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ANNEE 2007 THESE : 03 – TOU 3 – 4086…
ACTIVITE ANTIPALUDIQUE DE LA GIROLLINE
ETUDE IN VITRO ET IN VIVO
_________________
THESEpour obtenir le grade de
DOCTEUR VETERINAIRE
DIPLOME D’ETAT
présentée et soutenue publiquement en 2007devant l’Université Paul-Sabatier de Toulouse
par
Mariette, Régine SALERY26 Novembre 1982, Montpellier
___________
Directeur de thèse : M. le Docteur Philippe Jacquiet
___________
JURY
PRESIDENT :M. Alexis VALENTIN
ASSESSEUR :M. Philippe JACQUIETM. Philippe GUERRE
MEMBRE INVITE :Mme BENOIT-VICAL FrançoiseM.
Professeur à l’Université Paul Sabatier de TOULOUSE
Maître de Conférence à l’Ecole Nationale Vétérinaire de TOULOUSEProfesseur à l’Ecole Nationale Vétérinaire de TOULOUSE
Chargée de Recherche INSERM, Docteur en Sciences
2
REMERCIEMENTS
A notre Président de thèse,
Monsieur le Professeur Alexis VALENTIN Professeur des Universités Praticien hospitalier Zoologie-Parasitologie
Qui nous a fait l’honneur d’accepter la présidence de notre jury de thèse et de nous suivre tout au long de l’année
Hommage respectueux
A notre jury de thèse,
Monsieur le Docteur .Philippe JACQUIET Maître de Conférence de l’Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse Parasitologie et Maladies Parasitaires
Que nous remercions pour l’intérêt porté à notre travail Qu’il trouve ici l’expression de notre vive reconnaissance
Monsieur le Professeur Philippe . GUERRE Professeur de l’Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse Pharmacie et Toxicologie
Qui nous fait le plaisir de participer à notre jury de thèse, Sincères remerciements
Madame le Docteur Françoise. BENOIT-VICAL Chargée de Recherche INSERM
Qui a inspiré et porté avec nous ce travail tout au long de l’année Qui nous a transmis ses connaissances en matière de paludisme avec passion, travailler à ses côtés est un plaisir quotidien
Qu’elle soit assurée de notre plus profond respect et notre sincère reconnaissance
3
A Françoise,
Non seulement vous m'avez accueillie généreusement au sein de votre équipe, mais vous
m’avez également beaucoup transmis, " scientifiquement "parlant comme
" humainement "
Vous êtes une vraie "maman scientifique", votre patience est précieuse et l'ambiance que
vous savez créer est propice…au travail…et à la bonne humeur …
Merci d’avoir supporté, merci pour tout
A Alexis,
Sans toi je ne serais pas restée et ça n’aurait pas été pareil. Merci à toi aussi
A Patrice,
Rien de plus plaisant que ton flegme, ta disponibilité et ta bonne humeur Camerounaise
A David,
Ton incompétence informatique est touchante, bonne continuation
A Benoît,
Tu m’as fait mourir de rire
Petit tireur d’élite aux orientations politiques déroutantes,
Douceurs
Merci à vous trois, c’était beaucoup de bonheur et de joie quotidienne,
A Joêl du fond de ses States
A Katia, Céline et Angélique , merci pour votre disponibilité et votre gentillesse quotidiennes
A Monsieur JF Magnaval et à toute l’équipe du servie de Parasitologie-Mycologie du CHU
Rangueil.
4
A ma mère .
"Si ma foi vécut un jour ce fut pour ma mère"
Je t’aime
A mon père
"Celui qui nous construit le mieux est celui sur lequel on se cogne le plus "
Je t’aime
Je vous doit tout, merc i
A mon frère, Martin
"Ceux qui vivent sont ceux qui luttent"
Loin de mes yeux mais bien dans mon coeur
A mes grands-pères, dans ma mémoire
A mes grand-mères, avec tendresse
A ma famille
5
A Anaïs et Caroline ,
Je ne savais pas qu'on pouvait aimer des amies,
Vous êtes indispensables à mon équilibre
"Tous les jours dans mes pensées, vous êtes des fées!"
Longues vies à vous et vos bouts de choux à venir,
Amitiés aux chéris
A Julianne et Audrey,
Cinq années de rires et de pleurs, de joie et de travail, de franches rigolades et de bonnes
soirées
Spéciale dédicace aux TP avec Ju: "Vis ma vie de vétérinaire !"
Comment aurait-ce pu être autrement ? Vous êtres géniales
A Anaïg (on repart quand ?), Gérémy (trop de larmes versées pour rien ?), Emma (Merci
pour les progrès tennistiques), Tiny, Alex, Elo, Guillaume
Ce fut un plaisir et je n’oublierais rien
Bonne continuation, on se retrouvera
A Sylvain,
A tous ceux que j’ai croisé avant et que je n’oublie pas
6
A Lyssia, Simon, Lulu, Louis, Pierre, Soname, Thomas, Claire, Juliette, tous les autres et
ceux à venir…
"Le vie est dure, soyez doux !"
A Arizona, mon étoile
A Gamin, le mâle de ma vie, le cheval qui me ressemble le plus !
1
TABLE DES M ATIERES
TABLE DES ILLUSTRATIONS 5
TABLES DES ANNEXES 8
RAPPELS FONDAMENTAUX 9
I- INTRODUCTION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
A- Historique ......................................................................................................10
B- Epidémiologie de la maladie ....................................................................11
1- Répartition mondiale ............................................................................11
2- Incidence et prévalence .......................................................................13
3- Paludisme d’importation ......................................................................14
C- Contexte actuel............................................................................................14
I I- LE PALUDISME. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
A- Le Parasite.................................................................................................17
1- Le cycle...................................................................................................19
a- Cycle humain ou schizogonique ...............................................19
b- Cycle sexué ou sporogonique chez l’Anophèle ......................23
2- Les caractéristiques..............................................................................24
a- Métabolisme.................................................................................24
b- Génétique .....................................................................................28
3- Le vecteur ...............................................................................................29
B- La Pathologie................................................................................................30
1- Symptômes ............................................................................................30
a- Paludisme non compliqué = accès palustre simple ...............30
b- Le paludisme grave ou compliqué ............................................33
c- Paludisme viscéral évolutif.........................................................38
d- Fièvre bilieuse hémoglobinurique .............................................38
2
2- Physiopathologie
......................................................................................................................39
a- Contamination..............................................................................39
b- Immunité .......................................................................................39
c- La séquestration et la cytoadhérence ......................................42
d- Mécanismes de la maladie ........................................................43
3- Diagnostic...............................................................................................49
a- Direct .............................................................................................49
b- Indirect...........................................................................................54
I I I- T RAITEMENT DU PALUDISME . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
A- Principe général du traitement ................................................................57
B- Médicaments antipaludiques de synthès .............................................58
1- Les schizonticides.................................................................................59
a- Les amino-4-quinoléines ............................................................59
b- Les méthanolquinoléines ...........................................................62
c- Les antifoliques et les antifoliniques .........................................63
2- Les gamétocytocides : la primaquine ................................................69
3- Autres médicaments antipaludiques de synthèse ...........................70
4- Les associations ....................................................................................71
C- Médicaments antipaludiques naturels ..................................................72
1- Les alcaloïdes du Quinquina : la quinine ..........................................72
2- L’artémisinine et ses dérivés...............................................................74
D- Résistances ..................................................................................................79
E- Prévention .....................................................................................................80
3
PROJET DE RECHERCHE : ETUDE DE LA G IROLLINE 84
I- L ES MOLECULES M ARINES ET LEUR ACTIVITE B IOLOGIQUE
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
A- Les molécules marines..............................................................................86
1- Généralités.............................................................................................86
2- Les molécules à potentiel antipaludique ...........................................89
B- La Girolline et dérivés ................................................................................91
1- La girolline ..............................................................................................91
2- L’hyménialdisine ....................................................................................93
I I- ETUDE DE LA G IROLLINE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
A- Matériels et méthodes................................................................................94
1- In vitro .....................................................................................................94
a- Souches en culture .....................................................................94
b- Cultures de Plasmodium falciparum.........................................95
c- Synchronisation ...........................................................................95
d- Détermination des CI50 ...............................................................96
e- Détermination de la cytotoxicité ............................................. 102
f- Détermination du moment d’action d’une molécule au cours
du cycle asexué érythrocytaire ......................................................................................... 102
f- Etude de la réversion................................................................ 104
g- Etude de la potentialisation..................................................... 105
2- In vivo................................................................................................... 107
a- Culture du parasite ................................................................... 107
b- Evaluation de la DE50............................................................... 107
c- Etude de la toxicité ................................................................... 109
4
B- Résultats et Discussion.......................................................................... 111
1- In vitro .................................................................................................. 111
a- Détermination des CI50 ............................................................ 111
b- Détermination de la cytotoxicité ............................................. 115
c- Détermination du moment d’action d’une molécule au cours
du cycle asexué érythrocytaire ......................................................................................... 116
d- Etude de la réversion............................................................... 118
e- Etude de potentialisation......................................................... 119
2- In vivo................................................................................................... 120
a- Evaluation de la DE50............................................................... 120
b- Etude de la toxicité ................................................................... 123
C- Perspectives .............................................................................................. 126
CONCLUSION 128
B IBLIOGRAPHIE 131
ANNEXES 148
L ISTE DES ABREVIATIONS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .149
PUBLICATION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .151
5
TABLE DES ILLUSTRATIONS
F IGURES
Figure 1 : Répartition mondiale du paludisme ......................................................................... 12
Figure 2 : Erythrocytes parasités .............................................................................................. 22
Figure 3 : Erythrocytes parasités par des gamétocytes............................................................. 24
Figure 4 : Cycle de Plasmodium .............................................................................................. 25
Figure 5 : Métabolisme de l’hémoglobine par le parasite ........................................................ 26
Figure 6 : Anopheles gambiae .................................................................................................. 29
Figure 7 : Frottis mince ............................................................................................................ 50
Figure 8 : Morphologie des différents stades des 4 espèces de Plasmdium de l’homme......... 53
Figure 9 : Cibles des traitements disponibles........................................................................... 58
Figure 10 : Structure chimique de la chloroquine .................................................................... 59
Figure 11 : Mécanisme d’action de la chloroquine .................................................................. 60
Figure 12 : Structure chimique de l’amodiaquine .................................................................... 61
Figure 13 : Structure chimique de la méfloquine ..................................................................... 62
Figure 14 : Structure chimique de l’halofantrine ..................................................................... 63
Figure 15 : Mécanisme d’action du proguanil.......................................................................... 65
Figure 16 : Mécanisme d’action de l’association sulfadoxine-pyriméthamine ........................ 66
Figure 17 : Mécanisme d’action de la doxycycline .................................................................. 69
Figure 18 : Structure chimique de la quinine ........................................................................... 73
Figure 19 : Classification chimique des dérivés de l’artémisinine ........................................... 75
Figure 20 : Structure chimique de l’artémisinine ..................................................................... 76
Figure 22 : Structure chimique de l’artésunate......................................................................... 77
Figure 23 : Structure chimique de l’artéméther........................................................................ 78
6
Figure 24 : Détermination graphique de la CI50 ....................................................................... 99
Figure 25 : Exemple d’un plan d’une plaque utilisant la micro-méthode radioactive ............. 99
Figure 26: Structures des composés testés ............................................................................. 101
Figure 27 : Plan d’une plaque de détermination du moment d’action ................................... 103
Figure 28 : Plan des plaques d’étude de la réversion ............................................................. 105
Figure 29 : Isobologramme de potentialisation...................................................................... 106
Figure 30 : Plan d’une plaque d’étude de la synergie ............................................................ 106
Figure 31 : Pourcentage d’inhibition de la croissance parasitaire en fonction des
concentrations utilisées (gamme de 10 pg/mL à 10 µg/mL) pour la girolline et
l’artémisinine sur la souche FcM29 ............................................................................... 111
Figure 32 : Pourcentage d’inhibition de la croissance parasitaire en fonction des
concentrations utilisées (gamme de 50 pg/mL à 50 µg/mL) pour la girolline et la
chloroquine sur la souche W2 ........................................................................................ 112
Figure 33 : Pourcentage d’inhibition de la croissance parasitaire en fonction des
concentrations utilisées (gamme de 10 pg/mL à 10 µg/mL) pour la girolline et la
chloroquine sur la souche FcB1 ..................................................................................... 113
Figure 34 : Pourcentage d’inhibition de la croissance parasitaire en fonction des
concentrations utilisées (gamme de 10 pg/mL à 10 µg/mL) pour la girolline et la
chloroquine sur la souche F32 ........................................................................................ 113
Figure 35 : Profil des synthèses d’ADN, ARN et protéines au cours du développement de
Plasmodium falciparum en cultures synchrones (adaptation de Arnot et Gull)............. 116
Figure 36 : Activité de la girolline sur la souche W2 au cours du cycle asexué érythrocytaire
du parasite....................................................................................................................... 116
Figure 37 : Activité de la girolline sur la souche FcB1 au cours du cycle asexué érythrocytaire
du parasite....................................................................................................................... 117
Figure 38 : Isobologramme de la potentialisation entre la girolline et la chloroquine. Le trait
diagonal indique l’additivité ........................................................................................... 119
Figure 39 : Inhibition de la croissance parasitaire par la girolline en voie orale .................... 121
Figure 40 : Inhibition de la croissance parasitaire par la girolline en voie intrapéritonéale .. 121
7
Figure 41 : Suivi de la parasitémie chez les souris survivantes après le 10ième jour ............ 122
Figure 42 : Mortalité due à la girolline chez la souris ............................................................ 124
Figure 43 : Mortalité due à la girolline chez le rat ................................................................. 124
TABLEAUX
Tableau 1: Répartition géographique des 4 espèces plasmodiales humaines........................... 13
Tableau 2: Classification du parasite........................................................................................ 18
Tableau 3: Caractéristiques générales des 4 espèces de Plasmodium humains ....................... 19
Tableau 4: Critères de diagnostic du paludisme grave ou compliqué ...................................... 37
Tableau 5: Critères de différenciation de l'espèce sur frottis mince......................................... 52
Tableau 6: Traitements antipaludiques disponibles ................................................................. 58
Tableau 7: Répartition mondiale en 2007 de la résistance de Plasmodium falciparum........... 81
Tableau 8 : Traitement prophylactique du paludisme chez l’adulte, proposé en Franc ........... 82
Tableau 9: Molécules testées in vitro ..................................................................................... 100
Tableau 10: Répartition des animaux lors du test de Peters ................................................... 109
Tableau 11: Répartition des animaux lors de l’étude de la toxicité ....................................... 110
Tableau 12: CI50 de la girolline et de l’artémisinine sur la souche FcM29............................ 111
Tableau 13 : CI50 de la girolline et de la chloroquine sur la souche W2................................ 112
Tableau 14: CI50 de la girolline et de la chloroquine sur la souche FcB1 .............................. 112
Tableau 15 : CI50 de la girolline et de la chloroquine sur la souche F32 ............................... 113
Tableau 16: Tableau récapitulatif des CI50 obtenues sur la souche FcM29 pour les dérivés de
la girolline et pour certaines molécules extraites de Cymbastela cantharella ............... 114
Tableau 17: Détermination des CI50 et de la CR50 pour la souche W2 .................................. 118
Tableau 18: Détermination des CI50 et de la CR50 pour la souche F32 .................................. 118
8
TABLES DES ANNEXES
L ISTE DES ABREVATIONS 149
PUBLICATION 151
9
RAPPELS FONDAMENTAUX
10
Le paludisme est une parasitose sanguine causée par Plasmodium (essentiellement
Plasmodium falciparum). C’est la maladie parasitaire la plus répandue au monde. Cent sept
pays sont touchés et 3,1 milliards de personnes sont susceptibles d’être atteintes, ce qui
correspond à 48% de l’humanité aujourd’hui menacée (163). Bien que devancé par l’avancée
rapide de l’épidémie de VIH* et la recrudescence des cas de tuberculose humaine, il reste
encore une des maladies infectieuses prédominante.
I- INTRODUCTION (63)
A- Historique
L’histoire du paludisme commence certainement bien avant mais les premières
descriptions de cette maladie datent du Vième siècle avant Jésus Christ, avec Hippocrate. Il est
le premier dont les textes mentionnent le paludisme, sa clinique et ses complications.
Cinq cents ans plus tard, c’est Celsus qui établit les premières différences entre les
symptômes cliniques du paludisme à Plasmodium malariae, Plasmodium vivax et
Plasmodium falciparum.
Il faut ensuite attendre 1630 et la découverte des racines de quinquina, importées en
Europe du Pérou par Don Francisco Lopez, pour voir apparaître les premiers vrais traitements
de la maladie. A cette époque Morton et Sydenham en Angleterre, où la maladie est nommée
« Agues » et Torti en Italie, sont les premiers à distinguer les fièvres répondant à ces racines,
provoquées par le paludisme, et celles n’y répondant pas.
Puis au XVIIIième siècle, la maladie prend le nom de malaria (« mauvais air »), car les
scientifiques comprennent qu’elle se transmet dans les régions humides.
En 1820, Pelletier et Caventou, en France, découvrent dans les racines de quinquina, la
quinine, l’élément actif de ce traitement. C’est le début de l’ère de la chimiothérapie, la
quinine est aujourd’hui obtenue par hémi-synthèse chimique.
* Virus de l’Immunodéficience Humaine
11
Et en 1880, Alphonse Laveran, médecin militaire français en Algérie, décrit pour la
première fois le parasite à partir du sang d’un patient. Pour ses découvertes, Laveran se verra
offrir le Prix Nobel en 1907.
En 1897, la découverte du rôle de l’Anophèle dans la transmission de la maladie est due
à Ronald Ross, médecin militaire Anglais en Inde. Il recevra le Prix Nobel de 1902.
Enfin, en 1898, ce sont trois Italiens, Amico Bignami, Giusseppe Bastianelli et Battista
Grassi, qui décrivent le cycle complet de Plasmodium.
La découverte du cycle de vie du parasite permet dès lors de diminuer les populations
de moustiques responsables de l’épidémie et donc de diminuer les transmissions. Lors de la
Seconde Guerre Mondiale, le paludisme est responsable de millions de pertes humaines. Les
efforts pour lutter contre le parasite permettent alors de découvrir le DDT† (insecticide
efficace que l’on doit à Mueller, Suisse, en 1939) et la chloroquine (4-aminoquinoléine
découverte en 1930 en Angleterre).
B- Epidémiologie de la maladie
1- Répartition mondiale
Le paludisme est largement distribué à travers le monde, il est endémique des régions
tropicales ou sub-tropicales, soit la plupart des pays pauvres ou en voie de développement.
90% de la population atteinte vit en Afrique sub-saharienne, où la maladie est la première
cause de mortalité.
On retrouve la maladie :
♦ essentiellement en Afrique, au-dessous du désert du Sahara et au-dessus de la
28° latitude, avec 80% des cas totaux en 1990
† Dichloro Diphényl Trichloéthane
12
♦ sur une grande partie du sous-continent Indien, ainsi qu’en Asie du Sud et en
Océanie. Les pays les plus touchés sont pour cette région du monde : l’Inde, l’Afghanistan, le
Sri Lanka, la Thaïlande, l’Indonésie, le Viêt-Nam et le Cambodge
♦ également dans les états d’Amérique Centrale, à Haïti, en République
Dominicaine, dans le bassin Amazonien Brésilien ainsi que dans les pays voisins d’Amérique
du Sud. C’est le Brésil qui recense le plus de cas pour cette région
Cette répartition n’a quasiment pas évolué depuis les dernières décennies. Mais si la
distribution du parasite est homogène, sa transmission est bien plus intense en Afrique, ce
continent regroupe à lui seul 70% des nouvelles infections. www.rbm.who.int
2001-2010 United Nations Decade to Roll Back Malaria
Figure 1 : Répartition mondiale du paludisme
Il faut également remarquer que la répartition mondiale est différente en fonction de
l’espèce plasmodiale en cause. En particulier, Plasmodium falciparum, le plus dangereux, est
le plus largement répandu puisqu’il se retrouve dans la plupart des régions précitées où il est
responsable de la majorité des infections. A lui seul, cette espèce provoque 120 millions de
nouveaux cas et 1 million de décès par an. Les trois autres espèces de Plasmodium humains
ont, quant à elles, une répartition plus restreinte.
13
Tableau 1: Répartition géographique des 4 espèces plasmodiales humaines
Espèce plasmodiale Répartition
Plasmodium falciparum
Afrique Sub-Saharienne Bassin Amazonien Haïti La plupart des régions Asiatiques et Océaniennes
Plasmodium vivax Amériques Asie Certaines zones précises d’Afrique
Plasmodium malariae Plasmodium ovale
Quelques régions d’Afrique Quelques zones du bassin Amazonien Sporadiques en Océanie et en Asie du Sud
2- Incidence et prévalence
Sur la planète, entre 300 et 500 millions de personnes souffrent de cette parasitose et 1,5
à 2,7 millions en meurent chaque année (144) (141). Il faut noter que cette terrible maladie
cause principalement la mort des femmes enceintes et des jeunes enfants, chez lesquels elle
est responsable de plus de décès que tout autre agent infectieux. En fait, 75% des morts dus au
paludisme sont des enfants africains de moins de cinq ans infectés par Plasmodium
falciparum (18).
De part la persistance des étapes strictement sanguines du parasite, qui peuvent durer
plusieurs mois, l’incidence‡ est difficile à évaluer tandis que la prévalence§ reste élevée. En
moyenne on compte 300 à 500 millions de personnes infestées.
♦ en Afrique, 500 à 900 nouveaux cas pour 1 000 personnes sont recensés en une
année
♦ en Amérique du Sud ou en Asie du Sud-est, l’incidence se limite à 4 à 5
nouveaux cas pour 1 000 personnes
‡ Incidence = nombre de nouveaux cas d’une maladie dans une population sur une période de temps
donnée § Prévalence = nombre de cas d’une maladie dans une population à un instant donné
14
3- Paludisme d’importation
On peut noter que les pays non endémiques présentent un paludisme d’importation. En
France, en 2000 et 2001, de 7 000 à 8 000 cas ont été recensés. 80% des cas ont été déclarés
chez des patients ayant voyagé en Afrique Sub-Saharienne, les autres en Asie, en Amérique
Latine ou dans les Caraïbes. La plupart de ces cas de paludismes d’importation étaient dus à
Plasmodium falciparum et 3% étaient des formes graves. Cette forme de paludisme provoque
de 10 à 20 décès dans ces pays et est due à l’ignorance ou l’indifférence de certains voyageurs
vis-à-vis de la prophylaxie antipaludique (5).
C- Contexte actuel
Ainsi, le paludisme reste un fléau mondial qui a aussi un coût économique. Les pertes
estimées s’élèvent chaque année à plus de 12 milliards de dollars (63).
La maladie est d’autant plus dramatique que ce sont les populations vivant dans les pays
pauvres qui sont soumises à un risque plus élevé d’être infectées et de l’être fréquemment.
Dans ces zones, le paludisme concourt au taux de mortalité infantile particulièrement élevé.
C’est pourquoi depuis déjà plusieurs décennies, la maladie fait l’objet, comme le
SIDA** et la tuberculose, d’un programme mondial d’éradication déclaré par l’OMS††.
En 1957, suite aux découvertes en matière de traitement, de chimio-prophylaxie et
d’insecticides, l’OMS prévoyait une éradication du paludisme dans les 20 années suivantes.
C’était sans compter sur l’apparition des souches chloroquino-résistantes dans les années
1960. Depuis 1980, malheureusement, on observe une recrudescence des cas de paludisme et
l’extension des zones d’endémie, provoquées par l’apparition de formes multi-résistantes aux
molécules antipaludiques (160), en particulier pour Plasmodium falciparum en Asie.
** Syndrome de l’Immunodéficience Acquise †† Organisation Mondiale de la Santé
15
Ce phénomène est accentué par l’augmentation de la population mondiale,
l’accélération des flux de migration et les transports internationaux ainsi que la modification
du climat (123). L’OMS‡‡, en effet, prévoit le doublement de la population atteinte pour la
prochaine décennie si aucune stratégie antipaludique n’est mise au point. En réponse, les
Nations Unies ont mis en place en 1988 une nouvelle campagne de lutte, nommée « Roll Back
Malaria »§§ et en 1993 les différentes organisations de lutte ont été priées de redoubler
d’efforts pour lutter contre le paludisme. Ce programme réunit trois agences de l’ONU***
(Unicef, Programmes des Nations Unies pour le Développement et Banque Mondiale), des
Organisations Non Gouvernementales, des entreprises privées et des centres de recherche. Ce
programme vise à réduire de moitié l’incidence et la morbidité palustre d’ici 2010 à travers la
mise en œuvre d’une lutte antipaludique. Il s’appuie sur les systèmes de santé des pays, en
insistant sur le milieu rural et sur les populations à risque, enfants et femmes enceintes.
Entre 1990 et 1998, la mortalité due à la maladie a été bien supérieure à celle observée
sur la période allant de 1982 à 1989. Depuis 1980, la prévalence des infections causées par
des parasites chimio-résistants a augmenté considérablement, ce sont eux qui semblent
également être la cause de l’augmentation de la mortalité infantile. Toute tranche d’âge
confondue, l’OMS explique l’augmentation de la mortalité imputable à la maladie ces
dernières années en Afrique par :
♦ la chimio-résistance
♦ l’exposition plus fréquente de populations non- immunisées
♦ l’émergence du VIH, d’autant plus que les personnes VIH-positives sont plus
sensibles au parasite et que les symptômes sont plus graves
♦ les modifications climatiques et environnementales
♦ l’arrêt des programmes de contrôle
‡‡ Organisation Mondiale de la Santé §§ « Roll Back Malaria » = Faire Reculer le Paludisme *** Organisation des Nations Unies
16
Cette mortalité est d’autant plus grande que dans les pays atteints, les infrastructures
médicales sont peu efficaces.
La tragédie de la maladie est que la majorité des décès pourrait être prévenue.
C’est dans ce contexte qu’il semble urgent de mettre au point de nouvelles molécules
antipaludiques (168).
La large utilisation de la quinine, d’origine naturelle, et la découverte, il y a quelques
années, de l’artémisinine, molécule extraite d’une Armoise, Artemisia annua, largement
utilisée en médecine chinoise depuis des siècles, contre les fièvres palustres, a permis de
prendre conscience de la richesse de la pharmacopée traditionnelle.
Devant cet exemple, il semble évident d’associer à la recherche de molécules
synthétiques celle de molécules naturelles extraites de plantes ou d’organismes marins, source
encore peu exploitée en pharmacologie moderne. La recherche s’oriente également vers des
molécules déjà connues, par exemple en cancérologie. Ainsi, le Taxol, issu de l’If, Taxus
brevifolia, qui est un des meilleurs anticancéreux actuels a donné de très bons résultats sur
Plasmodium (114) (130).
C’est donc avec de plus en plus d’intérêt que la recherche s’oriente vers les molécules
naturelles. De nombreuses plantes, de tous les continents, font l’objet de tests in vitro et in
vivo. Quant aux organismes marins, issus d’une ressource encore peu exploitée, ils
commencent à intéresser la recherche pharmacologique. Certaines molécules déjà extraites
d’éponges marines ou d’autres micro-organismes marins, ont elles aussi fait l’objet d’études,
essentiellement dans le domaine de la cancérologie mais aussi des maladies infectieuses (138)
(79) (115).
La girolline est une molécule issue d’une éponge marine (Cymbastela cantharella)
initialement découverte pour ses propriétés anti-cancéreuses (8) (80). Son efficacité a conduit
cette molécule jusqu’aux essais cliniques chez l’homme.
Par analogie avec le Taxol, il nous a donc semblé intéressant de savoir si la girolline,
pourrait elle aussi présenter une activité antipaludique et être exploitée à des fins
thérapeutiques. C’est pourquoi nous l’avons étudiée plus précisément pour ses activités
antipaludiques in vitro et in vivo. A notre connaissance, elle n’avait pas encore fait l’objet
d’études sur ces propriétés anti- infectieuses, essentiellement envers Plasmodium.
17
II- LE PALUDISME
La malaria (nom italien le plus utilisé du paludisme) est une maladie aiguë et grave,
caractérisée par des accès de fièvres périodiques dites palustres.
C’est une érythrocytopathie causée par un hématozoaire††† du genre Plasmodium et
transmise par un moustique femelle du genre Anopheles. Les quatre espèces affectant
l’homme sont Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax , Plasmodium ovale et Plasmodium
malariae. Elles ont pour hôte intermédiaire l’homme (même si Plasmodium malariae peut
parfois affecter les grands primates) et pour hôte définitif l’Anophèle femelle.
La maladie peut affecter l’espèce humaine mais il existe de nombreuses autres espèces
plasmodiales qui parasitent les oiseaux ou les mammifères.
Chez l’homme, c’est Plasmodium falciparum qui est l’espèce la plus largement
répandue et la plus dangereuse puisqu’elle peut provoquer des cas de paludisme grave ou
neuro-paludisme, mortel.
A- Le Parasite (23) (19)
La classification du parasite est résumée dans le tableau 2.
††† Parasite unicellulaire du sang
18
Tableau 2: Classification du parasite
Règne Protistes Sous-règne Protozoaires
Phylum Sporozoaires ou Apicomplexa
caractérisé par la présence d’un complexe apical, qui permet l’invasion d’autres cellules
Classe Sporozoea Sous-classe Coccidies parasites de divers tissus
Sous-ordre Haemospiridiidae
parasites intracellulaires obligatoires que l’on retrouve dans le sang des vertébrés. Le cycle biologique de ce sous-ordre comprend deux
hôtes : un hôte vertébré hébergeant la reproduction asexuée (hôte intermédiaire) et un
hôte arthropode, vecteur hématophage hébergeant la reproduction sexuée et transmettant le parasite
à la faveur d’un repas sanguin (hôte définitif). Ordre Coccidiida
Famille Plasmodiidae
les Haemospiridiidae comportent également la famille des Piroplasmidae, avec le genre Babesia, parasite des animaux (et parfois de l’homme s’il
est très immunodéprimé ou splénectomisé).
Genre Plasmodium comprend 10 sous-genres dont 3 infectent les vertébrés
Vinckeia parasites de rongeurs ou d’autres mammifères mais jamais des primates
Laverania parasites de primates (dont l’Homme) Sous-genres infectant les
vertébrés Plasmodium également des parasites de primates (dont
l’Homme) Plasmodium (Laverania)
falciparum
Espèces infectant l’Homme
Plasmodium (Plasmodium) vivax
Plasmodium (Plasmodium) ovale
Plasmodium (Plasmodium) malariae
19
Tableau 3: Caractéristiques générales des 4 espèces de Plasmodium humains
Plasmodium falciparum Plasmodium vivax
Plasmodium ovale
Plasmodium malariae
Longévité Généralement < 2 mois, exceptionnellement 1 an 2 à 3 ans 2 à 3 ans,
parfois 5 ans Peut atteindre
20 ans Stade
érythrocytaire infecté
Toutes les hématies Jeunes
hématies Jeunes
hématies Vieilles hématies
Durée du cycle 48 h 48h 48 h 72 h Hypnozoïtes Non Oui Oui Non
Outre la souche, la diversité et le polymorphisme génétique de Plasmodium font qu’une
infection palustre est souvent le fait de sous-populations génétiques de la même souche (3 à 9
sous-populations par infection) (143).
1- Le cycle (19) (23)
Le cycle, hétéroxène, du Plasmodium est complexe et sensiblement le même pour les
quatre espèces humaines (58). Il comporte deux étapes essentielles :
♦ un cycle asexué chez l’homme, hôte intermédiaire
♦ un cycle sexué chez le moustique, hôte définitif
a- Cycle humain ou schizogonique
a- Phase hépatique, exo-érythrocytaire
Elle débute à la faveur d’une piqûre infectante d’un homme par un anophèle femelle :
des parasites (en moyenne 5 à 10, au maximum une centaine), sous la forme de sporozoïtes (1
x 7 µm) (petit élément mobile fusiforme possédant un complexe apical de pénétration), sont
injectés dans les capillaires sanguins, parfois dans les tissus, par l’intermédiaire de la salive.
Ils restent quelques minutes à une demi-heure dans le sang. Un grand nombre d’entre eux sont
détruits par les phagocytes (macrophages) et par les anticorps spécifiques chez les sujets
immuns (137), essentiellement dans la rate.
Mais quelques-uns de ces sporozoïtes gagnent le foie, en empruntant les sinusoïdes et en
traversant la barrière constituée par les cellules de Küpffer et endothéliales. Ce passage
20
s’effectue en moins de 30 minutes. Ils envahissent les hépatocytes grâce à une interaction de
type ligand-récepteur et il se produit alors un phénomène de reconnaissance de récepteurs par
les protéines de surface des sporozoïtes. Les parasites subissent une activation par des facteurs
de l’hôte présents exclusivement dans le microenvironnement des sinusoïdes hépatiques. Les
protéines parasitaires impliquées dans la reconnaissance de molécules de l’hôte sont
exprimées ou subissent un changement conformationnel (125).
C’est le début de la phase hépatique, qui dure au minimum 6 jours. Après l’invasion des
hépatocytes et la formation d’une vacuole parasitophore, les sporozoïtes perdent leur
complexe apical et se transforment en trophozoïtes de quelques µm de diamètre et se
multiplient pendant 1 à 3 semaines : c’est la schizogonie exo-érythrocytaire. La segmentation
du cytoplasme amène la formation de « mérozoïtes ».
Les produits de ces multiplications sont des schizontes matures (masse de mérozoïtes
dans l’hépatocyte hypertrophié), ou corps bleus, volumineuses cellules pla smodiales (40-100
µm) contenant quelques milliers de noyaux (environ 30 000), déformant la cellule
hépatocytaire et repoussant son noyau en périphérie.
A maturité, ces formes provoquent l’éclatement de l’hépatocyte, qui permet la libération
des mérozoïtes (petite cellule ovalaire de 1,5 µm de diamètre), formes uninucléées, dans la
circulation sanguine. C’est l’initiation de la phase érythrocytaire.
Notons que c’est pendant la phase hépatique que les Plasmodium ovale et Plasmodium
vivax ont la capacité de former des hypnozoïtes, à l’origine des cas de reviviscence
schizogonique. Ils peuvent rester à ce stade de quiescence pendant plusieurs mois, voire
plusieurs années.
ß/ Phase sanguine, cycle sexué endo-érythrocytaire
L’incubation de ce cycle est de 7 à 15 jours et la durée est de 12 mois maximum.
C’est le complexe apical qui est la clef de voûte des phénomènes de reconnaissance et
de pénétration dans les érythrocytes. Ce complexe est constitué d’une petite proéminence de
la membrane cellulaire et d’un groupe d’organelles (deux rhoptries, un anneau polaire, des
micronèmes et des microsphères ou granules denses).
21
3333333333333333333333333333333333333Comme lors de la phase précédente, la
pénétration des mérozoïtes dans les hématies met en jeu des mécanismes de reconnaissance
du type ligand-récepteur (25). Elle est rapide, complexe et se fait en quatre étapes :
♦ contact : entre le manteau glycoprotéique du mérozoïte et la surface de
l’hématie
♦ orientation : le mérozoïte présente sa région apicale au contact de la membrane
érythrocytaire. Ce phénomène est irréversible.
♦ pénétration : les rhoptries, micronèmes et granules denses relarguent
différentes substances dans la cellule hôte, qui déstabilisent la membrane cellulaire. Une
poche d’invasion se forme, créant une vacuole parasitophore autour du mérozoïte. La
formation de cette vacuole résulte d’un réarrangement de l’architecture du cytosquelette
protéique et des membranes de la cellule hôte. Des complexes protéiques mais aussi
lipidiques parasitaires sont incorporés.
♦ endocytose : la membrane de l’hématie s’invagine.
Dans le globule rouge, le mérozoïte se déplace par mouvements amoeboïdes vers le
centre du globule rouge, prend une forme en anneau (ring) et se transforme en trophozoïte (2 à
3 µm). Il se trouve dans une vacuole parasitophore faite du matériel de la cellule hôte, qui
repousse le cytoplasme érythrocytaire en périphérie et absorbe l’hémoglobine en libérant le
pigment malarique, l’hémozoïne. C’est pendant cette période qu’apparaissent les
protubérances (knobs), responsables du phénomène de séquestration, dont un des constituants
majeur est PfEMP1‡‡‡. Ce phénomène protège le parasite du passage dans la rate, où il serait
détruit.
Après une période de croissance, un processus de divisions des noyaux débute
(schizogonie intra-érythrocytaire où le noyau peut se diviser de 3 à 5 fois) qui aboutira à la
formation des schizontes matures, ou corps en rosace. Au sein du schizonte, surviennent des
changements cytoplasmiques tels que prolifération du réticulum endoplasmique, des
‡‡‡ Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1
22
ribosomes, multiplication des mitochondries. Des sortes de « centres de formation de
mérozoïtes » se créent, où sont assemblés les différents éléments : chaque mérozoïte issu de la
zone centrale du cytoplasme du schizonte mature est constitué d’un noyau, d’une
mitochondrie et d’un apicoplaste.
La formation de ces corps finit par provoquer l’éclatement de l’érythrocyte parasité,
libérant en moyenne 8 à 24 mérozoïtes. Cet éclatement entraîne la libération d’hémozoïne et
de débris cellulaires dans la circulation sanguine, qui sont phagocytés par les polynucléaires
neutrophiles, les monocytes et les cellules macrophagiques du foie, de la rate et de la moelle.
Le cycle se reproduit alors de façon itérative et continue tout au long de l’infection : de
nouvelles hématies vierges sont colonisées et de nouvelles schizogonies endo-érythrocytaires
ont lieu. Ceci se traduit par une croissance progressive de la densité parasitaire en l’absence
de traitement ou de réponse immune. En 43 à 48 heures, le nombre de parasites est ainsi
multiplié par 10 ou 20.
Les trophozoïtes disparaissent habituellement vers la 24ième heure du cycle, du fait de
leur séquestration dans les capillaires.
Les mérozoïtes ayant envahi des érythrocytes ont la capacité de se différencier en
gamétocytes, mâles ou femelles, et donc d’initier la phase sexuée. Ils sont habituellement
détectables après plusieurs cycles de schizogonies érythrocytaires. Le stimulus responsable de
cette différenciation reste encore très mal connu : des facteurs innés et environnementaux
seraient impliqués, tels que le stress immunologique, la densité parasitaire et la
chimiothérapie (62). La chloroquine pourrait induire la gamétocytogenèse.
www.scripps.edu/.../e-20021007/winzeler.htm
Figure 2 : Erythrocytes parasités
Forme « ring »
Forme trophozoïte
Forme schizonte ayant
libéré les mérozoïtes
23
b- Cycle sexué ou sporogonique chez l’Anophèle
Les gamétocytes sont ingérés par un anophèle à la faveur d’un repas sanguin sur un hôte
infecté. Seuls les gamétocytes poursuivent leur développement, les autres stades du parasite,
ingérés de la même façon sont digérés une fois dans le moustique. Les gamétocytes vont alors
se transformer en gamètes dans l’estomac du moustique.
En quelques minutes, un gamétocyte mâle donne 8 gamètes mâles haploïdes flagellés
(20 µm) ou microgamètes filamenteux, chacun pouvant fusionner avec un gamète femelle
haploïde, ou macrogamète, issu d’un gamétocyte femelle unique, après expulsion des
corpuscules chromatiniens.
Le microgamète résulte du phénomène d’exflagellation ou microgamètocytogenèse, où
le noyau du gamètocyte mâle se divise.
La gamogonie (fécondation) aboutit à la formation d’un zygote diploïde, qui subit deux
méioses, en moyenne 5 heures après sa formation. Il se transforme alors en oocinète diploïde
non mobile. Zygote et occinète sont les deux seules formes diploïdes du parasite.
Environ 10 heures après le repas sanguin, l’oocinète se transforme en ookinète par
méiose réductionnelle rapide. Il est mobile et possède un complexe apical de pénétration.
L’ookinète traverse activement la paroi stomacale de l’anophèle pour former, à la
surface de celle-là, un oocyste. Cette étape dure moins de 24 heures.
Dans l’oocyste, les cellules parasitaires vont se multiplier par divisions cellulaires pour
libérer en quelques jours et après éclatement de l’oocyste, un millier de sporozoïtes ou
cellules filles, mobiles.
Il est intéressant de noter que cette période est de durée variable, elle raccourcit avec
l’élévation de température, ce qui explique la transmission plus importante en périodes
chaudes.
Enfin, les sporozoïtes gagnent, 12 jours plus tard, les glandes salivaires de l’hôte
définitif pour s’y accumuler. Au cours d’un repas sanguin ultérieur, quelques dizaines de
sporozoïtes sont régurgités et inoculés à un nouvel individu. Une femelle anophèle possédant
des sporozoïtes dans ses glandes salivaires reste infestante toute sa vie.
24
Cette phase sexuée dure de 10 à 40 jours selon la température ambiante. Elle cesse avec
le froid (environ 18°C pour Plasmodium falciparum) et à la limite supérieure de 45°C.
C’est pendant cette période, courte, du cycle biologique du parasite, que celui-ci peut
évoluer par recombinaison génétique.
www.ksu.edu/parasitology/546tutorials/protquery26
Figure 3 : Erythrocytes parasités par des gamétocytes
2- Les caractéristiques
A l’intérieur de la vacuole parasitophore, au sein de l’hématie hôte, le parasite a besoin
d’éléments nutritifs et d’énergie afin de poursuivre son développement. Mais le globule rouge
est dépourvu de noyau et d’organites intracellulaires, il ne peut y avoir de synthèse. La survie
et la multiplication du Plasmodium passent alors par l’importation de nutriments et
l’utilisation de diverses voies métaboliques.
a- Métabolisme
Le parasite puise les éléments qui lui sont nécessaires dans le plasma ou le cytoplasme
de l’hématie ou alors il les synthétise à partir d’éléments simples (synthèse de novo, à partir
du glucose, de la glutamine par exemple).
25
Figure 4 : Cycle de Plasmodium
Lors de l’invasion des érythrocytes, le parasite digère de 25 à 80% d’hémoglobine pour
récupérer les acides aminés dont il a besoin et ainsi construire ses propres protéines. Le
phénomène se déroule à l’intérieur de la vacuole digestive dont le pH est très acide.
♦ L’hémoglobine est catalysée en globine, source d’acides aminés et en hème. La
formation d’hème-Fe§§§(II) libre génère un stress oxydatif toxique pour le parasite. Un
mécanisme de polymérisation est alors mis en jeu par ce dernier pour détoxifier l’hème. Un
complexe, l’hémozoïne ou pigment malarique, est formé pour détourner le stress oxydatif.
§§§ Fer
26
Figure 5 : Métabolisme de l’hémoglobine par le parasite
L’hémoglobine du cytosol du globule rouge est transportée, par pinocytose, vers la
vacuole digestive du jeune trophozoïte. Le catabolisme de cette hémoglobine, qui libère
l’hème toxique, est ralenti par le pH acide de la vacuole. Il se fait sous l’action de protéases
parasitaires qui séparent la partie hème de la partie globine de la molécule.
La toxicité de l’hème libre, ou protoporphyrine IX soluble, se joue sur les protéases du
parasite ainsi que sur les membranes, endommagées par la libération de radicaux libres. La
détoxification se fait par cristallisation des protoporphyrines en hémozoïne insoluble, non
toxique. Le parasite est également capable de survivre à l’environnement pro-oxydant qui
règne au sein de la cellule-hôte. Il met en place un système de défense anti-oxydant.
♦ Le parasite possède des capacités métaboliques et de transport des nutriments
et ions réduites (absence de gluconéogenèse, déficience de biosynthèse des acides aminés), ce
qui le rend dépendant des acides aminés de son hôte. Il ne possède pas de réserve de
glycogène ou d’autres polysaccharides. Sa source d’énergie est alors essentiellement le
Hémoglobine
Protéolyse
Peptides Acides aminés
Fe(II)PPIX Fe(III)PPIX
Stress oxydatif
Détoxification de l’hème
(polymérisation)
Vacuole parasitophore
Cytoplasme du parasite Erythrocyte
27
glucose plasmatique, une hématie parasitée consomme bien plus de glucose qu’un globule
rouge sain.
♦ En parallèle de la glycolyse anaérobie existe une voie de métabolisation du
glucose, la voie des pentoses phosphates. Le ribose-5-phosphate produit peut être utilisé dans
la biosynthèse nucléotidique de certaines cellules. Cette voie est une source importante de
NADPH****, qui joue un rôle dans le maintien à l’état réduit du glutathion, protection de la
cellule contre le stress oxydatif.
♦ Notons également que Plasmodium est capable de fixer le CO2†††† (128) (33) et
produire de l’a-cétoglutarate et de l’oxaloacétate. La voie de l’oxaloacétate conduit à la
formation d’aspartate, de malate, de glutamate et de citrate.
♦ La synthèse d’ADN ‡‡‡‡ se produit tout au long du cycle : au sein de l’hôte
définitif, elle a lieu dans les hépatocytes et les érythrocytes. Au sein du vecteur, cette synthèse
ne se produit qu’au niveau de l’estomac après fécondation et dans la formation de l’oocyste.
Mais le Plasmodium, comme l’hématie, est incapable de synthétiser le noyau purique.
Le parasite récupère les purines de l’hôte pour la synthèse de ses acides nucléiques (22) (136)
(57). Les bases purines nécessaires au parasite, l’adénosine, l’hypoxanthine, la xanthine et la
guanine, sont importées du milieu extracellulaire à l’aide de transporteurs spécifiques.
L’hypoxanthine est la principale source de purines et son incorporation (lorsqu’elle
radiomarquée) sert de marqueur de croissance dans la méthode décrite par Desjardins et al.
(49).
Par contre, le parasite est capable de synthétiser de novo les bases pyrimidiques. Cette
synthèse est liée au métabolisme des fo lates. Notons qu’une enzyme de ce métabolisme, la
DHFR§§§§ dépendante du NADPH, est la cible de l’association pyriméthamine-sulfadoxine,
utilisée dans le paludisme non compliqué (143).
**** Nicotinamide Adénine Dinucléoside Phosphate †††† Dioxyde de Carbone ‡‡‡‡ Acide Désoxyribonucléique §§§§ Di Hydro Folate Réductase
28
♦ Le métabolisme des lipides est quant à lui très actif chez Plasmodium qui
synthétise de nombreuses membranes lors de sa multiplication. Précisons que ces membranes
sont, contrairement à celles de la plupart des organismes eucaryotes, dépourvues de
cholestérol. Elle est essentiellement composée de phospholipides (phosphatidylcholine et
phosphatidylethanolamine). Si le parasite est capable d’incorporer certains phospholipides du
plasma, il possède également ses propres voies de biosynthèse.
♦ Par contre il ne peut synthétiser ses propres acides gras et utilise donc ceux du
plasma. On note une importante activité acétyl-CoA***** synthétase, qui produit de l’acétyl-
CoA, donneur d’acides gras (143).
♦ Les stades sanguins asexués de Plasmodium sont microaérophiles, c'est-à-dire
que leur croissance peut se faire sous de faibles pressions en oxygène. La respiration
s’effectue par un mécanisme de transfert d’électrons dans la mitochondrie et grâce aux
cytochromes.
b- Génétique
Le génome de Plasmodium falciparum comporte 23 Mb††††† codant pour environ 5 300
gènes (dont 55% d’introns) sur 14 chromosomes. Ce génome est riche en adénine et en
thymine. Le parasite contient 2 à 5 fois plus d’ARN ‡‡‡‡‡ que d’ADN.
Environ 60% des protéines codées ont peu ou pas d’équivalences chez les autres
organismes connus et leurs fonctions restent quasiment inconnues.
Une grande partie du métabolisme de Plasmodium reste mal connue aujourd’hui. Peu
d’enzymes ou sous-unités enzymatiques ont été identifiées, et celles qui le sont différent de
celles connues chez les autres organismes. De plus, chaque souche de Plasmodium possède
des iso-enzymes différentes qui lui confèrent un comportement différent vis-à-vis des
molécules antipaludiques.
***** Co-enzyme A ††††† Méga Base ‡‡‡‡‡ Acide Ribonucléique
29
Notons le peu d’importance que constituent les facteurs de transcriptions dans
l’ensemble des protéines parasitaires. Par contre, il est intéressant de mentionner l’importance
du génome dans la synthèse des protéines impliquées dans l’échappement à la réponse
immunitaire de l’hôte et dans les interactions hôte-parasite.
3- Le vecteur
Le cycle sexué, ou sporogonique, de Plasmodium s’effectue seulement chez les femelles
de certaines espèces de moustiques du genre Anopheles. Les mâles ne se nourrissent pas de
sang.
Ces insectes diptères appartiennent à la famille des Culicidae et à la sous-famille des
Anophelinae.
Il existe environ 400 espèces d’Anophèles dans le monde mais seule une soixantaine
d’entre elles sont vecteurs du paludisme en conditions naturelles.
Parmi ces espèces, citons : Anopheles gambiae et Anopheles funestus (Afrique, au Sud
du Sahara, Madagascar), Anopheles minimus (Chine su Sud, Péninsule Indochinoise,
.Anopheles maculipennis.
Les conditions de survie de ces moustiques nécessitent de l’humidité et une température
ambiante supérieure à 16°C. C’est pourquoi on ne retrouve généralement pas de paludisme
au-dessus de 1 500 m d’altitude en Afrique et 2 500 m en Asie ou en Amérique.
Les larves d’Anophèles se multiplient dans les eaux dormantes, qui constituent donc un
réservoir de la maladie.
La piqûre indolore est nocturne, le plus souvent à la tombée de la nuit.
entomology.ucdavis.edu/faculty/lanzaro/index.htm
Figure 6 : Anopheles gambiae
30
B- La Pathologie
1- Symptômes (23) (19) (117)
La période d’incubation, délai entre l’infection et l’apparition des manifestations
cliniques, dure en moyenne, 12 jours mais ses extrêmes sont de 9 jours et 12 mois.
La phase hépatique, exo-érythrocytaire, est asymptomatique, les signes cliniques sont
liés à la phase de schizogonie érythrocytaire. Une infection non traitée dure en moyenne de 2
mois à 2 ans. Les manifestations cliniques sont liées à l’espèce plasmodiale en cause mais
aussi à l’immunité de l’hôte, à la parasitémie et à divers phénomènes peu ou mal connus.
a- Paludisme non compliqué = accès palustre simple
C’est la forme la plus fréquente. La fièvre est toujours présente et fréquemment associée
à divers symptômes :
♦ asthénie
♦ algies multiples
♦ céphalées
♦ vomissements
♦ parfois diarrhées
Ces manifestations cliniques habituelles miment d’autres maladies et peuvent donc
masquer leurs symptômes. Elles peuvent par ailleurs être modérées alors que la parasitémie
est déjà élevée. L’évaluation clinique du paludisme est donc difficile.
a- Primo-invasion
L’accès de primo-invasion apparaît chez un sujet non- immunisé c'est-à-dire :
♦ les enfants de 4 mois à 4-6 ans en zones d’endémie
♦ les adultes ayant voyagé en zones d’endémie
31
Les premiers signes apparaissent 10 à 20 jours après la piqûre infestante mais le délai
peut atteindre plusieurs mois (classiquement si la souche est chloroquino-résistante, chez les
sujets dont la chimio-prophylaxie était inadéquate ou mal suivie).
Le tableau clinique est le suivant :
♦ fièvre continue et croissante, en plateaux ou oscillations irrégulières. Elle se
stabilise ensuite. Plusieurs pics de fièvres peuvent survenir dans une journée et atteindre 39 à
40°C.
♦ malaise général avec :
♦ myalgies et arthralgies. Les myalgies, bien qu’importantes ne sont jamais
aussi sévères que celles observées lors de dengue et les muscles sont moins tendus qu’en cas
de leptospirose ou de typhus
♦ céphalées
♦ douleurs abdominales avec troubles digestifs, nausées, vomissements et
diarrhées
♦ anorexie
♦ parfois le foie est légèrement hypertrophié et hypersensible
♦ les urines peuvent être rares et foncées
Cette forme évolue spontanément en fièvre persistante avec rémission et recrudescence
pendant 8 à 15 jours. Elle peut devenir intermittente. Il existe un risque de passage à la forme
compliquée.
ß- L’accès palustre ou accès à fièvre périodique
C’est la forme classique qui survient chez le sujet adulte et immun et fait suite à la
primo-invasion. Certains sujets risquent plus préférentiellement de déclarer cette forme :
jeunes enfants, femmes enceintes et voyageurs non immunisés ou avec une prophylaxie
déficiente.
Notons qu’avec Plasmodium ovale et Plasmodium vivax , le phénomène de reviviscence
(dû au « réveil » des hypnozoïtes) peut décaler cet accès de plusieurs mois à plusieurs années.
32
Les rechutes observées avec Plasmodium malariae sont quant à elles dues à des formes
érythrocytaires latentes.
L’accès palustre se déroule de manière stéréotypée. La fièvre tierce, à Plasmodium
falciparum, Plasmodium ovale ou Plasmodium vivax est caractérisée par des clochers
thermiques tous les deux jours tandis que la fièvre quarte à Plasmodium malariae l’est par des
clochers tous les trois jours. La fièvre à Plasmodium vivax, Plasmodium ovale et Plasmodium
malariae est bénigne et régulière. Elle est maligne et irrégulière avec Plasmodium falciparum.
Enfin, notons qu’une co- infection peut faire se chevaucher les cycles schizogoniques,
provoquant une fièvre quotidienne qui complique le diagnostic.
Les accès thermiques surviennent le plus souvent brutalement en fin de journée, ou dans
la nuit.
Trois stades se succédant sur 9 à 10 heures :
♦ frissons (associés à une sensation de froid, des tremblements et des malaises),
d’une durée de 1 heure. Le malade ressent un froid intense alors que sa température peut
atteindre 39°C. La rate peut être hypertrophiée et la tension artérielle diminuée.
♦ chaleur avec fièvre élevée (supérieure à 40°C), d’une durée de 4 heures. La
peau d’un malade est sèche et brûlante. Le volume de la rate diminue.
♦ sueurs profondes et abondantes avec décroissance thermique et grande fatigue,
d’une durée de 2 à 4 heures. La tension artérielle remonte. Cette période peut être suivie d’une
sensation de bien-être, voire d’euphorie.
Dans 20% des cas on note aussi des vomissements et des diarrhées. La splénomégalie et
l’anémie sont présentes lors de l’éclatement massif et répété des hématies.
Chez le patient non traité, plusieurs cycles peuvent ainsi se répéter. Mais si cette forme
à fièvre périodique est le tableau classique, elle n’est que rarement observée avec autant de
rigueur pour le paludisme à Plasmodium falciparum. Elle l’est par contre plus fréquemment
en cas de paludisme à Plasmodium vivax et Plasmodium ovale.
33
b- Le paludisme grave ou compliqué
Sa présentation classique est le neuro-paludisme, défini par l’altération de la conscience
fébrile pouvant faire tomber le patient dans le coma. C’est une encéphalopathie fébrile, aiguë,
diffuse et symétrique. Cette forme est responsable de la majorité des décès attribués au
paludisme. Elle est fatale dans 20 à 30% des cas.
Le paludisme grave n’est provoqué que par Plasmodium falciparum chez l’adulte (par
les quatre espèces chez l’enfant) et peut survenir d’emblée après une primo-infection ou
comme évolution d’un paludisme de primo-invasion. Si cette forme peut atteindre tous les
âges des deux sexes, elle est le plus souvent rencontrée chez les enfants de quatre mois à
quatre ans, de sexe masculin.
Le paludisme grave peut apparaître de façon progressive, avec une fièvre irrégulière, un
syndrome algique et des troubles digestifs proches de ceux de l’accès simple de primo-
infection. Mais il peut également survenir de façon plus brutale, parfois même foudroyante,
avec une fièvre, des convulsions et un coma qui constituent la triade symptomatique
caractéristique.
L’évolution de cette forme dépend de la rapidité et de la qualité de la prise en charge.
En l’absence de traitement, la mort survient en deux à trois jours.
a- Symptômes généraux
Ce paludisme grave est provoqué par le blocage des vaisseaux sanguins qui irriguent le
cerveau par les globules rouges parasités. Ce blocage résulte de la cytoadhérence de ces
hématies aux parois vasculaires et de l’intervention de nombreuses cytokines. On note
également des schizogonies au sein des capillaires intra-cérébraux.
♦ L’obstruction vasculaire entraîne une anémie cérébrale qui explique les
signes cliniques neurologiques :
♦ troubles de la conscience, qui peuvent prendre toutes les formes possibles,
dont des délires, des obnubilations et de la stupeur.
34
♦ troubles psychiques, avec confusion mentale, anxiété et troubles du
langage.
♦ coma profond (stade 2)§§§§§. On considère que le coma provoque 20% de
mortalité chez l’adulte et 15% chez l’enfant, et ce, même dans le cadre d’une prise en charge
médicale correcte. Il est le plus souvent calme, hypotonique mais il est possible de rencontrer
des formes agitées et hypertoniques. Le coma peut provoquer des troubles cérébelleux qui se
traduisent par une démarche ébrieuse avec dysmétrie.
♦ convulsions, généralisées et fréquentes. Elles peuvent être plus localisées
(hémi-corps). Elles sont soit isolées soit répétées, provoquant alors une encéphalite palustre
avec état de mal convulsif. Elles coïncident avec l’acmé des pics thermiques. Elles atteignent
jusqu’à 50% des enfants présentant un paludisme cérébral.
♦ signes méningés. On peut observer une divergence oculaire et une
disparition de la plupart des réflexes. Le réflexe cornéen est cependant conservé sauf lors de
coma profond. Le tonus musculaire peut être augmenté ou diminué et la posture en flexion ou
en extension. Les paralysies sont rares, associées au coma.
♦ fièvre pouvant atteindre 40 à 41°C. Dans un tiers des cas, elle est
supérieure à 41°C et est alors de mauvais pronostic. La fièvre s’associe à une accélération du
pouls.
♦ hémorragies cornéennes et diverses atteintes oculaires dans 10 à 30 % des
cas.
♦ troubles métaboliques tels qu’acidose et hypoglycémie. L’hypoglycémie
est fréquente surtout chez les enfants et les femmes enceintes et est de mauvais pronostic bien
que difficile à diagnostiquer. Elle résulte d’une défaillance de la gluconéogenèse hépatique et
de l’augmentation de la consommation du glucose à la fois par l’hôte et par le parasite. De
plus, quinine et quinidine, deux molécules couramment utilisées dans le traitement du
paludisme sévère, stimulent la sécrétion d’insuline pancréatique. Cette hypoglycémie aggrave
§§§§§ Disparition de la capacité d’éveil du sujet. Réaction aux stimuli douloureux parfois encore
appropriée. Communication avec le malade impossible
35
la souffrance cérébrale. L’acidose est elle aussi une cause majeure de décès, les
concentrations plasmatiques élevées en bicarbonates et lactate sont de bons éléments
pronostic.
♦ L’anémie quant à elle entraîne une dyspnée qui aggrave l’acidose et provoque
une tachycardie. L’hématocrite est inférieur à 15% ou l’hémoglobine à 5 g/dL. Elle peut
survenir rapidement et nécessiter une transfusion. Une épistaxis, des pétéchies ou une
hémoglobinurie peuvent survenir. Dans certaines zones d’Afrique, on observe des anémies
sévères consécutives à des infections répétées qui provoquent une réduction du temps de vie
des cellules sanguines ainsi qu’une dysérythropoïèse parfois non détectée. Au sujet de
l’anémie, il faut également savoir qu’elle est souvent responsable de la résistance au
traitement.
♦ D’autres atteintes sont possibles, comme l’insuffisance rénale aiguë, l’œdème
pulmonaire lésionnel, le choc septique, le syndrome de détresse respiratoire ou encore la
coagulation intra-vasculaire disséminée.
♦ Notons que l’œdème pulmonaire est une cause fréquente de décès et qu’il est
souvent aggravé par l’administration intraveineuse forte de fluides.
♦ Un ictère sévère peut apparaître et résulter de l’hémolyse, des lésions
hépatocytaires ainsi que de la cholestase. La bilirubinémie libre (résultant de la transformation
de l’hémoglobine libérée) augmente. Les dysfonctionnements hépatiques contribuent à
l’hypoglycémie, l’acidose lactique et les modifications de métabolisme des molécules.
L’hépatomégalie est un signe de mauvais pronostic, elle apparaît principalement chez les
enfants.
♦ Enfin, il faut savoir que l’atteinte rénale est plus fréquente chez l’adulte que
chez l’enfant et qu’elle se signe par une nécrose tubulaire aiguë sans nécrose corticale.
L’insuffisance rénale peut être d’origine fonctionnelle, les urines sont alors foncées et il y a
oligurie. Mais elle peut également être organique (1 à 2% des cas), dans ce cas il y a oligo-
anurie et la créatinine augmente.
Il existe des cas de paludisme grave se manifestant par ces symptômes mais sans les
troubles neurologiques.
36
ß- Cas particulier des adultes
Les adultes présentent les premiers signes de gravité après 3 à 7 jours d’évolution non
traitée. Des formes algides, avec hypothermie à 36°C, douleurs thoraco-abdominales
violentes, défaillance hépatique aiguë peuvent être observées.
d- Cas particulier des enfants
Si les adultes souffrent généralement peu de séquelles après une telle forme de
paludisme, 15% des enfants survivants à un paludisme compliqué présentent des déficits
neurologiques (hémiplégie, déficit cognitif…).
Les enfants présentent essentiellement des signes neurologiques accompagnés
fréquemment d’anémie sévère, d’hypoglycémie et d’acidose métabolique. Pour eux
l’évolution est souvent fatale et plus rapide. De plus il existe un problème de diagnostic
différentiel entre les septicémies, fréquentes dans les pays pauvres, et le paludisme sévère.
Pourtant, les enfants tolèrent bien les molécules antipaludiques et répondent rapidement au
traitement.
Il existe également chez les enfants des accès pernicieux cholériformes. On note alors
vomissements, diarrhées incoercibles, déshydratation. Un collapsus est possible.
e- Cas particulier des femmes enceintes
♦ Chez les femmes enceintes, le paludisme grave provoque une anémie avec
hypoglycémie, œdème aigu du poumon et parfois la mort du fœtus. L’incidence du paludisme
augmente au cours de la grossesse, surtout dans le dernier trimestre et principalement chez les
primipares ou les femmes au cours de leur seconde grossesse pour Plasmodium falciparum
(ce sont les multipares qui sont plus exposées pour Plasmodium vivax). L’infection maternelle
par le VIH prédispose les femmes enceintes à développer un paludisme gestationnel et leurs
nouveaux-nés à l’infection palustre congénitale.
♦ Le paludisme gestationnel provoque : avortement, décès ou retard de
croissance intra-utérins. Le fœtus peut naître avec un poids de naissance diminué, en moyenne
37
de 170 g ou l’accouchement peut être prématuré (94). C’est un facteur d’augmentation de la
mortalité néo-natale.
Des critères de définition du paludisme grave ont été élaborés par l’OMS pour les
populations locales des zones d’endémie.
Tableau 4: Critères de diagnostic du paludisme grave ou compliqué (3)
Critères majeurs
- Neuro-paludisme (coma irréductible sans autre étiologie
- Convulsions répétées (> 1 / 24 heures)
- Anémie grave (Ht****** < 15% ou Hb†††††† < 5 g/dL avec parasitémie > 10 000 parasites/µL)
- Insuffisance rénale (oligurie < 400 ml/24 h chez l’adulte, < 12 ml/kg/24 h chez l’enfant, non corrigée par la réhydratation, et créatinémie > 265 µmol/L)
- Œdème pulmonaire ou syndrome de détresse respiratoire de l’adulte
- Hypoglycémie < 2,2 mmol/L
- Collapsus circulatoire ou état de choc (pression systolique < 80 mmHg chez l’adulte ou < 50 mmHg chez l’enfant, associée à une peau moite et froide)
- Hémorragies spontanées ou CIVD‡‡‡‡‡‡
- Convulsions généralisées répétées (> 2/24 h), malgré le traitement de l’hyperthermie
- Acidémie (pH artériel < 7,25) ou acidose métabolique (bicarbonatémie < 15 mmol/L)
- Hémoglobinurie macroscopique Critères accessoires
- Troubles de la conscience sans coma
- Prostration ou faiblesse extrême
- Ictère clinique ou bilirubinémie totale > 50 µmol/L
- Parasitémie > 4% chez le sujet non immun ou > 20% chez le sujet immun
- Hyperthermie > 40°C
****** Hématocrite †††††† Hémoglobine ‡‡‡‡‡‡ Coagulation Intra -Vasculaire Disséminée
38
c- Paludisme viscéral évolutif
Ce paludisme est rare et résulte d’infections parasitaires répétées en zones d’endémie au
début de la phase d’acquisition de l’immunité. On le rencontre essentiellement chez l’enfant
de 2 à 5 ans ou chez l’adulte ayant suivi une chimio-prophylaxie incorrecte.
Dans ce cas, on observe une anémie hémolytique souvent intense (avec pâleur, asthénie,
anorexie) une dyspnée d’effort et parfois un souffle cardiaque. Le foie et la rate voient leur
volume augmenter, la rate est alors fibrocongestive. Une fièvre irrégulière peut apparaître et
provoquer une altération progressive de l’état général. Des oedèmes des membres inférieurs
apparaissent.
En l’absence de traitement, l’évolution se fait par une complication anémique, une
cachexie, parfois même avec une cirrhose hépatique et rupture de la rate.
Il est pourtant possible que cette forme évolue spontanément vers la guérison.
d- Fièvre bilieuse hémoglobinurique
Cette forme est exceptionnelle et provoquée par une prise inadaptée ou irrégulière de
quinine naturelle ou d’halofantrine (en prophylaxie ou en curatif). Elle est également nommée
« Black Water Fever ».
On assiste alors à une réaction de type immuno-allergique. Notons que cette forme se
distingue de l’accès pernicieux par une faible parasitémie, voir son absence.
Le début de la crise est brutal, avec apparition de lombalgies violentes, un état de
prostration, suivis de vomissements alimentaires devenant bilieux.
Il y a dans ce cas une hémolyse intra-vasculaire massive, une fièvre de 40°C, un état de
choc avec diminution de la tension artérielle. On observe également une oligo-anurie et des
urines foncées.
La mortalité de ce paludisme est fonction de la structure médicale à disposition. Il faut
en effet corriger rapidement l’anémie et obtenir une reprise de diurèse, mais également
procéder à une exsanguino-transfusion avec épuration extra-rénale.
39
2- Physiopathologie (23)
a- Contamination
L’homme représente l’unique réservoir de la maladie, la transmission se fait à partir
d’un sujet malade, par l’intermédiaire de l’Anophèle. Dans les zones de paludisme
endémique, un certain nombre de personnes parasitées, parfois fortement, ne présente pas de
symptômes. Ces porteurs asymptomatiques de la maladie sont responsables d’une grande
partie des transmissions du parasite et constituent donc un important réservoir de la maladie
(58).
Il existe également une contamination inter-humaine directe qui s’effectue dans le cadre
de la transmission transplacentaire.
Enfin, en France, grâce au dépistage systématique des donneurs de sang, la
contamination au cours des transfusions sanguines reste un cas extrêmement rare comme les
cas de transmission lors de greffes d’organes.
b- Immunité
L’homme n’est pas capable de développer une immunité innée efficace, ce qui implique
que la gravité de la parasitose dépend largement du statut immunitaire de la personne infectée.
♦ Lors de ré-infestations répétées, l’individu est capable de mettre en place une
immunité relative, ou état de prémunition, qui permet de limiter les effets pathologiques du
paludisme, les accès palustres s’avèrent alors plus rares et moins graves.
La plupart des personnes soumises au risque de paludisme vivent dans des régions où la
transmission est stable, l’infection y est suffisamment fréquente pour que cette immunité se
mette en place. Par contre, les personnes vivant en périphérie de ces zones sont soumises à
des infections et des épidémies saisonnières, cette immunité ne peut se mettre en place.
Dans les zones de transmission stable, ce sont les groupes des très jeunes enfants et des
femmes enceintes qui présentent les taux de mortalité et de morbidité les plus élevés. La
plupart des enfants est primo-infectée durant la première ou la deuxième année de vie, lorsque
l’immunité n’est encore pas assez développée, la maladie à cet âge est très dangereuse. Dans
40
ces zones- là, l’immunité développée par les femmes adultes est déprimée à la première
grossesse, ce qui cause également une grave maladie.
Mais cette immunité reste strictement spécifique de l’espèce plasmodiale, c’est une
immunité acquise dite « de souche » qui explique les fluctuations observées au cours
d’infestations multiples et les difficultés rencontrées dans la recherche d’un vaccin. Les
individus qui l’ont développée deviennent alors porteurs asymptomatiques. Elle est médiée
par des anticorps dirigés contre différents antigènes de surface.
Cette immunité s’atténue si le contact ou les ré- infestations sont interrompus pendant
quelques années. La variabilité naturelle de Plasmodium, due aux variations antigéniques
nombreuses, est présumée être le facteur majeur de cette susceptibilité persistante, même
après une longue exposition.
De plus, en ce qui concerne l’immunité développée à l’encontre du paludisme, il faut
noter qu’elle déprime celle développée contre d’autres antigènes, ce qui provoque une
diminution de la résistance de l’individu, ainsi que de sa réponse à certaines vaccinations.
Enfin, face à une première exposition au parasite, l’immunité individuelle est variable :
certaines personnes peuvent rapidement décéder tandis que d’aut res vont faire preuve d’une
certaine résistance en développant une immunité innée ou acquise.
♦ En ce qui concerne l’immunité innée, il est dit que le paludisme est l’agent
infectieux qui a le plus d’impact sur le génome de l’hôte. Dans les zones où les populations
humaines sont exposées à de hauts niveaux de transmissions, certains traits génétiques
(comme celui de la drépanocytose, maladie du sang fréquente en Afrique) sont sélectionnés
au fil des générations, conférant à ces populations une certaine protection.
Les nouveaux-nés quant à eux présentent une protection contre les fortes densités de
parasitémie jusqu’à l’âge de six mois, acquise in utero.
41
♦ Dans cette immunité, le rôle des cytokines reste mal connu. Certaines
protéines sécrétées, telles HRPII§§§§§§ ou les ancres GPI*******, contribuent à développer un
contexte inflammatoire fort et à la libération de cytokines : le TNFa††††††† qui joue le rôle
principal, les cytokines IL6‡‡‡‡‡‡‡ et IL1, pro-inflmmatoires, IL10 et TGFß
§§§§§§§, anti-
inflammatoires
Ce sont les cytokines qui sont responsables des symptômes tels que la fièvre et le
malaise. Il existe une bonne corrélation entre le niveau de cytokines et le pronostic du
paludisme sévère. IL12 et TGFß, qui permettent la régulation de la balance entre cytokines pro-
et anti- inflammatoires, sont retrouvés à des niveaux plus élevés dans le paludisme non
compliqué.
Les cytokines modulent l’expression des protéines d’adhésion pour les cellules
endothéliales.
Sous l’effet du TNF, du NO******** est libéré par les cellules cérébrales. Cette
hyperproduction cérébrale serait à l’origine des signes neurologiques.
Les cytokines causent la fièvre palustre et ont probablement un rôle dans les
dysfonctionnements placentaires, la suppression de l’érythropoïèse et l’inhibition de la
gluconéogenèse.
La prémunition qui peut se mettre en place à l’encontre de la maladie est le reflet à la
fois de la réponse immunitaire et de la production régulée de ces cytokines.
♦ Les processus immunitaires
Les infections aiguës à Plasmodium sont caractérisées par une activation polyclonale
des lymphocytes B avec faible activation des populations de lymphocytes T. Pourtant, bien
§§§§§§ Histidin Rich Protein II ******* Glyco Phosphatidyl Inositol ††††††† Tumor Necrosis Factor ‡‡‡‡‡‡‡ Interleukine §§§§§§§ Tumor Growth Factor ******** Monoxyde d’azote
42
que les personnes qui vivent en zones d’endémie présentent des hyperglobulinémies, il semble
que ces anticorps soient spécifiques d’une souche.
c- La séquestration et la cytoadhérence
Les érythrocytes qui contiennent les formes matures de Plasmodium falciparum
adhèrent à l’endothélium vasculaire (c’est la cytoadhérence) et disparaissent de la circulation
sanguine. Ce phénomène de séquestration commence environ 12 heures après le début du
cycle asexué du parasite et est accéléré à l’apparition de la fièvre.
Cette séquestration interfère avec le flux de la microcirculation. Une fois adhérés, les
globules rouges parasités ne retournent plus dans la circulation et on ne retrouve pas de
formes matures dans les frottis sanguins lorsque ce phénomène a lieu.
La séquestration est plus importante dans les organes vitaux : essentiellement le
cerveau, mais aussi le cœur, les yeux, le foie, les reins, les intestins et le tissu adipeux et
parfois la peau.
C’est cette cytoadhérence, accompagnée du phénomène de « rosetting » qui provoquent
l’obstruction des vaisseaux, cause de la glycolyse anaérobie, de l’acidose lactique et des
nombreux dysfonctionnements cellulaires.
Elle est médiée essentiellement par un variant PfEMP1 (pour Plasmodium falciparum
erythrocyte membrane protein 1), ligand parasitaire spécifique de souche et de haut poids
moléculaire. Douze heures après le début du cycle asexué, PfEMP1 est exprimé à la surface
de l’érythrocyte parasité, formant des knobs, points d’attachement à l’endothélium vasculaire.
Notons que PfEMP1 est sujet à d’importantes variations antigéniques.
♦ Les ligands endothéliaux
Différentes protéines à la surface des endothéliums peuvent lier les hématies parasitées
grâce à des interactions complexes. Au niveau du cerveau, c’est la molécule ICAM1††††††††
qui est impliquée de façon majoritaire dans ces interactions. Au niveau des villosités
†††††††† Inter-Cellular Adhesion Molecule 1
43
placentaires, on retrouve la molécule CSA‡‡‡‡‡‡‡‡. Au niveau des endothéliums vasculaires des
autres organes, c’est la molécule CD36 qui est majoritaire.
♦ Rosetting et agrégation
Les érythrocytes parasités par des formes matures adhèrent également aux hématies
saines, formant ainsi entre eux des « rosettes », microscopiquement visibles. Ce phénomène
débute environ 16 heures après le début du cycle asexué et est médiée par l’attachement de
domaines spécifiques de PfEMP1 à certains récepteurs.
Le rôle du phénomène dans le paludisme grave est controversé, il réduirait le flux
sanguin et de la microcirculation.
La formation de microthrombus dans les capillaires cérébraux et pulmonaires provoque
la lyse des rosettes. Ce phénomène est responsable de la libération de substances
phospholipidiques, induisant le processus de coagulation intra-vasculaire dissiminée. Il y a
également libération de substances vaso-actives (kinine, sérotonine, histamine), qui sont à
l’origine de la vasodilatation capillaire.
♦ Déformabilité des globules rouges
Un parasite mature au sein d’un érythrocyte conduit au passage d’une forme
normalement flexible et biconcave de cette hématie à une forme plus sphérique et plus rigide.
La diminution de cette déformabilité des globules rouges aurait un rôle dans la sévérité
de la maladie.
d- Mécanismes de la maladie
♦ L’infection des hématies provoque leur éclatement, qui entraîne alors une
hémolyse avec libération de matériel parasitaire (hémozoïne, potassium, ancre GPI) dans la
circulation. C’est ce qui est responsable de la fièvre, de l’anémie et de l’ictère communément
observés lors de paludisme.
‡‡‡‡‡‡‡‡ Chondroitin Sulfate A
44
♦ l’atteinte cérébrale :
La physiopathologie est mal connue.
L’augmentation de la pression intra-crânienne résulte d’une augmentation du volume
sanguin cérébral avec maintien de la perfusion cérébrale et concentration de parasites dans ce
compartiment.
Les enfants seraient plus vulnérables car juste après la soudure des os du crâne, l’espace
disponible pour l’expansion crânienne est plus faible que chez les adultes.
La cause du coma est quant à elle inconnue.
♦ l’accès pernicieux :
Il se caractérise par une anoxie cérébrale provoquée par la thrombose vasculaire.
L’adhérence des globules rouges lors du paludisme à Plasmodium falciparum est responsable
d’une augmentation de la perméabilité vasculaire et de petites hémorragies.
♦ la fièvre :
Elle est due à la libération de l’hémozoïne et du potassium à l’éclatement synchrone des
globules rouges contenant des corps en rosace. Le pigment malarique est hautement
pyrétogène.
L’éclatement des schizontes peut être asynchrone, la fièvre est dans ce cas irrégulière,
voire continue.
♦ l’anémie :
Sa pathogenèse est multifactorielle. Elle est provoquée par la destruction des globules
rouges, conséquence de trois phénomènes :
♦ Les globules rouges parasités présentent à leur surface des antigènes de
mérozoïtes, qui permettent l’action des auto-anticorps anti-érythrocytaires et donc leur
hémolyse en phase de mérogonie
♦ l’opsonisation des globules rouges sains et leur destruction accélérée,
parallèlement à la sévérité de la maladie
♦ la dyserythropoïèse au niveau de la moêlle osseuse, en relation avec la
production de cytokines
45
L’hémolyse rapide des globules rouges sains persiste plusieurs jours ou semaines suite à
un accès aigu de paludisme et le taux de réticulocytes reste faible durant la phase aiguë de la
maladie.
L’anémie et la sévérité du paludisme sont aussi à mettre en relation avec la diminution
de la déformabilité des érythrocytes mais les mécanismes restent inconnus. Il en est de même
pour le rôle des anticorps qui interfèrent dans les mécanismes spléniques de clairance des
globules rouges anormaux.
Enfin, chez les jeunes patients, l’anémie entraîne une augmentation de la susceptibilité
aux infections ainsi que la diminution des concentrations en fer. Une complémentation en fer
concourt à la guérison de la maladie.
♦ l’hépato-splénomégalie :
Le paludisme provoque un hypersplénisme, accompagné d’une augmentation de la
capacité de clairance des globules rouges circulants.
La rate serait également responsable de la modulation de la cytoadhérence. Elle joue un
rôle central dans la limitation de l’extension de la parasitose. Enfin la rate est impliquée dans
la clairance parasitaire suite au traitement antipaludique (essentiellement à l’artémisinine).
Une vraie déficience hépatique reste exceptionnelle. Il existe une séquestration au
niveau de la microvascularisation et lors de paludisme très grave, le flux sanguin est réduit à
ce niveau- là.
♦ l’atteinte rénale :
La vasoconstriction du cortex rénal est la cause d’une hypoperfusion rénale lors des cas
de paludisme sévère.
On observe une nécrose tubulaire aiguë qui résulte de l’obstruction de la
microvascularisation rénale et des atteintes cellulaires. Elles sont consécutives au phénomène
de séquestration mais également à la filtration de l’hémoglobine, de la myoglobine et d’autres
matériels cellulaires des hématies parasitées.
♦ l’œdème pulmonaire :
Notons qu’il survient lors de paludisme compliqué à Plasmodium falciparum mais
également lors de paludisme à Plasmodium vivax.
46
Il est consécutif à une soudaine élévation de la perméabilité capillaire dans les poumons
mais qui reste de cause inconnue.
Bien que le siège d’une importante séquestration, la pompe cardiaque est assez bien
préservée lors d’accès sévère.
♦ les modifications électrolytiques :
Le volume total en eau de l’organisme est habituellement inchangé. On note une
élévation de l’activité de la rénine plasmatique, de l’aldostérone et de l’hormone
antidiurétique, reflet d’une activation normale des mécanismes homéostatiques mis en place
afin de maintenir le volume circulant en présence d’une vasodilatation généralisée et d’une
diminution de l’hématocrite.
Une hyponatrémie (exceptionnellement sévère) et une hypocalcémie modérées sont
fréquentes alors que la kaliémie reste normale.
♦ la coagulopathie et la thrombocytopénie :
La cascade de la coagulation intrinsèque est accélérée, avec une transformation plus
rapide du fibrinogène, une consommation élevée de l’antithrombine III, une réduction du
facteur XIII et une élévation de la concentration des produits de dégradation du fibrinogène.
La thrombocytopénie, provoquée par l’augmentation de la clairance splénique est
habituelle. On note également un turn-over plaquettaire plus élevé.
♦ la « black water fever » :
Ce cas rare est caractérisé par une hémolyse intravasculaire massive avec une coloration
des urines couleur Cola. Il survient dans trois cas :
♦ chez des patients déficients en G6PD§§§§§§§§ traités avec des molécules
oxydantes (primaquine, sulphonamides)
♦ parfois chez des patients déficients en G6PD traités avec de la quinine
§§§§§§§§ Glucose 6 Phosphate Déshydrogénase, enzyme de la glycolyse
47
♦ plus rarement chez des patients non-déficients en G6PD et traités avec de
la quinine sans que l’on comprenne le mécanisme alors en jeu
Les personnes déficientes en G6PD sont plus susceptibles au stress oxydatif car elles ne
peuvent pas synthétiser de quantité suffisante de NADPH dans le shunt des pentoses, ce qui
conduit à une diminution en glutathion et donc à l’altération des membranes des hématies et
une augmentation de la susceptibilité aux peroxydes organiques.
♦ les dysfonctionnements gastro-intestinaux :
Des douleurs abdominales peuvent être importantes lors de paludisme sévère.
Un ulcère de stress de l’estomac et du duodénum, même mineur, est fréquent.
Des malabsorptions des sucres, des graisses et des acides aminés suggèrent une
réduction de la perfusion splanchnique, ce qui provoque une séquestration intestinale et une
vasoconstriction viscérale.
La paroi intestinale voit son épaisseur augmentée et peut parfois être associée à une
réduction des défenses locales contre les toxines bactériennes et les bactéries elles-mêmes.
L’absorption des antipaludiques oraux n’est affectée que si elle dépend de celle des
graisses (cas de l’halofantrine, de l’atovaquone ou de la luméfantrine).
♦ l’acidose :
C’est une cause majeure de mortalité bien que l’acide majoritaire ne soit pas identifié.
Habituellement, il s’agit d’une acidose lactique chez l’adulte mais elle est céto-acide chez
l’enfant. L’augmentation des concentrations en lactate est directement proportionnelle à la
sévérité de la maladie.
La glycolyse tissulaire, cause de l’acidose lactique, est une conséquence de l’obstruction
microvasculaire, de déficiences hépatiques et de la clairance rénale du lactate ainsi que de la
production de lactate par les parasites.
♦ Les taux de triglycérides et d’acides gras libres sont également élevés en cas
de paludisme grave.
♦ Particulièrement lors des accès compliqués, tous les autres organes,
essentiellement ceux dont le métabolisme est intense, dysfonctionnent. Les glandes
48
endocrines ne font pas exception et l’on retrouve donc également des atteintes de la thyroïde
et des parathyroïdes. Ainsi, des hypocalcémies ou des hypophosphatémies peuvent survenir.
♦ l’hypoglycémie :
Elle résulte de :
♦ l’augmentation du recrutement périphérique du glucose, conséquence de la
glycolyse anaérobie
♦ l’augmentation de la demande métabolique lors de fièvre
♦ l’augmentation de la demande en glucose due à la présence des parasites
♦ la déficience de la gluconéogenèse et de la glycogénolyse hépatiques
Le processus peut conduire à une hypoglycémie de 20 à 30% chez les enfants présentant
un paludisme grave. L’hypoglycémie contribue au dysfonctionnement neurologique et aux
séquelles nerveuses chez les patients guéris.
♦ dysfonctionnement placentaire :
La grossesse augmente la susceptibilité à la maladie, sans doute par des phénomènes
d’immuno-suppression, au niveau systémique comme placentaire. On observe une forte
séquestration des globules rouges parasitaires au niveau du placenta, une activation locale des
cytokines pro-inflammatoires ainsi qu’une anémie maternelle.
Cette situation concours à l’insuffisance placentaire et au retard de croissance fœtale.
Le risque est important chez les femmes primipares en région fortement endémique
mais il atteint également les femmes multipares si la transmission est plus faible.
♦ les infections bactériennes :
Le paludisme compliqué provoque également une plus grande vulnérabilité,
essentiellement du tractus urinaire et des poumons. La salmonellose est aussi une
complication habituelle des accès graves.
La septicémie post-partum est également plus fréquente et des infections sont souvent
concomitantes du paludisme chez les enfants, ce qui induit des difficultés de diagnostic.
49
3- Diagnostic (23) (19) (117)
a- Direct
Il consiste à détecter le parasite chez les patients et si possible à procéder à la diagnose
d’espèce, sachant que 80% des cas sont dus à Plasmodium falciparum, essentiellement en
Afrique.
Lorsque la parasitémie est élevée, le pronostic est plus mauvais mais les personnes
régulièrement infectées tolèrent mieux de hautes densités parasitaires.
Plasmodium vivax , Plasmodium ovale et Plasmodium malariae parasitent
essentiellement les hématies très jeunes ou celles très vieilles, ils provoquent rarement des
parasitémie supérieures à 1 ou 2%, la mortalité est dans ces cas faible.
Par contre Plasmodium falciparum parasite lui les hématies de tout âge, la parasitémie
peut parfois s’élever jusqu’à 50% et en l’absence de traitement adéquat la mortalité est élevée.
La prédominance des formes matures signe une importante séquestration et est de
mauvais pronostic. Il en est de même pour la présence d’hémozoïne à l’intérieur des
leucocytes, qui est le reflet de la rupture des schizontes.
Il faut également savoir que les complications graves sont évitées avec un diagnostic
rapide et un traitement adapté.
La densité parasitaire se détermine usuellement par le décompte du nombre de globules
rouges parasités pour 1 000 globules rouges sur frottis mince. Mais en cas de faible
parasitémie, il est plus aisé d’utiliser le nombre de parasites / µL de sang.
♦ la goutte épaisse
C’est la technique de référence de l’OMS.
Une goutte de sang est déposée sur une lame puis étalée sur 1 cm2 et séchée. Une
coloration GIEMSA permet la déglobulisation des hématies. Les parasites sont retrouvés exo-
érythrocytaires et on observe des modifications morphologiques par rapport à un frottis
mince.
Cette technique est sensible, avec un seuil de détection de 10 à 20 parasites par µL. Elle
est par ailleurs semi-quantitative : la parasitémie est obtenue sur 1 000 champs
50
microscopiques ou avec le nombre de globules rouges parasités en fonction des leucocytes
dans 1 mL de sang.
♦ le frottis mince
C’est la technique la plus couramment utilisée car elle est à la fois simple et rapide. Le
frottis doit présenter une zone claire et être coloré au MGG, GIEMSA rapide ou RAL. Il est
ensuite lu au microscope optique à l’objectif 1 000 à immersion.
♦ Les parasites sont ici intra-érythrocytaires et il est possible de faire la
diagnose d’espèce en fonction de : la taille du parasite, sa forme ou la présence éventuelle de
granulations
www.radil.missouri.edu/.../bloddsmear6a.jpg
Figure 7 : Frottis mince
La sensibilité de cette technique est de 200 parasites par µL et l’on compte le nombre de
globules rouges parasités pour 1 000 globules rouges. Les résultats sont rendus en
pourcentage d’hématies parasitées. Au-dessus de 5%, le paludisme est grave.
Si la goutte épaisse est une meilleure méthode de diagnostic, car de 20 à 40 fois plus de
sang est observé, la diagnose d’espèce reste plus facile et plus rapide avec le frottis mince.
Chez un patient suspect de paludisme, un frottis mince doit être réalisé chaque 12
heures pendant 36 à 42 heures, si le premier frottis s’avère négatif, avant de déclarer le patient
non atteint par la maladie ; cela en raison de la forte séquestration qui peut avoir lieu quand il
existe d’importants symptômes (comme la fièvre).
51
♦ autres techniques
♦ QBC = Quantitative Buffy Coat
C’est une méthode d’immunofluorescence directe. Cette technique se base sur l’affinité
de l’acridine orange pour les acides nucléiques, la densité spécifique des différentes cellules
sanguines et sur les différents stades évolutifs de Plasmodium. Les noyaux et les éléments
parasitaires du sang deviennent fluorescents après excitation aux UV*********.
C’est un bon test de dépistage mais il ne permet ni le calcul de la parasitémie ni la
diagnose de l’espèce. De plus il nécessite un équipement coûteux.
♦ Antigènes solubles
Ce test est spécifique de Plasmodium falciparum et met en jeu HRPII ou la lactate
déshydrogénase, sécrétée au cours du cycle érythrocytaire avec un pic à la rupture des
schizontes. Il est assez sensible (50 parasites / µL de sang) et assez bien corrélé au niveau de
la fièvre. Il n’est pas utilisé en première intention.
Ce test reste positif longtemps après la phase aiguë de la maladie, ce qui est un
inconvénient lors de prévalence forte dans les enquêtes épidémiologiques mais un avantage
pour dépister les patients traités ne présentant pas de parasitémie périphérique.
Il existe également d’autres tests tels que les sondes à ADN, les PCR††††††††† (157) ou
encore la cytométrie de flux.
********* Ultra Violet ††††††††† Polymerase Chain Reaction
52
Tableau 5: Critères de différenciation de l'espèce sur frottis mince
Espèces Critères de différenciation sur frottis Plasmodium falciparum - présence de trophozoïtes donnant au frottis un aspect
monotone (la schizogonie se faisant dans les capillaires
profonds)
- forme annulaire avec un anneau fin, « en bague à chaton »
- hématies parasitées de tout âge, de taille normale,
présentant parfois des tâches de Maürer et pouvant être
polyparasitées
- apparition de protubérances à la surface de l’hématie
(knobs)
- parfois quelques gamétocytes, en « banane », visibles
Plasmodium vivax - tous stades parasitaires
- schizontes en forme amiboïde et corps en rosace
- hématies parasitées jeunes, de grande taille, déformées
avec parfois des granulations de Schuffner
- gamétocytes ronds et de grande taille
Plasmodium ovale - proche de Plasmodium vivax
- hématies jeunes, ovalisées et frangées
- granulations de Schuffner précoces
Plasmodium malariae - tous les stades parasitaires
- schizontes en bandes équatoriales, corps en rosace
contenant 6 à 12 mérozoïtes
- hématies parasitées plus âgées, plus petites et sans
granulation, avec parfois de fins pigments de Ziemann ou de
l’hémozoïne
53
Figure 8 : Morphologie des différents stades des 4 espèces de Plasmdium de l’homme
Hermes.ffn.ub.es/…/Malaria/Malaria.html
54
b- Indirect
Le diagnostic indirect détecte lui le s conséquences de la parasitémie.
On peut donc évaluer :
♦ la thrombopénie
♦ la leucopénie neutropénique, qui reste le plus souvent modérée
♦ l’anémie (normo- ou hypochrome, avec anisocytose, poïkilocytose,
polychromatophilie et élévation du taux de réticulocytes).
♦ l’hypercholestérolémie et l’hypertriglycéridémie
♦ l’élévation de la CRP ‡‡‡‡‡‡‡‡‡. La vitesse de sédimentation augmente
également.
♦ l’élévation de la LDH§§§§§§§§§, avec hyperbilirubinémie libre.
♦ L’hypergammaglobulinémie (IgM et IgG)********** avec diminution du
complément
♦ L’hypoglycémie, inférieure à 2,2 mmol/L elle est un facteur de gravité
On peut également observer les modifications morphologiques des érythrocytes, avec
des granulations basophiles, une anisocytose et une polychromatophilie.
La sérologie quant à elle est spécifique. Elle est utilisée dans le cadre du paludisme
viscéral, de la prévention du paludisme transfusionnel et des enquêtes épidémiologiques. Les
antigènes réactifs utilisés sont des antigènes hétérologues (Plasmodium de singe) ou des
antigènes homologues obtenus sur à partir de sang de malades fortement parasités ou par
culture de Plasmodium falciparum. En pratique courante sont utilisées la réaction
‡‡‡‡‡‡‡‡‡ C Reactiv Protein §§§§§§§§§ Lactate Déshydrogénase ********** Immunoglobuline
55
d’immunofluorescence indirecte dite « simple sandwich », le test ELISA, l’électrophorèse ou
l’hémagglutination passive.
I I I- TRAITEMENT DU PALUDISME
Le traitement du paludisme est une nécessité pour enrayer l’extension de la pandémie et
sauver les populations atteintes et notamment les enfants qui sont les plus touchés.
Malheureusement, jusqu’ici, la diversité et l’inadaptation des schémas thérapeutiques,
préventifs ou curatifs, et les méthodes de lutte anti-vectorielle, longtemps proposés, ont rendu
difficile l’adoption d’une stratégie de lutte efficace.
Une première stratégie d’éradication, définie par l’OMS de 1955 à 1969 s’avéra
inefficace en dépit des moyens considérables mobilisés (99) et les 10 années qui suivirent
furent marquées par l’extension de la résistance des anophèles aux insecticides, par
l’apparition de chimio-résistance de Plasmodium à la chloroquine, par l’impossibilité de
mettre en place un programme d’éradication dans les zones de haute endémie, et même par la
résurgence de la maladie dans des zones considérées comme contrôlées.
Depuis 1985, tous les organismes nationaux et internationaux sont en quête d’une
nouvelle politique antipaludique.
L’OMS a alors proposé une réévaluation de la situation mondiale, jusqu’ici difficile,
afin d’assurer le diagnostic et le traitement du paludisme symptomatique, d’abandonner la
chimio-prophylaxie de masse et de contrôler, voire d’interrompre la transmission vectorielle.
Le programme « Roll Back Malaria » préconise un certain nombre de recommandations :
diagnostiquer et traiter rapidement la maladie, planifier la mise en œuvre des moyens de lutte
antivectorielle, effectuer un suivi et une prévention épidémiologiques. Ces mesures sont à
accompagner de recherches fondamentale et opérationnelle.
56
Actuellement, la lutte contre la maladie repose sur trois principes :
♦ la lutte contre les piqûres de moustique :
♦ avec l’utilisation d’insecticides en zones d’endémie, qui butte sur le
développement de résistance du moustique à ces molécules
♦ avec la distribution de moustiquaires associée à l’information et la
sensibilisation des populations les plus touchées
♦ la recherche et le développement de vaccins, qui buttent contre :
♦ les stratégies de Plasmodium pour contourner le système immunitaire,
l’existence de différents stades parasitaires au sein du même hôte et la complexité du génome
du parasite
♦ l’absence de modèle animal adéquat
♦ la recherche et le développement de nouvelles molécules antipaludiques ainsi
que l’utilisation de poly-chimiothérapies
Depuis la découverte du parasite en 1880 par A.Laveran et les premières découvertes
empiriques de l’écorce de quinquina en Amérique du Sud, ou de l’artémisinine tirée d’une
armoise chinoise, plusieurs centaines de molécules antipaludiques ont été étudiées. Ces
molécules peuvent être utilisées soit en prophylaxie soit en curatif mais quasiment toutes
rencontrent actuellement des résistances développées par Plasmodium.
L’OMS met actuellement l’accent sur les efforts à mener dans le renforcement des
capacités locales et l’utilisation des ressources existantes.
Selon elle, en 2003, la médecine traditionnelle est toujours répandue dans les pays en
développement (4). Les insuffisances d’accès aux soins de la médecine moderne actuelle et
les comportements socioculturels font que les populations de ces zones ont toujours recours
aux remèdes traditionnels, souvent issus de plantes, pour soigner les affections les plus
courantes. Mais cette médecine se répand actuellement également dans les pays industrialisés,
avec par exemple l’usage de l’artémisinine et de la quinine dans le cas du traitement du
paludisme.
57
A- Principe général du traitement (107)
Un traitement antipaludique doit, en premier lieu, reposer sur des molécules peu
onéreuses car elles sont destinées avant tout au traitement de populations pauvres pour qui
l’accès au soin n’est pas évident.
Ensuite, le choix du traitement dépend surtout de l’évaluation de la gravité clinique de
la maladie, d’où la nécessité d’un diagnostic rapide et pertinent. Le traitement curatif de
l’accès palustre doit tenir compte de plusieurs principes :
♦ il doit être le plus précoce possible afin de prévenir, lors d’infection à
Plasmodium falciparum, l’évolution vers un paludisme grave
♦ il doit mettre en balance la toxicité des molécules disponibles et leur efficacité
vis-à-vis du parasite, compte tenu de la résistance possible de certains clones en fonction de
leur origine
Il faut savoir qu’en général, les traitements anti-malariques sont plus toxiques que les
antibiotiques, l’index thérapeutique est étroit mais les effets secondaires sévères restent tout
de même rares.
Enfin, rappelons que le traitement du paludisme doit nécessairement respecter certaines
règles dans le but d’éviter l’émergence des résistances de certaines souches aux molécules
existantes. Il ne faut ainsi traiter que les paludismes « maladies » de façon rapide en utilisant
des doses efficaces.
L’OMS préconise actuellement l’utilisation de l’artémisinine et des ses dérivés. Ces
molécules doivent être utilisées dans les zones de chimio-résistance en association avec
d’autres molécules (Artemisinine based Combination Therapy) (143).
58
B- Médicaments antipaludiques de synthèse (19) (117)
Ils peuvent être classés en fonction de leur stade d’action (schizonticides et
gamétocyticides) et leur site d’action. Les molécules les plus efficaces agissent lors de la
phase d’infection des globules rouges, qui est responsable de la pathologie : ce sont la
chloroquine, la méfloquine et la quinine, qui reste encore de nos jours le médicament de
référence.
Tableau 6: Traitements antipaludiques disponibles
Stade visé Traitements disponibles Schizonte Amino-4-quinoléines et aryl-amino-alcools :
Chloroquine, amodiaquine, pyronaridine, méfloquine, halofantrine
Antimétabolites :
Sulfones, sulfamides Diaminopyryrimidine, proguanil, pyriméthamine
Atovaquone
Substances naturelles :
Quinine, Artémisinine et molécules dérivées
Gamétocyte Pamaquine, primaquine, tafénoquine
Figure 9 : Cibles des traitements disponibles
Vacuole parasitophore
Golgi
Apicoplaste : antibiotiques
Cytoplasme érythrocytaire
Noyau et RER
Mitochondrie : atovaquone
Vacuole digestive : amino-4-quinoléines, artémisinine et
quinine
Cytosol : artémisinine, amodiaquine
59
1- Les schizonticides
a- Les amino-4-quinoléines
Ce sont les premiers antipaludiques de synthèse, isolés entre 1938 et 1941. Ils ont en
commun un noyau quinoléique, une chaîne latérale aminée en 4 et un radical chloré en 7.
En l’absence de suspicion de résistance de Plasmodium falciparum, les amino-4-
quinoléines (chloroquine et amodiaquine) sont indiquées en première intention dans le
traitement de l’accès palustre simple (15).
♦ La chloroquine (Nivaquine®) (59, 86)
NCl
NH N
Figure 10 : Structure chimique de la chloroquine
C’est le chef de file, né entre les deux guerres mondiales du fait des recherches
allemandes puis américaines, dans le but de trouver une alternative à la quinine. Elle est
encore massivement utilisée en traitement curatif mais aussi prophylactique car peu onéreuse
et de distribution élargie.
C’est un schizonticide sanguin à action rapide mais peu actif sur les sporozoïtes et les
stades exo-érythrocytaires.
Sur les souches sensibles, l’efficacité sur les schizontes sanguins est excellente avec des
clairances de fièvre et de parasitémie de deux jours.
Elle peut provoquer un certain nombre d’effets secondaires tels que des troubles
digestifs, hématologiques, psychiatriques.
Ce sont ses propriétés de base faible et son effet inhibiteur de la synthèse de protéines
héme-dépendantes qui sont responsables de son activité antipaludique (139) (148) (140).
60
Figure 11 : Mécanisme d’action de la chloroquine
Elle inhibe la formation de l’hémozoïne dans la vacuole digestive du parasite, bien que
d’autres mécanismes soient aussi entrevus.
Il faut noter la haute affinité de la chloroquine (par sa partie quinoléine) pour l’hème
(par sa partie porphyrique).
Depuis de nombreuses années déjà, des rapports publient l’avancée de la chimio-
résistance (96) (135) (53) (75) (28) (32). Le nombre s’accroît dans la plupart des zones
d’endémie (34) (149) (6) (120) (111) (124). Les résistances sont d’origines diverses (147)
(14) (127) (42) et peuvent être reversées de différentes façons, telles que l’emploi
d’inhibiteurs des canaux calciques (91) (158) (171) (vérapamil par exemple) ou de la
calmoduline.
L’inhibition de la polymérisation de l’hème est fonction de la concentration de la
chloroquine dans le parasite. Les causes des résistances actuellement observées seraient des
altérations des processus de transports associés à la membrane ainsi que l’augmentation de
Hémoglobine
Peptides Acides aminés
Fe(II)PPIX
Fe(III)PPIX
Détoxification de l’hème
Vacuole parasitophore
Cytoplasme du parasite Erythrocyte
Digestion
Chloroquine
ChloroquinePIX Toxique
61
l’efflux de la molécule par le parasite. Ces deux mécanismes font chuter la concentration de
molécule au niveau du site d’action.
♦ L’augmentation du pH lysosomal réduit l’accumulation de la chloroquine.
C’est la conséquence de la mutation K76T sur la protéine PfCRT†††††††††† de la membrane de
la vacuole digestive (76) (159) (103).
♦ Le mécanisme MDR‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡ aux agents anti- infectieux et anti-cancéreux est
aussi mis en jeu. Il est associé à des « mdr-gènes », codant pour un groupe de glycoprotéines
membranaires qui gouvernent l’efflux cellulaire du principe actif. PfMDR est l’un d’entre eux
chez Plasmodium falciparum (159) (103).
♦ L’amodiaquine (Flavoquine®)
NCl
NH N
OH
Figure 12 : Structure chimique de l’amodiaquine
Elle fait elle aussi partie des premières 4-aminoquinoélines de synthèse, isolée pendant
la Seconde Guerre Mondiale.
Sa structure diffère de celle de la chloroquine par la présence d’un cycle benzène mais
son mécanisme d’action est semblable (84).
Elle possède également une activité schizonticide et elle est active sur les souches
chloroquino-résistantes (37) car le gène PfMDR ne semble pas en cause dans les phénomènes
de résistance à l’amodiaquine (103) (48). Elle est donc souvent utilisée et pour augmenter son
activité, des associations avec l’atovaquone et le proguanil sont actuellement mises en place
(118).
†††††††††† Plasmodium falciparum Chloroquine Resistant Transporter ‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡ Multi Drug Resistance
62
Elle reste pourtant une thérapeutique de seconde intention, du fait des résistances
croisées possibles avec la chloroquine et la toxicité éventuelle, essentiellement sur le système
hépatique.
b- Les méthanolquinoléines
Elles font partie des aryl-amino-alcools qui regroupent des composés identifiés à partir
des années 1970, de structures chimiques diverses mais partageant un radical « carbinol » ou
« méthanol ».
♦ La méfloquine (Lariam®)
NCF3
CF3
HONH
Figure 13 : Structure chimique de la méfloquine
C’est une 4-méthanol-quinoléine dont la structure présente des parentés avec celle de la
quinine (120). Sa synthèse fut faite en 1973. C’est un puissant schizonticide érythrocytaire
mais elle n’a aucune activité sur les stades intra-hépatiques.
Son mécanisme d’action, proche de celui de la quinine, passe par la liaison à la
ferriprotoporphyrine IX (produit de dégradation de l’hémoglobine dans la vacuole digestive
du parasite) et le blocage de sa dégradation en pigment non toxique (l’hémozoïne) qui
s’accumule alors (19).
La méfloquine est utilisée comme traitement curatif contre les souches chimio-
résistantes (27) (104) (son activité est proche de 100%, surtout en Afrique, (132)) malgré une
augmentation des cas de résistances, apparues pour la première fois dans les années 1980 en
Asie du Sud-Est (50) et de leur répartition géographique (31) (30) (54) (119), ainsi que des
problèmes de tolérance.
Ces effets indésirables (essentiellement des troubles gastro- intestinaux, dermatologiques
et cardiologiques) peuvent survenir longtemps après la prise du médicament du fait de sa
63
demi-vie d’élimination longue. La méfloquine doit être prise avec précaution aussi car elle
provoque des troubles neurologiques et neuropsychiatriques. Malgré cela elle reste
indispensable dans certains cas de résistance à la chloroquine.
♦ L’halofantrine (Halfan®)
F3C
Cl Cl
OH
N
Figure 14 : Structure chimique de l’halofantrine
Ce dérivé phénanthrène méthanol est efficace sur les souches de Plasmodium
falciparum résistantes aux amino-4-quinoléines et les souches multi-résistantes, bien que
depuis 1993 ont été mentionnés les premiers cas de résistances (29).
Elle est active sur les schizontes sanguins (51).
Son mécanisme d’action, mal connu, passerait par l’inhibition de la dégradation des
molécules ferriprotoporphyrine IX (97) (65).
Elle peut provoquer des troubles cardiaques et est donc aujourd’hui utilisée avec une
extrème prudence (1).
c- Les antifoliques et les antifoliniques
Ils sont connus depuis les années 1950. Ils agissent en bloquant la synthèse des acides
nucléiques de l’hématozoaire.
Ce sont des antifolates, c’est à dire des molécules qui inhibent les enzymes intervenant
dans le métabolisme des folates : ils induisent donc la diminution de la synthèse des
pyrimidines, de l’ADN et interfèrent avec le métabolisme de certains acides aminés.
Leur utilisation se développe dans les années 1970 car ils sont alors utilisés en
associa tion, afin de détourner les phénomènes de chimio-résistance.
Parmi les antifoliques, on compte : les sulfamides et les sulfones. Et parmi les
antifoliniques, les biguanides et les diaminopyrimidines.
64
♦ Les antifoliques : les sulfamides et les sulfones
Les sulfamides utilisés sont surtout la sulfadoxine et le sulfalène (167), qui agissent sur
les schizontes érythrocytaires de Plasmodium.
Ce sont des analogues du PABA§§§§§§§§§§ et agissent comme inhibiteurs compétitifs de
la DHPS*********** au niveau de son site actif. La DHPS catalyse la transformation de
l’hydroxyméthyldihydroptérine en dihydroptéroate au cours du métabolisme des folates.
♦ Les antifoliniques (ou inhibiteurs de la dihydrofolate réductase) :
Ils inhibent la DHFR, qui intervient dans la réduction du dihydrofolate en
tétrahydrofolate. Ce dernier est un cofacteur nécessaire dans la biosynthèse de la thymidylate,
des nucléotides puriques et de certains acides aminés.
Deux sont utilisés : le proguanil (qui est un biguanide) et la pyriméthamine (qui est une
diaminopyrimidine).
Leurs modes d’action étant synergiques, antifoliques et antifoliniques sont le plus
souvent utilisés en association (105).
♦ Le proguanil (Paludrine®)
Le proguanil et le chloroproguanil (Lapudrine®) sont des produits employés depuis
1950, et depuis quelques années de plus en plus en association (avec la chloroquine et
l’atovaquone) (118) (98).
L’action antipaludique du proguanil est due à une inhibition de la dihydrofolate
réductase, enzyme de la biosynthèse des bases puriques et pyrimidiques (85). Cette action
anti-métabolique est spécifique du micro-organisme, qui ne peut synthétiser correctement son
ADN. L’action se produit sur le stade érythrocytaire asexué, ainsi qu’exo-érythrocytaire. Il
inhibe également la sporogonie.
§§§§§§§§§§ Paraaminobenzoïque Acid *********** Di Hydropteroate Synthetase
65
Notons que le proguanil, inactif par lui-même, agit par l’intermédiaire de son
métabolique hépatique (la cycloguanil) (87) (70). Cette métabolisation subit un
polymorphisme génétique au sein des populations.
†††††††††††
Figure 15 : Mécanisme d’action du proguanil
Le proguanil provoque fréquemment des intolérances gastriques. Il existe également des
résistances mises en place par Plasmodium falciparum par mutation de la DHFR.
Il est recommandé dans les pays du groupe II, en association, et du groupe III si les
autres antipaludiques recommandés ne sont pas tolérés.
♦ La pyriméthamine (Fansidar®)
C’est le plus efficace des inhibiteurs de la dihydrofolate réductase (155). Elle agit sur
les schizontes érythrocytaires.
††††††††††† dUMP : désoxy Uridilate Mono Phosphate
dTMP : désoxy Thymidine Mono Phosphate DHF : Di Hydro Folate
dUMP dTMP Synthèse d’ADN
Acide folinique
Méthylène THF DHF Acide folique
THF
NADPH,H+
NADP+
Cycloguanil
DHFR
Inhibition
Proguanil Métabolisation hépatique
66
Comme pour le proguanil, son utilisation provoque l’apparition rapide de chimio-
résistance par des mutations sur la séquence de l’enzyme cible (43).
♦ Les associations
♦ La pyriméthamine-sulfadoxine
Ces deux molécules provoquent, dans le cas de l’association, une potentialisation de
leurs effets, par blocage séquentiel de deux enzymes intervenant dans la biosynthèse de
l’acide tétrahydrofolique à partir de l’acide folique. L’interruption de la synthèse des
nucléotides puriques et pyrimidiques entraîne alors une inhibition de la production d’acides
nucléiques.
Figure 16 : Mécanisme d’action de l’association sulfadoxine-pyriméthamine
L’effet obtenu par l’association dépasse de beaucoup celui que produit chacun des
composés utilisés seuls.
Le cycle du parasite est bloqué aux stades où intervient la synthèse des acides
nucléiques, soit chez l’homme, aux stades érythrocytaires asexués (trophozoïtes, empêche la
maturation des schizontes) et pré-érythrocytaires. Cette action schizonticide permet un
traitement efficace du paludisme aigu.
Acide folique
Acide dihydrofolique
Acide tétrahydrofolique
DHPS
DHFR
Sulfadoxine
Pyriméthamine
-
-
Synthèse des bases azotées
ARN ADN
67
Il est important de noter également que l’association présente une longue durée
d’action. Elle est bien tolérée bien qu’il puisse survenir des phénomènes d’hypersensibilité
(126).
Elle est indiquée dans le traitement curatif du paludisme non compliqué, en cas de
résistance aux 4-amino-quinoléines ou de contre- indications aux autres antipaludiques.
Actuellement, cette association n’a plus d’activité en Asie du Sud-est, en Amazonie,
une activité réduite en Afrique de l’Est et de l’Ouest et une activité encore bonne le long des
Côtes d’Amérique du Sud. Les résistances apparaissent suite à l’accumulation de mutations
ponctuelles au niveau des plusieurs gènes des deux enzymes, conduisant à la substitution d’un
acide aminé sur la protéine. Elles sont favorisées par les demi-vies longues des deux
molécules, qui accentuent la pression de sélection des parasites résistants en zones de haute
transmission (126).
♦ L’atovaquone-proguanil (Malarone®)
Les deux molécules agissent en synergie et permettent d’obtenir une efficacité proche
de 100% là où l’utilisation seule de l’atovaquone provoque des recrudescences et des
résistances.
L’atovaquone (hydroxynaphtoquinone, analogue de l’ubiquinone ‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡) agit par
inhibition du transport mitochondrial des électrons au niveau du cytochrome bc1 de la
mitochondrie du parasite, en entrant en compétition avec son substrat naturel, l’ubiquinone.
Ceci entraîne une dépolarisation membranaire et inhibe la réplication (165).
Elle est à la fois active sur les formes érythrocytaires et hépatiques.
Il existe une résistance de l’atovaquone liée à l’existence de mutations ponctuelles sur le
cytochrome (9) (31).
‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡ Enzyme de la chaîne respiratoire capable de transférer des électrons. Elle joue également un rôle
anti-oxydant.
68
L’association est indiquée dans le traitement de l’accès palustre simple à Plasmodium
falciparum et en chimio-prophylaxie mais elle doit être prise par voie orale lors d’un repas
pour favoriser l’absorption de l’atovaquone.
♦ Les antibiotiques
Il existe plusieurs antibiotiques qui montrent une activité antipaludique. L’usage des
antibiotiques a pour intérêt d’éviter les rechutes en achevant l’élimination des parasites.
♦ Les cyclines
Ce sont des schizonticides sanguins actifs sur les souches de Plasmodium falciparum
résistantes aux quinoléines (82).
♦ les tétracyclines sont utilisées en traitement curatif, en
association, par exemple avec la quinine (166) (74).
♦ la doxycycline (Vibramycine®) inhibe la synthèse protéique
mitochondriale (165) par fixation réversible sur la sous-unité 40s du ribosome, qui empêche la
fixation du complexe Acide aminé-ARNt sur le complexe ARNm-ribosome. La phase
d’élongation se trouve alors provisoirement bloquée. On n’a observé jusqu’ici aucune
résistance de Plasmodium à la doxycycline (164). Cet antibiotique peut provoquer des effets
secondaires tels que troubles digestifs et photosensibilisation. Elle est préconisée dans le
traitement prophylactique en zones de résistances ou lors de contre- indications à la prise de
méfloquine. Elle est également utilisée hors AMM§§§§§§§§§§§, associée à la quinine, dans le
traitement du paludisme si la souche est originaire d’Asie du Sud-Est ou d’Amazonie.
§§§§§§§§§§§ Autorisation de Mise sur le Marché
69
Figure 17 : Mécanisme d’action de la doxycycline
♦ Les macrolides
Ils sont utilisés en association avec d’autres antibiotiques (érythromycine, spiramycine)
ou isolément (clindamycine) en cas de chimio-résistance.
♦ La clindamycine (165)
C’est un antibiotique dérivé de la lincomycine, utilisé hors AMM dans le traitement du
paludisme en cas de contre- indications à la doxycycline (femmes enceintes, enfants de moins
de 8 ans). Associée à la quinine, elle est aussi efficace que l’artésunate (150).
♦ Azithromycine
C’est un macrolide du sous-groupe des azalides. Elle protège bien en prophylaxie contre
Plasmodium vivax , quelque peu moins bien contre Plasmodium falciparum (151).
2- Les gamétocytocides : la primaquine
Ils sont tous des amino-8-quinoléines : pamaquine (première 8-aminoquinoléine
synthétisée en Allemagne dans les années 1920), primaquine, rhodaquine, quinocide. Seule la
primaquine reste encore disponible.
Ils possèdent une chaîne latérale dont le radical aminé est branché sur le carbone 8 du
noyau quinoléine et un radical méthoxy en 6.
40S
60S
Mitochondrie
Chaîne peptidique en formation AA-ARNt
Doxycycline Blocage de la phase
d’élongation P A
5’ 3’
70
Son activité est bonne sur les schizontes hépatiques primaires de Plasmodium
falciparum et Plasmodium vivax (ainsi que sur les formes hypnozoïtes de ce dernier) (38)
(116).
Elle utiliserait les mêmes systèmes de réduction (à NADPH de l’érythrocyte et de
l’hépatocyte) pour sa biotransformation que les schizontes. La cellule devient alors incapable
de fournir au schizonte des éléments indispensables de son métabolisme. La primaquine
bloque également le développement des gamètes dans le tube digestif de l’anophèle.
Elle est responsable d’effets secondaires fréquents et importants, tels que douleurs
abdominales, nausées et vomissements. Elle est de plus contre-indiquée en cas de déficience
en G6PD (risque d’anémie hémolytique). Elle est utilisée pour obtenir une guérison radicale
et prévenir les risques de récidives. Elle est encore bien efficace en curatif et en prophylaxie
dans les zones touchées mais peu utilisée du fait de cette toxicité.
3- Autres médicaments antipaludiques de synthèse
♦ Tafénoquine
C’est une 8-amino-quinoléine dérivée de la primaquine développée par l’armée
américaine, initialement pour augmenter son efficacité, réduire sa toxicité et prolonger sa
demi-vie plasmatique.
Encore en essai, elle est active sur le stade érythrocytaire asexué de Plasmodium
falciparum, contrairement à la primaquine. Elle agit également sur les formes hépatiques et
possède une activité anti-sporozoïtes. Son mode d’action, proche de celui des 4-amino-
quinoléines, passe par l’inhibition de la polymérisation de l’hème et donc l’accumulation de
l’hémine toxique. L’action sur le stade exo-érythrocytaire (hépatique) et au niveau des
gamétocytes s’expliquerait par la production de métabolites toxiques au niveau mitochondrial.
La tafénoquine serait mieux tolérée que la primaquine mais également contre- indiquée
en cas de déficience en G6PD (dépistage systématique avant utilisation) (134) (133). Elle est
utilisée en prophylaxie en zones de chloroquino-résistance (95) et son activité au stade
hépatique la rend intéressante sur Plasmodium vivax . S’il est clairement prouvé que la
tafénoquine bloque la transmission du paludisme, cette molécule pourrait avoir une
importance en santé publique dans les zones d’endémie.
71
♦ Pyronaridine (165)
Développée en Chine, cette molécule est recommandée dans le traitement du paludisme
depuis 1980 en essai. Elle montre une structure et un mécanisme d’action proches de ceux des
4-amino-quinoléines. C’est donc un schizonticide sanguin interférant dans la détoxification de
l’hème libre (66).
Bien tolérée, elle est indiquée dans le traitement de l’accès palustre résistant à la
chloroquine, avec une grande efficacité. Mais sa large utilisation dans certaines régions a déjà
été à l’origine d’apparition de souches résistantes (92).
4- Les associations
D’après le programme « Roll Back Malaria », un traitement combiné consiste « à mettre
à profit l’association synergique ou additive de deux médicaments ou davantage, afin
d’améliorer leur efficacité thérapeutique et de retarder l’apparition de résistance à chacun des
constituants de cette association ». Concrètement, il convient d’utiliser en association au
moins deux schizonticides sanguins dont les modes d’actions sont indépendants, avec des
cibles biochimiques intra-parasitaires différentes. Il faut exclure les associations synergiques
fixes, où aucun des constituants ne peuvent être administrés en monothérapie, comme
l’association sulfadoxine-pyriméthamine.
L’OMS a également souligné les arguments favorables à l’introduction des
combinaisons à base d’artémisinine en Afrique :
♦ Traitement de première intention compromis, charge morbide due au
Plasmodium et à l’anémie chronique
♦ Efficacité des dérivés de l’artémisinine pour éliminer rapidement les
symptômes et les parasites
♦ Pas de résistance attestée à ces dérivés
♦ Possibilité de ralentir la progression de résistance aux autres antipaludiques
♦ Possibilité de réduire la transmission, en raison de l’activité des dérivés de
l’artémisinine sur le taux de portage gamétocytaire
Plusieurs autres associations que celles déjà citées sont utilisées.
72
Mentionnons simplement :
♦ artéméther + luméfantrine : (Riamet®, Coartem®) : La luméfantrine est un
aryl-amino-alcool proche de la quinine, de la méfloquine et de l’halofantrine, développée dans
les années 1980 en Chine (165). Elle a une action schizonticide sanguine avec un mécanisme
proche de celui de la quinine (164). Les effets secondaires de cette association sont nombreux
(vertiges, anorexie, douleurs abdominales, nausées, prurit et éruptions cutanées…). Son
administration doit se faire au cours des repas pour favoriser l’absorption de ses principes
actifs. Elle est indiquée dans le traitement de l’accès palustre non compliqué à Plasmodium
falciparum et est plus efficace que l’association artésunate + méfloquine. Elle aujourd’hui
fortement recommandée (106).
♦ chloroquine-dapsone
♦ artésunate-pyronaridine
♦ méfloquine-sulfadoxine-pyriméthamine (MSP), cette association n’est plus
recommandée depuis 1990
C- Médicaments antipaludiques naturels (117) (19)
Le faible nombre d’antipaludiques encore efficaces actuellement sur le marché a révélé
que ceux d’origine naturelle sont encore actifs et représentent une piste de développement et
de recherche.
Ainsi, la quinine et ses alcaloïdes demeurent les antipaludiques majeurs de l’urgence et
de la gravité. Et plus récemment, le qinghaosu et ses principes actifs (artémisinine, artéether,
artésunate et arteméther) sont utilisés avec succès.
1- Les alcaloïdes du Quinquina : la quinine (Paluject® ; Quinine
Lafran®)
Quatre alcaloïdes princ ipaux sont extraits de l’écorce de Quinquina : quinine, quinidine,
cinchonine et cinchonidine. Seule la première est un antipaludique majeur mais la quinidine,
diastéréo- isomère de la quinine est également active et parfois utilisée.
73
Le Quinquina est un arbre de la famille des rubiacées, originaire d’Amérique du Sud. La
quinine qui en est extraite est utilisée par les indiens d’Amérique du Sud en médecine
traditionnelle.
Pour l’histoire, il faut savoir que ce sont les jésuites espagnols qui en ont répandu
l’usage au XVIième siècle. En 1630, Don Francisco Lopez observe en effet, au Pérou,
l’utilisation par les Indiens de décoctions d’écorce de l’arbre pour leurs vertus curatives des
accès fébriles. Et rappelons que sous Louis XIV, où le paludisme sévissait encore en France à
cause de l’infestation des marais, les personnes soumises au risque mâchaient de l’écorce de
cet arbre pour se protéger.
L’isolement et la purification de la quinine ont été obtenus en 1820 par deux
pharmaciens militaires, Pelletier et Caventou, et sa synthèse artificielle en 2001, bien
qu’économiquement peu intéressante. La quinine est encore aujourd’hui extraite de Quinquina
de culture. Cultures qui débutent dans les années 1960 au Brésil et en Asie du Sud-est, puis
s’étendent dans les années 1980.
N
O
HO N
H
Figure 18 : Structure chimique de la quinine
Elle comporte un cycle quinoléine et un radical méthanol (carbinol) en position 4, que
l’on retrouve chez les autres méthanolquinoléines de synthèse.
La quinine est un schizonticide sanguin à action rapide (34) (169) mais a peu d’activité
sur les sporozoïtes et les stades exo-éryhtrocytaires.
Son mécanisme d’action serait proche de celui des amino-quinoléines. C’est une base
faible qui se concentre dans les vacuoles digestives du parasite. Elle agirait alors en inhibant
l’action de l’hème polymérase (qui polymérise les molécules d’hémines, ferriprotoporphyrine
IX). La quinine, en se liant avec l’hémine libre, bloque le processus de détoxification par
l’hémozoïne et il y a accumulation d’hémine, toxique pour Plasmodium (146).
74
La quinino-résistance est connue dans l’Est africain, l’Asie du Sud-est, le Brésil et
l’Amazonie. Mais elle reste le plus souvent partielle et de faible niveau, ce qui a pour l’instant
que peu de conséquences cliniques perceptibles (16)
Ces phénomènes de résistances seraient dus à une consommation inappropriée et aurait
pour support la surexpression du Pfmdr (24).
Les effets secondaires, dits « cinchonisme », sont importants et concentration-
dépendants : acouphène, vertiges, céphalées, hypoglycémie, parfois convulsions, allergies
cutanées, anémie hémolytique aiguë. Elle doit être utilisée le plus souvent par voie
intraveineuse, ce qui limite son utilisation dans les pays aux infrastructures médicales peu
développées. De plus, sa courte demi-vie conduit à des administrations répétées qui
prédisposent aux surdosages et donc à la toxicité.
La quinine est encore aujourd’hui utilisée pour son efficacité importante. Lors de
sensibilité diminuée à la quinine (Thaïlande par exemple), il est possible d’utiliser la
quinidine (73) (112), normalement utilisée en cardiologie.
2- L’artémisinine et ses dérivés
L’artémisinine fut découverte en 1972 par des scientifiques chinois. C’est un
sesquiterpène lactone dérivé de la plante Qinghaosu, utilisée depuis des millénaires dans la
médecine chinoise pour le traitement des fièvres.
Trois dérivés principaux sont produits à partir de l’artémisinine : l’artéméther,
l’artésunate et l’artééther. L’artéméther est de nos jours le plus utilisé, l’artééther et
l’artésunate commencent à l’être également. Leur efficacité dans la réduction du taux de
parasitémie par cycle est supérieure à celle des autres antimalariques actuels. Mais leur demi-
vie courte est responsable de nombreux cas de recrudescence s’ils sont utilisés seuls.
75
Figure 19 : Classification chimique des dérivés de l’artémisinine
Le développement des analogues synthétiques contenant la base endopéroxyde de cette
dernière a été nécessaire du fait des faibles paramètres pharmacocinétiques de l’artémisinine.
L’artémisinine, comme ses dérivés, est un schizonticide sanguin (68) (67). Elle agit par
formation d’un radical alkyl après ouverture du pont peroxyde en contact avec du FeII à
l’intérieur des vacuoles digestives du parasite. Ce radical peut alkyler la molécule d’hème et
inhiber ainsi le processus de détoxification, entraînant une altération cytologique notable
(165) (164) (122). De plus, après ouverture, il y a libération d’oxygène et de radicaux libres
qui provoque un blocage de la réplication de l’ADN et de la synthèse protéique, ainsi qu’une
perturbation des membranes par alkylation des protéines. Les pro-oxydants, ou un fort taux
d’oxygène, potentialisent l’activité antipaludique, a contrario, les piégeurs de radicaux libres
la diminuent. Ce sont les seules molécules qui sont capables de tuer le parasite aussi tôt dans
son cycle.
C‘est le motif endopéroxyde que possèdent ces molécules qui leur confèrent leur
activité, les mêmes molécules délétées de leur motif perdent toute activité.
Notons également que les globules rouges parasités concentrent cent fois plus
l’artémisinine et ses dérivés que les globules rouges sains, ce qui rend ces molécules peu
toxiques et hautement actives.
L’artémisinine, comme ses dérivés, est hydrolysée en dihydroartémisinine.
On ne note pas d’activité de ces composés sur les hypnozoïtes mais une efficacité sur la
phase sexuée du parasite (sur les gamétocytes donc).
Artémisinine
Dihydroartémisinine
Artésunate Hémisuccinate
Artéether Ethyléther
Artéméther Méthyléther
Réduction
76
L’efficacité de l’artémisinine et de ses dérivés est encore très bonne sur les souches de
Plasmodium résistantes à la chloroquine, à l’association sulfadoxine-pyriméthamine et à la
quinine. Ils sont plus actifs sur les souches chloroquino-résistantes que sur les souches
chloroquino-sensibles.
♦ Qinghaosu = l’artémisinine (Cotexin®)
C’est le produit extrait d’Artemisia annua, connu et utilisé comme antipaludique depuis
plus de deux milles ans dans la médecine traditionnelle chinoise. Ce sont les feuilles de cette
armoise qui sont utilisées. Le produit est depuis toujours reconnu efficace contre les fièvres.
C’est en 1973 que les chercheurs chinois isolent de la plante l’artémisinine.
Depuis cette découverte, plus d’un million d’individus ont été traités et les résultats
confirment l’action très rapide de l’artémisinine ou de ses dérivés.
O
O
OCH3
H
H3C
CH3HOO
H
Figure 20 : Structure chimique de l’artémisinine
La structure de l’artémisinine montre une fonction endopéroxyde incluse dans un cycle
trioxane.
On conseille l’utilisation de l’artémisinine dans le traitement du paludisme non
compliqué à Plasmodium falciparum multi-résistant. Elle est également recommandée dans le
traitement du neuro-paludisme.
Il intéressant d’association systématiquement un autre antipaludique à l’artémisinine ou
à ses dérivés afin d’éviter l’apparition de résistances (161), qui sont pour le moment faibles et
localisées, et non corrélées à celles à la chloroquine ou à la méfloquine. Notons que
lorsqu’une résistance à l’artémisinine apparaît, il semble qu’elle puisse être réversée par
l’arrêt de la pression médicamenteuse (46).
Le rendement d’extraction de l’artémisinine à partir des feuilles de l’armoise peut être
divisé par un facteur 10 ou 20 selon la région de culture, ce qui rend son approvisionnement
77
aléatoire. Par ailleurs, la synthèse totale de l’artémisinine est trop coûteuse pour être
envisagée de façon industrielle.
♦ L’artésunate (Arsumax®)
O
O
CH3
H
H3C
CH3HOO
H
H O COOH
O Figure 22 : Structure chimique de l’artésunate
C’est un dérivé hémisuccinate hydrosoluble de l’artémisinine. Son association à la
méfloquine reste active contre toutes les souches de Plasmodium falciparum, même les plus
hautement résistantes (88) (102) .
Fe2+ Ouverture du pont endoperoxyde
Alkylation de l’hème Libération d’O°
Radicaux libres
Altérations des lipides
Alkylation des protéines
FP IX Hémozoïne
Lyse rapide des parasites
Artémisinine ou son dérivé
Figure 21 : Mécanisme d’action de l’artémisinine et des ses dérivés
78
♦ L’artéméther (Paluther®) (20) (165)
O
O
CH3
H
H3C
CH3HOO
H
H OCH3
Figure 23 : Structure chimique de l’artéméther
L’utilisation de ce dérivé de l’artémisinine liposoluble est maintenant fréquente (69). Il
est plus efficace que la quinine, même dans le traitement du paludisme grave (71) 25).
Son utilisation provoque quelques effets secondaires, troubles ou gênes digestives.
Il est indiqué dans le traitement de l’accès palustre grave à Plasmodium falciparum
suspecté de résistances aux autres antipaludiques (71) (25).
♦ L’artééther
Ce dérivé éthyléther de l’artémisinine a des propriétés semblables à celles de
l’artéméther mais son efficacité est moins bonne. Son avantage est d’être de synthèse peu
coûteuse.
Actuellement, l’artémisinine et ses dérivés ne disposent pas d’une AMM en France,
seule une ATU************ existe pour l’artésunate.
************ Autorisation Temporaire d’Utilisation
79
D- Résistances (6,8)
La résistance aux antipaludiques, connue dès 1950-1960 avec le proguanil, pour toutes
les espèces et en toutes régions, s’est étendue quelques années plus tard à la pyriméthamine
dans les mêmes conditions.
Ces résistances ne devinrent un problème de santé publique qu’à partir du moment où
elles concernèrent la chloroquine, antipaludique le plus utilisé et le moins onéreux depuis son
développement en 1934 en Allemagne par la firme Bayer.
Cette chimio-résistance est basée sur l’absence ou la diminution de l’activité des
antipaludiques sur les souches de Plasmodium. Entre 1960 et 1985, la chloroquino-résitance
s’étend, en partant de l’Asie du Sud-est vers l’Afrique. Plasmodium falciparum est reconnu
plus ou moins sensible à la chloroquine dans les différentes zones d’endémie (162). Depuis,
un classement par groupe de pays d’endémie intègre la fréquence de la résistance observée
pour les quatre espèces de Plasmodium envers la chloroquine et le proguanil (6).
Ces résistances apparaissent suite à la pression médicamenteuse et sont dues à des
mutations simples ou à des facteurs multi-génétiques.
Cette situation a contraint jusqu’ici les praticiens à proposer des combinaisons de
médicaments simples afin de les faire agir en synergie : par exemple l’association
proguanil/atovaquone sous le nom de Malarone® ou proguanil/chloroquine sous le nom de
Savarine®.
Comme dans la chimiothérapie anti-tuberculeuse ou anti-cancéreuse, l’association de
deux molécules antipaludiques doit permettre d’améliorer l’efficacité du traitement et d’éviter
l’émergence des souches résistantes.
Mais en 1987, la chimio-résistance s’est encore étendue rendant encore plus urgente la
mise au point de nouvelles molécules.
80
E- Prévention (6)
En fait, le meilleur traitement contre le paludisme reste la prévention de sa transmission,
pour les populations atteintes en zones d’endémie mais aussi pour les voyageurs dans ces
zones.
Pour cela, deux principes sont à appliquer :
♦ la lutte contre la transmission par la réduction des risques de piqûres de
moustiques. C’est sur ce point que repose la réduction de l’épidémie dans les zones
concernées. Il faut savoir que les anophèles piquent habituellement entre le coucher et le lever
du soleil et c’est donc au cours de cette période que la protection doit être maximum. Il faut
ainsi :
♦ porter des vêtements longs, recouvrant entièrement le corps le soir, afin de
limiter les zones de peau exposées aux moustiques
♦ utiliser des répulsifs efficaces
♦ dormir la nuit sous des moustiquaires imprégnées. Ce dernier point est
depuis quelques années une priorité du programme « Roll Back Malaria » qui promouvoit la
distribution de moustiquaires et la formation à leur utilisation dans les pays les plus touchés
♦ notons seulement que la réduction des zones humides et eaux dormantes,
réservoir de larves de moustiques, doit aussi être effectuée
♦ de plus, chez les voyageurs seulement, car cela n’est pas envisageable pour les
populations résidant dans les zones d’endémie, il est fortement conseillé de procéder à un
traitement chimioprophylactique.
♦ dans ce cas, il faut, comme pour le traitement de la maladie, adapter le
médicament à la durée du voyage et à l’éventuelle chimio-résistance du Plasmodium, qui est
fonction de la zone visitée. Le médicament doit être à prise orale. La plupart des médicaments
utilisés dans cette prophylaxie sont des schizonticides sanguins qui tuent les parasites lors de
leur sortie du foie et de l’invasion des hématies, ce qui contrarie la progression de la maladie.
Les molécules usitées ne sont pas dénuées d’effets secondaires mais la plupart des chimio-
prophylaxies peut être utilisée avec un bon niveau de sécurité.
81
Tableau 7: Répartition mondiale en 2007 de la résistance de Plasmodium falciparum, (2)
REPARTITION MONDIALE DE LA RESISTANCE DE PLASMODIUM FALCIPARUM
Groupe 0 : Zones sans paludisme, pas de chimio-prophylaxie
Groupe 1 : Zones sans chloroquino-résistance
Argentine du Nord*, Belize*, Bolivie* (sauf Amazonie), Chine* (Nord-Est), Costa Rica*,
Equateur (sauf Amazonie), Guatemala*, Haïti, Honduras*, Iran* (sauf Sud-Est), Iraq*,
Jamaïque* (Kingston), Mexique*, Nicaragua*, Panama* (Ouest), Paraguay* (Est), Pérou*
(sauf Amazonie), République Dominicaine, El Salvador*, Venezuela (sauf Amazonie)
Groupe 2 : Zones de chloroquino-résistance
Burkina Faso, Colombie (sauf Amazonie), Inde (sauf Assam), Madagascar, Mali, Mauritanie,
Népal (Téraï), Niger, Sri Lanka*, Tadjikistan*, Tchad, Vanuatu
Groupe 3 : Zones de prévalence élevée de chloroquino-résistance ou multi-résistance
Afghanistan* Afrique du Sud (Nord-Est seulement), Angola, Arabie saoudite* (Sud, Ouest),
Bangladesh (sauf Dacca), Bénin, Bhoutan*, Bolivie (Amazonie), Botswana, Brésil
(Amazonie), Burundi, Cambodge, Cameroun, Chine (Yunnan et Hainan), Colombie
(Amazonie), Comores, Congo, Côte d’ivoire, Djibouti, Equateur (Amazonie), Erythrée,
Ethiopie, Gabon, Gambie, Ghana, Guinée, Guinée Bissau, Guinée Equatoriale, Guyana,
Guyanne française (fleuves), Inde (Assam), Indonésie (sauf Bali), Iran* (Sud-Est), Kenya,
Laos, Libéria, Malaisie (sauf zones urbaines et côtières), Malawi, Mayotte*, Mozambique,
Myanmar, Namibie, Nigeria, Ouganda, Pakistan, Panama (Est), Papouasie Nouvelle Guinée,
Pérou (Amazonie), Philippines, République Centrafricaine, République Démocratique du
Congo, Rwanda, Sao Tomé et Principe, Salomon (Iles), Sénégal, Sierra Léone, Somalie,
Soudan, Surinam, Swaziland, Tanzanie, Thaïlande (frontières avec le Cambodge, Le Laos, le
Myanmar et la Malaisie), Timor Oriental, Togo, Venezuela (Amazonie), Vietnam (ailleurs
que bande côtière et delta), Zambie, Zimbabwe, Yémen
* : Chimio-prophylaxie facultative pour un séjour de moins de 7 jours pour l’ensemble
du pays, si possibilité de consulter, en urgence, en cas de fièvre, dans les mois qui suivent.
82
Tableau 8 : Traitement prophylactique du paludisme chez l’adulte, proposé en France (2)
Molécules (et nom déposé) Groupe de résistance BEH n°26-27/2003 Chloroquine
(Nivaquine®) Groupe 1
Chlorhydrate de proguanil + chloroquine (Savarine®)
Groupe 2 Groupe 3 (en cas de contre- indication ou de
mauvaise tolérance à la méfloquine) Méfloquine (Lariam®)
Groupe 3
Atovaquone + chlorhydrate de proguanil (Malarone®)
Groupe 3 Groupe 2
Doxycycline (Doxypalu®)
Groupe 3
♦ dans tous les cas, le traitement doit être prolongé après avoir quitté la zone
impaludée car les médicaments n’ont pas d’effet sur les formes précoces de l’infection
(sporozoïtes) inoculées par le vecteur ainsi que sur les schizontes hépatiques.
♦ Il faut savoir que cette chimio-prophylaxie est aussi conseillée :
♦ pour les femmes enceintes bien que leur voyage dans de telles
zones ne leur soit pas recommandé. Il leur est recommandé d’utiliser l’association
chloroquine/proguanil
♦ pour les enfants et les nourrissons, chez qui la prophylaxie de la
mère n’est pas transmise s’ils sont nourris au sein. Là encore, le voyage est déconseillé. Les
molécules utilisées restent les mêmes mais il faut adapter leur posologie au poids de l’enfant.
♦ Enfin, notons que les personnes devant séjourner longtemps dans une zone
d’endémie (en général plus de 6 mois) sont exposées, si elles suivent une chimio-prophylaxie,
à des effets secondaires importants, essentiellement avec la chloroquine et le proguanil.
Quant au vaccin, sans cesse promis, il paraît irréalisable dans l’immédiat. En effet, dans
les premiers essais, sa forme actuelle ne protège que de 20 à 30% en Amérique du Sud et
beaucoup moins en Afrique (109) (108) (154). De plus, cette protection partielle remet en
cause le processus d’immunité naturelle des populations vivant en zones d’endémie, qui pour
certains semblent préférable.
La recherche de ce vaccin butte sur différents problèmes tels que la diversité génétique
du Plasmodium et la mise en place de mécanisme d’échappement. La réponse immunitaire
83
reste difficile à mettre en place d’autant plus qu’il n’existe pas encore de modèle animal
adéquat.
Pourtant, dans le contexte de cette recherche d’un éventuel vaccin, très attendu,
différents stades du cycle évolutif du parasite représentent des cibles éventuelles : quatre
stades, concernant les formes libres du parasite se révèlent plus particulièrement prometteurs :
♦ les sporozoïtes, formes infestantes pour l’homme et inoculées lors du repas
sanguin du moustique
♦ les mérozoïtes, issus de l’éclatement des schizontes érythrocytaires
♦ les gamètes, obtenus dans l’estomac de l’anophèle femelle gorgée du sang des
malades porteurs des éléments potentiellement sexués (les gamétocytes)
♦ le corps bleu intra-hépatique (schizontes) ou ses mérozoïtes
C’est le stade hépatique qui suscite de nos jours un intérêt croissant car il est supposé
renfermer les antigènes non accessibles au système immunitaire mais qui, cependant,
pourraient le stimuler à la libération des mérozoïtes hépatiques.
L’hépatocyte infesté semble, de plus, pouvoir être la cible de cytokines, intervenant
dans des phénomènes de cytotoxicité.
Ce sont pourtant les stades érythrocytaires qui ont été jusqu’ici les plus explorés, car ils
sont responsables de la symptomatologie et sont longtemps restés les seuls cultivables in
vitro. Actuellement, la plupart des chercheurs s’orientent vers un vaccin multivalent associant
les épitopes des différents stades.
Le développement de ce vaccin n’est donc pas encore fait.
Par ailleurs, les avancées de la biologie moléculaire ouvrent la voie à de nouveaux
moyens de prévention. Par exemple, il serait intéressant de produire des moustiques mâles
réfractaires à l’infection par le Plasmodium puis de les lâcher massivement dans la nature afin
de créer une compétition avec les moustiques sensibles au parasite, et ainsi limiter la
transmission.
84
PROJET DE RECHERCHE : ETUDE DE LA G IROLLINE
85
I- LES MOLECULES MARINES ET LEUR ACTIVITE
B IOLOGIQUE
Parmi les molécules actuellement utilisées, les plus usitées sont d’origine naturelle :
♦ la quinine, bien qu’actuellement sa synthèse soit semi-synthétique et que des
dérivés soient recherchés afin de détourner les difficultés de son utilisation
♦ l’artémisinine et ses dérivés
Dans la recherche de nouveaux médicaments antipaludiques, la piste des molécules
d’origine naturelle est donc à privilégier.
A partir du champ habituellement défini par les plantes et ²²²²²²²²les micro-organismes
terrestres, le screening de nouvelles molécules à potentiel antipaludique est en marche.
Par exemple, le Taxol, extrait de l’If (Taxus brevifolia), actuellement un des meilleurs
anti-cancéreux et récemment étudié pour ses propriétés anti-plasmodiales, est issu de
recherches ethnopharmacologiques à partir de la médecine traditionnelle (121) (113). De
nombreuses autres molécules en sont également issues, mentionnons seulement la morphine
dérivée de l’opium, l’aspirine d’abord issue du saule. Beaucoup de molécules d’origine
naturelle sont encore irremplacées par des substituts de synthèse.
La nature regorge de composés encore inexplorés ou mal connus. La biodiversité
représentée par les organismes marins commence tout juste à être exploitée, même si à
Alexandrie déjà, des éponges marines étaient utilisées pour diverses applications médicales
(138).
Mais le screening des composés naturels, et en particulier marin, est pour l’instant un
travail laborieux et minutieux. Il consiste à évaluer l’activité des différents organismes sur les
différents agents infectieux, lignées cellulaires, tumeurs, selon l’effet recherché et étudié.
Selon les résultats, il faut extraire des espèces intéressantes les molécules actives et ce travail
est encore difficile.
Pour autant, il ne faut pas négliger cette ressource car elle a déjà démontré sa capacité à
produire des molécules d’intérêt.
86
A- Les molécules marines (138) (115)
1- Généralités
Plus de 70% de la planète est couverte par les océans, et dans certains écosystèmes,
comme les barrières de corail, la biodiversité est supérieure à celle des grandes forêts
tropicales. La ressource marine est considérable.
Certaines éponges étaient déjà recommandées par Plinius pour traiter des infections ou
des fractures. Et au 18ième siècle, d’autres étaient utilisées en Russie et en Europe de l’Est pour
le traitement de maladies pulmonaires et certains rhumatismes.
En 1950, l’Ara-C, agent anti- tumoral du traitement de leucémies et lymphomes, et
l’Ara-A, anti-viral, furent les premiers composés dérivés de la mer (115).
Depuis, plus de 15 000 composés marins ont été décrits, pour leurs propriétés dans
différentes applications :
♦ anti- inflammatoire, comme le manoalide (éponge marine, Luffariella
variabilis), également bien étudié pou son action sur le psiorasis (60) (142) (47).
♦ anti-tumorale. Certaines molécules inhibent de façon non spécifique la
croissance cellulaire, d’autres sont spécifiques des cellules tumorales, enfin d’autres sont
spécifiques d’un type de tumeurs. Des molécules comme l’halichondrine B (Halichondria
okadai), interfèrent avec les microtubules. D’autres, comme la latrunculine A (Latrunculia
magnifica) inhibent la polymérisation de l’actine. Enfin certaines, comme la spongiacidine B
(Hymeniacidon sp.), provoquent un arrêt du cycle cellulaire en inhibant la kinase 4 cycline-
dépendante, arrêtant ainsi le cycle cellulaire en phase I. D’autres actions anti-tumorales sont
décrites pour différentes molécules.
♦ immuno-suppressive
♦ cardio-vasculaire
♦ neuro-suppressive
♦ anti-virale : des molécules comme les papuamides C et D (Theonella mirabilis,
Theonella swinhoei) ou l’avarol (Dysidea avara, également possédant une activité sur le
87
psoriasis) inhibent le virus du VIH. La classe des 2’-5’ oligoadenylates, issus de diverses
éponges, sont eux impliqués dans la réponse médiée par l’INF†††††††††††† contre divers virus de
mammifères.
♦ antipaludiques
♦ antibiotiques et antifongiques
Les cibles de ces molécules sont, comme leurs applications, variées (64):
♦ les canaux ioniques, comme pour les conotoxines
♦ les enzymes
♦ inhibition des sérine kinases et thréonine kinases comme la bryostatine
(Bugula neritina), l’hyménialdisine (vide infra), la scytonemine (Stigonema sp.)
♦ inhibition des tyrosine kinases, comme l’aéroplysinine-1 (Verongia
aerophoba), qui inhibe la prolifération des cellules tumorales stimulée par l’EGF ‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡
♦ inhibition des phospholipases A2, comme le sesterpène monoalide, dont
l’essai clinique de phase I fut arrêté pour des raisons de toxicité
♦ certaines molécules interfèrent avec les microtubules, comme la dolastatine
(Dolabella auricularia)
♦ beaucoup interagissent avec l’ADN et ont un rôle anti- tumoral certain.
Actuellement, la question de savoir pourquoi tant d’éponges ou composés marins
présentent de telles propriétés reste sans réponse.
La complexité des métabolites marins, et leur accumulation, semble avoir comme
intérêt la survie des organismes qui les produisent.
Leur niveau élevé de cytotoxicité assure autour des organismes un environnement
compatible avec leur vie, éloignant les prédateurs, d’autant qu’ils sont le plus souvent
immobiles et peu protégés. La plupart des composés marins d’intérêt sont produits en région
†††††††††††† Interféron ‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡ Epidermal Growth Factor
88
tropicale ou sub-tropicale, où la pression de prédation est forte. Il est intéressant de noter que
les composés les plus actifs dans la lutte contre les prédateurs sont ceux présentant le plus
d’intérêt pharmacologique.
Les métabolites produits sont, de plus, assez sélectifs pour ne pas provoquer la
destruction de ces organismes. Il est intéressant de noter que peu d’être vivants marins
utilisent ces métabolites dans leur régime alimentaire.
Ces métabolites semblent également jouer un rôle dans la protection des organismes
marins contre les bactéries, champignons ou encore parasites. Mais il faut noter que ces
organismes vivent assez régulièrement en symbiose, avec des bactéries surtout, est qu’il est
difficile de distinguer métabolites produits par la bactérie, métabolites produits par
l’organisme marin et métabolites produits spécifiquement dans la symbiose.
Enfin, les métabolites marins sont produits par ces organismes avec des variations qui
suivent celles de l’environnement.
Un problème qui se pose avec les composés marins est la difficulté d’extraire une
grande quantité de molécules à partir des organismes producteurs et les problèmes
écologiques qui peuvent résulter de telles exploitations. De plus, possédant fréquemment des
centres asymétriques, ces molécules sont souvent de synthèse difficile.
Mais le problème majeur de ces composés, est leur toxicité assez régulière (101) (12).
La plupart du temps hautement cytotoxiques, de nombreuses molécules marines sont étudiées
pour leurs propriétés anti- tumorales, un nombre important de molécules déjà passées en essais
cliniques ont vu leur développement stoppé à cause de leur toxicité trop élevée. Celles
présentant des intérêts anti-plasmodial, anti-viral ou anti- infectieux sont souvent toxiques et
leur index thérapeutique est souvent faible.
Les conotoxines, aux doses usuelles, sont par exemple toxiques et même létales pour
l’homme (64). La didemnine B, excellent anti-viral et présentant une bonne cytotoxicité fut
étudiée en essais cliniques qui durent être stoppés à cause de sa forte toxicité (101).
Il est intéressant de corréler la toxicité importante de ces produits à l’encontre des
organismes terrestres au fait que le milieu marin provoque une forte dilution des molécules.
Elles sont donc souvent hautement actives pour contrebalancer cet effet de dilution (64).
89
2- Les molécules à potentiel antipaludique
Comme cité précédemment, les molécules et métabolites marins peuvent présenter des
propriétés antipaludiques.
Laurent et Pietra ont listé les différentes cibles contre lesquelles peuvent agir les
molécules (79) :
♦ cibles enzymatiques dont :
♦ kinases (dont on compte 85 gènes sur les 6 000 que compte Plasmodium
falciparum)
♦ cystéines protéases (avec la falcipaïne), dont l’inhibition peut permettre de
bloquer la dégradation de l’hémoglobine et donc le développement du parasite
♦ hémoglobine. De nombreuses molécules peuvent se lier à la
ferriprotoporphyrine IX
♦ métabolisme des phospholipides. Les phospholipides polaires peuvent inhiber
de façon spécifique la biosynthèse de la phosphatidylcholine des érythrocytes parasités.
♦ nouvelles cibles issues des études génomiques, comme l’apicoplaste
parasitaire, qui est sans analogie chez l’homme.
Puis ces mêmes auteurs ont décrits les différents composés qui ont montré des activités
anti-plasmodiales intéressantes.
♦ Alcaloïdes :
♦ La famille des manzamines est produite par des éponges marines de
différents ordres. La manzamine A présente une CI50§§§§§§§§§§§§ sur les souches W2 et D6 de
Plasmodium falciparum de 0,96 µM et une administration intrapéritonéale prolonge la survie
de souris infectées et diminue leur parasitémie. Mais elle est létale à 500 µM/kg, son index
§§§§§§§§§§§§ CI50 = Concentration Inhibitrice de 50%
90
thérapeutique est de 10 (10). Cette molécule semble agir en stimulant l’immunité anti-
plasmodiale (11).
♦ Les phléodictynes (Phleodictyon sp.) présentent une haute cytotoxicité sur
lignée de cellules tumorales humaines. Certaines possèdent une CI50 sur FcB1 de 0,62 µM,
leur index de sélectivité (IS************* = activité / cytotoxicité) est de l’ordre de 45 (89).
♦ Les prodiogosines possèdent également une activité anti-plasmodiale
intéressante in vitro et in vivo mais sont généralement cytotoxiques et toxiques (35) (56) (81).
♦ D’autres alcaloïdes marins ont montré des activités anti-plasmodiales in
vitro avec des CI50 de l’ordre du nM (ascididemines) (85) (41).
♦ Enfin, certains alcaloïdes présentent des activités inhibitrices de kinases.
Ces propriétés peuvent être exploitées contre certaines tumeurs mais également contre le
parasite. C’est le cas de l’hymenialdisine qui inhibe Pfnek-1††††††††††††† et PfK7‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡
avec des CI50 de 4 et 30 µM respectivement. La xestoquinone inhibe Pfnek-1 avec une CI50 de
1 µM (78).
♦ Dérivés d’acides aminés et peptides
♦ La bistramide A (Lissoclinum biastratum) peut inhiber l’invasion par les
mérozoïtes et l’induction de la gamétocytogenèse. Les bistramides D et K ont montré une
activité in vivo contre Plasmodium berghei et Plasmodium vinckei petteri mais la dose létale
est très proche de la dose effective (90) (145) (55).
♦ La dolastatine 10 (Dolabella auricularia) et ses analogues synthétiques
provoquent un arrêt des divisons nucléaires par désassemblage des microtubules nucléaires.
Elle est entrée en phase II des essais cliniques mais son activité aux doses utilisée, contre les
cancers prostatiques est trop faible (52).
************* Index de Sélectivité ††††††††††††† Plasmodium falciparum NIMA related kinase 1 ‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡ Plasmodium falciparum Kinase 7
91
♦ Endopéroxides :
♦ Une molécule comme le 2-epinuapauonate (Diacarnus levii) présente une
CI50 de 7,4 µM, un IS de 10 et inhibe 56% de la croissance de Plasmodium berghei in vivo
lors du test de Peters à une dose de 25 mg/kg/j (44).
♦ Terpénoïdes :
♦ Plusieurs molécules de cette famille présentent des CI50 de l’ordre du nM et
des IS > à 1 000.
♦ Les a-galactosyles céramides (Agelas mauritanius), initialement découverts
pour leur action anti- tumorale, peuvent être simplement modifiés pour présenter une forte
activité anti-plasmodiale, en stimulant l’immunité (61) (170).
B- La Girolline et dérivés
1- La girolline (80) (8) (7)
La girolline est un métabolite naturel extrait en 1988 d’une éponge de Nouvelle
Calédonie, Cymbastela cantharella (dont l’ancien nom est Pseudaxinyssa cantharella). C’est
un alcaloïde dérivé d’un 2-aminoimidazole (45).
Plus récemment la girolline a aussi été extraite d’une éponge collectée à l’ouest du
Japon, Axinella brevistyla.
Les premières études menées sur la girolline pour évaluer son éventuelle activité anti-
tumorale ont démontré une cytotoxicité intéressante in vitro. La CI50 sur les cellules KB est
de 0,14 µM.
Puis in vivo la girolline a montré une activité anti- tumorale prometteuse, par exemple
contre des tumeurs murines ainsi que sur des tumeurs solides. Les premiers tests in vivo ont
permis d’envisager des essais cliniques en tant qu’anti-tumoral.
En dépit d’études sur le chien et la souris montrant peu d’effets toxiques, les essais
cliniques de phase I concernant la girolline ont rapidement dû être arrêtés à cause d’effets
secondaires sévères, essentiellement sur le système cardio-vasculaire. En particulier, la
girolline induit une forte hypotension sans effet antitumoral apparent (36).
92
Afin de détourner ces effets, des analogues de synthèse ont ensuite été envisagés. Deux
séries de dérivés ont été imaginées, selon la position de la chaîne latérale.
En 2002, la série de la « 5-déazathiogirolline » a été la première synthétisée. Dans cette
série, la chaîne latérale est portée en position 5 sur le groupe aminothiazole. Mais seulement
quelques dérivés de cette chaîne ont montré une cytotoxicité aux dilutions modérées et la 5-
déazathiogirolline elle-même reste inactive (129). La série de la 4-déazathiogirolline a donc
été envisagée, où la chaîne latérale est en position 4 sur le cycle aminothiazole (100). Mais là,
le chef de file, la 4-déazathiogirolline, est inactif, et aucun des composés de la série n’est plus
actif que ceux de la série de la « 5-déazathiogirolline ». En revanche, les composés acides et
les dérivés protégés, intermédiaires de synthèse dans ces séries ont montré une plus grande
activité que les composés terminaux, l’un de ces composés intermédiaires présente même une
CI50 de 8 µM.
Outre leur activité anti- tumorale, la girolline et ses dérivés ont aussi été étudiés pour
leur activité anti-rétrovirale. En particulier, les composés de la série de la « 4-
déazathiogirolline » ont été testés sur le virus VIH-1. La CI50 est pour cette activité de 0,1
mM, pour une CI50 de l’AZT§§§§§§§§§§§§§, molécule de référence, de 6 nM sur le virus VIH-1
Bal dans des conditions particulières de culture (100).
Des différentes études réalisées sur les composés des deux séries, il ressort que
l’hétérocycle aminoimidazole est un élément important dans la structure des composés pour
qu’ils aient une activité cytotoxique. En effet, le remplacement de la moitié aminoimidazole
par un aminothiazole provoque une disparition de cette activité.
La synthèse totale de la girolline a été faite par différentes équipes (17) (7) (40).
Le mode d’action de la girolline n’a encore pas été complètement identifié. Lavelle et
al. et les chercheurs de Rhône Poulenc (39) qui ont mené les essais cliniques ont suggéré
qu’elle inhibait la synthèse des protéines préférentiellement lors de la phase terminale de cette
synthèse chez les eucaryotes (80) (101) (39). Cette action est ciblée sur le relargage des
peptides au niveau du ribosome.
§§§§§§§§§§§§§ Azidothymidine
93
Très récemment, Schroeder et al. ont cherché à démontrer le même effet sur le ribosome
bactérien. Mais il semble que l’affinité de la girolline pour la grande sous-unité ribosomale
soit plus forte chez les eucaryotes que chez les procaryotes (131).
Quant à Tsukamoto et al., ils ont plus particulièrement étudié le mécanisme d’arrêt du
cycle cellulaire de la girolline (153). On sait que la protéine p53, suppressive de tumeurs, est
impliquée dans l’arrêt du cycle en phase G2/M, capable de provoquer l’arrêt du cycle
cellulaire ou l’apoptose lors de lésions de l’ADN, elle contrôle la croissance cellulaire et le
développement des anomalies génétiques. La girolline provoquerait l’accumulation de p53
polyubiquitinée en bloquant son recrutement par le protéasome, « protéase multimérique ». Il
est la voie principale de la dégradation des protéines cellulaires préalablement « marquées »
par une chaîne polyubiquitinée. De nombreuses protéines régulatrices passent ainsi par cette
voie de dégradation, régulant des mécanismes physiologiques mais aussi
physiopathologiques. Cette voie du protéasome joue alors un rôle important dans la croissance
néoplasique et métastatique. Elle est d’ailleurs la cible d’une partie des nouveaux anti-
cancéreux actuellement développés.
De toutes les façons, c’est la synthèse des protéines au cours du cycle cellulaire qui
semble être le mode d’action de la girolline.
2- L’hyménialdisine
Cette molécule, extraite de différentes éponges marines, dont Cymbastela cantharella,
est un alcaloïde qui est capable d’inhiber des kinases et d’avoir donc un effet anti-tumoral
mais également anti-parasitaire.
Cette molécule a été également étudiée pour ses propriétés inhibantes de protéines
kinases impliquées dans des dysfonctionnements neuronaux (responsables de maladies tels
que maladies d’Alzheimer ou de Parkinson). Dans ce cas elle agit par inhibition de la GSK-
3ß************** et de la CK2†††††††††††††† (avec des CI50 de 10 et 35 nM) respectivement,
************** Glycogen synthase kinase -3ß †††††††††††††† Caséine Kinase 2
94
enzymes d’hyperphosphorylation de la protéine tau, associée aux microtubules et impliquée
fortement dans le dépôt des peptides amyloïdes de ces maladies neurodégénératives. (93).
II- ETUDE DE LA G IROLLINE
Les propriétés anti-tumorales de la girolline, particulièrement intéressantes, l’ont portée
jusqu’en essais cliniques de phase I chez l’homme.
Par analogie avec des composés comme le taxol, anti- tumoral à activité anti-
plasmodiale, nous avons voulu savoir si la girolline pouvait présenter ce même type de
propriétés. D’autant plus que l’hypothèse selon laquelle cette molécule pouvait inhiber la
synthèse des protéines était prometteuse.
Nos premières études in vitro nous ont conduits à explorer de façon plus approfondie le
comportement de cette molécule sur des souches de Plasmodium falciparum mais également
sur des souches murines in vivo.
A- Matériels et méthodes
1- In vitro
a- Souches en culture
Quatre souches de culture in vitro de Plasmodium falciparum ont été utilisées pour les
tests d’activité :
♦ W2-Cambodge, elle est multi-résitante et donc chloroquino-résistante, sa CI50
pour la chloroquine a été évaluée à 299 nM.
♦ FcM29-Cameroun, elle est chloroquino-résistante, sa CI50 pour la chloroquine
est de 400 nM
♦ FcB1-Colombie, elle est chloroquino-résistante, sa CI50 pour la chloroquine a
été évaluée à 200 nM
♦ F32-Tanzanie, elle chloroquino-sensible, sa CI50 pour la chloroquine a été
évaluée à 29 nM
95
b- Cultures de Plasmodium falciparum
Toutes les manipulations effectuées in vitro se font sous un Poste de Sécurité
Microbiologique (BH 2004, Faster (n°GBM : HFL 1032) et RERAsafe, Heraeus).
La méthode de culture continue et asynchrone dérive de celle mise au point par Trager
et Jensen (152) et suit également les modifications décrites par Van Huyssen et Rickmann
(156). Elle se fait de manière stérile car aucun antibiotique n’est rajouté dans le milieu de
culture pour éviter les contaminations par d’autres micro-organismes. En effet, on ne connaît
pas l’interaction des antibiotiques avec les différentes molécules testées, ainsi que leurs effets
sur la croissance des parasites.
Les flacons de culture (25 cm3) contiennent des parasites dans des hématies humaines
(du groupe O+/-, du CTS‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡ de Toulouse). Le milieu de culture est du RPMI 1640
(Life Technologies) supplémenté avec 25 mL d’HEPES et 2,05 mM de L-glutamine. Ce
milieu est ensuite complémenté d’un mélange de sérum humain (CTS de Toulouse).
La culture est maintenue en atmosphère humide dans une étuve à 37°C contenant 5% de
CO2.
Chaque jour, l’hématocrite est rapporté à 1% par ajout de globules rouges sains et la
parasitémie ajustée à 2%.
c- Synchronisation
Les parasites en culture in vitro ne conservent pas spontanément la synchronisation in
vivo.
Les souches FcB1 et W2, dites K+, ont la capacité de produire, in vitro, des knobs, qui
forment des protubérances à la surface des hématies parasitées.
‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡ Centre de Transfusion Sanguine
96
Leur intérêt réside dans leur capacité à être synchronisées, c'est-à-dire que l’on retrouve
alors dans le milieu de culture tous les parasites au même stade du cycle.
La synchronisation s’effectue par deux étapes successives jusqu’à obtenir des parasites
ayant au maximum un écart de 6 heures dans le déroulement de leur cycle.
♦ La première étape est une synchronisation au D-sorbitol, qui provoque la lyse
osmotique des parasites en formes âgées (trophozoïtes et schizontes) (77). La perméabilité des
globules rouges parasités par des formes âgées du parasite est fortement modifiée par rapport
aux autres hématies, le sorbitol pénètre fortement dans ces érythrocytes. En pratique, une
solution de sorbitol à 5% est ajoutée à une culture dans laquelle on retrouve une majorité de
formes « rings » (jeunes) puis incubée le temps de provoquer la lyse des autres formes. Le
culot de sang contenant les formes jeunes est ensuite remis en culture.
Cette synchronisation des formes jeunes du parasite peut s’effectuer sur une souche
n’exprimant pas de knobs.
♦ La deuxième étape, de sédimentation, a lieu sur des parasites en formes âgées
(qui ont plus de deux noyaux), c'est-à-dire au stade schizonte. A ce stade du cycle, ces
souches synthétisent les knobs. En rajoutant une solution de Plasmion, produit gélatineux (72)
(83), les formes qui expriment les protubérances sédimentent moins vite que les formes sans
knobs jeunes. Les formes âgées contenues dans le surnageant sont alors remises en culture
avec du sang frais afin de permettre la réinvasion des parasites issus d’un nouveau cycle.
d- Détermination des CI50
a- Principe
La CI50, qui représente la concentration capable d’inhiber de 50% la croissance du
parasite, en culture in vitro, est déterminée par la microméthode radioactive mise au point par
Desjardins et al. (49) et suivant les modifications décrites par Benoit et al. (21). Cette
méthode consiste à tester, en triplicata, les différentes molécules dans des plaques 96 puits
contenant une culture non synchronisée de Plasmodium falciparum.
97
Les étapes de cette méthode sont les suivantes :
♦ Mise en culture de Plasmodium falciparum
De l’eau stérile est distribuée dans les puits du bord des plaques afin d’éviter les effets
de bord.
Dans 57 puits, 100 µL de la culture en milieu RPMI à 5% de sérum humain sont
distribués. L’hématocrite final doit être de 2% et la parasitémie de 1%.
♦ Distribution des dilutions
Les molécules à tester, hydrophobes, sont diluées dans du DMSO§§§§§§§§§§§§§§ afin de
réaliser une solution-mère. Des dilutions successives de cette solution-mère permettent
d’obtenir la gamme de concentrations définie.
Une dernière dilution au 1/50ième dans du milieu RPMI à 5% de sérum humain est
nécessaire afin d’obtenir une concentration finale en DMSO dans le puits n’excédant pas 2%.
En effet, si le DMSO est nécessaire à la bonne dissolution des molécules (solvant apolaire), il
est toxique pour le parasite et induit une dénaturation des protéines.
Notons qu’il est possible de réaliser des solutions-mères directement dans le RPMI à
5% de sérum humain avec les molécules hydrosolubles, c'est-à-dire dans notre cas la
chloroquine seulement.
100 µL de chaque dilution sont distribués dans trois puits par dilution.
Des puits témoins reçoivent du RPMI à 5% de sérum humain ou du RPMI à 5% de
sérum humain et à 2% de DMSO, ils serviront de référence et représenteront 100% de
croissance parasitaire au sein du puits. Enfin, trois puits dits « bruit de fond » contiennent du
milieu RPMI à 5% de sérum humain et 2% d’hématocrite sans parasite, ils servent de témoin
d’éventuelles contaminations de la culture ainsi que de référence pour le niveau basal de
radioactivité.
§§§§§§§§§§§§§§ Diméthylsulfoxyde
98
Les plaques sont mises en incubation à 37°C en atmosphère humide pendant 24h, au
cours desquelles le parasite va se développer.
Les dilutions sont testées de façon extemporanée, le jour de leur préparation puis
quelques jours plus tard (au maximum une semaine) afin de tester l’éventuel effet de leur
conservation au frais. Notons que la conservation améliore parfois l’activité des composés car
elle permet parfois aux molécules de mieux se dissoudre dans le solvant.
De plus, chaque molécule est testée par deux manipulations indépendantes. Au total,
chaque molécule est testée quatre fois.
♦ Incorporation de l’hypoxanthine tritiée
24h après l’ensemencement, 50 µL de milieu RPMI à 5% de sérum humain contenant
0,25 µCi d’hypoxanthine tritiée sont ajoutés dans chaque puits.
L’hypoxanthine est une base azotée qui est nécessaire au développement des parasites et
qui va donc être incorporée par le Plasmodium lors de l’incubation pour produire ses acides
nucléiques.
Les plaques sont laissées incuber à 37°C pendant 24h en atmosphère humide.
♦ Arrêt de l’incorporation de l’hypoxanthine tritiée
24h après l’ajout de l’hypoxanthine tritiée, les plaques sont congelées à - 80°C pour
induire un arrêt brutal de la multiplication des parasites.
♦ Mesure de l’activité inhibitrice des molécules anti-malariques testées sur
Plasmodium
La décongélation des plaques va provoquer la lyse des globules rouges. A l’aide d’un
collecteur de cellules (Filtermate Harvester, Packard®), les acides nucléiques radioactifs (qui
ont donc incorporé l’hypoxanthine tritiée) sont retenus sur un filtre en fibre de verre.
L’addition d’un liquide de scintillation sur ces filtres permet alors la mesure de la
radioactivité retenue dans chaque puits grâce à un compteur ß (1450-Microbeta Trilux,
Wallac-Perkin Elmer®).
Les résultats obtenus sont exprimés en cpm (coups par minute).
Les puits « bruit de fond », qui ne contiennent pas de parasite, représentent la
radioactivité basale de la plaque.
99
100% de croissance parasitaire est représentée par la croissance parasitaire dans les
puits témoins DMSO.
Le pourcentage d’inhibition est calculé comme suit :
X : moyenne des cpm des 3 puits / Bf : bruit de fond / T : témoin
Pour chaque molécule, est tracée la courbe de pourcentage d’inhibition obtenu en
fonction de la concentration. L’échelle est logarithmique. C’est sur cette courbe, qu’est
déterminée la CI50.
Figure 24 : Détermination graphique de la CI50
Figure 25 : Exemple d’un plan d’une plaque utilisant la micro-méthode radioactive
% d’inhibition = 100 - X
T- Bf x 100
1 2 3 5 4 6 7 : eau stérile (37°C)
: témoins DMSO
: témoins RPMI
: bruits de fond
Numéros de dilution pour une molécule :
1 2 3
5 4
6 7 Numéros de dilution pour l’autre molécule :
100
ß- Molécules testées
La plupart des extraits ont été testés sur la souche FcM29 mais la girolline, ainsi que la
chloroquine, ont été testées sur les quatre souches d’intérêt.
Tableau 9: Molécules testées in vitro
1 girolline (forme dichlorhydrate) extraite de Cymbastela cantharella PM = 262
2 5-déazathiogirolline (forme érythro) 3 5-déazathiogirolline (forme thréo) 4 (+)-(3S,4R)-3-benzylloxy-4,5-O-isopropylidène-4,5-dihydropentene
5 (2R/S,3S,4R)-3-benzyloxy-1,2-époxy-4,5-O-isopropylidène-4,5-dihydroxypentane
6 2-amino-4-[(1’S,2’R)-1’-benzyloxy-(2’,3’)-dihydroxypropyl]-thiazole-N2-tertbutylcarbamate
7 2-amino-4-[(1’S,2’R)-3’-azido-1’-benzyloxy-2’-hydroxypropyl]-thiazole-N2-tert butycarbamate
8 2-amino-4-[(1’S,2’S)-3’-azido-1’-benzyloxy-2’-chloropropyl]-thiazole-N2-tert butycarbamate
9 4-déazathiogirolline
10 dibromocantharelline extraite de Cymbastela cantharella
11 hyménialdisine extraite de Cymbastela cantharella PM = 324
12 débromohyménialdisine oxydée dérivé de l’aldisine
13 débromohyménialdisine dérivé de l’aldisine
14 artémisinine PM = 283,34
15 chloroquine PM = 515,87
101
SN
OH
NH2
H2N
Cl
erythro
5
SN
OH
ClNH2
H2N
5
threo
NS
OH
NH2
H2N 2HCl
4
NHN
OH
ClNH2
H2N 2HCl
NS
OBn
OHOH
BocHN
NS
OBn
OHN3
BocHN
SN
OBn
ClN3
BocHN
OO
OBn
OOO
OBn
NH
NHN
NH2
Br
Br
O
girolline 5-deazathiogirollines
9
Cl
2 3
4 5 6
7 8
10
1
4-deazathiogirolline
dibromocanthare lline
NH NH
NHN
O
NH2
O
Br
11 hymenialdisine Figure 26: Structures des composés testés
102
e- Détermination de la cytotoxicité
Elle a été réalisée pas l’équipe collaboratrice de phyto-chimistes de Gif-sur-Yvette.
Des cellules KB (lignée cellulaire provenant de carcinomes épidermoïdes humains) sont
cultivées en série dans un milieu essentiel minimum (MEM***************) avec une solution de
sel d’Earle contenant 10% de sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine, 60 µg/mL de
pénicilline, 60 µg/mL de sulfate de streptomycine et 40 µg/mL de gentamycine. Pour le test
mis au point par Borenfreund et Puerner (26), les cellules sont mises en culture dans des
plaques 24 puits à raison de 25 000 cellules par puits dans 1 mL de milieu. Des dilutions en
série sont réalisées à partir des solutions-mères des composés et ajoutées aux cultures à raison
de 10 µL de dilution par puits, immédiatement après la mise en plaque des cellules. Les
cultures sont incubées à 37°C en atmosphère humide (95% air-5% CO2). Trois jours plus tard,
la viabilité des cellules est déterminée par addition de 100 µL par puits d’une solution de dye
rouge neutre pendant 8 à 16 heures. Puis les cellules sont lavées au PBS (phosphate-buffered
saline) et lysées par ajout de sulfate lauryldodecyle à 1 % sodium. Puis le rouge extrait est
quantifié par photométrie à 540 nm.
On calcule alors la prolifération cellulaire ou son inhibition par rapport à un témoin ne
recevant pas de molécules.
f- Détermination du moment d’action d’une molécule au cours du
cycle asexué érythrocytaire
Cette manipulation consiste à déterminer à quel moment de la phase asexuée
érythrocytaire du cycle de Plasmodium agit une molécule. Le cycle de 48 heures est ici
découpé en 6 périodes de 8 heures.
Pour cela, il faut que la souche sur laquelle est étudiée la molécule soit synchronisée sur
une période de 6 heures environ. Grâce à la synchronisation de FcB1 et W2, nous avons pu
*************** Milieu Essentiel Minimum
103
réaliser le test sur deux souches de sensibilités différentes à la chloroquine afin de valider les
résultats obtenus.
Dans des plaques 24 puits, ces parasites jeunes (« rings ») sont mis en culture (2%
d’hématocrite et 1% de parasitémie) à un temps T0 dans autant de plaques que de périodes de
8 heures (soit 6 périodes pour le cycle de 48 heures, plus une plaque supplémentaire pour les
8 heures suivantes afin de couvrir la réinvasion des globules rouges au cycle suivant ainsi
qu’une plaque pour la durée totale du cycle).
La plaque correspondant aux 8ières heures et la plau couvrant toute la durée du cycle
reçoivent les dilutions de la molécule à des concentrations encadrant la CI50 de la molécule
sur la souche utilisée. Les autres plaques reçoivent seulement du RPMI.
Toutes les 8 heures, les puits contenant les dilutions sont lavés deux fois au RPMI puis
les parasites sont remis en culture avec du RPMI. La plaque correspondant aux 8 heures
suivantes reçoit alors les dilutions aux mêmes concentrations.
L’opération est ainsi poursuivie sur les 48 heures que dure le cycle du parasite.
A la fin de la manipulation, des frottis sont réalisés pour toutes les cultures puis colorés.
La parasitémie de chaque puits est ensuite déterminée puis l’inhibition de la croissance
parasitaire par rapport aux témoins (qui subissent les mêmes opérations) et en fonction de
l’âge de des parasites.
Cette inhibition peut ensuite être comparée au métabolisme du parasite sur les mêmes
périodes.
Figure 27 : Plan d’une plaque de détermination du moment d’action
Témoin RPMI
Témoin DMSO
Molécule 1 (trois concentrations croissantes)
Molécule 2 (trois concentrations croissantes)
104
f- Etude de la réversion
Cette manipulation consiste à étudier l’éventuel effet reversant de la chloroquino-
résistance d’une molécule sur une souche résistante à la chloroquine. En effet, certaines
molécules comme le vérapamil, sont capables d’agir sur les mécanismes par lesquels les
parasites résistent aux anti-malariques. Nous avons voulu savoir si la girolline pouvait elle-
aussi contrarier les mécanismes mis en place par le parasite pour résister à la chloroquine.
Ici, deux souches différentes de Plasmodium sont utilisées :
♦ W2-Indochine, qui est résistante à la chloroquine, c’est sur cette souche que
doit s’exercer l’éventuel effet de réversion
♦ F32-Tanzanie, qui est sensible à la chloroquine et qui sert de témoin négatif
Le principe de cette manipulation est de mettre en culture les parasites en présence de
chloroquine et d’une concentration sub- inhibitrice de la molécule à étudier. Le vérapamil,
reversant de référence, est utilisé comme témoin positif de la réversion.
Après la mise en présence des parasites et des molécules, la manipulation est poursuivie
selon le même protocole utilisé pour la détermination de la CI50.
Ici, est recherchée la diminution de CI50 de la souche vis-à-vis de la chloroquine
lorsqu’elle est en présence de la molécule par rapport à la CI50 de la souche vis-à-vis de la
chloroquine lorsqu’elle est seule. Une concentration qui réverse de 50% la chloroquino-
résistance (CR50††††††††††††††† = concentration réversante de 50%) est déterminée. Cette
concentration correspond à la concentration de molécule réversante qui va induire une
diminution de 50% de la CI50 de la chloroquine (avec comme valeur 100%, la CI50 de la
chloroquine seule).
††††††††††††††† Concentration Réversante de 50%
105
Figure 28 : Plan des plaques d’étude de la réversion
g- Etude de la potentialisation
Ce test permet d’étudier l’effet potentialisateur de la girolline sur la chloroquine. A
l’instar des antibiotiques, les antipaludiques sont capables, au sein du même organisme,
d’interagir, certaines combinaisons d’antipaludiques offrent un effet synergique qui augmente
leur activité, d’autres s’addit ionnent simplement et certains s’antagonisent. La synergie est
recherchée car, dans ce cas, l’activité obtenue dans la combinaison est supérieure à la somme
des activités des deux composants de la combinaison.
L’effet potentialisateur des molécules s’évalue sur des courbes dites
« isobologrammes ». Pour ce test, différentes concentrations de chaque molécule
(correspondant à des fractions des CI50 respectives) ont été ajoutées à une culture de
Plasmodium falciparum (souche F32).
Chloroquine molécule ajoutée
Girolline
Vérapamil
témoin DMSO
bruit de fond
témoin RPMI
4 3 2 1 aucune
4 3
2 1 3 2
1
Chloroquine W2 F32
4 0,1 µM 0,01 µM 3 0,25 µM 0,025 µM 2 0,5 µM 0,05 µM 1 1 µM 0,1 µM
Girolline W2 et F32 4 10% de la CI50 3 20% de la CI50 2 40% de la CI50 1 50% de la CI50
Vérapamil W2 et F32 3 0,1 µM 2 0,25 µM 1 0,5 µM
106
Ainsi, pour une fraction de la CI50 d’une molécule A, on cherche la concentration de la
seconde (B) qui permet d’atteindre la CI50 de la combinaison. La valeur CI50 de B dans cette
combinaison / CI50 de B seule est l’ordonnée du point dans l’isobologramme. Puis pour le
correspondant de la molécule B (100 – la fraction de A) la concentration de A qui permet
d’obtenir la CI50 est recherchée. La valeur CI50 de A dans cette combinaison / CI50 de A seule
est l’abscisse du point dans l’isobologramme.
Figure 29 : Isobologramme de potentialisation
Figure 30 : Plan d’une plaque d’étude de la synergie
eau bruit de fond
témoin RPMI
témoin DMSO
Chloroquine
Girolline
10 % CI50
100 % CI50 75% CI50
10 % CI50
100 % CI50 75% CI50
Chloroquine
Girolline
0% 25 % CI50
50 % CI50
75 % CI50
100 % CI50
0% 10 % CI50
50 % CI50
75 % CI50
100 % CI50
% de la CI50 de A
% d
e la
CI 5
0 de
B
100
100
Antagonisme
Synergisme
Additivité
107
2- In vivo
Toutes les manipulations sur les animaux sont réalisées dans l’animalerie du service de
Parasitologie de l’hôpital de Rangueil (Toulouse) placée sous le contrôle des Services
Vétérinaires (N° d’agréement pour les expériences sur les animaux vertébrés : A3155503).
Elles sont conformes à la directive Européenne (86/609 datée du 24/11/1986). Les études in
vivo sont approuvées par le Comité Institutionnel Français d’Ethique des Expérimentation
Animales (ETH/MP-TLS-1510-01/R/01/06).
a- Culture du parasite
La souche murine Plasmodium vinckei petteri a été utilisée pour les tests in vivo car elle
permet une bonne évaluation de la DE50‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡ avec le test de Peters. Cette souche est
sensible à la chloroquine.
Elle est maintenue in vivo par des passages en série de sang de souris femelles infectées.
Du sang de la souris impaludée est recueilli par prévelement au niveau du sinus rétro-orbital
(la souris étant anesthésiée) et réinoculé à une souris receveuse saine.
Ainsi, une série de passages est réalisée à partir d’une souche de Plasmodium congelée.
Les passages en série modifient la virulence et la capacité de développement du parasite. Afin
de réaliser des tests in vivo reproductibles et fiables. Nos expériences sont toutes daites avec
une souche entretenue entre 8 et 15 passages successifs après sa décongélation.
b- Evaluation de la DE50
Afin d’éva luer la DE50 de la girolline, un test suppressif de 4 jours de Peters (110) a été
utilisé. Le principe est d’injecter 4 jours de suite des molécules à des souris impaludées et
d’évaluer au 5ième jour, l’inhibition de croissance parasitaire due à ces molécules.
‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡‡ Dose Efficace de 50%
108
Les souris utilisées sont des souris Swiss femelles, âgées d’environ 7 semaines au début
du test et pesant environ 30 g. Elles subissent avant le début du test une quarantaine d’une
dizaine de jours. Elles sont maintenues en cages, nourries et abreuvées à volonté. La
température et l’humidité sont celles de l’environnement et les cycles nuit/jour sont de 12
heures.
Le déroulement du test est le suivant :
♦ A Jo :
Toutes les souris du test (sauf celles du lot sentinelle) sont impaludées avec 2.107
parasites dans 100 µL de sérum physiologique. La parasitémie précise du sang est déterminée.
A l’aide d’une cellule de Mallassez, une numération du nombre de globules rouges par
microlitre de sang est également réalisée. Ce mélange sang + sérum physiologique est injecté
par voie intra-péritonéale.
♦ A Jo + 3h
Les souris reçoivent la molécule à différentes concentrations. L’excipient utilisé est
pour chaque souris 100 µL de DMSO (sauf à 0,1 mg/kg/j, où il est composé de 50 µL de
DMSO et 50 µL de sérum physiologique). Les différentes dilutions sont distribuées soit par
voie intrapéritonéale soit par voie orale à l’aide d’une sonde gastrique.
Un lot témoin, impaludé, reçoit l’excipient seul. Un lot sentinelle (souris saines, ni
impaludées, ni traitées) permet d’observer les éventue ls problèmes sanitaires (essentiellement
infectieux) qui pourraient interférer dans le test.
♦ J1, J2 et J3, à la même heure que la veille :
Les souris reçoivent chaque jour la même quantité de molécule, par la même voie.
♦ J4 :
Des frottis minces (réalisé sur une goutte de sang caudal) sont réalisés sur l’ensemble
des animaux puis colorés. La parasitémie est alors évaluée sur chaque frottis par comptage sur
3 champs minimum (un millier de globules rouges environ comptés). L’inhibition de la
croissance parasitaire est évaluée par rapport au témoin recevant l’excipient seul (qui
représente 100% de la croissance parasitaire). Si les souris survivent, un suivi régulier de la
parasitémie est réalisé à l’aide de frottis minces, jusqu’au 60ième jour.
109
Plasmodium vinckei petteri est létal chez la souris Swiss entre J6 et J9. Les souris
impaludées non traitées présentent généralement vers J5 une faible hypothermie avec un poil
hérissé et une activité ralentie. Cependant, aucune médication analgésique ne peut être
envisagée pour le traitement éventuel de la douleur pour ne par contrarier les effets de la
molécule testée. En effet, ne connaissant pas suffisamment ni le mécanisme d’action, ni
l’efficacité intrinsèque de la molécule étudiée, nous ne pouvons pas l’associer à un autre
médicament qui pourrait influencer la réponse des souris traitées. Par ailleurs, les souris non
traitées et celles qui ne seront pas guéries pas le traitement meurent rapidement en raison
d’une anémie aigue due à une hémolyse engendrée par le parasite. Ce phénomène brutal et
rapide, dépend de la parasitémie et de l’efficacité du traitement. Il ne peut pas être anticipé et
les souris ne peuvent donc pas être euthanasiées avant. La survie des animaux traités par
rapport aux souris témoins est également observée. Les souris sont suivies et contrôlées
jusqu’à J60 pour évaluer la toxicité des molécules aux concentrations utilisées. Les différentes
souris encore en vie à J60 sont ensuite euthanasiées par inhalation de CO2.
Tableau 10: Répartition des animaux lors du test de Peters
Doses testées (mg/kg/j) (VO et IP
Nombre de souris par doses
Témoins
0,1 3 1 5 10 5 25 5 50 5
Sentinelles Témoin excipient VO Témoin excipient IP
VO = Voie orale IP = Voie intrapéritonéale
c- Etude de la toxicité
Dans le cadre de l’étude de la toxicité aiguë, la DL50§§§§§§§§§§§§§§§ de la girolline a été
évaluée selon un protocole permettant de connaître la dose unique capable de provoquer la
mort d’au moins la moitié des animaux.
§§§§§§§§§§§§§§§ Dose Létale de 50%
110
Dans ces tests, les animaux ne sont pas impaludés. Afin de tester la toxicité de la
girolline sur deux espèces animales de laboratoires connues pour ne pas répondre de la même
façon aux toxiques, des souris Swiss femelles comme celles utilisées lors du test de Peters
ainsi que des rattes Wistar (âgées de 4 semaines et pesant une centaine de grammes) ont
reçues différentes doses de girolline.
La molécule est distribuée aux animaux par voie intrapéritonéale ou par voie orale à
l’aide d’une sonde gastrique, une seule fois.
L’excipient est un mélange de sérum physiologique et de DMSO en proportions égales.
Pour les souris, la molécule est distribuée dans 100 µL de cet excipient, tandis que pour les
rats elle l’est dans 200 µL. Lors des tests de Peters précédents, la molécule était diluée dans
du DMSO pur. Le DMSO étant toxique, diminuer de moitié la quantité permet d’en minimiser
l’effet tout en permettant encore une bonne dilution de la molécule qui doit se faire dans un
solvant apolaire.
Après cela, la mortalité provoquée par l’injection est observée quotidiennement. La
DL50 correspond à la concentration qui induit 50% de mortalité dans les 10 premiers jours.
Après cela, les animaux sont encore gardés sous observation pendant 60 jours.
Tableau 11: Répartition des animaux lors de l’étude de la toxicité
Animal Doses testées (mg/kg/j) (VO et IP)
Nombre d’animaux par dose (VO et IP)
Témoin
1 1 5 4 10 4 25 3
Souris
50 4
Sentinelles Témoin excipient VO Témoin excipient IP
1 3 5 3 10 3 25 3
Rats
50 3
Sentinelles Témoin excipient VO Témoin excipient IP
Notons que le nombre de trois animaux est le nombre généralement recommandé dans
les études de toxicité des produits pharmacologiques. Pour les souris, certains lots comptent
plus ou moins d’animaux car un test préliminaire (avec les doses de 1, 5, 10 et 50 mg/kg/j sur
un animal par dose) a d’abord été mis en place.
111
B- Résultats et Discussion
1- In vitro
a- Détermination des CI50****************
♦ Pour la girolline :
♦ Pour la souche FcM29 :
Pour cette souche, l’activité de la girolline a été comparée à celle de l’artémisinine. La
figure 31 montre une courbe d’inhibition obtenue pour les deux composés, avec des
préparations extemporanées et conservées. L’axe des abscisses, correspondant aux
concentrations est à l’échelle logarithmique.
Tableau 12: CI50 de la girolline et de l’artémisinine sur la souche FcM29
Girolline Artémisinine Chloroquine Extemporané (ng/mL et nM) 40 153 2 7 775 400
Conservé (ng/mL et nM) 30 115 3,5 12,3 775 400
0102030405060708090
100
0,01 0,1 1 10 100 1000 10000Concentrations (ng/mL)
% d
'inh
ibit
ion
girolline (extemporanée) girolline (conservée)
artémisinine (extemporanée) artémisinine (conservée)
Figure 31 : Pourcentage d’inhibition de la croissance parasitaire en fonction des concentrations utilisées (gamme de 10 pg/mL à 10 µg/mL) pour la girolline et l’artémisinine sur la souche FcM29
**************** Les manipulations ayant été effectuées plusieurs fois, nous montrons ici qu’une courbe par
souche, la plus représentative
112
On observe qu’à partir de 100 ng/mL, la girolline inhibe 100% de la croissance
parasitaire. Il en est de même pour l’artémisinine à partir de 10 ng/mL.
♦ Pour la souche W2 :
Pour cette souche, l’activité de la girolline a été comparée à celle de la chloroquine.
Tableau 13 : CI50 de la girolline et de la chloroquine sur la souche W2
Girolline Artémisinine Chloroquine Extemporané (ng/mL et nM) 47,5 182 2,2 7,8 155 300
Conservé (ng/mL et nM) 12 46 2,3 8 132,5 257
0102030405060708090
100
0,01 0,1 1 10 100 1000 10000
Concentrations (ng/mL)
% d
'inhi
bitio
n
Girolline (extemporanée) Girolline (conservée)
Chloroquine (extemporanée) Chloroquine (conservée)
Figure 32 : Pourcentage d’inhibition de la croissance parasitaire en fonction des concentrations utilisées (gamme de 50 pg/mL à 50 µg/mL) pour la girolline et la chloroquine sur la souche W2
On observe qu’à partir de 500 ng/mL, la girolline inhibe 100% de la croissance
parasitaire. Il en est de même pour la chloroquine à la même concentration.
♦ Pour la souche FcB1 :
Tableau 14: CI50 de la girolline et de la chloroquine sur la souche FcB1
Girolline Artémisinine Chloroquine Extemporané (ng/mL et nM) 72,5 277 2 7 75 145
Conservé (ng/mL et nM) 40 153 2,5 9 35 68
113
0102030405060708090
100
0,01 0,1 1 10 100 1000 10000Concentrations (ng/mL)
% d
'inh
ibit
ion
Girolline (extemporanée) Girolline (conservée)Chloroquine (extemporanée) Chloroquine (conservée)
Figure 33 : Pourcentage d’inhibition de la croissance parasitaire en fonction des concentrations utilisées
(gamme de 10 pg/mL à 10 µg/mL) pour la girolline et la chloroquine sur la souche FcB1
On observe qu’à partir de 1 000 ng/mL, la girolline inhibe 100% de la croissance
parasitaire. Il en est de même pour la chloroquine à la même concentration.
♦ Pour la souche F32 :
Tableau 15 : CI50 de la girolline et de la chloroquine sur la souche F32
Girolline Artémisinine Chloroquine Extemporané (ng/mL et nM) 30 114 6 21 12,5 24
Conservé (ng/mL et nM) 10,3 39,3 9 32 17,5 34
0102030405060708090
100
0,01 0,1 1 10 100 1000 10000Concentrations (ng/mL)
% d
'inh
ibit
ion
Girolline (extemporanée) Girolline (conservée)
Chloroquine (extemporanée) Chloroquine (conservée)
Figure 34 : Pourcentage d’inhibition de la croissance parasitaire en fonction des concentrations utilisées (gamme de 10 pg/mL à 10 µg/mL) pour la girolline et la chloroquine sur la souche F32
114
On observe qu’à partir de 100 ng/mL, la girolline inhibe 100% de la croissance
parasitaire. Il en est de même pour la chloroquine à la même concentration.
La girolline a montré, in vitro et pour les quatres souches étudiées, une grande efficacité
puisque son niveau d’inhibition de la croissance parasitaire atteint celui de molécules de
références telles que l’artémisinine ou la chloroquine.
♦ Pour les autres composés (de 2 à 13):
En raison de la cloroquino-résistance elevée de cette souche, ils ont été testés contre la
souche FcM29 de Plasmodium falciparum.
Parmi les analogues de girolline, seule la 5-déazathiogirolline, sous ses formes érythro
et thréo, permet d’obtenir une inhibition de la croissance parasitaire. Le maximum de cette
inhibition est de 25 et 30% respectivement. Les autres molécules testées contre le parasite
présentent toutes des activités faibles, avec des valeurs de CI50 supérieures à 50 µg/mL.
C’est parmi la famille de l’aldisine, extraite de Cymbastela cantharella, que l’on
retrouve à nouveau des valeurs de CI50 intéressantes. En particulier, l’hyménialdisine présente
une CI50 de l’ordre du ng/mL.
Tableau 16: Tableau récapitulatif des CI50 obtenues sur la souche FcM29 pour les dérivés de la
girolline et pour certaines molécules extraites de Cymbastela cantharella
CI50 en ng/mL CI50 moyenne en nM Composés extemporanée conservée extemporanée conservée
2 >50.103 >50.103 > 200. 103 > 200. 103 3 >50.103 >50.103 > 200. 103 > 200. 103 4 >10.103 >10.103 > 50. 103 > 50. 103 5 >10.103 >10.103 > 50. 103 > 50. 103 6 >10.103 >10.103 > 50. 103 > 50. 103 7 >10.103 >10.103 > 50. 103 > 50. 103 8 >10.103 >10.103 > 50. 103 > 50. 103 9 >10.103 >10.103 > 50. 103 > 50. 103 10 >10.103 >10.103 > 50. 103 > 50. 103 11 700 900 2200 2800 12 55.103 45.103 > 0,05 > 0,05 13 3.103 2.103 > 0,05 > 0,05
115
En ce qui concerne les essais avec les analogues de la girolline :
♦ la totalité des dérivés de la girolline ne présente pas d’activité anti-plasmodiale
ni de cytotoxicité. Cette absence d’activité chez les dérivés de la girolline, rapportée
également par Nay et al. et Schiavi et al. (100) (129) lors des tests d’activité anti- tumorale
semble avoir pour origine l’absence de l’hétérocycle aminoimidazole qui se trouve sur la
molécule de la girolline.
♦ quant aux molécules extraites de la même éponge que la girolline (famille de
l’aldisine et dibromocantharelline, extraites également de Cymbastela cantharella), elles
présentent également une activité anti-plasmodiale fa ible, exceptée l’hyménialdisine non
oxydée, dont l’activité s’avère intéressante bien que 10 fois moins élevée que celle de la
girolline. Cette observation permet de confirmer l’action anti-parasitaire de l’hyménialdisine
via son inhibition des kinases.
b- Détermination de la cytotoxicité
Suite à la découverte de cette puissante activité in vitro, il a fallu différencier l’activité
propre de la molécule à l’encontre de Plasmodium falciparum de l’activité qu’elle exerce par
ailleurs sur cellules.
La CI50 de la girolline sur les cellules KB est de 3.10-7 M.
L’index de sélectivité est le ratio cytotoxicité / activité. Il compare l’inhibition de la
prolifération des cellules avec l’inhibition de la croissance parasitaire. Ici il est donc de 300 /
133, c'est-à-dire de 2,25. Un index de sélectivité > 1 correspond à une sélectivité prometteuse.
En comparaison, la cytotoxicité de l’artémisinine a été déterminée sur cellules KB. La
CI50 n’a pas pu être déterminée car l’artémisinine s’avère peu cytotoxique. Une concentration
de 3,5.10-5 M d’artémisinine inhibe 19% de la prolifération cellulaire. L’index de sécurité de
cette molécule est donc supérieure à 4000.
L’équipe de Nay (100) a déterminé sur ces mêmes cellules, la cytotoxicité de la 4-
déazathiogirolline et de ses dérivés (6, 7, 8). Elle est supérieure à 10 µM pour la 4-
déazathiogirolline et les composés 6 et 7, elle est de 8 µM pour le composé 8. Pour les
composés 2 et 3 (5- déazathiogirollines), elle est supérieure à 5 µM. Cette activité anti-
cancéreuse a été étudiée dans le cadre de l’étude des propriétés anti-tumorales.
116
c- Détermination du moment d’action d’une molécule au cours du
cycle asexué érythrocytaire
Les résultats de ces tests sont exprimés en pourcentage d’inhibition au fil du cycle
érythrocytaire du parasite. Il faut ensuite les comparer à la synthèse des acides nucléiques et
des protéines pour pouvoir comparer les moments où la girolline exerce son activité anti-
plasmodiale et les moments où sont synthétisés les différents composés.
Figure 35 : Profil des synthèses d’ADN, ARN et protéines au cours du développement de Plasmodium falciparum en cultures synchrones (adaptation de Arnot et Gull) (13)
♦ Pour la souche W2 :
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 H - 48 H 0 H - 8 H 8 H - 16 H 16 H - 24 H 24 H - 32 H 32 H - 40 H 40 H - 48 H 48 H - 8 H
Temps
% d
'inh
ibit
ion
5 ng/mL 50 ng/mL 250 ng/mL Figure 36 : Activité de la girolline sur la souche W2 au cours du cycle asexué érythrocytaire du parasite
0 6 12 18 24 30 36 42 48 Temps (h)
Synt
hèse
s (c
oups
/min
)
Protéine ARN
ADN
Invasion Lyse
117
♦ Pour la souche FcB1 :
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 H - 48 H 0 H - 8 H 8 H - 16 H 16 H - 24 H 24 H - 32 H 32 H - 40 H 40 H - 48 H 48 H - 8 H
Temps
% d
'inh
ibit
ion
5 ng/mL 50 ng/mL 250 ng/mL
Figure 37 : Activité de la girolline sur la souche FcB1 au cours du cycle asexué érythrocytaire du parasite
Pour les deux souches, on observe que l’activité de la girolline se concentre entre la
16ième et la 40ième heure du cycle asexué érythrocytaire du parasite. On remarque également
que cette activité atteint un pic vers la 32ième heure. Notons enfin que la girolline agit dès la
8ième heure sur la souche FcB1 mais pas sur la souche W2.
Grâce au profil de synthèses de Plasmodium falicparum, on peut établir un parallèle
entre le profil de la courbe d’activité de la girolline et celui de la synthèse des protéines, qui a
lieu principalement au cours des stades trophozoïtes.
Le mode d’action de la girolline, bien qu’ayant fait l’objet d’un certain nombre
d’études, reste encore mal connu.
D’un côté, Tsukamoto et al. avancent l’hypothèse d’une action passant par l’inhibition
du protéasome (vide supra) (153). D’un autre côté, Lavelle et al. et Colson et al. (39)
suggèrent, lors des études sur l’activité anti- tumorale de la girolline, un mode d’action passant
par l’inhibition de la synthèse des protéines à travers le relargage des peptides par les
ribosomes (80). Notre étude au cours du cycle érythrocytaire asexué du parasite abonde dans
ce sens et se confirme par l’utilisation de deux souches. Mais ce mode d’action, s’il se
confirme chez les eucaryotes, ne semble pas l’être chez les procaryotes, chez lesquels la
girolline ne se lie pas avec autant d’affinité au ribosome (131).
118
d- Etude de la réversion
Enfin, en raison des problèmes de résistances évoqués précédemment, la girolline a été
étudiée pour ses éventuels effets en combinaison avec la chloroquine.
L’analyse des résultats de cette étude passe par plusieurs étapes :
♦ La détermination de la CI50 de la chloroquine seule
♦ La détermination de la CI50 de chaque combinaison de molécule
♦ La détermination de la CR50
Les résultats de ce test sont résumés dans les tableaux suivants :
♦ Pour la souche W2, chloroquino-résistante
Tableau 17: Détermination des CI50 et de la CR50 pour la souche W2
en nM CI50 % / CI50 chloroquine seule CR50 Chloroquine seule 350 Ø Ø
100 390 100 250 340 97 Vérapamil 500 150 42.9
460
40 300 85.7 80 300 85.7 150 100 28.6
Girolline
190 100 28.6
120
♦ Pour la souche F32, chloroquino-sensible
Tableau 18: Détermination des CI50 et de la CR50 pour la souche F32
en nM CI50 % / CI50 chloroquine seule CR50 Chloroquine seule 35 Ø Ø
100 35 100 250 35 100 Vérapamil 500 35 100
Pas de réversion
30 35 100 60 20 57.1 100 10 28.6
Girolline
200 10 28.6
70
119
Ainsi, l’effet réversant du vérapamil, qui sert ici de témoin positif est confirmé. En effet,
la CI50 de l’association vérapamil – chloroquine est diminuée dans le cas de la souche
résistante à la chloroquine. De plus, le fait que la CI50 de l’association ne diminue pas dans le
cas de la souche sensible confirme que l’effet du vérapamil se joue sur la résistance à la
chloroquine.
A contrario, la CI50 de l’association chloroquine-girolline diminue à la fois pour la
souche sensible et pour la souche résistante. La girolline n’a dont pas d’effet sur la résistance
à la chloroquine. Par contre, la forte diminution de la CI50 avec l’association girolline +
chloroquine, nous a poussés à investiguer l’effet de l’association de la girolline à la
chloroquine dans des tests de potentialisation.
Contrairement à l’action du vérapamil, la girolline n’est pas capable d’agir sur les
canaux PfMDR et de réverser la chloroquino-résistance du parasite.
e- Etude de potentialisation
Lors de ce test, un isobologramme précis de l’association girolline + chloroquine a été
tracé. On observe sur le nuage de points obtenu que tous les points sont bien en deçà de la
diagonale représentant l’additivité. La girolline, associée à la chloroquine, permet de réduire
considérablement la CI50 de cette dernière sur la souche F32. L’activité de l’association est en
effet 2,5 fois plus forte que celle de la chloroquine seule.
Figure 38 : Isobologramme de la potentialisation entre la girolline et la chloroquine. Le trait diagonal
indique l’additivité
120
En combinaison avec la chloroquine, la girolline a permis d’obtenir un effet synergique
fort et significatif. Cet effet particulièrement intéressant est recherché, dans les associations
que recommande l’OMS.
Dans le cas de la girolline, cette synergie peut être également une première réponse au
problème de toxicité puisqu’elle permettrait de réduire les doses de molécules utilisées.
2- In vivo
a- Evaluation de la DE50
L’évaluation de l’efficacité de la girolline in vivo s’est avérée difficile à cause d’une
toxicité importante de la girolline dans les conditions du test.
Les souris traitées avec de la girolline aux doses de :
♦ de 10, 25 et 50 mg/kg/j par voie orale et par voie intrapéritonéale sont mortes
dès le premier jour de traitement.
♦ de 1 mg/kg/j par voie intrapéritonéale, une souris est morte le 3ième jour de
traitement.
Pour la plupart des souris, la toxicité de la girolline n’a donc pas permis d’évaluer
l’inhibition de la croissance parasitaire au 5ième jour, ce qui est normalement fait lors d’un test
de Peters. Pour les souris encore en vie au 5ième jour, des frottis colorés ont permis d’évaluer
l’inhibition par rapport à la croissance parasitaire observée sur les souris témoins, traitées
avec l’excipient.
Les résultats de ce test sont représentés sur les figures 39 et 40.
♦ à 1 mg/kg/j par voie orale, l’inhibition de la croissance parasitaire est de
43,7%. La DE50 par voie orale est donc proche de 1 mg/kg/j.
♦ à 1 mg/kg/j par voie intrapéritonéale, l’inhibition de la croissance parasitaire
est de 87%, elle est de 26,5% à 0,1 mg/kg/j. La DE50 par voie intrapéritonéale est donc de
0,45 mg/kg/j.
121
010
20304050
60708090
100
0,1 mg/kg/j 1mg/kg/j 10mg/kg/j 25mg/kg/j 50mg/kg/j% d
'inhi
bitio
n de
la c
rois
sanc
e du
par
asite
Toxique Toxique Toxique
Figure 39 : Inhibition de la croissance parasitaire par la girolline en voie orale
0102030405060708090
100
0,1 mg/kg/j 1mg/kg/j 10mg/kg/j 25mg/kg/j 50mg/kg/j% d
'inh
ibit
ion
de
la c
rois
san
ce d
u p
aras
ite
Toxique Toxique Toxique
Figure 40 : Inhibition de la croissance parasitaire par la girolline en voie intrapéritonéale
Les souris traitées avec 0,1 mg/kg/j voient leur parasitémie augmenter progressivement
pendant une dizaine de jours puis meurent de cette charge parasitaire et de l’anémie associée.
♦ Entre le 5ième jour et le 9ième, 4 souris traitées avec 1 mg/kg/j de girolline par
voie orale meurent de leur parasitémie, une seule souris de ce lot survit jusqu’au 60ième jour.
122
♦ Entre le 5ième jour et le 9ième, 2 souris traitées avec 1 mg/kg/j de girolline par
voie intrapéritonéale meurent de leur parasitémie, deux souris de ce lot survivent jusqu’au
60ième jour.
Pour les souris ayant survécu, un suivi de la parasitémie a été effectué grâce à la
réalisation de frottis réguliers. On observe, après une recrudescence de parasitémie à J10 par
voie orale et J12 par voie intrapéritonéale, une baisse de la parasitémie. Un deuxième pic de
recrudescence est observé à J26. Après ce jour, la parasitémie diminue pour devenir nulle
(guérison parasitaire).
0
5
10
15
20
25
30
35
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
Jours (J0+)
Par
asité
mie
(%)
1 mg/kg/j (VO) 1 mg/kg/j (IP)
Figure 41 : Suivi de la parasitémie chez les souris survivantes après le 10ième jour
Le résultat de ce test montre donc une efficacité de la girolline à des doses basses mais
aussi une toxicité importante qui nous a conduit à l’évaluer de plus près.
♦ Le calcul de la DE50 est un bon indicateur d’efficacité. Les résultats de DE50
obtenus avec la girolline montrent une grande efficacité anti-plasmodiale de cette molécule.
Cette DE50 est connue pour la plupart des molécules utilisées actuellement ou en essais. Elle
permet donc de comparer l’inhibition de la croissance parasitaire de façon significative. Par
exemple, elle est de 2,5 mg/kg/j pour l’artésunate en voie orale sur Plasmodium vinckei
petteri chez la souris.
La DE50 de la girolline par voie intrapéritonéale est bien inférieure à 1 mg/kg/j et par
voie orale aux alentours de 1 mg/kg/j. Ces valeurs montrent que l’activité in vitro de la
123
girolline se confirme in vivo et s’approche de la plupart des molécules déjà connues. Cette
activité est d’ailleurs confirmée par le suivi de parasitémie, à la dose de la DE50, la girolline
inhibe la recrudescence du parasite, elle guérit efficacement certaines des souris traitées.
Notons que la courbe de parasitémie en fonction des jours montre une évolution que
l’on peut rencontrer avec d’autres molécules : deux pics de parasitémie aux environ du 12ième
et du 28ième jours sont en effet fréquents.
Bien qu’utile, la DE50 n’est pourtant qu’une approximation de l’efficacité réelle d’une
molécule ou d’un futur médicament.
♦ tout d’abord, elle est déterminée sur un modèle animal, le plus souvent murin.
La physiopathologie de la maladie est alors différente de celle chez l’être humain.
♦ il faut savoir également que la DE50 n’est pas la dose qui guérit l’animal de ses
parasites. Pour connaître la dose suppressive ou la dose curative, il faut utiliser d’autres types
de tests.
b- Etude de la toxicité
L’étude de la toxicité aiguë de la girolline a permis d’évaluer la DL50, dose provoquant
50% de mortalité chez les animaux ayant reçu la molécule.
♦ Chez la souris :
♦ par voie orale, la dose de 10 mg/kg/j provoque 75% de mortalité tandis que
la dose de 5 mg/kg/j ne provoque pas de mortalité. La DL50 de la girolline en voie orale chez
la souris est donc de 8,5 mg/kg/j. Mais dès 5 mg/kg/j, des signes de toxicité (abattement
essentiellement) ont été observés.
♦ par voie intrapéritonéale, la dose de 25 mg/kg/j provoque 100% de
mortalité tandis que la dose de 10 mg/kg/j ne provoque pas de mortalité. La DL50 de la
girolline en voie intrapéritonéale chez la souris est donc de 17,5 mg/kg/j. Mais dès 10
mg/kg/j, des signes de toxicité (abattement essentiellement) ont été observés.
124
* = 1 animal** = 3 animaux*** = 4 animaux
0102030405060708090
100
1 * 5 *** 10 *** 25 ** 50 ***
Doses (mg/kg)
% d
e m
ort
alité
VO
IP
Figure 42 : Mortalité due à la girolline chez la souris
♦ Chez le rat :
♦ par voie orale, la dose de 25 mg/kg/j provoque 100% de mortalité tandis
que la dose de 10 mg/kg/j ne provoque pas de mortalité. La DL50 de la girolline en voie orale
chez le rat est donc de 17,5 mg/kg/j. Mais dès 10 mg/kg/j, des signes de toxicité (abattement
essentiellement) ont été observés.
♦ par voie intrapéritonéale, la dose de 10 mg/kg/j provoque 100% de
mortalité tandis que la dose de 5 mg/kg/j provoque 33,3% de mortalité. La DL50 de la
girolline en voie intrapéritonéale chez le rat est donc de 6,5 mg/kg/j.
** = 3 animaux
0102030405060708090
100
1 ** 5 ** 10 ** 25 ** 50 **
Doses (mg/kg)
% d
e m
ort
alit
é
VO
IP
Figure 43 : Mortalité due à la girolline chez le rat
125
En résumé, cette étude de la toxicité montre :
♦ une plus grande toxicité par voie orale que par voie intrapéritonéale chez la
souris. C’est l’inverse chez le rat, la girolline est, chez eux, plus toxique par voie
intrapéritonéale que par voie orale.
♦ une plus grande toxicité par voie orale chez la souris que chez le rat, une plus
grande toxicité par voie intrapéritonéale chez le rat que chez la souris.
♦ des doses inférieures à la DL50 provoquent des signes d’abattement, la girolline
semble donc toxique pour des doses plus basses encore.
Nous pouvons comparer les valeurs de DE50 et de DL50 bien que celles ci ne résultent
pas des mêmes manipulations, la DL50 étant calculée sur une injection unique et la DE50 sur 4
injections.
Un faible écart sépare ces deux valeurs :
♦ chez la souris :
♦ de 8,5 par voie intrapéritonéale
♦ de 17,5 par voie orale
♦ chez le rat :
♦ de 17,5 par voie intrapéritonéale
♦ de 6,5 par voie orale
Ceci indique que la girolline ne peut être ut ilisée en l'état puisque la dose létale est
proche de la dose efficace.
126
Notons premièrement que la girolline est capable de provoquer la mort avec une seule
injection, ce qui dénote déjà sa toxicité importante et contrebalance les bons résultats
précédents de son activité.
De plus, la girolline est capable de provoquer la mort des animaux, en injection unique,
pour des doses supérieures ou égales à 5 mg/kg/j. Or lors du test de Peters, la toxicité se
manifeste dès 1 mg/kg/j, ce qui est le reflet de la toxicité chronique et non plus aiguë.
L’accumulation de girolline au sein de l’organisme au fil des traitements est donc mortelle.
Les valeurs de DE50 et DL50 trop proches sont le reflêt de la difficulté d’utiliser la
girolline telle quelle dans les traitements.
Enfin, malgré l’utilisation de deux espèces animales ne répondant pas de la même façon
aux toxiques, la toxicité de la girolline, malgré quelques différences (essentiellement sur la
voie et la dose toxique), est générale, quelque soit l’espèce. Après des essais chez la souris, le
rat et le chien, les essais cliniques chez l’homme ont été stoppés à cause d’effets toxiques de
la molécule aux doses anti- tumorales.
La plus grande toxicité de la girolline par voie orale que par voie intrapéritonéale chez
la souris est une réponse inhabituelle et n’est dans ce cas précis pas expliquée.
Comme pour le test de Peters, le test d’évaluation de la DL50 que nous avons mis en
place est un bon moyen d’appréhender la toxicité de la girolline mais n’est pas parfait car il
prend en compte la mortalité seule, sans évaluer d’autres paramètres reflets de toxicité
(paramètres biologiques, comportement etc.).
Notons également que l’évaluation d’un produit passe l’étude de la toxicité chronique,
avec des injections répétées à des doses plus faibles. Cette évaluation n’a pas été faite dans le
cas de la girolline.
C- Perspectives
La girolline a été étudiée in vitro et in vivo en suivant des protocoles bien définis et de
référence, sauf dans le cas de la toxicité. Mais l’étude plus approfondie de cette molécule
devrait être poursuivie afin d’étudier plus finement son activité.
En particulier, in vivo, il serait intéressant, par voie intrapéritonéale de savoir si
l’utilisation d’un autre excipient réduirait la toxicité de la molécule.
127
De plus, toujours chez la souris, l’étude de la potentialisation avec la chloroquine
pourrait être poursuivie afin de savoir si l’effet synergique in vitro se confirme in vivo. Cette
étude de potentialisation pourrait éga lement s’étendre à d’autres molécules telles que
l’artémisinine ou l’un de ses dérivés.
Enfin, il pourrait être envisagé la production de nouveaux dérivés conservant le cycle
aminoimidazole afin d’étudier leur activité et leur toxicité.
128
CONCLUSION
129
Le paludisme reste un problème de santé publique majeur. L’épidémie est toujours en
extension et le traitement butte sur le manque de molécules. La plupart de celles actuellement
utilisées font l’objet de résistances développées par le parasite. Celles qui restent encore
hautement efficaces sont souvent trop chères pour être utilisées à grande échelle dans les pays
les plus atteints.
Ce constat a conduit de nombreuses équipes à travers le monde à se pencher sur la
recherche de nouvelles molécules à potentiel ant ipaludique.
Certaines synthétisent des molécules originales en s’appuyant sur les découvertes
récentes du métabolisme et du génome de Plasmodium. D’autres se concentrant sur le
screening de molécules naturelles. Parmi elles, certaines équipes font appel aux données en
matière de médecine traditionnelle et d’ethno-pharmacologie. D’autres recherchent des
molécules de façon plus large dans les plantes, les micro-organismes ou encore les
organismes marins.
Nos travaux s’inscrivent dans cette démarche.
La découverte de la forte activité antipaludique de la girolline et la confirmation de son
mode d’action se sont avérées prometteuse dans cette quête.
Malheureusement, la toxicité importante de cette molécule compromet son éventuelle
utilisation en l’état.
Par cont re, les activités in vivo intéressantes, renforcée par la forte synergie dans
l’association à la chloroquine, représentent un espoir.
Bien que les premiers dérivés synthétisés n’aient pas présenté des activités aussi bonnes
que celles de la molécule mère, il semble légitime d’envisager la possible production de
dérivés conservant le cycle imidazole de la girolline. Ces composés, s’ils présentent une
activité anti-plasmodiale pourraient représenter une nouvelle classe d’antipaludiques et
seraient un espoir pour de nombreuses populations touchées par la maladie.
130
Permis d’imprimer
131
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148
ANNEXES
149
L ISTE DES ABREVIATIONS
ADN = Acide Désoxyribonucléique
AMM = Autorisation de Mise sur le Marché
ARN = Acide Ribonucléique
ATU = Autorisation Temporaire d’Utilisation
AZT = Azidothymidine
CI50 = Concentration Inhibitrice de 50%
CIVD = Coagulation Intra-Vasculaire Disséminée
CK2 = Caséine Kinase 2
CO2 = Dioxyde de Carbone
CoA = Co-enzyme A
CR50 = Concentration Réversante de 50%
CRP = C Reactiv Protein
CSA = Chondroitin Sulfate A
CTS = Centre de Transfusion Sanguine
DDT = Dichloro Diphényl Trichloéthane
DE50 = Dose Efficace de 50%
DHF = Di Hydro Folate
DHFR = Di Hydro Folate Réductase
DHPS = Di Hydropteroate Synthetase
DL50 = Dose Létale de 50%
DMSO = Diméthylsulfoxyde
dUMP = désoxy Uridilate Mono Phosphate
dTMP = désoxy Thymidine Mono Phosphate
EGF = Epidermal Growth Factor
Fe = Fer
G6PD = Glucose 6 Phosphate Déshydrogénase
GPI = Glyco Phosphatidyl Inositol
GSK-3ß = Glycogen synthase kinase -3ß
Hb = Hémoglobine
HEPES = Acide N-2-hydroxyéthylepipérazine-N’-2-éthansulfonique
HRPII = Histidin Rich Protein II
Ht = Hématocrite
150
ICAM = Inter-Cellular Adhesion Molecule 1
Ig = Immunoglobuline
IL = Interleukine
INF = Interféron
IP = Intrapéritonéale
IS = Index de Sélectivité
IT = Index Thérapeutique
K76T = Remplacement d’une lysine par une thréonine au codon 76
LDH = Lactate Déshydrogénase
Mb = Méga Base
MDR = Multi Drug Resistance
MEM = Milieu Essentiel Minimum
NADP = Nicotinamide Adénine Dinucléoside Phosphate
NO = Monoxyde d’Azote
OMS = Organisation Mondiale de la Santé
ONU = Organisation des Nations Unies
PABA = Paraaminobenzoïque Acid
PCR = Polymerase Chain Reaction
PfCRT = Plasmodium falciparum Chloroquine Resistant Transporter
PfEMP1 = Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1
PfK7 = Plasmodium falciparum kinase 7
PfNek-1 = Plasmodium falciparum NIMA related kinase 1
QBC = Quantitative Buffy Coat
RPMI = Roswell Park Memorial Institut
SIDA = Syndrome de l’Immunodéficience Acquise
TGF = Tumor Growth Factor
THF = Tétra Hydro Folate
TNF = Tumor Necrosis Factor
UV = Ultra Violet
VIH = Virus de l’Immunodéficience Humaine
VO = Voie Orale
151
PUBLICATION
Girolline, a new antiplasmodial compound extracted from the sponge
Cymbastela cantharella
Françoise Benoit-Vical $a,b*, Mariette Saléry $b, Patrice Njomnang Soh a,b, Cécile Saugeon b,
Alain Ahond c, Christiane Poupat c
Dedicated to Pierre Potier who initiated marine chemistry in the I.C.S.N. and
had been fully involved in the girolline project
Running Title: Girolline, a new antiplasmodial compound
$: first co-authors (FBV and MS have contributed equally to this manuscript)
a Laboratoire de Chimie de Coordination du CNRS, UPR8241, 31077 Toulouse 4, France
b Service de Parasitologie-Mycologie, Centre Hospitalier Universitaire de Rangueil, 31059
Toulouse 9, France
c Institut de Chimie des Substances Naturelles du CNRS, 91198 Gif-sur-Yvette cedex, France
*Corresponding author :
Dr F. Benoit-Vical: Service de Parasitologie, CHU Rangueil, 1 av Poulhès, TSA50032, 31059
Toulouse 9, France. Phone: ++33 561323446 – Fax : ++33 561322096.
e-mail: [email protected]
Toulouse, 2007
NOM : SALERY Prénom : Mariette
TITRE : ACTIVITÉ ANTI-PALUDIQUE DE LA GIROLLINE, ETUDE IN VITRO ET IN VIVO
RESUME : Le paludisme est causé par le parasite hématozoaire Plasmodium. Sérieux problème de
santé publique, il provoque de nombreux décès, surtout chez les enfants de moins de cinq ans des
zones tropicales.
Les traitements classiques deviennent inefficaces à cause des résistances du parasite. L'urgence
est la découverte de nouvelles molécules. Les ressources naturelles (dont proviennent quinine et
artémisinine, antipaludiques majeurs), et parmi elles les organismes marins, sont une source
potentielle de molécules. La girolline, connue pour ses propriétés antitumorales, est extraite de
l'éponge Cymbastela cantharella. Nous avons étudié sa capacité à inhiber la croissance du
Plasmodium in vitro et in vivo, son mode d'action et sa potentialisation avec la chloroquine
(antipaludique de référence). Nous avons aussi évalué sa toxicité cellulaire et murine (aiguë) et
l’activité de quelques dérivés. Excellent antipaludique, la girolline peut devenir le chef de file d'une
nouvelle classe de molécules.
MOTS-CLES : Paludisme- Plasmodium - Girolline-Produits marins-Antipaludiques
ENGLISH TITLE: ANTI-MALARIAL ACTIVITY OF GIROLLINE, IN VITRO AND IN VIVO STUDY
ABSTRACT: Malaria, mainly caused by the blood protozoa parasite Plasmodium, is a serious
public health problem. It causes a lot of deaths, principally among under five years old children in
tropical countries.
Classical treatments become inefficient because of resistance developed by the parasite. The
emergency is to discover new molecules. Natural resources (from which are issued quinine and
artemisinin, two major antimalarials) and, among them, marine organisms, represent a potential
source of molecules. Girolline, known for its antitumor properties, is a metabolite extracted from
Cymbastela cantharella. We have studied her antimalarial potential through her capacity to
inhibit the parasitic growth in vitro and in vivo, her mechanisms of action and her potentiation
with chloroquine (antimalarial of reference). We have also evaluated her cytotoxicity and her acute
toxicity and the activity of some derivatives. Excellent antimalarial, girolline could become the basis
of a new class of molecules.
KEYWORDS: Malaria – Plasmodium - Girolline – Marine products - Antimalarials
