Influence de l'acide glyoxylique sur les propriétés des mitochondries isolées

BIOCHIMIE, 1975, 57, 637-645.

lnfluence de l'acide glyoxylique sur les propri6tds des mitochondries isol6es.

M a r g u e r i t e LucAs (* @ ) et A n n e - M a r i e PONS (**).

Laboratoire de B ioch imie Cellulaire, ColI~ge de France, Place Marcelin Berthelot , 75231 Paris Cedex 05,

UER des Sciences Pharmaceut iques et Biologiques de P a r i s - L t t x e m b o u r g - 75270 Paris Cedex 06.

(7-10-1974).

Summary. - - Glyoxalate is an effector of oxidat ive phospbory la t ion in isolated mito- ehondr ia : i t slows do'wn State 3 bu t does not affect State 4 respi ra t ion . This repor t presents the findings of our s tudy on the mechan i sm of act ion of glyoxalate ; these findings are l isted below.

The inh ib i t ion of Stage 3 resp i ra t ion by glyoxalate does not set in immedia te ly , ran be reversed in par t by the add i t ion of an uncoupl ing agent or a dithiol , is non-compe- t i t ive agains t succinate and can be demons t ra t ed w i th subs t ra tes requi r ing the invo lvment of o ther m e m b r a n e t r a n s p o r t systems.

Glyoxalate prevents the increased oxygen uptake s t imula ted by 2,4-DNP or Sr +'. Glyoxalate also inh ib i t s phospha te t r a n s p o r t and th is i n h i b i t i o n ran account for most of the effects observed.

The i nh ib i t i on of State 3 resp i ra t ion is para l le led by a decrease in the mi tochondr ia [ accumula t ion of suecinate : th is decrease could arise f rom a direct effect of glyoxalate on diearboxylic ar id t r anspo r t or could be the resu l t of an i nh ib i t i on of the phospha te l r anspo r t system, which is connected w i t h the former.

The decrease in the resp i ra to ry ra te of uncoupled mi tochondr i a placed in a phosphate free med ium demons t ra tes t h a t the cffeetor acts direct ly at the subs t ra te t r anspo r t o r / a n d electron t r ans f e r level. Phospl~ate, by delaying the resp i ra to ry inh ib i t ion due to glyoxalate, has a protect ing effect on mi tochondr i a l funct ions .

Glyoxalate is thus acting at several mi tochoudr i a l sites. I t a r t s p resumably by fo rming hemimercap ta l s , blocking su l fhydryl groups. Its effects can be accounted for by the unfo ld ing of such (hcmieercaptal) groups under the influence of ADP, Pi, uncoupl ing or others agents wh ich br ing about confo rma t iona l changes in the in te rna l mi toehondr i a l membrane .

I N T R O D U C T I O N .

L ' a c i d e g l y o x y l i q u e ou a c i d e oxo6 t l~ano lque es t u n c o n s t i t u a n t de p l u s i e u r s m i c r o o r g a n i s m e s [1] que 1'.on a c a r a c t 6 r i s 6 6ga l e Inen t chez l ' a n i m a l e n 6tat d ' a v i t a m i n o s e B~ ou d ' o x a l o s e [2]. Le glyo- x y l a t e d i m i n u e l 'ac,tiv~t6 de p l u s i e u r s e n z y m e s du c y c l e de K r e b s te l le que l 'c~-c6toglutarate d e s h y d r o - g6nase [3J ; p,ar ses p r o d u i t s de c o n d e n s a t i o n a v e c l ' o x a l o a c 6 t a t e ou le p y r u v a t e , r e s p e c t i v e m e n t l ' o x a - loma~ate et le 3 - h y d r o x y - 2 - c 6 t o g l u t a r a t e , il p r o - v o q u e l ' i n h i b i t i o n r 6 v e r s i b l e de l ' i s o c i t r a t e d e s h y -

(*) Ce t rava i l f a i t pa t t i e d 'une th~se de doctorat d '~tat en Sciences qui dolt ~tre soutenue h l 'univers i t5 de Par i s VI.

(**) Avec la co l labora t ion de M m~ J. Roman et grace h une subven t ion du C.N.R.S.

"~ A qui toute correspondance dolt ~tre envoyde an Labora to l re de Biochimie Cellulaire, Coll~ge de France, 75231 Par i s Gedex 05.

dr, o g 6 n a s e et de l ' a c o n i t a t e h y d r a t a s e [4] . I1 c o n - tr61era~it a ins i , d i r e c t e m e n ~ ou i n d i r e c t e m e n t , la v i t e s s e d u c y c l e c i t r i q u e d,ans l e s m i t o c h o n d r i e s h 6 p a t i q u e s de r a t [5]. Le g l y o x y l a t e a f fec te aus s i les o x y d o p h o s p h o r y l a t i o n s des m i t o c h o n d r i e s iso- 16es p u i s q u ' i l f r e i n e l e u r resp~i ra t ion l o r s q u ' e l l e s s o n t p l a c 6 e s clans les 6 ta ts a c t i f o n d 6 c o u p l 6 m a i s i l n e m o d i f i e p a s c e d e de l ' 6 t a t con t r616 [8].

La f o n c t i o n a l d 6 h y d e du g l y o x y l a t e le r e n d t r6s r 6 a c t i f v i s -h -v i s des g r o u p e m e n t s t h i o l s a v e c les- que l s i l p e u t f o r m e r des h 6 m i m e r c a p t a l s [5]. De n o m b r . e u x t r a v a n x m e t t e n t en 6 v i d e n c e l ' i n t e r v e n - t i o n de ces g r o u p e m e n t s d a n s la p l u p a r t des f o n c - t i o n s m i t o c h o n d r i a l e s : s y s t 6 m e s de t r a n s p o r t m e m b r a n a i r e s , c o u p l a g e , c h a i n e de t ransferor des 61ec t rons ; en effet l ' ac t iwi t6 de ces s y s t 6 m e s e n z y - m a t i q u e s est i n f l u e n c 6 e p a r d i v e r s a g e n t s a l k y l a n t s te l le la N-~ thy l m a l 6 i m i d e (NEM) [7-10], c ' e s t

638 M. L u c a s et A.-M. Pons .

pourqu~oi nous avons suiv~ l'effet du glyoxylate sur la consommat ion d 'oxygbne des mi tochondr ies en prdsence de substrats faisant i n t e rven i r des t ranspor teurs d 'an ions diff6rents [11-15] et dans divers 6tats 6nerg6ti,ques. Nous rechercherons 6galement s'il modifi.e l 'acivit6 du t ranspor teur de phosphate [16, 17] et des dicarboxyla~tes, une inh ib i t ion h ce niveau pouv,ant rendre compte de la d iminu t ion de la vi, tesse respiratoire [18, 19~.

Nos r6sultats cor respondent h uue accessibilit6 des .thiols, var iable suivant l '6tat 6nerg6tique, et peuvent ~tre rapproch6s des donn6es anl6rieures obtenues avec d 'autres r6actifs [8, 20, 21~.

MATI~RIEL ET TECHNIQUE.

1. Preparation des mitochondries.

Les mit.ochondries h6patiques de r.at sont pr6- par6es et conserv~es d.ans du saccharose 0,25 M 0°C seIon la m6thode de Schneider et Hogeboom [22] par t ie l lement modifi6e [23]. La concen t ra t ion en prot6ines est d6termin6e par une m6thode rapide au biuret [24].

% Mesure de la consommation d'oxgg~ne.

Les vitesses respiratoires sont mesur6es par polarographie h l'ai.d.e d 'une 61ectrode v ibrante recouwerte d 'une membrane de t6flon reli6e h u n enregis t reur ~i lson GME. Les essais son.t r6alis6s h 25°C d i n s une cellule thermostat6e de 1 ml ou 1,5 ml. Les mitochond.ries sont raises en suspension dans du tampon de Chance pH 7,35 de composi- t ion suivante : NaF 12 raM, MgCI. e 6 raM, KH~PO4 3 raM, NaC1 26 raM, K2HPO ~ 13 mM~. Lorsque le substrat utilis6 eM du succinate de sodium, on ajoute de la r~t6none 1,5 t~M afin de bloquer la 1V~.H deshydrog6nase.

3. Mesure du transport de phosphate.

Lorsque les mi~ochondries sont l~ises en suspens ion dans du phosphate d ' a m m o n i u m isoto- nique, on peut consid6rer que la fixati.on d 'eau qui se tradu4t par une var ia t ion de la densi46 optique est foncfiion de l 'activit6 du . t ransporteur de phosphate [~5]. Nous avons abord6 cette 6tude en met- rant .en oeuvr.e la technique de Chappell et Crofts [25] modifi6e pa~r Debise et Durand [263. Les mi tochondr ies sont pr6incub6es dans du tampon saccharose 25,0 raM, Tris 40 raM, EGTA 1 mM pH 7,4 h 25°C (8 mg de prot6ines mi.~ochondriales par ml). On .ajoute l'effec.teur et au bout d 'une minute la r6act ion est arr6t6e par di lut ion :0 ,2 ml de Eincubat sont ajout6s dans une cure optique- ment taill6e contenan.t 2,8 ml de phosphate d 'am- m o n i u m 1,0.0 mM~. On utilise un spectrophotom6tre Gilford reli6 h u n .enregis4reur. La densi~t6 optique est mesur6e a 546 nm.

4. Mesure du transport du succinate.

Les mesures sont r6alis6es grhce/( une technique de centr i fugat ion-f i l t ra t ion raise au po in t par Werkheiser et Bartley [27] adapt6e par Harr is et -Van Dam ~28]. Cette technique permet de s6parer tr6s rap idement les mi~ochondries de leur mil ieu de suspens ion sans modifier leur contenu ou leur perm6abilit6. Le mil ieu d ' incuba t ion est le m~me que celui utibis6 pour les mesures oxygraphiques, mats on ajoute de l ' an t imyc ine A (0,6 ~g/ml) qui bloque l e t ransfer t des 61ectrons afin d 'emp~cher l 'oxydat ion du succinate et la ftrite des produi ts de d6gradation. L 'accumula t ion du succinate n 'est pas influenc6e par l ' addi t ion d ' an t imyc ine A [291. Lors des d6terminat ions de concen t ra t ions in t rami tochondr ia les du substrat, on introdtri~t dans le mil ieu (1,5 ml) 0,4 lwCi de 1~C succinate (activit6 sp6cifique : 27 mCi par nmole) et 1,5 ~Ci d 'eau triti6e)~.

Des essais parall61es r6alis6s avec de l 'eau triti6e et du dextrane marqu6 au 14C permet ten t de d6ter- mine r le volume mi tochondr ia l par rappor t au volume total en t ra in6 dans le culot acide. La r6act ion est d6clench~e par addi t ion des part icules (7 mg de prot6ines mi tochondr ia les par ml) et, aprbs une incuba t ion de 60 secondes, une par t ie de la suspension est pr61ev6e et d6pos6e dans un microtube h centr i fuger con tenan t une couche d 'acide perchlor ique 1,6 N de densit6 1,09, surmon- t~e d 'une couche d ' lmile silicon6e de densit6 b ien d6finie 1,06 qui permet le passage des part icules et d 'une faible part ie du mil ieu d ' incuba t ion . En pa rvenan t dans ~la touche acide, les mi tochondr ies sont lys6es et l ib6rent leur contenu. Des parties aliquotes du milieu, du surnageaRt et de l 'extrai t acide sont pr61ev6es et leur rad.ioactivit6 mesur6e au compteur ~ sc.in~tillation Tr i ca rb Pact~ard, Les calculs et les tests statistiques sont faits h 1'aide d 'une Programma 101 (*).

EXPI~RI.ENCES ET RI~SULTATS.

A. - - I N F L U E N C E DU GLYOXYLATE

SUR LA R E S P I R A T I O N DES M I T O C H O N D R I E S ISOLEES.

1. Respiration en dtat 3 en prdsence de succinate.

a) Concentration variables en e[fecteur.

Les enregis t rements pr6sent6s sur la figure la montvent que lorsque le glyoxylate est ajout6 en 6tat 4, il ne modifie pas la vitesse de consommat ion d'oxyg6ne des mi tochondr ies . Lorsque l 'on ajoute ensuite de I'ADP, on observe une s t imulat ion t ran-

(*) Nous remercions M. Jean Maccario pour l'analyse math6matique des r~sultats.

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 5.

Acide glgoxglique et mitochondries isoldes. 639

s i t o i r e de la , r e sp i r a t i on qui d i m i n u e p r o g r e s s i v e -

m e n t jusqu '~ o b t e n t i o n d ' u n e v i t e s se constant ,e . Cell,e-ei v,arie a v e c l a c o n c e n t r a t i o n en g t y o x y l a t e el p e u t ~tre , infSr ieure '~ eel le de l '~tat 4. Ce f a i t e s t

.M +SUC M÷SUC

0 ~ 0 4 ) - -

GI 0mM +S'UC M * SUC

DN --

~ ~ | 3 2 m ~ ~GISmM

~x \ a~ 8 mM ~ a , Om~

Gi 0 mM

Fro. 1. - - Influence du glgoxglate (Gt) sur la respiration des mitonchondries.

Les mitochondries sont en suspension darts ],5 ml de t ampon de Chance pH 7,4 h 25°C contenant de la rotOnone 1,5 '~tM et du succinate 6 mM (SUC). Les chiffres entre parenthOses indiquent les vitessses respiratoires en nmo,les d'O~ consommOes par minute et par mg de prot~ines.

M ---- mitocho.ndries ADP = 0,5 raM. (a) Concentrations variables de glyoxglate. Prot6ines mitochondria les = 1,2 mg/ml , (b) Incubation du glgoxylate en dtat !~ pendant des

temps variables. Les chiffres soulign~s indiquent ] 'addit ion de

glyoxylate 16 raM, I ~ 30 sec 2 : 1 mn 3 = 2 ran. Les temps d ' incubat ion sont calcul~s h par t i r de

l 'addi t ion du glyoxylate jusqu 'h l 'addi t ion d'ADP. ProtOines m~tochondriales = 1,4 mg/nf l (c) Influence du :~,~ dinitroph~nol (DNP) sar l'inhi-

hilton respiratoire en ~tat 3 produite par le glgoxglate. Prot~ines mitochondria les = 1,2 mg/ml . DNP -- 50 ,~tM.

= tOmoins sans DNP. (d) Influence du dithiothreitol (DTT) sur l ' inhibition

respiratoire en dtat 3 produite par le glgoxglate. ProtOines mitochondria les = 1,1 mg/ml . DTT = 10 mM. ........... = tOmoins sans DTT.

h s o u l i g n e r p u i s q u e la f igure 1 m o n t r e que l '~tat 4 n ' e s t j a ma i s mod.ifi~ q u e l q u e soi l la c o n c e n t r a t i o n d ' . e g e c t e u r ut i l is~e.

b) T e m p s d ' incuba t ion .

D a n s ces essa i s nous a v o n s ajout6 I 'ADP apr~s des t e m p s d ' i n c u b a t i o n v a r i a b l e s du g l y o x y l a t e en ~tat 4 : 30 s e c o n d e s , 1 m i n u t e et 2 m i n u t e s . On o b s e r v e sur la f igure l b que l ' i n t e n s i t 6 et la durOe de la s t i m u l a t i o n r e s p i r a t o i r e p rovoquf i e s p a r ]e nuclOot ide d ~ c r o i s s e n t l o r s q u e le t e m p s d ' i n e u - b a r t o n augmen,te.

c) I n f l u e n c e de £ tMdi t ion d 'un dOcouplant sur

l ' i nh ib i t ion .

Nous v o y o n s su r la f igure l c que l ' add / t i .on de 2 ,4 -d in i t rophOnol (DNP) ~ une s u s p e n s i o n mi to - c h o n d r i a l e d o n t la r e s p i r a t i o n en 6tat 3 est inhibOe p a r le g lyoxy la t e p r o v o q u e une accOlOration de eell e-ci ; en p r e s e n c e d ' u n dOcouplan t l ' i n h i b i t i o n est d o n c p a r t i e l l e m e n t rOvers ible , Les carac tOr is - t i q u e s de la l evee d ' i n h i b i t i v n son t tes s u i v a n t e s :

i) elle n'.est p a s immOdia t e : la r e s p i r a t i o n s 'accO- Ibre p r o g r e s s i v e m e n t aprbs l ' a d d i t i o n du DNP.

it) el le est p a r t i e l l e : on ne rOtabli t j a ma i s la v i t esse r e s p i r a t o i r e du tOmoin sans g lyoxy la t e .

d) I n f l u e n c e d 'un d i th io l sur l ' i nh ib i t ion .

Le d i th io th rOi to l (DTT) est un di,thiol qui 1bye ou p rOvien t 1.es i n h i b i t i o n s d u e s au b locage des thi.ols [7]. Nous a v o n s suiv i l ' i n f l u e n c e de ce rOa~tif su r l ' i nh ib i . t ion que p r o d u i t le g l y o x y l a t e en 6tat 3. C o m m e le m o n t r e la f igure l d , son a d d i -

V (nm ole s 02/rn n/m g)

3O

2 0

GlOmM

~ GISmM G{ 16ram

1o

O ; 1'0 15 20 D'~TT(ITIM) FIO. 2. - - Action du dithiothreitol (DTT) sur l'inhi-

bition respiratoire du glgoxglate en ~tat actif. Les mitochondries (2,3 mg de protdines dans 1,5 ml)

sont en suspension dans du t ampon de Chance pH 7,4 & 25°C contenant de la rot6none 1,5 ,~M. Le subst ra t est du snccinate de sodium 6 mM. Le glyoxylate (GI) est ajout6 1 mn avant I'ADP 0,5 raM, le DTT est ajout6 80 seeondes apr6s I'ADP, lorsque l ' inhib i t ion est 6tablie.

= t6moin sans glyoxylate. • glyoxylate 4 mM.

+ = glyoxylate 8 raM. × = glyoxylate 16 mM.

BIOCHIMIE, 1975 , 57, n ° 5.

640 M. L u c a s el A. -M. Pons .

TABLEAU I.

Inf luence du gIyoxylate sur la respiration de mitochondries placdes en dtat 3 en prdsence de divers substrats.

Glyoxylate

0 mM 8 mM

12 mM 16 mM

' Glutamate Matate ~ H dro

81,8 I 0 37,2 I 0 / 76 ,81 0 20,4 0 22,4 I ~s 19,1 ~9 15,0 81 8,4 50 14,4 I 82 14,1 [ 62 [ 10,2 [ 87 6 ,6 68

/ 10,4 ! 87 ! 12,0 ! 68 I 7,2 i 91 6,6 68

Les essais sont rGalisGs duns du t a m p o n de Chance et la concent ra t ion en protGines mi tochondr ia les est de 1,4 mg dans 1,5 ml. Les vi tesses respi ra to i res sont mesurGes une minu te aprbs addi t ion de l 'effecteur.

V ~ vitesse resp i ra to i re exprimde en nmoles O~ X inn-1 X mg-L I ~ inh ib i t ion exprimGe en pour cent.

t i o n p r o v o q u e u n e s t i m u l a t i o n de la c o n s o m m a t i o n d ' o x y g 6 n e . Cel le -c i es t i m m 6 d i a t e , c o n t r a i r e m e n t

ce q u e l ' o n o b s e r v e a p r ~ s l ' a d d i t i o n d ' u n d6cou- p l a n t . Les r 6 s u l t a t s p r 6 s e n t 6 s s u r la ffi~gure 2 m o n -

G l y o x y i a t e 6 r a m

oosl / • T e r n o i n

I _ _ _ . 4 ~ Y - _ . . . . . • t I I

o 0,25 0.5 1 ~[s] (~M) 1 /

FIG. 3. - - Cindtique d'inhibition par le gtyoxylate de la respiration de mitochondries plac~es cn ~tat actif en prdsence de suceinate.

Les mi toehondr ies (2,3 mg de protGines dans 1,5 ml) sont mises en suspens ion dans du t a m p o n de Chance con tenan t de la ro~Gnone 1,5 .~M. On a jon te ensui te I'ADP 250 !~tM, puts ]e glyoxylate on son solvant . La r~action est d~clench~e pa r l ' add i t ion du substra t . La vitesse resp i ra to i re est mesurGe 1 minu te aprbs le dGbut de la respi ra t ion .

t r e n t que des c o n c e n t r a t i . o n s c r o i s s a n l e s de d i t h i o - t h rGi to l a u g m e n f e n t Ja lev6e d ' i n h i b i t , ion , s a n s que ce l le -c i so i t t o u t e f ~ i s to ta le . D a n s les c o n d i t i o n s e x p G r i m e n t a l e s c h o i s i e s , 27 p. c e n t de Ia r e s p i - r~tiron e n O a t 3 r e s t e bloquGe.

e) Nature de l ' inhibition.

La f igure 3, r e p r G s e n t a t i o n en d o u b l e s i n v e r s e s de L i n e w e a v e r - B u r k , r e n d c o m p l e des rGsu l ta t s o b t e n u s a v e c des c o n c e n t r a t i o n s v a r i a b l e s de suc - c i na t e . La v i t e s s e r e s p i r a t o i r e est mes~rGe u n e m i n u t e a p r b s a d d i t i o n d u s u b s t r a t qu i d G c l e n c h e la

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 5.

rGac.tion. On o b t i e n t de s d r o i t e s qu i se c o u p e n t s u r l ' a x e des absc i s se s , ce qu i c a r a c t G r i s e u n e i n h J - t i o n de t y p e n o n compGt i t i f .

2. Respirat ion en ~tat 3 en presence de divers snbslrats.

N o u s a v o n s r e p r i s les t r a v a u x a n t G r i e u r s su r l ' in f l .uence d u g l y o x y l a t e s u r ]a r e s p i r a t i o n en 6*at a c t i f a v e c d u s u c c i n a t e et d,u ~ - h y d r o x y b u t y r a t e . Le s u c c i n a t e f a i t i n t e r v e n i r Ie sys tb Ine de t r a n s - p o r t des d . i ca rboxy la t e s , le ~ - b y d r o x y b u t y r ~ t e n ' , i m p l i q u e r a i t p u s de t r a n s p o r t e u r [30], N o u s

TABLEAU II.

Inf luence du glgoxglate sur la respiration de mi tochondr ies placdes dans divers ~tats dner-

g~tiques.

Glyoxylate

{:0' 8 mM 15,0 / 80,5 16 mM 7,2 90,6

Activateurs respiratoires

ADP 530 ~M Sr++ 600 ,~M DNP 50 ~M

I V I V

. 0 3 0 o 3 ,8 . 64 38,3 29 19,51 8 3 1 3 3 , 9 ! 3 7

Les condi t ions expGrimentales sont indiquGes dans le texte. Les vitesses resp i ra to i res sont mesurGes une m i n u t e apr~s add i t ion du glyoxylate. La concent ra t ion en protGines mi toehondr ia les est de 1,4 mg dans 1,5 m].

V ---- vitesse resp i ra to i re exprim~e en nmoles 0,, X mn- l × mg-1.

I ---- i nh ib i t i on exprimde en pour cent. Le subs t ra t est du succinate de sodium 6 mM.

Acide g lgoxg l ique et m i t o c h o n d r i e s isol6es. 641

avons suivi 6galement son compor tement avec les m61anges glutamale-malate et malat6-iso~itrate, te p remie r met en jeu les t ranspor teurs des dicarboxylates et des acides amin6s, le deuxi6me ceux des d icarhoxyla tes et t r i carboxyla tes [30]. Les r6sultats du tableau I mont ren t que l ' inh ib i t ion se manifeste avec tous ces substrats e t croi t avec la concent ra t ion d'effecteur.

3. Divers 6tats 6nerg~tiques.

Les mi tochondr ies sont raises en pr6sence de succinate, la respi ra t ion est stimul~e par addi t ion soit d'ADP, soit de Sr ++, soit de 2,4-dini~roph6nol (DI~P). Nous voyons sur le tableau II que dans chacun de ces 6tats, le glyoxylate p rovoque une inh ib i t ion croissant avec sa concentra t ion. C ette inh ib i t ion est plus forle en 6tat actif ou en pr6- sence de Sr ÷÷ qu 'en 6tat d6coup]6.

B . - - I N F L U E N C E D U G L Y O X Y L A T E

S U R LES SYSTI~MES I )E T R A N S P O R T M E M B R A N A I R E .

Divers auteurs ont mis en 6vidence l ' impor tance des groupemenls thiols dans les fonci ions mitochondria les , .ils pa r t i c ipen t en par t icu l ie r aux t ranslocat ions no tamment :~ celle dn phosphate. La lev6e par t ie l le de l ' inh ib i t ion resp i ra to i re due au glyoxylate par le di thiothr6i tol confirme une action au niveau de ees groupements.

GI 16ram DO

1,6 =' - C

DTT OmM 1, 4 OTT lOmM

DTT 20 ou3OlnM T GI OmM

GI S m M DO 1,6 C

1, 4 % D T T OmM DTT I0 ou 20~IM

T GI OI~M

Fro. 4. - - Influence du glyoxylate sur l'activit( du transporteur de phosphate.

Les mitochondries (4 mg de protdines) sont pr6incu- b6es & 25°C dans 0,5 ml de tampon saccharose 250 mM tris 40 mM EGTA 1 mM pH 7,4. Apr6s 1 minute 0,2 ml de cet incubat sont ajont~s darts la cuve du spectro- photom6tre ~ 2,8 ml de phosphate d'ammonium 100 mM pH 7,4 et la variation de la densit6 optique (D.O.) est suivie ~ 546 nm.

Lors des fitudes de lev6e d'inhibition, Ie dithiothreitol (DTT) est ajout6 dans l'incubat h la fin de la pr~incubation, une minute apr6s le glyoxylate.

Afin de v~rifier que les effecteurs ne provoquent pas par eux-mSmes de gonflement des mitochondries, des confr61es (C) sont effeetuds en ajoutant ces produits darts un milieu ne contenant pas de phosphate: le milieu d'iucubation.

T -~ t6moin sans glyoxylate.

1. Transporteur de phosphate.

Les mKoch:ondries raises en suspension dans du phosphate d ' ammon ium fix ent r ap idement de l 'eau

ce qui p rovoque une d iminut ion de la densit6 optique (D.O.)~. Les var ia t ions de la D.O. t raduisent l 'act ivi t6 du t ranspor teur de phosphate . Afin de v6ri'fi~er que le glyoxylate ne p rovoque pas par lui-m6me des modif icat ions du volume des mitochondries , nous avons r6alis6 des contrSles (C) (fig. 4) en ajoutant l 'effecteur dans le mil ieu d ' incubat ion ne contenant pas de phosphate : la densit6 optique n'est pas modifi6e. Les enregis t rements rapport6s sur la figure 4 mont ren t que le glyoxylate 8 et 16 mM incub6 pendan t une minute avec des mi tochondr ies entra ine une inhib i t ion nette de l 'entr6e du phosphate . En pr6sence de glyoxylate 8 et 16 raM, le di thioihr6i tol p rovoque une lev6e d ' inh ib i t ion maximale pour des concent ra- t ions respect ives de 10 et 20 raM. Darts les deux cas 37 p. cent de l 'act ivi t6 du t ranspor teur reste blo- qu6e.

A p r o p o s de ces r6sultats une r emarque s ' im- pose : le mil ieu dans lequel on suit le gonflement cont ient une cer ta ine quantit6 de glyoxylate l ibre apport6 par le mil ieu d ' incubat ion. Dans le phosphate d ' ammonium la concent ra t ion en effecteur est toutefois 15 lois plus faible que darts le mif ieu d ' incubat ion. Nous avons voulu connal t re Fin- fluence de cet appor t d 'effecteur sur le gonflement. Dans ce but nous avons r6alis6 des essais en pr6- incubant les rni tochondries sans glyoxylate et en ra joutant celui-ci dans le phosphate d ' ammonium A des concent ra t ions 15 fois plus faibles que celles utilis6es lots des pr6 incubat ions ; darts ces condi- t ions les enregis t remeuts sont ident iques fi ceux du t6moin T r6alis6 sans effecteur.

Le phosphate peut 6tr.e 6chang6 h t ravers la membrane mi tochondr ia le par l ' in te rm6dia i re de deux t ranspor teurs : l 'un qui r6alise un 6change phospha t e /hyd roxy le , l 'autre phospha te /d i ca rbo - xylate [31]. Dans les condi t ions exp6r imenta les choisies, il est vra isemblable que l 'on mesure pr in- c ipa lement l 'act ivi t6 du premier . Nous avons tout de m6me v6rifi6 s i u n 6change phospha t e /d i ca rbo - xylate avai t lieu. Dans ce bul, nous avons ajout6 au mil ieu d ' incuba t ion du ph4nylsuccinate qtri est un inhib i teur comp6ti t i f du t ranspor t des dicarboxylates [32]. Aux concent ra t ions d ' inh ib i t eur utilis~es, 10 el 20 mM et 6taut donn6 la faible quan- tit6 de d icarboxyla tes (substrats endog6nes), l 'act i- vit6 d,u ~ransporteur dolt 6tre tota lement inhib6e. Lorsque les par t icules sont incub6es pendant une minute avec le ph6nylsuccinate , les var ia t ions de la D.O. en pr6sence de phosphate d 'ammon,ium son t semblables ~ cenes du t6moin T. La tech- n ique utihs~e permet doric bien de mesurer seu- lement l 'activit6 du t ranspor teur Pi /OH-.

BIOCHIMIE, 1975, 57, n o 5.

642 M. L u c a s el A.-M. Pons .

2. Accumulat ion intramitochondriale du snccinate.

N o u s a v o n s su iv i .la c o n c e n t r a t i o n i n t r a m i t o - c h o n d r i a l e d u succ , ina te af in d.e d 6 t e r m i n e r si l ' e f fe t i n h i b i t e u r r e s p . i r a t o i r e e n 6 ta t 3 d u glyo-

d 'un.e d i z a i n e de m e s u r e s . Le tes t F de S n 6 d 6 c o r i n d i q u e que les v, a r . i ances des p o g u l a t i o n s t 6 m o i n s et g l y o x y l a t e s o n t comparab l . e s . On e x 6 c u t e a lo r s o n t e s t t de S tnden1 af in de c o m p a r e r les m o y e n n e s . L o r s q u ' i l est u t i l i s6 .en 6 ta t 3 ~ la c o n c e n t r a t i o n de 2 raM, le g l y o x y l a t e d i m i n u e la v i t e s s e r e s p i -

TABLEAU I I ' l .

Effets du glyoxylate 2mM sur la pdn6tration intramitochondriale el l 'oxydation da suecinate 0,8 raM.

Experiences

Molarit~ intramatricielle du suceinate

T6moia

1,71 -~- 0,34

J~ Glyoxylate

1,01 ~ 0,30

1,23 -t- 0,08

1,66 ~ 0,34 [

1

2 1,78 .-I- 0,11

3 2 ,40 -t- 0,17 I

Inhibition de la

respiratiml p. cent

Inhibition de la

p4adtration p. cent

28 40

18 30

19 30

Les rdsul ta t s sont donndes avec un in te rva l le de confianee de 95 p. cent. Les condi t ions exp~r imenta les sont indiqu~es dans te texte.

x y l a t e c o r r e s p o n d h u n e i n t e r v e n t i o n a u n i v e a u des sy s t~mes de t r a n s p o r t des 4 i c a r b o x y l a ' t e s . Les r6sul , ta ts o b t e n u s son,t i n d i q u d s d a n s le l a b l e a u III . C h a q u e v a l e u r de la c o n c e n t r a t i o n .est la moyenne

M + SUC ¢,

GI

GI 16 mM

1 m n G{ 4raM

G[ 0 mM

Fro. 5. - - Influence du gtgoxylate sur la respiration des mitoehondries plac~es en ~tat ddcoupld dans un milieu ddpourou de phosphate.

Les mitoet tondries (M ~ 2,1 mg de prot4ines dans 1,5 ml) sont en suspens ion "h 25oC dans un t ampon pH 7,4 don t la composi t ion e s t : NaF 12 raM, MgCI~ 6 raM, NaG1 26 raM, Tris-KC1 14,5 m M ; il eont ient de la rotdno,ne 1,5 ,aM et du suecinate (SUC) 6 raM. I.e glyoxylate (G1) est ajout~ en 6tat 4, une minu te avan t le 2 ,4-dini t roph6nol (DNP) 50 ,t~M.

Les ehlffres ent re paren theses ind iquen t les vitesses resp i ra to i res exprim~es en nmoles d'O~ × ran-1 X mg-L

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 5.

r a t o i r e de 20 h 30 p. cen t . On o b s e r v e p a r a l l ~ - l e m e n t une i n h i b i t i o n de Ia p ~ n 6 t r a t i o n de 30 40 p. cen t . Ces d i f f 6 r e n c e s s o n t h a u t e m e n t s i g n i - h c a t i v e s .

3. Etat d~coupl6 sans phosphate.

L o r s des e s sa i s p r d c d d e n t s les p a r t i c u l e s se t r o n - v e n t d a n s les c o n d i t i o n s de 1 '6tat 3, c ' e s t - h - d i r e en p r 6 s e n c e de p h o s p h a t e ; or K l i n g e n b e r g a

TABLEAU IV.

Effet protecteur du phosphate sur l ' inhibition respiratoire du glgoxglate

en 6tat 3. Vitesse resp i ra to i re en nmoles Oe × ran-1 × rag-1.

phosphate avan t

(1)

phosphate apr~s

(2)

Glyoxylate

30 see I mn 2 m n

30 see 1 mn 2 mn

31,8 [ 14,4 31,8 ~ 10,2 31,8 / 9 ,0

3J,2 1%0 31,2 9 ,0 31,2 9 ,0

8,7 I 8,7 7,21 4,5 5,4 / 4,5_ 6 ,0 [ 4,8 5 ,7 4 ,8 5,7 [ 4 ,8

Les mitoehondries (2,1 mg de protdines dans 1,5 ml) sont en suspens ion h 25°C dans un t a m p o n Tris-KC1 pH 7,4 (voir figure 5) eon tenan t de la rotdnone 1,5 ~tM et du suecinate 6 raM. Le phospha te de po tass ium 1,6 m M e s t ajoutd, so.it au ddbut de l ' i ncuba t ion lors des essais [1] soit en mdme temps que I'ADP lors des essais L2]. Le glyoxylate est ajout~ en ~tat 4 une minu te avan t I 'ADP 0,5 mM.

Les vitesses respi ra to l res sont mesurdes 30 seeondes, 1 minu te on 2 minu tes apr~s add i t ion de I'ADP.

Acide glyoxylique et mitochondries isoldes. 643

montr~ que ies activitbs des divers t ranspor teurs son't l ibes ; en par t ieul ier le passage des dicarboxylates n~cessite du phosphate [301. La dimi- ~tution de la concent ra t ion in t ramdtochondria le de succinate provoqu~e p.ar le glyoxylate peut done soit ~tre la consequence d'~ane in te rven t ion direete sur le tr .ansporteur des dicarboxylates soit r6sulter de l ' in 'hibi t ion du t ranspor t du phosphate. En nous p la~ant dans ut~ mil ieu d+pourvu de phosphate, les mi tochondr ies ~tant en ~tat d~coupl+, nous ~linainons l ' inf luence du t ranspor t de phospha.te. Les r~sul'tats obtenus dans ces condi- tions sont pr6sen.t~s sur la figure 5. L 'addi t ion de gtyoxylate provo~lue un.e inh ib i t ion croissant avec sa concentra t ion. On .est done amen6 ~t envisager une in t e rven t ion de l'effec~teur .au niveau du transport des dicarboxylates ou /e t du t ranspor t des ~lectrons, pt~isque seules ces deux ~tapes inter- viennen.t.

~ . - - P R O T E C T I O N DES F O N E T I O N S M I T O C H O N D R I A L E S

P A R LE P H O S P H A T E .

Debise et Durand ont m.ontr~ que le phosphate exerce une protect ion vis-'~-vis de l ' i nh ib i t ion du transpor~t de phosphate par un r~actif a lkylant tel que la N-~thylmal+imide (NEM) [26].

Ncms avons recherch~ un effet s imilaire dH phosphate sur Faction respira loi re du glyoxylate. Nous avons vu pr~c~demment que l ' i nh ib i t ion de l,a consommation d 'oxyg~ne en ~tat 3 produi te par le glyoxylate s'&tablit progressivement. Les r6sultats pr6sen~6s sur le tableau IV mon t ren t que, lorsque l 'effecteur est ajou.t6 avant le phosphate, l'effet est plus rapide. On peut en conclure que la presence du phosphate protege les fonct ions mitochondria les en re ta rdan t Fact ion du glyoxylate.

CONCLUSION.

Le glyoxylate, aeide ald~hydiq,ue, inh ibe la resp i ra t ion des mi tochondr ies en presence de divers subs~ra.ts .et dan.s des ~tats 6nerg~tiques varies : ~tat 3, ~tat activ~ par un eat ion et 6tat d~coupl+. Nos r6sultats sur le gonflement m, ito- chondr ia l mont ren t qu' i l inhibe le t ranspor teur de phosphate. Plusieurs faits exp~rimentaux peuvent s ' in terpr6ter par ce seul m6canisme :

- - l ' i nh ib i t ion de la respi ra t ion en 6tat 3 peut s ' expl iquer par une lelle action puisqne la syn- th+se d 'ATP n+cessite du phosphate.

- - il n 'y a pas d 'act ion sur la consommat ion d'oxyg+ne en ~tat 4.

- - on peu, t r endre compte aussi de 1.a d iminu t ion de la respi ra t ion aetiv~e par un cation car l ' in ten-

sit6 de la s t imulat ion d6pend de la pr6senee de phosphate [33].

- - l ' i n h i b i t i o n de l ' accumula t ion du succinate pourraK ~tre la cons6quence de l ' i nh ib i t ion du t ranspor t puisque Kl ingenberg a montr6 clue les activit6s des diff6ren~s t ranspor teurs sont li6es, en par t icul ier celui des dicarboxylates est influ- enc6 par le phosphate [30].

- - l ' i nh ib i t ion observbe en 6tat d6coupl6 pour- rait p roven i r de la d iminu t ion de la concent ra t ion ln t r ami tochondr ia l e du substrat.

Cependant l ' in te rven t ion du glyoxylate au niveau du t ranspor teur de phosphate ne permet pas d 'expl iquer , d 'une part, que la respi ra t ion inhib~e en 6tat 3 puisse devenir inf6rieaare "~ cetle de l'~tat 4, d 'autre part , qu 'une inh ib i t ion soit obser- v6e dans un mil ieu d6coupl6 sans phosphate. Dans ce dernier eas, l 'effecteur in te rv iendra i t directe- ment sur le t ranspor t du substrat ou/e t celui des 6lectrons. Une in t e rven t ion au niveau du t ransfer t des 61ectrons est 6taybe par deux fairs : l '6tude des 6tats d 'oxydor6duct ion des coenzymes respiratoires par Di Jeso a montr6 un point d ' in te rven t ion de l 'effecteur soit dans la r6gion des flavopro- t6ines, soit dans une r+gion proche du second site de phosphoryla t ion [6J, on observe 6galement une inh ib i t ion de l '6tat d6coupl6 en pr6sence de ~-hydroxybatyrate , or aucuu t ranspor teur sp6- cifique de cet an ion n 'a 6tO caract6risb dans la membrane in te rne mi tochondr ia le [30].

Les r6sultats obtenus avec le di thiothr6i tol sur la respi ra t ion et l 'activi{6 du t ranspor teur de phosphate montren.t que le glyoxylate est tin agent capable de bloquer certains SH. L'accessibi- lit6 de ces groupements pent 6tre modifi6e par des agents tels que ADP, phosphate, d6couplants [7, 201. L'addi.tion d'ADP i ndu i r a i t des modifica- t ions conformat ionnel les de la membrane in te rne qui augmentera ient le nombre de groupements SH accessibles aux inhibi teurs . Certains seraient d6- masq.u6s m6me en l 'absence de product ion d '6ner- gie par suite de la l ia ison de I'ADP h sa trans- locase [21, 34I, d 'autres le seraient lors de la t rans i t ion 6tat 4/6tat 3, en relat ion avec le cou- plage E8, 35]. L 'addi t ion de glyoxylate ne modifie pas la respi ra t ion des mi tochondr ies en 6tat 4 mats nos essais mon t ren t q u e s i l 'on ajoute ensuite de I'ADP, on observe une s t imulat ion t rans i to i re de la respira,tion suivie d 'une inhib i t ion . Cette act ivat ion peut refl6ter une modificat ion conformat ionnel le qui d6masque des thiols avec lesquels le glyoxylate pent alors rbagir. Lorsque le temps &incuba t ion avec l 'effecteur croit, l ' intensi t6 et la dnr6e de la s t imulat ion d~iminuent. On pent penser

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° b

644 M . L u c a s e t A . - M . P o r t s .

que le g l y o x y h t e b l o q u e r a i t c e r t a i n s g r o u p e m e n t s SH m ~ m e en l ' a b s e n c e d ' A D P m a i s b e a u c o u p m o i n s r a p i d e m e n t que l o r s q u e ceux -c i s o n t r e n d u s a c c e s s i b l e s p a r la m o d i f i c a t i o n c o n f o r m a t i o n n e l l e de la m e m b r a n e i n t e r n e . B ien que le g l y o x y l a t e ne p r o d u i s e a u c u n e modifi*cation en 6ta t 4, la r es - p i r a t i o n inh~b6e e n 6tat 3 d e v i e n t i n f S r i e u r e h cel le

de l '6 ta t 4. Ceci p e n t s ' e x p l i q u e r p a r le f a i t que l ' a d d i t i o n du n u c l 6 o t i d e r e n d a c c e s s i b l e h l ' e f fec- t e a r c e r t a i n s -SH d,e la c h a i n e r e s p i r a t o i r e , c e u x - c i 6rant << e n t e r r 6 s >> en a b s e n c e d ' a c c e p t e u r s de

p h o s p h a ¢ e .

Les d 6 c o u p l a n t s 4 i m i n u e n t le n o m b r e de -SH t i t r a b l e s p a r le DTN~B (ac ide 5,5' d i t h i o b i s - 2 - n i t r o - b e n z o i q u e ) [20] ; u n p lus g r a n d n o m b r e de -SH es t d o n e a c c e s s i b l e aux agen t s a l k y l a n t s en ~tat 3 q u ' e n 6tat d6coupl6 . On c o n s t a t e pa ra l l61emen t un effet i n h i b i t e u r r e s p i r a t o i r e du g lyoxyla¢e p lus

i n t e n s e ,en ~tat 3.

D e b i s e e t D u r a n d [26] sugg~ren t que des f o n c - l i o n s t h io l s du t r a n s p o r t e u r de p h o s p h a t e p o u r - r a i e n t ~tre m o b i l e s , le p h o s p h a t e p r o v o q u a n t n n e o r i e n t a t i o n des -SH du c6~6 de la l na t r i c e mi to - c h o n d r i a l e les r e n d a n t a ins i m o i n s a c c e s s i b l e s aux a g e n t s a lky lan t s . Ce~i est en a c c o r d avec nos

r6su l ta t s m o n t r a n t que l ' i n h i h i t i o n e.n ~tat 3 s '6ta- b l i t p lus r a p i d e m e n t d a n s un m i l i e u d 6 p o u r v u de

p h o s p h a t e .

E n f i n s.elon T y l e r [36] et la l h6o r i e c h i m i o s m o - t i q u e [37], le t r a n s p o r t e u r de p h o s p h a t e f e r a i t p a r t i e d.u m6can . i sme de coup lage . G a u t h e r o n r a p - p o r t e de nombreus . e s d o n n 6 e s exp6 r imen . t a l e s en a c c o r d av.ec ce t te h y p o t h 6 s e [8]. Nos r6su l t a t s m o n t r a n t que le glyoxyla. te i n t e r v i e n t au niv.eau d,u co up lage et i n h i b e le t r a n s p o r t du p h o s p h a t e s ' i n s c r i v e n t e n f a v e u r de ce module .

R~SUM~.

Le glyoxylate est un effecteur des oxydophosphory- lati(ms des mitochoudries isol~es, puisqu' i l freine la resp i ra t ion en ~tat 3 mais ne modifie pas celle de l '~tat 4. Notre t ravai l a consist~ h rechercher le m~- canisme d 'act ion de ce produit . I1 ressort de nos essais que :

- - l ' inhibi t ion respiratoire en dtat 3 n 'est pas imm4diate. Elle pent ~tre par t ie l lement levee par addi t ion d'uu ddcouplant on d 'un dithiol. Elle se maui- feste 6galement avec des substrats fa isant in tervenir d 'autres syst~mes de t ranspor t memhranai res .

- - le glyoxylate freine aussi la co nsommat ion d'oxy- g6ne stimulde par le 2,4-dinitrophdnol et le s tron- t ium.

- - il inhibe le t ranspor t du phosphate et cette action pent rendre eompte de la p lupar t des effets observes.

- - o n eonstate une d iminut ion de l 'aecuumlat iou in t rami toehondr ia le du succinate paral l~lement h

l ' inhibi t ion respiratoire de l '6tat 3. Cette diminut ion pourra i t r6sulter d 'une in tervent ion directe de l'effecteur sur le t ransporteuv des dicarboxylates ou n'Stre que la cons6quenee de l ' inhib i t ion du t ranspor t de phosphate, les activit~s de ces divers syst6mes 6tant li6es.

- - la d iminut ion de la vitesse respiratoire des mitochondries placdes en dtat d~coupl6 dans un milieu ddpourvu de phosphate t radui t une intervent ion direete de l 'effecteur au niveau du t ranspor t de sub- s trat ou /e t du t ransfer t des dlectrons.

- - enfin o.n (~bserve un effet protecteur des fonct ions mitoehondria les par le phosphate puisque celui-ei retarde l ' inhib i t ion respiratoire due au glyoxylate.

Le glyoxylate poss6de done plusieurs sites d ' in tervent ion darts les mitoehondries. I1 agirait en b loquant des groupements SH avec lesquels il forme des hdmi- mercaptals . Ses effets s 'expl iqueraient par nne aecessi- bilit6 variable de ces groupements sons l 'influence d 'agents tels que ADP, Pi, ddeouplants.., qui provoquent des modifications conformat ionnel les de ia membrane interne.

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Influence de l'acide glyoxylique sur les propriétés des mitochondries isolées