Universite Pierre et Marie Curie, Laboratoire de Cytologie et Morphogenese vegetales, Bat. L, 4 place Jussieu, F - 75230 PARIS CEDEX 05

Influence de Ia Concentration en Kim!tine sur I'Obtention et Ie Degre de Ploidie des Bourgeons N eoformes a Partir de Ia Moelle du Tabac Cultivee in vitro

The Influence of Kinetin on Formation and Ploidy Levels of Buds Arising from Nicotiana tabacum pith Tissue Grown in vitro

DOMINIQUE BROSSARD

A vee 17 figures

Re~u Ie 1 er Decembre 1975 . Accepte Ie 15 Janvier 1976

Summary

The behavior of Nicotiana tabacum pith explants grown in vitro was studied in presence of 3 different kinetin concentrations (0.02, 0.2 and 1 mg per liter) in the medium. Cytological features as well as microspectrophometric analyses were reported.

0.02 mg/l of kinetin did not promote any organogenesis but only some callus initiation. 0.2 mg/l is a favourable concentration for bud neoformation and two kinds of buds were found: diploids (17.6 Ofo) and tetraploids (82.4 Ofo). 1 mg/l enhanced the number of these buds, but several differences should be pointed out. High concentration of kinetin resulted in: early greening of the explants, enhanced speed of calluses and bud formation, modification in the site of bud initiation, their morphology and their ploidy levels. Three kinds of buds were examined: diploids (6.4 Ofo), tetraploids (29 Ofo) and aneuploids (64.6 Ofo). Therefore, high levels of kinetin promoted the creation of an aneuploid condition which was always correlated to teratological appearances. Aneuploid levels were set between diploidy and tetra­ploidy. It was also noted that 1 mg/l of kinetin lengthened the duration of the G1-phase of diploid and tetraploid buds.

Key words: Kinetin, ploidy levels, pith explants, Nicotiana tabacum.

Introduction

Bien que de nombreux resultats physiologiques attestent de l'intervention des cytokinines dans la morphogenese, i1 subsiste une meconnaissance de leurs effets au niveau cytologique. On sait que les cytokinines sont indispensables a la dedifferen­ciation de la moelle du Tabac cultivee in vitro (SKOOG et MILLER, 1957; NISHIYAMA et TAIRA, 1966; MURASHIGE et NAKANO, 1967; NITSCH et LANCE-NouGARimE, 1967). La kinetine, par exemple, utilisee en association avec 2 mg/l d'acide indolylacetique (AlA) dans des cultures de tissus non tumoraux du Nicotiana tabacum, induit une

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organogenese caulinaire a des doses de 0,05 (MURASHIGE et NAKANO), 0,2 (SKOOG et MILLER, NITSCH et LANCE-NOUGAREDE) ou de 1 mgll (SKOOG et MILLER, NISHIYAMA et TAIRA). SKOOG et MILLER notent egalement qu'au-dela de 1 mgll, la kinetine pro­voque des effets toxiques dont la nature n'est cependant pas connue. D'autre part, les precedents travaux ne precisent pas si les bourgeons neoformes aux diverses con­centrations en kinetine possedent tous les memes caracteristiques cytologiques et fonctionnelles.

Dans un precedent travail (BROSSARD, 1975), nous avons montre que, sur un milieu favorable au bourgeonnement contenant une dose moyenne de kinetine, soit 0,2 mg/l, divers types de bourgeons, differents par leurs aspects morphologiques et leurs degres de ploidie, pouvaient etre obtenus. Nous avons etabli que la dedifferenciation du tissu medullaire, heterogene du point de vue de la ploidie des cellules qui Ie compo­sent, n'aboutit pas a une diploidisation primordiale, mais a l'obtention de bourgeons feuilles diploides ou, Ie plus souvent, tetraploides. Devant la preponderance des bour­geons neoformes tetraploides, nous avons envisage l'hypothese d'une selection au pro­fit de cette categorie cellulaire par Ie milieu utilise, plus particulierement par la kinetine, puisqu'un r&le inducteur de cette substance, dans Ie declenchement des mitoses des cellules endomitotiques, a ete mis en evidence par TORREY (1958) dans les cultures de racines excisees du Pisum. Nous presentons ici une comparaison des resultats precedemment obtenus avec ceux fournis par des explants medullaires de meme nature, cultives sur Ie meme milieu de base, mais contenant des concentrations plus faible (0,02 mg/l) et plus forte (1 mg/l) en kinetine.

Materiel et Methodes

Materiel

La moelle provient des entrenoeuds situes a 10-20 cm du point vegetatif des plantes adultes du Nicotiana tabacum L., var. «Wisconsin 38», de 1 metre de hauteur et cultives en serre sous une photoperiode de 16 heures.

Modalites de culture in vitro

Les explants medullaires, de 5 mm de longueur et de 4 mm de diamerre, SOnt extraits aseptiquement et places horizontalement (voir BROSSARD, 1975, pour les conditions de sterilisa­tion et d'ensemencement) dans des tubes steriles contenant Ie milieu de LINSMAIER et SKOOG. A ce milieu sont ajoutees de l'auxine (2 mg/I), de I'adenine (40 mg/I), et la kine tine (lot a: 0,02 mg/l; lot b: 0,2 mg/I ou lot c: 1 mg/l). Apres l'ensemencement, les cultures sont soumises :'t une photoperiode de 16 heures (energie lumineuse: 1,2 . 104 ergs/s/cm2 ; temperatures diurne: 23°C et nocturne: 17°C).

Etudes cytologiques et microspectrophotomhriques

Pour chaque condition de culture, des cals porteurs de bourgeons sont fixes par Ie melange alcool erhylique-formol-acide acerique (A.F.A.), inclus dans de la paraffine selon les procedes classiques, sectionnes :'t 7 p,m d'epaisseur et colores par du vert de me thy Ie-pyronine afin de reperer les zones pyroninophiles meristematiques.

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D'autres fragments de cals organogenes destines a l'analyse microspectrophotometrique, ainsi que des points vegetatifs diploides preleves sur des pi antes entieres, sont fixes durant 24 heures par du formol neutre a 10 0/0, inclus dans de la paraffine et sectionnes a 12 ,urn, epaisseur choisie afin de preserver un maximum de noyaux entiers. Apres traitement des preparations par la technique de FEULGEN (hydrolyse: 10 mn a 60 DC; reactif de SCHIFF: 2 heures), les noyaux sont examines seIon la methode de la double longueur d'onde de PATAU (1952) au moyen d'un cytophotometre MPV Leitz. Vne courbe d'extinction obtenue pour une gamme croissante de longueurs d'onde est etablie pour chacun des lots b et c dont Ie traitement par la cytophotometrie s'est effectue a des dates differentes. Les deux courbes presentent une extinction maximale a 560 nm. Sur ces courbes, les deux longueurs d'onde necessaires aux mesures, determinees par la methode de SWIFT (voir PATAU, 1952) pour les noyaux tres chromatiques, sont de 490 et 525 nm pour les bourgeons du lot b et de 485 et 530 nm pour ceux du lot c. Les contenus en DNA nucleaire SOnt fournis par les tables de MENDELSOHN (1958) pour des paires de valeurs de transmission, multiplies par la surface des champs cyto­photometres et exprimes en unites arbitraires. Tous les resultats microspectrophotometriques SOnt presentes sous forme d'histogrammes de frequence distributionnelle sur lesquels sont reportees les valeurs reperes 2 C et 4 C. Ces valeurs moyennes, dont les parametres de distri­bution figurent sur Ie tableau 1, sont determinees statistiquement pour Ie lot b sur 105 demi­telophases et 151 metaphases et pour Ie lot c sur 62 demi-telophases et 122 metaphases de points vegetatifs de plantes entieres. Pour chaque lot, des distributions des valeurs 2 C et 4 C sont norm ales, ce qui permet de reporter, de part et d'autre d'elles sur les histogrammes, leur dispersion possible a 95 Ofo de securite (egale a deux fois l'ecart-type s).

Tableau 1: Parametres de distribution des valeurs 2 C et 4 C determines respectivement pour les lots b et c sur des points vegetatifs de plantes entieres. Chaque valeur correspond a un contenu en DNA exprime en unites arbitraires.

2C 4C

lot b lot c lot b lot c

moyenne 96,3 64,33 194,5 122,21 mediane classe 90-100 classe 60-70 classe 190-200 classe 120-130 mode classe 90-100 classe 60-70 classe 200-210 classe 120-130 ecart-type s 15,35 8,5 33,7 14,5

Resultats

1. Observations macroscopiques

Au cours de 2 series de manipulations identiques, 96 explants de chaque lot sont examines. Notre attention s'est tout d'abord portee sur la rapidite de mise en place des cals et des bourgeons, sur les modifications morphologiques des explants qui l'accompagnent et sur l'allure ext erne des plantes neoformees.

lot a: En presence d'une faible concentration en kinetine, les explants edifient tres rarement un cal (12 cas sur 96); lorsqu'ils en presentent, apres 10 jours de culture in vitro, ceux-ci, situes au p8le basal, PB, demeurent peu developpes (fig. 1) et ne sont jamais organogenes. Les autres explants brunissent et degenerent rapidement.

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lot b: Les explants deviennent chlorophylliens des Ie 2eme jour et un cal s'organise, a leur p6lc basal, 5 a 6 jours apres l'excision (fig. 2). Des bourgeons feuilles, au nombre de 2 a 40 par explant, sont reconnaissables sur les cals vers Ie 25eme jour de culture. Deux types de plantes neoformees, morphologiquement normales, sont obtenues: les unes sont comparables a de jeunes pI antes entieres de Tabac (fig. 3), les autres sont plus trapues, plus pubescentes, avec des feuilles plus charnues aux nervures plus larges (fig. 4). Quelques feuilles teratologiques peuvent ~tre observees au contact du milieu de culture (fig. 3 et 4, fleches), celles situees a l'air libre demeurant essentiellement normales.

lot c: Les explants verdissent considerablement au cours du premier jour de cul­ture. Au 6eme jour, un volumineux cal, present ant de nombreux nodules, occupe leur face inferieure situee au contact du milieu ainsi que leurs deux p6les (fig. 5). Les cals ont une formation plus rapide et une polarite moins accentuee que dans Ie lot b. Les premiers bourgeons feuilles sont visibles des Ie 16eme jour et, au 20eme jour, les cals sont entierement recouverts de ces jeunes bourgeons (fig. 6) dont Ie nombre est sou­vent superieur a 40 par explant. De developpement inegal, la plupart de ces bour­geons se differencient de ceux du lot b par de nombreuses anomalies: aspect hydrique des jeunes plantes; feuilles de morphologies diverses, turgescentes, bi- ou tridentees (fig. 7, neche), soudees ou aux bords replies (fig. 8, neches). De plus, des rameaux axillaires se developpent souvent de fa<;on aussi prononcee que les principaux (fig. 8, r. ax.).

2. Origines des bourgeons ne%rmes

lot b (voir BROSSARD, 1975): En presence de 0,2 mg/l de kinetine, les meristemes proviennent de la dedifferenciation totale de cellules cambiales externes aux nodules ou bien de celle de cellules peu profondes du parenchyme neoforme des cals.

Fig. 1: Explant medullaire cultive in vitro depuis 10 jours sur un milieu contenant 0,02 mg/l de kinetine. Cal peu developpe au p8le basal, PB. Gr. X 2,5. Fig. 2: Explant medullaire cultive depuis 6 jours en presence de 0,2 mg/l de kinetine. Cal en formation au p8le basal, PB. Gr. X 2,5. Fig. 3 et 4: Jeunes plantes neoformees apres 30 jours de culture sur un milieu contenant 0,2 mg/l de kinetine. Les fleches signalent quelques feuilles teratologiques au contact du milieu de culture. Gr. X 0,8. Fig. 3: type normal; - fig. 4: plante a tige et nervures foliaires plus epaisses. Morphologies foliaires differentes de fig. 3. Fig. 5 a 8: Explants cultives en presence de 1 mg/l kinetine. Fig. 5: 6 jours de culture; explant vu de profil. Un cal occupe Ie p8le basal, PB, ainsi que la face inferieure situee au contact du milieu de culture. Gr. X 2,5. - fig. 6 et 7: 17 jours de culture; explants vus du dessus. De tres nombreux bourgeons ont ete inities sur tout Ie cal. Quelques uns possedent des feuilles teratologiques, par exemple tridentees (fig. 7, neche). Gr. X 2,5; - fig. 8: jeune plante neoformee apres 30 jours. Feuilles aux bords replies (neche) et de formes variables. Noter la presence d'un rameau axillaire tres developpe, r. ax.; r. adv: racine adventive. Gr. X 0,8.

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10 Fig. 9 et 10: Localisation des activites meristematiques primaires sur des cals obtenus en pre­sence de 1 mg/l de kinetine. N: nodule Fixation: A.F.A.; coloration: vert de methyle­pyronine. Gr. X 40. Fig. 9: en section transversale, les nodules sont bordes de 2 a 4 rangees de cellules tres pyro­ninophiles (t&tes de neches); - fig. 10: mise en place de meristemes primaires en bordure des nodules. Une intense pyroninophilie caracterise un bourgeon feuille naissant, bfn, et son pro­cambium, pr, ainsi que des meristemes teratologiques, mt, non feuilles.

lot c: Les cals offrent, a l'examen microscopique, un aspect beaucoup plus des­organise que ceux du lot b. Plus volumineux, leurs nodules sont souvent bordes, au

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contact du milieu de culture, d'une frange tres pyroninophile (fig. 9, t&tes de fleches) qui initie de place en place des bourgeons a fonctionnement organogene (fig. 10, bfn) ainsi que des massifs meristematiques tres saillants mais non feuilles (fig. 10, mt), analogues aux meristemes teratologiques observes par BOWES (1971) dans des cultures de racines de Taraxacum officinale.

3 . Quelques aspects histologiques des plantes feuiltees neoformees

Les tiges situees sous les meristemes ayant initie 5 a 6 feuilles, ainsi que les cellules medullaires des derniers entrenoeuds sont de dimensions differentes dans les lots b et c comme en temoigne Ie tableau 2.

Tableau 2: Comparaison des dimensions des meristemes, des tiges et des cellules medullaires sous-jacentes aux m.fristemes dans les lots b et c. Les moyennes, accompagnees de leur inter­valle de confiance it 5 0/0, sont estimees sur des sections longitudinales axiales de bourgeons pourvus de 5 it 6 feuilles.

largeur moyenne des meristemes (a)

largeur moyenne de la tige sitUl!e it 800 fl sous I'apex (a)

dimensions moyennes des cellules medullaires situees entre 80 et 300 flm sous l' apex (b)

hauteur largeur

nombre moyen des cellules medulla ires sur un diarnetre de tige it 300 flrn sous I'apex (a)

lot b

210± 9,2 fl m

1010±28,3 ,um

23± 4,5 .um 34 ± 5,2 fl rn

9± 0,7

(a) rnoyennes portant sur 10 rneristemes et tiges de chaque lot. (b) rnoyennes portant sur les rnesures de 200 cellules dans chaque lot.

lot c

338 ± 11,7 flrn

1960 ± 38,8 flrn

45 ± 14,7 ,urn 52±16,1.urn

15 ± 0,9

Ainsi, les fortes concentrations en kinetine (lot c) induisent, chez les bourgeons neoformes, un elargissement des jeunes entrenoeuds resultant d'une augmentation du nombre et des dimensions des cellules medullaires ainsi qu'un elargissement des meristemes eux-m&mes. Notons qu'une dilatation importante du premier entrenoeud des plantules de pois Annonay traitees par des cytokinines synthetiques a aussi ete enregistree par ROUSSAUX (voir DOUCE et ROUSSAUX, 1969).

4. Degres de plo'idie des bourgeons neoformes

Les contenus en DNA de tous les noyaux de 34 bourgeons feuilles dll lot b et de 31 bOllrgeons du lot c sont analyses.

Dans Ie lot b, 28 bourgeons pres en tent des teneurs en DNA reparties de 4 C a 8 C (fig. 11) avec quelques rares valeurs « 1 Ofo) situees entre les limites de la dispersion des 2 C; 6 autres bourgeons ont, par contre, des teneurs variant de 2 C a 4 C (fig. 12)

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F 6

50

40

30

2

10

F

100 200 300 q

Fig. 11 et 12: Contenus en DNA des points vegetatifs des p!antes neoformees en presence de 0,2 mg/! de kine tine. F: frequence; q: quantite de DNA en unites arbitraires. Deux types d'histogrammes sont obtenus: Fig. 11: somme des histogrammes de type tetrap!oi"de; - fig. 12: somme des histogrammes de type dip!oi"de. Fig. 13: Histogramme presentant res contenus en DNA, q, de points vegetatifs dip!oi"des de plantes entieres.

selon un profil diplolde typique, analogue a celui obtenu pour des meristemes apicaux de pI antes entieres (fig. 13). En presence de 0,2 mg!l de kinetine dans Ie milieu de culture, les explants medullaires initient done des bourgeons soit diploldes (17,6 Ofo), soit, plus frequemment, tetraploldes (82,40/0). Dans ce cas, nous avons pu egalement examiner un Hot meristematique non pourvu de feuilles apres 25 jours de culture, auquel ses teneurs en DNA, presque toutes intermediaires entre 2 C et 4 C (fig. 14), conferent un caractere d'aneuploldie.

F 2C

10

4C

q

Fig. 14: Contenus en DNA de type aneup!oi"des dans un massif meristematique non feuille apres 2S jours de culture en presence de 0,2 mg/! de kinetine.

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Fig. 15 a 17: Contenus en DNA des points vegetatifs de pI antes neoformees en presence de 1 mg/I de kinetine. fig. 15: somme des histogrammes de type diplolde; fig. 16: somme des histogrammes de type tetrapiolde; fig. 17: somme des histogrammes de type aneupiolde.

Dans Ie lot c, l'analyse cytophotometrique fournit des histogrammes tn~s variables selon les bourgeons. Seulement 2 d'entre eux sont diploYdes (fig. 15) et 9 tetra­ploY des (fig. 16). Les 19 autres ont des profils essentiellement situes entre 2 C et 4 C (fig. 17), avec des pics d'emplacements divers; ces 19 histogrammes aneuploYdes sont regroupes sur la figure 17. En presence de 1 mg/l de kinetine, les bourgeons neoformes sont donc porfois euploYdes (diploldes: 6,4 Ofo; tetraploYdes: 29 Ofo) mais Ie plus fre­quemment aneuploldes (64,6 Ofo).

Les histogrammes diploldes et tetraploldes obtenus pour les lots b et c ayant des profils un peu differents, no us avons tente d'estimer quantitativement les pourcentages des noyaux situes dans l'intervalle des 2 C, 4 C et 8 C (la valeur 8 C, theorique, etant obtenue par doublement de 4 C) dans les deux cas. Les tableaux 3 et 4 presentent ces estimations.

Notons, sur Ie tableau 3, que si les bourgeons diploYdes neoformes dans Ie lot b sont tres comparables a. ceux de pI antes entieres, ceux du lot c, par contre, presentent un plus grand nombre de noyaux dans l'intervalle des 2 C, c'est-a.-dire en phase pre­synthetique G1 de leur cycle mitotique. Une modification du m~me ordre, provoquee par la kinetine a. forte dose, est decelee pour les bourgeons tetraploYdes (tableau 4) dans lesquels on note une augmentation du nombre des noyaux 4 C au detriment

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des 8 C. On peut aussi remarquer que les bourgeons 4n (tableau 4) possedent toujours plus de noyaux en G 1 que les bourgeons 2n (tableau 3).

Tableau 3: Comparaison des fn\quences relatives des noyaux dans l'intervalle des 2 C (2 C ± 2s2 c) et des 4 C (4 C ± 2s4 C) sur les histogrammes diploi"des de plantes entieres ou neoformees dans les lots b et c.

plantes entieres bourgeons 2n du lot b bourgeons 2n du lot c

2 C ± 2s2 C

45,03 0/0 48,95 010 62,68010

4 C ± 2s4 C

54,97010 51,07010 25,37010

Tableau 4: Comparaison des frequences relatives des noyaux dans l'intervalle des 2 C (2 C ± 2s2 C), 4 C (4 C ± 2s4 C) et 8 C (8 C ± 2s8 C) sur les histogrammes tetraploi"des des bourgeons neoformes dans les lots b et c.

bourgeons 4n du lot b bourgeons 4n du lot c

2 C ± 2s2 C

6,59 0/0':-) 3,06 0/0':-)

4 C ± 2s4 C

56,53 010 68,11 010

8 C ± 2s8 C

36,88010 16,85010

,:-) les quelques valeurs 2 C dans les bourgeons 4n sont en partie, au moins, dues a des noyaux non entiers dans l'epaisseur des preparations ou a des sous-estimations de noyaux 4 C.

Conclusions

Des consequences jusqu'alors peu connues de l'action de la kinetine sur la morpho­genese caulinaire in vitro sont donc degagees. SOSSOUNTZOV (1967), sur Ie sporo­phyte du Marsilea drummondii A. BR. cultive in vitro montre que de fortes doses de kine tine induisent la formation d'axes depourvus de feuilles precedant un arret d'activite du meristeme. En presence de 1 mg/l de kinetine, des modifications du developpement foliaire sont observees ainsi qu'un accroissement et une levee d'inhibi­tion des bourgeons lateraux. Si des phenomenes du meme ordre sont induits par 1 mg/l de kinetine sur les bourgeons neoformes in vitro de la moelle du Tabac, la micro­spectrophotometrie permet de lier les anomalies enregistrees a l'etat aneuploi"de des meristemes qui les presentent. Dne action de la kinetine au niveau nucIeaire peut ainsi etre envisagee. Dne organogenese normale et continue est obtenue en presence de 0,2 mg/l par des meristemes neoformes diploi"des ou tetraploi"des, donc euploi"des, Ce fonctionnement normal est perturbe par la kinetine a forte dose qui, bien que favorisant la neoformation de meristemes primaires, accentue l'aneuploi"die par des voies non encore decelees. On sait que les cals non organises du Tabac cultive in vitro pres en tent frequemment une variation du nombre chromosomique (Fox, 1963) ainsi que de nombreuses aberrations mitotiques (NISHIYAMA et TAIRA, 1966) et amitotiques

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(BROSSARD, 1975). On peut se demander si les fortes doses de kinetine n'accentuent pas ces dereglements nucleaires et ne sont pas a I'origine de la forte frequence de l'aneuploldie.

Nos resultats revelent egalement que I'aneuploldie s'installe toujours entre la diploldie et la tetraploldie. D'autre part, il est montre que I'activite meristematique des bourgeons 2n et 4n, bien que traduite par des histogrammes de profils assez com­parables, suit des cycles cellulaires dont la duree des diverses phases est differente en fonction de la concentration en kinetine. Dans Ie cas de forte concentration, on note toujours une plus grande frequence relative des noyaux en G1 par rapport a ceux' se trouvant en G2, qu'il s'agisse de bourgeons 2n ou 4n. Un allongement de la duree de la phase G 1 pourrait ainsi &tre une consequence supplementaire de I'effet de la kinetine a forte dose, phenomene que l'on peut relier a la tendance inhibitrice de I'organogenese manifestee dans ces conditions.

References

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Dr. DOMINIQUE BROSSARD, Universite Pierre et Marie Curie, Laboratoire de Cytologie et Morphogenese vegetales, Bit. L, 4 place Jussien. F-75230 Paris Cedex 05.

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