Dans le cadre de l’article rédigé pour le journal Water Research, une étude

préliminaire de la survie de C. albicans en présence d’un surnageant de culture de H.

vermiformis a été réalisée (voir Résultats et Discussion Chapitre 3 II. 1)

Article : Water Research (2012) – Interactions entre H. vermiformis et Candida spp.).

Celle-ci suggérait que C. albicans était capable de proliférer aussi bien en présence de

surnageant de culture amibienne qu’en présence de H. vermiformis : le contact avec les

amibes ne semblait donc pas nécessaire pour augmenter la survie fongique ; la présence de

débris amibiens ou encore de métabolites sécrétés par les amibes, contenus dans le

surnageant, permettait donc également une survie importante des levures dans l’eau,

comparé au témoin.

Afin de compléter et de vérifier ces résultats, des analyses supplémentaires ont été

réalisées : la survie des trois espèces de Candida en présence de surnageant de culture

amibienne a été étudiée sur 360 h d’incubation à 20°C et répétée au moins deux fois (Figure

46). Les résultats obtenus précédemment ont été confirmés : la croissance des levures,

quelle que soit l’espèce étudiée, est fortement favorisée dans l’eau contenant du surnageant

de culture amibienne. Cette augmentation de la survie est également observée en présence

d’amibes.


127

Ces résultats montrent que H. vermiformis, par contact direct et phagocytose, ou encore par

sécrétion de métabolites, est capable de favoriser la survie de Candida spp. dans l’eau

filtrée.

Figure 46 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B) et C. parapsilosis (C), en présence de

surnageant de culture amibienne ou de H. vermiformis, dans l’eau filtrée, à 20°C (n=2).

III. Observations microscopiques

Dans le cadre de la rédaction de l’article, les cocultures amibes-levures ont été

incubées 72 h à 20°C afin de visualiser les interactions par MET (voir Résultats et


128

Discussion Chapitre 3 II. 1) Article : Water Research (2012) – Interactions entre

H. vermiformis et Candida spp.). Ce temps d’incubation avait été choisi arbitrairement

pour illustrer les cocultures à un temps moyen et afin d’obtenir des quantités suffisantes de

micro-organismes observables. Ces observations microscopiques ont par la suite été

complétées, d’une part par d’autres expériences en MET avec des temps d’incubation de 24

h et de 168 h, à 20°C (Figure 47). D’autre part, en réalisant des observations des micro-

organismes en cocultures et adhérés à une surface PVC (Figure 49), tel qu’ils pourraient

l’être à l’intérieur des tubulures d’USD, après différents temps d’incubation à 20°C (de 3 à 42

jours) et observation au MEB (Figure 50).

1) Microscopie électronique à transmission

a) Observations des cocultures en suspension

Aux différents temps d’incubation (24, 72 et 168 h), les levures ont été observées sous

forme de blastospores, dont certaines se trouvaient en bourgeonnement (Figure 47-A) ; ce

détail montre bien que la présence de salive et/ou d’amibes libres favorise ou du moins

n’inhibe pas la prolifération de Candida. De même, H. vermiformis a été observée sous

forme de kystes (Figure 47-B) mais également de trophozoïtes (Figure 47-C, D, E et F),

quelle que soit le temps d’incubation, ce qui montre que les amibes libres survivent

naturellement dans les conditions de l’expérience.

Comme décrit dans l’article pour le cas d’une observation après 72 h d’incubation (voir

Résultats et Discussion Chapitre 3 II. 1) Article : Water Research (2012) –

Interactions entre H. vermiformis et Candida spp.), après 24 h ou même 168 h

d’incubation des cocultures, H. vermiformis est capable d’interagir (Figure 47-C et E) et

d’internaliser les levures du genre Candida (Figure 47-D et F). De plus, après 168 h, de

nombreux micro-organismes, provenant soit de l’eau de réseau, soit de la salive, soit du

cytoplasme des amibes (ARB ou endosymbiotes libérés), ont pu être observés dans le

milieu à proximité des levures et des amibes libres (Figure 47-E). Cependant, la présence de

ces micro-organismes, représentant une source potentielle de nutriments pour les

prédateurs que sont les amibes, n’empêche pas H. vermiformis d’interagir et d’internaliser

les levures (Figure 47-C, D, E et F).


129

Figure 47 : Observations en MET de C. albicans (A) et de H. vermiformis (B) en coculture

dans de l’eau filtrée avec 2% de salive filtrée (v/v) après 24 h (C-D) et 168 h (E-F)

d’incubation à 20°C (n=2).

b) Marquage immunocytochimique

Afin de savoir si, en plus de pouvoir les héberger dans leur cytoplasme, les amibes

sont capables de digérer des micro-organismes de grande taille tels que les levures, un

marquage immunocytochimique des levures a été réalisé. Dans l’article, les résultats

obtenus par cette expérience ont été décrits, mais non illustrés (voir Résultats et

Discussion Chapitre 3 II. 1) Article : Water Research (2012) – Interactions entre

H. vermiformis et Candida spp.). Sur la figure 48 les billes d’or colloïdal se retrouvent

localisées sur les levures (Figure 48-A et B), principalement au niveau du cytoplasme, et par


130

endroits au niveau de la paroi. La cible de l’anticorps primaire utilisé (3H8) est cependant

intrapariétale, c’est-à-dire à l‘intérieur de la paroi fongique, et les billes d’or devraient donc

se retrouver principalement dans la paroi (Marcilla et al., 1999). L’explication pourrait être la

température d’incubation utilisée pour l’expérience (20°C) ; la molécule ciblée par l’anticorps,

intrapariétale dans des conditions de culture plus classiques (37°C par exemple), n’est peut-

être pas correctement transportée à la paroi dans les conditions expérimentales et se

retrouverait ainsi dans le cytoplasme. Toutefois, le marquage réalisé reste spécifique des

levures du genre Candida ; le marquage est bien ciblé sur les levures et non pas diffus dans

le milieu de culture. De ce fait, les résultats obtenus permettent bien d’affirmer que les

débris cellulaires, visualisés sur la figure 48-C et zoomés sur la figure 48-D, sont des levures

en cours de digestion dans une vacuole de H. vermiformis.

Les amibes libres H. vermiformis se nourrissent donc de levures dans les conditions

expérimentales utilisées, sans toutefois détruire la totalité de la population fongique, puisque

la prolifération de Candida spp. est augmentée en présence d’amibes libres.

Figure 48 : Observations en MET de C. albicans et de H. vermiformis en coculture dans de

l’eau filtrée avec 2% de salive filtrée (v/v) après 72 h d’incubation à 20°C et marquage

immunocytochimique (A-D) (n=2).


131

2) Microscopie électronique à balayage

Les cocultures amibes-levures ont ensuite été réalisées sur des coupons de PVC,

dans l’eau de réseau filtrée avec 10% de salive filtrée (v/v) ; une concentration plus forte en

salive, et donc en nutriments, a été choisie pour les expériences de MEB afin de faciliter

l’adhérence des micro-organismes à la surface PVC, tout en restant dans des conditions

pouvant être retrouvées dans les USD. D’une part les coupons de PVC, incubés seuls dans

l’eau de réseau filtrée, 72 h à 20°C, ont été observés en MEB (Figure 49) : ces coupons

apparaissent comme étant des surfaces très rugueuses, très irrégulières (Figure 49-A) et de

ce fait propices à l’adhérence microbienne. De plus, des cristaux de sels minéraux,

probablement de calcium et provenant de l’eau de réseau, ont été retrouvés déposés sur les

surfaces PVC (Figure 49-B) ; de tels dépôts favorisent également l’adhérence.

Figure 49 : Observations en MEB de coupons de PVC incubés dans de l’eau filtrée, après 72

h d’incubation à 20°C (A-B) (n=1).

C. albicans et H. vermiformis ont été cocultivées sur ces coupons de PVC, dans l’eau

avec 2% de salive filtrée (v/v), à 20°C pendant 3, 15 et 42 jours avant d’être observées en

MEB (Figure 50).

Après 3 jours d’incubation, quelques amibes et quelques levures étaient visibles, adhérées à

la surface PVC (Figure 50-A). Des interactions entre ces micro-organismes, comme observé

en MET (voir Résultats et Discussion Chapitre 3 III. 1) Microscopie

électronique à transmission), ont été observées (Figure 50-B) : sur cette image, une

levure sous forme de blastospore est englobée par une amibe (trophozoïte). Après 15 jours

d’incubation, les levures se sont multipliées, de nombreuses blastospores sont adhérées au

PVC, certaines sont même en cours de bourgeonnement (Figure 50-C). La surface du


132

coupon étant déjà très irrégulière (Figure 49-A), les « filaments » observés autour des micro-

organismes sont soit des rugosités du PVC, soit de la matrice polysaccharidique.

Figure 50 : Observations en MEB de C. albicans et de H. vermiformis en coculture sur

coupons de PVC, dans de l’eau filtrée avec 2% de salive filtrée (v/v) après 3 jours (A-B), 15

jours (C-D) et 42 jours (E-F) d’incubation à 20°C (n=1).

Dans le biofilm fongique nouvellement formé, de nombreuses bactéries sont visibles (Figure

50-C) ; ces bactéries proviennent soit de l’eau de réseau ou de la salive et auraient résisté à

l’étape de filtration (mais c’est peu probable), soit du cytoplasme des amibes (dans le cas

d’endosymbiotes ou d’ARB libérés). Tout comme après 3 jours d’incubation, des interactions

amibes-levures sont visibles (Figure 50-D) : des blastospores se retrouvent sur un amas de

trophozoïtes, dont un, ayant une extrémité allongée, semble avoir formé un pseudopode.


133

Enfin après 42 jours d’incubation à 20°C, le biofilm microbien s’est développé, une matrice

extracellulaire épaisse est visible, ainsi que de nombreuses levures, toujours sous forme de

blastospores et en cours de bourgeonnement (ce qui montre que les conditions de culture

sont assez favorables pour leur croissance) (Figure 50-E et F). En revanche, les amibes, qui

se retrouvent agglomérées avec les levures dans le biofilm, ont une morphologie différente.

Leur forme est plus arrondie et leur surface semble ridée, plissée (Figure 50-E et F), ce qui

correspond certainement à des amibes enkystées.

IV. Cytométrie en flux

La cytométrie en flux est une technique permettant d’analyser des cellules en

suspension, en fonction de divers paramètres dont la taille et la granularité. L’utilisation de

fluorochromes vitaux, tels que le Syto 9 ou l’IP, permet d’obtenir une proportion de cellules

vivantes et de cellules perméabilisées. Cette technique a été envisagée pour l’analyse des

cocultures, afin de remplacer les techniques classiques de microbiologie, plus lourdes

(dénombrement des UFC). Les résultats présentés ici ne sont qu’une étude préliminaire de

faisabilité de cette technique appliquée à des populations microbiennes complexes (mélange

de levures, de trophozoïtes et de kystes). Dans un premier temps, les outils d’analyse du

logiciel ont été élaborés par analyses des témoins amibes et levures (avec salive filtrée 5%

v/v). Cette étape a permis de localiser sur les graphiques les fenêtres d’analyse

correspondant aux différentes populations cellulaires (Figures 51, 52 et 53). Ainsi, cinq

fenêtres ont été déterminées : la fenêtre P1 correspondant à la population totale contenue

dans l’échantillon, P2 représentant les levures, P3 et P4 les amibes et P7 correspondant aux

cellules marquées à l’IP, et donc perméabilisées (considérées comme non viables) (Boulos

et al., 1999 ; Mogoa et al., 2010).

Les figures 51, 52 et 53 illustrent les résultats obtenus. Le graphique A montre

l’enregistrement des données SSC et FSC : chaque point représente une cellule

enregistrée, toutes les cellules étant réparties sur le graphique selon leur taille (FSC, en

abscisse) et leur granularité (SSC, en ordonnée). Ainsi, par exemple, des cellules de grande

taille et de faible granularité se situent vers le bas, à droite du graphique, et des cellules de

petite taille avec une forte granularité sont vers le haut, à gauche du graphique. Le

graphique B indique la fluorescence émise par l’IP : les cellules non marquées à l’IP (avec

une membrane intacte) sont à gauche, et les cellules IP+ à droite (fenêtre P7).

Lors des premiers essais, un double marquage avec l’IP et le Syto 9 avait été réalisé,

mais aucun résultat exploitable n’avait été obtenu : les spectres d’émission des deux


134

fluorochromes se chevauchant, l’interprétation des fluorescences verte et rouge des cellules

était impossible. Par la suite, seul l’IP a été utilisé afin d’obtenir la proportion de cellules non

perméabilisées.

1) Analyse des suspensions de levures

La suspension témoin levures (C. albicans) a été analysée par cytométrie en flux après

72 h d’incubation à 20°C dans de l’eau filtrée en présence de 5% de salive filtrée (v/v). Ce

témoin a permis de localiser les fenêtres P1 et P2 (Figure 51-A). Sur ce graphique, deux

populations sont visibles : une population ayant une petite taille et une faible granularité, et

une autre population, plus nombreuse, avec une taille plus importante et une faible

granularité. Les cellules de plus petite taille, moins nombreuses, correspondent certainement

à des débris contenus dans la salive. La population choisie pour représenter les levures (P2)

comptabilise environ 83% des cellules enregistrées par le cytomètre (Figure 51-A).

Le deuxième graphique montre que la grande majorité des levures ont survécu après

72 h d’incubation dans l’eau à 20°C en présence d’une faible concentration de salive : en

effet environ 89% des cellules sont non marquées à l’IP (Figure 51-B).

Ces résultats sont cohérents avec ceux précédemment décrits, obtenus par suivi de la

viabilité des levures en suspension et dénombrement des UFC (voir Résultats et

Discussion Chapitre 2 I.).


135

Figure 51 : Résultats de cytométrie en flux (A-B) d’une suspension de C. albicans après 72

h d’incubation dans de l’eau filtrée avec 5% de salive filtrée (v/v) à 20°C (n=2).

2) Analyse des suspensions d’amibes libres

Un témoin amibes, cultivé dans les mêmes conditions que le témoin levures, a ensuite

été analysé par cytométrie en flux et a permis de confirmer l’emplacement de la fenêtre P1,

ainsi que de localiser les fenêtres d’analyse P3 et P4 (Figure 52-A) : ces fenêtres

correspondent à des populations présentes dans chaque échantillon d’amibes étudié. La

population P3 possède une taille assez faible et une granularité élevée et variable. La

population P4 possède une taille beaucoup plus importante et une granularité assez faible.

Les données trouvées dans la littérature concernant la taille des amibes du genre

Hartmannella (Smirnov and Michel, 1999), ainsi que les différentes observations

microscopiques qui ont pu être faites au cours de ce travail, suggèrent que la population

ayant la plus petite taille (P3) correspondait aux amibes sous forme kystes, et la population

de plus grande taille (P4) correspondait aux amibes sous forme trophozoïtes. D’une manière


136

générale, la suspension d’amibes libres est beaucoup plus hétérogène que celle des

levures : les points représentant les cellules enregistrées sont beaucoup plus éparpillés sur

le graphique (Figure 52-A). Les débris venant de la salive, visualisés dans la suspension de

levures (Figure 51-A), sont ici inclus dans la population de kystes (P3), ce qui entraîne un

premier biais dans les résultats. Malgré tout, l’analyse du graphique permet de dire qu’après

72 h d’incubation à 20°C, environ 42% des amibes sont enkystées, et environ 34% sont

sous forme trophozoïtes (Figure 52-A).

L’analyse de la fluorescence émise par l’IP (Figure 52-B) donne un résultat assez

inattendu : seulement 19% des amibes libres n’auraient pas intégré l’IP, ce qui signifie

qu’environ 81% des amibes auraient une membrane perméabilisée. Dans un article de 2010,

des suspensions d’Acanthamoeba ont été analysées par cytométrie en flux, et 25% des

cellules étaient IP+ après 72 h d’incubation dans du milieu PYG (Mogoa et al., 2010). Cette

différence peut s’expliquer par le fait que pour l’étude décrite dans cet article, les amibes ont

été incubées dans un milieu riche, donc plus propice à leur survie, expliquant un meilleur

taux de cellules non perméabilisées. H. vermiformis, en culture dans l’eau filtrée, n’est pas

dans un milieu optimal pour sa croissance et survit assez mal. Cependant, les résultats

décrits dans le chapitre précédent (voir Résultats et Discussion Chapitre 2 II.)

montraient que les amibes étaient capables de survivre pendant 360 h en présence de

salive. Les résultats obtenus ici par cytométrie en flux signifieraient que seules 19% des

amibes survivent après 72 h d’incubation (Figure 52-B). Toutefois, la population

majoritairement retrouvée en P7 (IP+) est la population P3 correspondant aux kystes, alors

qu’une grande partie des trophozoïtes (en violet) n’est pas marquée à l’IP. Cela pourrait

signifier que le marquage à l’IP n’est pas significatif des amibes perméabilisées, et

marquerait tous les kystes, viables ou non ; ce qui représenterait un autre biais dans les

résultats.


137

Figure 52 : Résultats de cytométrie en flux (A-B) d’une suspension de H. vermiformis après

72 h d’incubation dans de l’eau filtrée avec 5% de salive filtrée (v/v) à 20°C (n=1).

3) Analyse des cocultures

Enfin, les paramètres d’interprétation des résultats ayant été fixés, les cocultures ont

pu être analysées par cytométrie en flux (Figure 53). Ainsi, d’après les fenêtres P2, P3 et P4

déterminées à l’aide des témoins, après 72 h d’incubation des cocultures environ 22% des

amibes seraient sous forme trophozoïtes et 38% sous forme kystes ; 55% de la population

totale étant représentées par les levures (Figure 53-A).

Cependant, les fenêtres P2 et P4 se superposent (Figure 53-A) : les levures et les

trophozoïtes de H. vermiformis ont une morphologie assez proche, et les cellules ne peuvent

pas être correctement différenciées par cytométrie en flux. De plus, le marquage à l’IP

n’étant pas interprétable de façon satisfaisante, seule la fluorescence des levures a été

observée (Figure 53-B) : 80% des levures ne sont pas marquées à l’IP.


138

Ces résultats confirment ceux obtenus précédemment par analyse de la viabilité en

coculture et dénombrement des UFC (voir Résultats et Discussion Chapitre 3

II.).

Figure 53 : Résultats de cytométrie en flux (A-B) d’une suspension de C. albicans et de H.

vermiformis en coculture, après 72 h d’incubation dans de l’eau filtrée avec 5% de salive

filtrée (v/v) à 20°C (n=1).

La cytométrie en flux permet d’obtenir des résultats reproductibles mais complexes à

analyser, surtout dans les conditions expérimentales de ce travail (présence de débris de

salive, cocultures de cellules à morphologie proche, fluorescence plus ou moins spécifique

de l’IP).

La méthode ainsi mise au point a montré trop de limites pour être utilisée pour l’analyse des

cocultures amibes-levures, et a donc abandonnée pour la suite des travaux au profit de la

microscopie et des techniques plus classiques de culture. Son utilisation aurait nécessité

des mises au point complémentaires sans toutefois garantir des résultats exploitables, étant

donné la complexité des populations analysées.

- Résultats et discussion – Chapitre 4 : Les traitements chimiques -

139

Chapitre 4 : Les traitements chimiques

Depuis quelques années, la désinfection des USD fait l’objet de nombreuses études,

et différentes méthodes ont été mises au point (O’Donnell et al., 2011) : la méthode la plus

simple et la moins onéreuse reste la purge des tubulures. Un simple rinçage des tuyaux

avec une eau distillée a été montré comme diminuant la charge microbienne de l’eau

circulant dans l’USD, mais seulement de façon transitoire, et surtout n’ayant aucun effet

satisfaisant sur le biofilm résident à l’intérieur du circuit d’eau de l’USD (Cobb et al., 2002).

De nombreux traitements chimiques, périodiques ou continu, ont été élaborés et proposés

par différents fournisseurs d’USD. Tous les produits et les protocoles proposés n’ont pas ou

peu été étudiés en termes d’efficacité. De même, peu de recherches ont été réalisées

concernant les problèmes de corrosion ainsi que les effets à long terme (tels que la

recolonisation par des micro-organismes) sur le circuit d’eau des USD. De plus, une grande

variabilité des résultats obtenus est observée selon la dose du produit utilisé, les micro-

organismes étudiés, le temps de traitement, ou encore la présence de biofilm et de matières

organiques qui peuvent dénaturer le produit et ainsi diminuer son efficacité (Fiehn and

Henriksen, 1988; Karpay et al., 1999).

Trois désinfectants, communément utilisés dans le traitement des réseaux d’eau et

retrouvés pour la désinfection des USD ont été choisis pour ce travail : le chlore, le H2O2 et

l’Oxygenal 6©. Ces trois produits ont déjà été étudiés pour le traitement des USD, mais dans

des conditions différentes de celles utilisées dans cette étude expérimentale (Szymanska,

2006a; Szymanska, 2006b; Zanetti et al., 2003). La survie après mise en présence avec ces

désinfectants a été étudiée pour trois espèces de Candida (C. albicans, C. glabrata et C.

parapsilosis) et pour l’amibe libre H. vermiformis en mono-culture ou coculture dans l’eau de

réseau filtrée additionnée de 2% de salive filtrée (v/v).

I. Survie des microorganismes en mono-culture – Article en cours de soumission (2012)

La survie des micro-organismes choisis a dans un premier temps été étudiée après 1,

24, 48, 72, 168 ou 360 h d’incubation à 20 ou 27°C dans de l’eau de réseau filtrée

additionnée de 2% de salive filtrée (v/v), et 15 min après la mise en présence avec

différentes doses des trois désinfectants choisis : 3 à 118 ppm pour le chlore, 0,07 à 0,9%

pour le H2O2 et 0,05 à 2% pour l’Oxygenal 6©. Les résultats obtenus ont fait l’objet de la

rédaction d’un article récemment soumis pour publication.


140

Les principaux résultats ont montré que les amibes libres résistaient assez bien aux

trois désinfectants, certainement grâce à leur capacité d’enkystement. En ce qui concerne

les levures, le chlore n’était efficace qu’avec de fortes doses (> 26 ppm). Dans les conditions

testées, le H2O2 ne présentait aucune action antifongique significative. Enfin, l’Oxygenal 6©

semblait être le plus efficace contre Candida spp. : dès 0,05% et quelle que soit la dose

utilisée, une forte diminution de la viabilité des levures a été observée. Seule l’espèce C.

parapsilosis, déjà notée dans les chapitres précédents comme étant plus résistante que les

deux autres espèces, était capable de mieux résister à la présence d’Oxygenal 6©.


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II. Survie des microorganismes en cocultures

Dans le chapitre précédent sur les cocultures amibes-levures, les résultats obtenus ont

permis de constater que C. albicans était capable d’interagir avec H. vermiformis : les

levures ont été retrouvées à l’intérieur du cytoplasme des amibes libres (voir Résultats

et Discussion Chapitre 3 II.). Le genre Hartmannella est connu comme ayant la

capacité d’héberger différents micro-organismes dans son cytoplasme (Greub and Raoult,

2004; Kuchta et al., 1993; Rohr et al., 1998), et surtout comme pouvant les protéger contre

diverses agressions extérieures telles que des traitements chimiques. Ainsi, dans une étude

de 2005, les auteurs ont montré que L. pneumophila était plus résistante au chlore dans un

milieu contenant des amibes libres : une réduction de 2,09 log bactéries/mL était observée

en absence d’amibes libres et de seulement 0,74 log bactéries/mL en présence de H.

vermiformis (Donlan et al., 2005).

Dans cette dernière partie du travail, l’activité antimicrobienne des trois désinfectants

sélectionnés (chlore, H2O2 et Oxygenal 6©), en utilisant les mêmes doses que

précédemment, a été testée sur C. albicans en coculture avec H. vermiformis, dans l’eau

filtrée et additionnée de 2% de salive filtrée (v/v), à 20°C. Il s’agit d’une étude préliminaire

qui nécessiterait d’être répétée afin de confirmer les hypothèses émises ci-après.

1) Viabilité des levures

La figure 54 illustre la survie des levures 15 min après traitement au chlore (Figure 54-

A), au peroxyde d’hydrogène (Figure 54-B) ou à l’Oxygenal 6© (Figure 54-C) ; les

graphiques montrent la concentration en levures cultivables sur géloses (en log UFC/mL) en

fonction du temps d’incubation avant le traitement chimique. En comparant ces résultats

avec ceux obtenus pour les levures en mono-culture (voir Résultats et Discussion

Chapitre 4 I.), des observations différentes peuvent être faites pour chacun des

traitements.

Des doses de 3 et 6 ppm de chlore n’ont pas ou peu d’effet sur C. albicans, une dose de 12

ppm a une activité variable au cours du temps et une efficacité moins forte pour des temps

d’incubation plus longs (Figure 54-A). Seules les concentrations ≥ 26 ppm ont une activité

antifongique quasi-totale quelque soit le temps préalable d’incubation des micro-organismes

dans l’eau : ces résultats sont similaires à ceux obtenus pour les levures en mono-culture.

Dans les conditions expérimentales, la présence des amibes libres n’a donc pas d’influence

sur la sensibilité de C. albicans vis-à-vis du chlore.


158

Figure 54 : Survie de C. albicans en coculture avec H. vermiformis, dans l’eau filtrée, à 20°C

et après 15 min de mise en présence de chlore (A), d’H2O2 (B) ou d’Oxygenal 6© (C) (n=1).

De même que pour le traitement au chlore, 15 min après la mise en présence avec

différentes doses de H2O2, les levures survivent assez bien, qu’elles aient été cultivées en

présence ou non d’amibes libres. La concentration en levures cultivables était de log 4

UFC/mL en mono-culture, alors qu’en coculture avec H. vermiformis, cette concentration est

d’environ log 3 UFC/mL, quelle que soit la dose de H2O2 utilisée et quel que soit le temps

d’incubation (Figure 54-B) ; cette sensibilité légèrement augmentée en présence d’amibes

libres reste à confirmer (n=1).


159

En revanche, des résultats bien différents ont été obtenus pour le traitement à l’Oxygenal 6©

en présence et en absence d’amibes libres. En mono-culture, C. albicans ne montrait qu’une

faible survie à partir de 48 h d’incubation et seulement pour l’utilisation de faibles doses de

désinfectant (≤ 0,1%) ; moins de 1 log UFC/mL ne survivaient 15 min après la mise en

présence avec des doses ≥ 0,2%. La présence d’amibes libres dans le milieu aiderait les

levures à résister à l’Oxygenal 6© : en effet, après seulement 24 h d’incubation avec H.

vermiformis, C. albicans est capable de résister aux plus fortes doses de désinfectant

testées dans ce travail (1% voire 2%) (Figure 54-C). De plus, cette résistance est visible

durant toute l’étude, même après 360 h d’incubation ; les levures sont capables de maintenir

leur concentration à environ log 3 UFC/mL (Figure 54-C).

2) Viabilité des amibes libres

La figure 55 montre la survie de H. vermiformis 15 min après traitement au chlore

(Figure 55-A), au peroxyde d’hydrogène (Figure 55-B) ou à l’Oxygenal 6© (Figure 55-C) ; les

graphiques présentent la concentration en amibes libres (en log amibes/mL) en fonction du

temps d’incubation avant le traitement chimique. En comparant ces résultats avec ceux

obtenus pour les amibes en conditions de mono-culture (voir Résultats et Discussion

Chapitre 4 I.), il semblerait que H. vermiformis résiste mieux aux désinfectants en

présence de levures.

D’une part, sur les trois graphiques le témoin (amibes seules, non traitées) a une

concentration constante (environ log 5 amibes/mL) au cours du temps (Figure 55). Les

doses de chlore < 12 ppm n’ont que peu d’effet sur les amibes, et seules les doses ≥ 62

ppm sont efficaces contre H. vermiformis après des temps d’incubation longs (168 et 360 h)

(Figure 55-A). En mono-culture, une faible concentration d’amibes survivantes était notée

tout au long de l’étude, quelle que soit la dose de chlore utilisée. En coculture, les amibes

libres survivent à plus forte concentration mais à des doses plus faibles de chlore ; la dose

de 118 ppm les éradiquent dès 24h d’incubation en coculture (Figure 55-A).

L’efficacité du peroxyde d’hydrogène a été modérée sur les amibes libres en mono-culture ;

une concentration d’environ 2 logs amibes/mL subsistant durant les 360 h de l’étude et ce

quelle que soit la dose de H2O2 utilisée. En coculture avec C. albicans, la concentration en

amibes est restée constante (entre log 5 et 6 amibes/mL) quels que soient la dose du

traitement et le temps d’incubation (Figure 55-B) ; la présence de levures semble permettre

à H. vermiformis de mieux résister à l’H2O2. Cependant, cette expérience n’ayant pu être

réalisée qu’une seule fois (n=1), cette hypothèse reste à confirmer.


160

Figure 55 : Survie de H. vermiformis en coculture avec C. albicans, dans l’eau filtrée, à 20°C

et après 15 min de mise en présence de chlore (A), d’H2O2 (B) ou d’Oxygenal 6© (C) (n=1).

De même que pour le chlore, seules les fortes doses d’Oxygenal 6© (1 et 2%) montrent un

effet sur la viabilité des amibes libres (Figure 55-C). La présence des levures favorise la

résistance des amibes ; H. vermiformis survit mieux, à plus forte concentration mais pour

des doses plus faibles en désinfectants.

161

Conclusion et

perspectives

- Conclusion et perspectives -

162

Durant ce travail de recherche, quatre axes principaux ont été abordés, en lien avec

les conditions de développement microbien retrouvées au sein des units de soins dentaires :

la composition de la salive, la survie des levures du genre Candida dans l’eau de réseau

filtrée, les interactions amibes libres-levures et l’activité antimicrobienne de traitements

chimiques contre ces micro-organismes.

Dans une première partie, nous avons pu amorcer une analyse qualitative des

molécules composant la salive. Les résultats ont montré que la salive ne contenait que peu

de glucides et, à l’inverse, de nombreuses protéines.

Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés à l’influence de la présence

de salive sur la survie de différentes espèces de Candida et d’amibes libres dans l’eau.

D’une part nous avons pu constater que les levures survivaient difficilement dans l’eau de

réseau filtrée, mais que la présence de traces de salive (dés 2% v/v) permettait une

prolifération fongique potentiellement élevée. Un effet espèce-dépendant a également était

démontré ; C. parapsilosis est une espèce plus résistante que C. glabrata ou C. albicans.

D’autre part, nous avons confirmé que les amibes libres testées, Acanthamoeba castellanii

et Hartmannella vermiformis, étaient capables de survivre dans l’eau, et nous avons montré

que l’ajout de salive ne modifiait pas leur viabilité.

En se plaçant dans le contexte de la contamination des USD, les amibes libres et les

levures du genre Candida sont susceptibles de cohabiter dans l’eau de réseau circulant

dans les tubulures. Nous avons donc réalisé des cocultures entre amibes libres et levures,

afin d’observer d’éventuelles interactions entre ces espèces microbiennes. Ainsi, nous avons

montré que A. castellanii était capable d’inhiber la croissance de C. albicans, dés 24 h de

coculture, probablement en les digérant par phagocytose. En revanche, nous avons pu

mettre en évidence des interactions plus favorables entre H. vermiformis et les trois espèces

de Candida. Les résultats de dénombrement d’UFC sur géloses ont montré une prolifération

des levures augmentée en présence d’amibes libres, et les résultats de microscopie

électronique ont permis de visualiser une internalisation des levures par H. vermiformis.

Cette internalisation était parfois suivie d’une digestion des levures : certaines étaient

retrouvées fragmentées à l’intérieur de l’amibe. Mais la plupart des Candida apparaissaient

intactes à l’intérieur de vacuoles. De plus, nous avons testé l’effet d’un surnageant de

culture amibienne sur la survie des levures, et observé que la prolifération fongique était

augmentée aussi bien en présence d’amibes libres qu’en présence de leur surnageant de

culture ; H. vermiformis, par contact direct ou par sécrétion de métabolites serait donc

capable de favoriser la prolifération de Candida dans l’eau de réseau filtrée.

Enfin, dans une dernière partie, toujours en se plaçant dans des conditions proches de

celles retrouvées dans les USD, nous avons testé l’efficacité de trois traitements chimiques


163

(le chlore, le H2O2 et l’Oxygenal 6©) sur les différentes espèces de Candida choisies pour ce

projet, et sur H. vermiformis. Les résultats ont montré des activités antimicrobiennes

différentes pour chaque produit utilisé : le chlore était très efficace contre les levures et les

amibes libres, mais seulement à fortes doses (> 26 ppm) ; le H2O2 ne montrait que peu

d’effet sur les micro-organismes dans nos conditions expérimentales ; et enfin l’Oxygenal 6©

s’est avéré être le plus efficace, avec une forte inhibition de la croissance des levures même

à faible dose (0,05%).

Ces résultats viennent compléter les connaissances déjà acquises en ce qui concerne

le risque infectieux lié à l’eau des USD et la décontamination du circuit d’eau : le reflux de

salive et de micro-organismes oraux peut engendrer le développement, à l’intérieur des

tubulures, de germes potentiellement pathogènes pour l’Homme. La salive, favorisant la

survie des levures du genre Candida dans l’eau, peut également permettre la prolifération

d’autres micro-organismes, en particulier d’origine orale, et le développement de biofilm

dans le réseau d’eau de l’USD. De plus, certaines amibes libres, comme H. vermiformis,

provenant du réseau d’eau, peuvent héberger certains micro-organismes, les aider à

survivre dans un milieu pauvre tel que l’eau de l’USD et même les protéger contre des

traitements physiques ou chimiques. Ces observations montrent l’importance de la

surveillance de la contamination de l’eau des USD et surtout l’utilisation de méthodes de

prévention efficaces contre ces contaminations. Enfin, les résultats obtenus pour l’activité

antimicrobienne de désinfectants chimiques contre Candida spp. et H. vermiformis

confirment la variabilité d’efficacité de tels traitements selon les conditions

environnementales (température, milieu, micro-organismes présents, développement de

biofilm), et soulignent la nécessité d’utiliser plusieurs méthodes combinées pour la

désinfection et l’entretien des USD ; un traitement chimique seul ne suffit pas, et doit être

complété d’un traitement physique tel que la purge des tubulures.

Certaines études présentées dans ce mémoire sont préliminaires et ne permettent de

ce fait qu’une analyse approchée. Des travaux complémentaires pourraient donc être

envisagés : portant d’une part sur les conditions expérimentales utilisées, toujours dans le

but de se rapprocher au mieux des conditions de l’USD, et d’autre part sur l’analyse de

l’activité antimicrobienne des désinfectants.

Dans ce travail, les micro-organismes ont été étudiés cultivés dans de l’eau de réseau

filtrée, il pourrait être intéressant de faire ces expériences dans de l’eau directement

prélevée d’USD. De même, les expériences pourraient être élargies à d’autres espèces de

Candida déjà isolées d’USD, ou encore d’autres espèces d’amibes libres du genre

Hartmannella. De plus, les cocultures amibes-levures n’ont été faites que pour C. albicans.

Or, C. glabrata et C. parapsilosis ont montré un comportement différent, notamment au


164

niveau de leur consommation en nutriments ou encore de leur résistance aux traitements, et

pourraient réagir différemment en coculture avec H. vermiformis.

Ensuite, des analyses supplémentaires pourraient être envisagées pour continuer

l’identification des molécules de salive favorisant la survie des levures dans l’eau. Pour cela,

les résultats de GC-MS pourraient être exploités au niveau quantitatif : les aires des pics,

calculées par rapport à l’aire totale du chromatogramme, donneraient une proportion relative

(semi-quantitatif) pour les différentes molécules identifiées. Une autre possibilité serait de

réaliser des gammes d’étalonnage pour chaque molécule, mais la contrainte majeure pour

une telle analyse est de disposer d’étalons purs pour chacun des composés. Une analyse

des molécules de la salive, non pas fragmentées comme en GC-MS, mais entières en

chromatographie liquide, couplée à une spectrométrie de masse ou encore une analyse UV,

pourrait permettre d’identifier les composants de la salive. Les protéines pourraient être

séquencées, les glucides et les lipides dosés par méthodes colorimétriques par exemple. De

plus, la grande majorité des composants de la salive étant protéiques, des analyses plus

ciblées sur les protéines pourraient permettre d’identifier plus précisément quelle(s)

molécule(s) permet(tent) la survie des levures dans l’eau. Ainsi les protéines pourraient être

fractionnées par électrophorèse en deux ou trois dimensions, par exemple SDS-PAGE, et

les différentes fractions pourraient être testées indépendamment sur la survie des levures

(Cannon et al., 1995b).

Les expériences de survie des micro-organismes dans l’eau en mono-culture ou

coculture ont été faites en microplaques, directement sur le revêtement polystyrène des

puits. Les études étant conduites généralement pendant 360 h, les micro-organismes

n’étaient certainement pas homogènes, et se trouvaient probablement pour certains à l’état

planctonique et pour d’autres à l’état sessile ; dans le cas de ces durées prolongées, un

biofilm a donc pu initier son développement. Il serait de ce fait intéressant de comparer les

résultats obtenus dans les conditions « polystyrène » avec ceux obtenus en utilisant par

exemple des surfaces PVC (coupons), et de mieux analyser l’état et l’organisation des

micro-organismes dans ces conditions respectives. Ainsi, la survie dans l’eau, l’influence de

la salive et même l’efficacité des traitements pourraient être testés en condition plus proches

des USD.

Enfin, les expériences en microplaques (sur revêtement polystyrène ou sur coupons

PVC) représentent des conditions statiques ; contrairement aux conditions retrouvées dans

les USD, les micro-organismes sont cultivés dans une eau non renouvelée, et sans

agitation. Réaliser ces expériences avec un modèle dynamique, mimant le fonctionnement

de l’USD (circulation intermittente de l’eau, longues périodes de stagnation, …) permettrait

de mieux comprendre ce qui peut se passer à l’intérieur de l’USD. L’utilisation d’un CDC

réacteur correspondrait bien à un tel projet (Amoussou et al., 2005; Donlan et al., 2005;


165

Donlan et al., 2004) : ce dispositif permet de suivre des micro-organismes cultivés dans un

milieu renouvelé, sous agitation, sur des coupons de PVC par exemple, et surtout, à l’aide

d’une pompe programmable, avec une circulation d’eau contrôlée ; un contrôle de la

température pourrait également être envisagé.

D’autre part, les travaux concernant l’efficacité des désinfectants doivent être

complétés. Les gammes de doses choisies pour les différents produits peuvent être élargies,

afin de trouver par exemple une dose efficace pour le H2O2. L’autre paramètre pouvant être

modifié est le temps de mise en présence : la viabilité pourrait être étudiée non pas 15 min

après l’ajout de désinfectant mais 30 min par exemple. De plus, afin de compléter les

données sur l’efficacité des désinfectants, un dosage résiduel des produits (ex : le chlore)

pourrait être réalisé à différents moments avant l’analyse de la viabilité des micro-

organismes. En effet, la présence de matière organique liée à la salive doit certainement

consommer le désinfectant et inhiber son activité antimicrobienne ; le dosage du résiduel

permettrait de connaitre plus précisément le temps de contact entre les micro-organismes et

le désinfectant. Comme précisé dans le paragraphe précédent, l’activité antimicrobienne

pourrait être comparée sur des micro-organismes planctoniques et sessiles, adhérés à des

surfaces PVC par exemple. En ce qui concerne l’Oxygenal 6©, étant très efficace contre les

levures du genre Candida, il serait intéressant de le tester contre d’autres micro-organismes

de la cavité orale, par exemple Streptococcus gordonii. L’efficacité des traitements pourrait

également être testée à plus long terme : la viabilité des micro-organismes pourrait être

vérifiée plusieurs jours après l’arrêt du traitement, afin de constater ou non une éventuelle

recolonisation.

D’autres méthodes d’analyse pourraient aussi être envisagées afin d’étudier l’efficacité

de désinfectants, non pas avec des techniques classiques de microbiologie, mais avec par

exemple de la cytométrie en flux. Un marquage à l’IP permettrait de suivre la viabilité des

cellules au cours de traitements (Mogoa et al., 2010). Il resterait à régler le problème de

différenciation entre levures et amibes libres rencontré lors de ce travail, dans le cas des

cocultures : un marqueur, spécifique d’une population (levures ou amibes), serait à utiliser.

La microscopie électronique pourrait également être utilisée afin de visualiser des éventuels

changements morphologiques engendrés par la présence de désinfectants (Mogoa et al.,

2010). Enfin, d’autres méthodes d’analyse de la viabilité des amibes libres pourraient être

testées : par exemple la technique Alamar Blue (McBride et al., 2005), qui permet une

différenciation des cellules mortes et vivantes par coloration des puits de culture.

Ces perspectives d’analyses permettraient de compléter ce travail réalisé dans le but

d’enrichir les connaissances sur le risque infectieux lié à l’eau des USD.

166

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RESUME

La contamination microbienne des units de soins dentaires (USD) est connue depuis les années 60. L’eau circule à l’intérieur des USD dans des conditions favorables au développement d’un biofilm (faible débit, nature des surfaces, stagnation). Ce biofilm, réservoir de micro-organismes potentiellement pathogènes, peut représenter un risque infectieux pour les patients et le personnel dentaire exposés à l’eau et aux aérosols générés lors des soins dentaires, en particulier s’ils sont immunodéprimés.

Des micro-organismes provenant de l’eau, tels que les amibes libres, peuvent être retrouvés dans ce biofilm. Des protozoaires ubiquitaires de l’environnement du genre Acanthamoeba ou Hartmannella, connus comme pathogènes opportunistes chez l’Homme (kératites, méningo-encéphalites) et ayant la capacité de servir d’hôte pour le développement intracellulaire de certains microorganismes pathogènes (ex : Legionella pneumophila), ont en effet été isolés dans l’eau des USD.

D’autre part, des micro-organismes provenant de la cavité buccale d’un patient peuvent également se retrouver dans le système d’eau des USD, en même temps que des traces de salive et/ou de sang, suite à un dysfonctionnement ou un mauvais entretien des valves anti-reflux des porte-instruments rotatifs. Les levures du genre Candida sont des commensaux du tube digestif humain, pathogènes opportunistes notamment responsables d’infections oro-pharyngées, et parfois retrouvées dans les USD.

Ce travail a consisté d’une part en l’étude de la capacité de deux amibes libres : A. castellanii et H. vermiformis, ainsi que de trois espèces de Candida : C. albicans, C. glabrata et C. parapsilosis, à survivre dans l’eau, en présence ou non de salive. Les résultats montrent une influence dose-dépendante et espèce-dépendante de la salive sur la survie des trois levures, et aucun effet sur la viabilité des amibes. Des interactions ont pu être mises en évidence entre amibes libres et levures : A. castellanii est capable d’internaliser puis de digérer les trois espèces de levures, induisant leur élimination rapide, indépendamment de la présence de salive. En revanche, H. vermiformis permet la survie et la prolifération de Candida spp. dans l’eau, même en l’absence de salive.

Enfin, dans une démarche de prévention et de lutte contre le risque infectieux lié à l’eau des USD, l’efficacité de différents traitements chimiques communément utilisés : le chlore (NaOCl), le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et l’Oxygenal 6©, a été étudiée sur les différentes espèces de Candida et d’amibes libres. Ces traitements montrent une efficacité variable : le chlore requiert l’utilisation de concentrations élevées (>26 ppm) et peu compatibles avec l’usage courant des USD. Le H2O2 ne présente pas d’activité significative dans les conditions testées (de 0.07% à 0.9% v/v). En revanche, l’Oxygenal 6© apparaît le plus efficace pour l’éradication des levures du genre Candida et des amibes libres dans l’eau (dès 0.05%).

Mots-clés : risque infectieux – Candida – amibes libres – interactions microbiennes – salive – units de soins dentaires – eau

Documents

Implication des levures du genre Candida et des amibes