INTiRl?T DE LA DETECTION SlMULTANiE

DE LA TOXINE A ET DE LA GLUTAMATE

DiSHYDROGiNASE (TRIAGEND C, DlFFlClLE PANEL)

POUR LE DIAGNOSTIC DES INFECTIONS DIGESTIVES

ASSOCliES A CLOSTRIDUM DIFFULE

Frederic Barbut a,bs* , Valerie Lalandea, BBatrice BurghofferS GaglIe Daprey a, Patrick Cohen a, Nathalie Marle”, Jean-Claude Petita

RBsume

TriageND C. difficile Panel (Biosite Diagnostics, BMD, Marne-la-

VaIlBe) est un test imrnuno-enzymatique unitaire permettant la

detection simultanke de la toxine A et de la glutamate d&hydrog8-

nase (GDH), une enzyme spkifique de Clostridium difficile.

C&valuation de ce test a BtB r&al&e a partir de 304 selles de

patients hospitalis& suspects de diarrhees & C. difficile. Les r&J-

tats de la GDH ont BtB compar& Q ceux de la culture et les &sul-

tats du dkpistage de la toxine A a ceux du test de cytotoxicit&

depistant la toxine B. Les frbquences de ksultats positifs en toxine

B et en culture Btaient respectivement de 11,2 O/o et de 25 %. Le

test TriageND a prkentk une sensibilitk de 90,8 ‘J/o pour la GDH

(par rapport a la culture) et de 79,4 010 pour la toxine A (par rapport

au test de cytotoxicitk). D’un point de vue pratique, la rbalisation du

test Triage ND s’est avkrke rapide (20 min) et simple. II peut 6tre uti-

Iis6 comme m&hode de diagnostic des infections digestives Ii&es Q

C. difficile mais aussi comme mkthode de dkpistage des selles

positives g C. difficile (y compris des souches non toxinogknes)

dans les Etudes Bpidkmiologiques.

Clostridium difficile - toxine A - glutamate d&hydrog&

nase - diagnostic - diarrhee.

Summary

TriageND C. difficile Panel (Biosite Diagnostics, BMD, Mame-la-

VaEe) is an individual immunoassay, detecting both a specific

enzyme (glutamate dehydrogenase, GDH) and the toxin A of

Clostridium difficile. Evaluation of this test was performed from

“Service de bact&lologie-virologle bUnitk d’hygikne et de lutte contre les infections nosocomiales (UHLIN) H8pita Saint-Antoine 184, rue du Faubourg Saint-Antoine 75571 Paris cedex 12

* Correspondance.

article recu le 3 novembre 1999, accept6 le 9 ftivrier 2000.

0 Elsewer, Paris

304 stools from patients suspected of having C. difficile associa-

ted diseases. Results of GDH and toxin A were compared to

those of culture and cytotoxicity assay (toxin B), respectively.

Frequencies of toxin B-positive and culture-positive stools were

11.2 % and 25 % respectively Sensitivity of TriageND was 90.8%

for GDH (compared to culfure) and 79.4% for toxin A (compared

to cytotoxicity assay). 7Eage ND is a very rapid (20 min.) and an

easy-to-perform test, It could be useful for diagnostic purpose and

also for detecting non toxigenic strains in epidemiogical studies.

Clostridium difficile - toxin A - glutamate dehydrogenase -

diagnosis - diarrhea.

I. Introduction

C lostridium difficile est responsable de 15 a 25 O/o des diarrhbes

post-antibiotiques et de plus de 95 % des colites post-anti-

biotiques [l , 7, 8, 20, 25, 271. Cette bactkrie anakrobie reprksente

une cause majeure de diarrhbe nosocomiale chez les patients hos-

pitali&s [2]. Le diagnostic biologique des infections digestives libes

a C. difficile repose soit sur I’isolement du germe, soit sur la d&ec-

tion d’un antigene spkcifique (la glutamate d&hydrogbnase ou

GDH), ou des toxines (A ou 6) dans les selles [6, 14, 161.

Actuellement, la mkthode de reference est le test de cytotoxicitk des

selles qui met en kvidence la toxine B par I’effet cytopathique qu’elle

induit en culture cellulaire [lo, 141. Cependant, cette mkthode est

longue (minimum 48 heures), nkessite une infrastructure adaptke

a la culture cellulaire et I’approvisionnement en antitoxine (qui a pour

but de confirmet la specificit de I’effet cytopathique obserk), non

commercialiske en France, et manque de standardisation. De nom-

breuses trousses immuno-enzymatiques de type Elisa dbpistant soit

la toxine A, soit les toxines A et I3 simultanement 13, 1 1, 22, 23, 261

ont BtB commerciali&es depuis une dizaine d’annbes. Plus r&em-

ment, des tests unitaires rapides detectant soit la toxine A, soit la

GDH sont apparus en France [4, 51.

TriageND C. difficile Panel (Biosite Diagnostics, BMD, Marne-la-Valke)

est un test immuno-enzymatique unitaire permettant la detection simul-

take de la toxine A et de la GDH. Cobjectif de cette Etude est d’dva-

luer les performances de cette trousse (sensibilit6, spkificit8) vis-A-

vis du test de cytotoxicit6, pris comme mbthode de reference pour le

diagnostic des infections digestives & C. difficile.

Revue Franqaise des Laboratoires, septembre 2000, N” 325 25

2. Materiels et methodes

2.1. Patients

CBtude a BtB r&ali&e B partir de 304 selles de patients hospitalis&

dans diffbrents h6pitaux de la region parisienne entre mars 1999 et

juin 1999. Ces patients prkentaient une diarrhke et/au une colite sur-

venant, pour la plupart, au d&ours d’une antibiotherapie ou d’une chi-

miothbrapie et pour laquelle une recherche de C. difficile a 6% sp&

cifiquement prescrite par le mkdecin traitant.

Les selles ont bt8 acheminbes au laboratoire sans condition particu-

Ii&e de transport ; d&s leur keption, une partie a BtB prklevbe et

congeke & -80% en vue d’un Bventuel contrBle ultkieur ; la culture,

le test de cytotoxicit8, et le test Triage ND C. difficile Panel ont BtB rba-

Ii&s simultan&ment au maximum dans les 48 heures suivant la rkep-

tion des selles conservbes ti + 4 “C.

Le test TriageND C. difficile Panel a BtB effect& en aveugle par rap-

port au test de cytotoxicit& des selles et ti la culture.

2.2. Recherche de la toxine B

La toxine B a BtB recherchke par la mise en &idence, sur une culture de

cellules fibroblastiques embryonnaires humaines (MRC5), d’un effet cyto-

pathique neutralisable par un antiserum spkifique [lo, 21 I. Un khan-

tillon de selles a BtB dilue au 1 I1 0 dans du tampon PBS, puis a btk homo-

g&&k et centrifugk g 3 500 tourslmin pendant 45 min. Le surnageant

a & filtrb sur membrane Millipore 0,45 pm et 20 PL du filtrat ont 6ttB dbpo-

~6s pur et diluk au 1 /l Oe sur cellules MRC-5 cultivbes en microplaques

de 96 puits. La nappe cellulaire a BtB observbe apr&s 24 et 48 heures

d’incubation B 37 “C en atmosphere humide contenant 6,5 % de CO,.

Ceffet cytopathique dQ g la toxine B est caractkrisb par une * ballonisa-

tion n des cellules. La spkificiti! de I’effet cytopathique a BtB confirm&e

par sa neutralisation avec un &rum anti-Closfridium sordellii (p&park au

laboratoire des anakrobies de I’lnstitut Pasteur, Pr M. Sebald).

2.3. Triage ND C. difficile Panel

Triage ND C. difficile Panel est un test immuno-enzymatique se prk

sentant sous forme de cassette unitaire, permettant la detection simul-

tanee de la toxine A de C. difficile et de la GDH. Le principe du test

repose sur la fixation sur une membrane d’anticorps antitoxine A et anti-

GDH qui vont fixer les antigenes correspondants Bventuellement prC-

sents dans les selles. Les complexes immuns ainsi form& sont r&k-

I& par addition d’anticorps (anti-GDH et antitoxine A) conjuguk a la

peroxydase et d’un chromog8ne.

Les selles ont BtB analysbes selon les recommandations du fabricant.

Elles ont BtB dilubes au 1 I1 Oe puis centrifugbes 5 min & 1 500 g. Le sur-

nageant & BtB filtr& & I’aide de la seringue fournie dans le coffret. Le fil-

trat de selles (0,5 ml) a 6% ensuite depose sur la membrane. Aprks son

absorption, 140 FL de conjug& ont BtB ajoutbs et incubes pendant 3

min k~ temperature ambiante. Apr&s deux lavages successifs, 4 gouttes

de substrat ont &tB d&pos&es. La lecture et I’interpr&ation des rksultats

ont BtB rbali&es au bout de 5 min d’incubation selon les recomman-

dations du fabricant. Capparition d’une bande bleue au niveau de la toxine

A ou de la GDH de la zone test &tait interpr&e comme un r&sultat posi-

tif. Sur chaque cassette, existent un contrble positif (constitk par la pr&

sence de la toxine A et de la GDH fixkes & un anticorps spkifique immo-

bilisb sur la membrane) et un contrble nbgatif (absence de fixation de

la toxine A et de la GDH sur la membrane).

2.4. Dktection des g&es des toxine? A et B

La detection des genes des toxines A et B a’& r&ali&e sur toutes

les souches isokes de patients qui ont p&sent6 un r&ultat discor-

dant entre la toxine A (TriageND) et la toxine B (cytotoxicitk).

Les genes des toxines A et B ont BtB recherchbs par amplification

gbnique (PCR) multiplex +I I’aide des amorces NKS-NKl 1 (fragment

de 1 200 pb du gene correspondant a la portion repetitive du gene

de la toxine A) et NKlO4-105 (fragment de 270 pb correspondant Z+I

la portion non rbpbtitive de la toxine B) [191. CADN des souches a BtB

extrait k~ partir de 2-3 colonies isokes sur boite par lyse des back+

ries par la chaleur en presence de r&sine Chelex (InstagBneND Matrix,

Bio-Rad, France). Le programme de PCR comprenait une dknatura-

tion $I 94 “C pendant 5 min, suivie de 40 cycles a 95 “C pendant 20 s,

62 “C pendant 2 min, 74 “C pendant 40 s, et d’une extension finale

de 5 min B 74 “C. Les produits amplifi& ont BtB visualis& sur gel d’aga-

rose & 3 O/o aprks coloration par le bromure d’kthidium.

2.5. Dbtection de la toxine B in vitro

Ce test a pour but de determiner le caractkre toxinogene des souches

de C. difficile isokes des selles. II a CtB rkalisk sur toutes les souches

isokes de selles pksentant un rksultat nbgatif pour les deux toxines.

Les souches de C. difficile ont BtB cultivbes en bouillon TGY rbgkn&

(30 min g 100 “C) et incubees en anabrobiose pendant 5 jours. La sus-

pension bactbrienne a & ensuite centrifugbe pendant 15 min & 3 000

tours/min et filtrke sur membrane Millipore 0,22 pm. Le surnageant ainsi

obtenu a BtB inocuk sur cellules MRC-5 (cf. test de cytotoxicit8).

2.6. Culture de Clostndium difficile

Chaque selle a BtB ensemencke sur un milieu selectif derive du milieu

de George [15] et compok d’une gblose BHI (Difco) enrichie par 5 O/o

de sang de cheval dkfibrink, additionnbe de deux antibiotiques (cyclo-

skrine [250 mg/L] et cbfoxitine 110 mg/L] [Difcol) et de 0,i % de tau-

rocholate de sodium (Sigma). Aprks 48 heures d’incubation en atmo-

sphere anabrobie & 37 “C, C. difficile a BtB identifib par I’aspect de

ses colonies (3-5 mm de diambtre, plates, circulaires $I bords irkgu-

liers, blanches g grises, non hkmolytiques), par I’aspect de la back+-

rie & la coloration de Gram (bacille B Gram positif presentant une spore

subterminale peu dbformante), par I’odeur caracteristique (proche de

celle du (( crottin de cheval ~b), et par les caractkres biochimiques dkrits

par le Manuel des ana&obies (VPI, Virginia Polytechnic Institute) 1181

et d&ermin& grace $I I’utilisation des galeries Rapid 32 A

(bioM&ieux) [91.

2.7. Analyse des rksultats

En cas de ksultats discordants entre la GDH et la culture ou entre

la toxine A et la toxine B, les selles ont BtB retestbes par les trois

mkthodes (TriageNo C. difficile Panel, test de cytotoxicite des selles

et culture) $I partir de kchantillon de selles conservb .$I - 80 “C. Se&

les rksultats dbfinitifs (c’est-&dire apr&s vkrification) ont &tB inclus dans

I’analyse finale.

Trois comparaisons ont BtB r&ali&es : - TriageND GDH versus culture,

- TriageND toxine A versus toxine B,

- TriageND GDH versus toxine B.

Pour chacune de ces comparaisons, la sensibilitk et la spkificitb du

test TriageND C. difficile Panel ont BtB calculkes.

3. R&ultats

Toutes les selles (n = 304) ont prksente un resultat interpretable par

le test TriageND C. difficile Panel. Au total, 34 selles (1 1,2 o/o) ont prk-

senti! un test de cytotoxicitb positif et 76 selles (25 O/o) ont BtB posi-

tives en culture. Parmi les 42 souches isolbes de selles negatives en

toxine B et en toxine A, 41 ont fait I’objet d’une d&termination du pou-

voir toxinogene in vitro : parmi celles-ci, 23 (56,l %) se sont a&r&es

toxinog&nes in vitro.

26 Revue Franc$se des Laboratoires, septembre 2000, N’ 325

1 Culture positive I Culture nbgative I TriageND GDH positif 69 I 3

TriageNn GDH neaatif 1 7 225

SensibiM : 90,8 % ; sp&ificiW : 98,7 % ; concordance : 96,7 %.

3.1. Comparaison Triage N3 GDH versus culture (tableau I)

La comparaison des resultats de TriageND GDH versus culture montre

que sept selles positives en culture n’ont pas ete depistees par le test

TriageND (faux negatifs) et trois selles negatives en culture ont ete posi-

tives par le test Triage ND GDH (faux positifs).

3.2. Comparalson Triage ‘,c toxine A versus toxme B

(tableau II)

Le resultat du test TriageNo toxine A etait tres faiblement positif pour ,

six selles (leg&e bande bleutee a la limite de la vrsrbrlrte) : cinq etaient

positives en toxine B et une etait negative.

Une discordance entre Triage ND toxine A et le test de cytotoxicite a ete

observee pour huit selles : seule la toxine B etait positive dans sept cas

et seule la toxine A dans un cas. Les resultats de la PCR multiplex rea-

lisee sur les souches isolees de ces patients ont montre que les sept

souches positives seulement en toxine B possedaient bien les genes

des deux toxines (done faux negatifs en toxine A) et la souche positive

seulement en toxine A ne possedait aucun de ces genes (done faux posi-

tif). La sensibilite et la specificite du test TriageND toxine A comparees

au test de cytotoxicite etaient de 7g,4 % et 99,6 o/o respectivement.

3.3. Comparaison TriageND GDH versus toxine B

(tableau III)

Si I’on compare les resultats de TriageND GDH & ceux de la toxine B

(c’est-&dire si on considere le test TriageNo comme un test de (1 depis-

tage )b des selles positives en toxine B), la sensibilite est alors de g7,l O/o

et la specificite de 85,6 O/o.

4. Discussion

Le test de cytotoxicite des selles est actuellement consider@ comme la

methode de reference pour le diagnostic biologique des infections liees

a C. difficile de par sa tres grande sensibilite (de I’ordre du picogramme

de toxine B). Neanmoins, cette methode presente un certain nombre d’in-

convenients : delai d’obtention des resultats superieur a 24 heures, infra-

structure lourde (culture cellulaire) et possibilite d’effet cytotoxique “sty-

pique” necessitant une neutralisation. Pour pallier ces differents

inconvenients, de nombreux tests immuno-enzymatiques detectant soit

la toxine A, soit les deux toxines simultanement, soit encore un antigene

specifique de C. difficie (GDH) ont ete commercialises ces dix dernieres

an&es 13-5, 11-l 3,21-24,261. Ces tests se presentent pour la plu-

part sous forme de tests Elisa en microplaques de titration, ou sous forme

de cassettes unitaires.

TriageND C. difficile Panel est un nouveau test immuno-enzymatique dont

I’originalite reside dans le fait qu’il permet la detection rapide et simul-

tanee de la toxine A et d’un antigene specifique de C. difficile, la GDH.

Nous avons done &value la praticabilite de ce test et avons compare

ses performances vis-&v/is du test de cytotoxicite et de la culture.

D’un point de vue pratique, Triage ND C. difficile Panel se presente sous

forme de cassette unitaire. La realisation d’un test ne requiert aucun

1 TriaoeND toxine A oositif 1 I--- I

27 I 1 I TriaieND toxine A negatif 1 7 269

Sensibrht6 : 79,4 % ; sptkificitt! : 99,6 % ; concordance : 974 %.

Testdecybtoxklbs Teet&?cybtoxf&6 POW w

TriageND GDH positif 33 39

TriageND GDH negatif 1 231

Sens,bhtB : 971 % ; spdcificit6 : 85,6 % ; VPP : 45,8 % ; VPN : 99,6 %. -1

materiel supplementaire hormis une centrifugeuse. Elle est simple et

s’effectue en 20 min. La lecture est aisle, les bandes apparaissant en

bleu sur fond blanc. Aucun resultat douteux n’a ete obtenu. Tous les

resultats ont ete valid& grace aux temoins positifs et negatifs presents

sur la membrane de chaque test unitaire.

Nous avons cependant constate que certaines filtrats de selles pou-

vaient presenter une absorption lente ou difficile sur la membrane

entrainant une coloration bleue de celle-ci apres addition du chro-

mogene g&rant la lecture. Dans ce cas, la centrifugation du filtrat de

selles 1 minute a 10 000 tours/min (microcentrifugeuse) pallie ce pro-

bleme.

Sur les 304 selles testees provenant de patients tous suspects de diar-

rhees ou de colites a C. difficile, 34 (soit 1 1,2 O/o) ont Bte retrouvees

positives par le test de cytotoxicite des selles. Cette frequence est infe-

rieure a la prevalence des diarrhees ou colites post-antibiotiques dues

a C. difficile dont les taux rapportes dans la litterature varient entre 15

et 25 % [7, 8, 251. Cette discordance peut refleter une prescription

mal ciblee de la recherche de C. difficile pour des patients ne pre-

sentant pas de facteur de risque de diarrhee ace germe (patients sans

antibiotique par exemple).

La sensibilite de la detection de la toxine A par le test TriageNo par rap-

port au test de cytotoxicite est de 79,4 O/o. Elle est comparable a la sen-

sibilite des tests unitaires (80 % avec MeridianNo toxine A) [4] et des

tests immuno-enzymatiques en microplaques rapport& dans la litte-

rature et utilisant comme methode de reference la culture cellulaire 13,

23, 261. Cette sensibilite peut s’expliquer par un seuil de detection de

la toxine A (de I’ordre du nanogramme) inferieur au seuil de detection

de la toxine B par culture cellulaire (de I’ordre du picogramme de

toxine), sachant par ailleurs que les quantites de toxines A et B secre-

tees in vivo par C. difficile sont equivalentes. Une autre hypothese pou-

vant expliquer cette difference de sensibilite serait la presence de

souches de C. difficile ne secretant que la toxine B (souches ToxB +

ToxA -). Ces variants sont isoles principalement chez les enfants

(souches de serogroupe F de la classification de Delmee), et ont ete

decrits plus recemment par une equipe japonaise chez I’adulte asymp-

tomatique ou leur prevalence pourrait atteindre 12 O/o [19]. Dans le

cadre de notre etude, cette hypothese est a &carter car nous avons

montre que les souches isolees de selles positives uniquement en

toxine B possedaient bien les genes des deux toxines.

La specificite du test Triage ND toxine A est excellente (99,6 O/o) tout comme

celle des autres tests immuno-enzymatiques commercialises [3, 11-l 3,

23, 261. Nous n’avons observe qu’ un seul resultat faussement positif

Revue Franqaise des Laboratares, septembre 2000, No 325 27

avec le test TriageNo. Dans ce cas, bien que la culture ait ete positive,

la souche s’est averee non toxinogene (absence des genes de la toxine

A et B par PCR multiplex). A ce jour, aucune souche ToxB - ToxA +

n’a ete d&rite dans la litterature.

La sensibilite de la detection de la GDH par rapport a la culture est

de 90,8 %. Une concordance de resultats est observee dans 96,7 Vo

des cas. Les trois faux positifs observes avec le test TriageND et les

sept faux negatifs pourraient resulter d’une repartition heterogene de

C. difficile au sein des selles analysees. Nous n’avons jamais observe

de resultat positif en toxine A et negatif en GDH par le test TriageND.

Si l’on compare la detection de la GDH a celle de la toxine B, c’est-

a-dire si Ton utilise le test Triage ND GDH comme test de depistage,

alors sa valeur predictive d’un resultat negatif en toxine B est de 99,6 O/o

dans la population etudiee. En revanche, la valeur predictive positive

est faible (45,8 O/o) car toutes les souches de C. difficile, y compris

celles qui ne sont pas toxinogenes, sont detectees.

Parmi les 42 souches isolees de patients negatifs en toxine A et toxine

B dans les selles, 56,l O/o se sont averees toxinogenes in vitro. Gerding

et al. [17] ont montre que cette situation correspondait pourtant, dans

1 1 o!, des cas, a un diagnostic positif de diarrhees a C. cMici/e [l 11.

C’est pour cette raison que la recherche isolee des toxines dans les

selles semble insuffisante a I’heure actuelle comme methode de diag-

nostic et que les recentes recommandations de I’Association ameri-

Caine de gastro-enterologie preconisent la recherche simultanee de

la bacterie en culture (suivie de la determination de son pouvoir toxi-

nogene in vitro) et de ses toxines directement dans les selles [141. Dans

ce contexte, Triage ND C. difficile Panel repond aces recommandations

permettant a la fois la recherche rapide de toxine A dans les selles et

le depistage du germe.

5. Conclusion

T riageND C. difficile Panel s’inscrit dans la lignee des nouveaux

tests immuno-enzymatiques unitaires recemment commercialises

pour le diagnostic des infections digestives dues a C. difficile. II s’en

distingue par la detection simultanee de la GDH, enzyme specifique

de C. difficile, et de la toxine A. II est rapide (20 min) et tres facile

a rkaliser. Sa sensibilite de 90,8 ‘J/o pour la GDH (par rapport a la

culture) et de 79,4 Yo pour la toxine A (par rapport au test de cyto-

toxicite). Le test TriageND peut etre utilise comme methode de dia-

gnostic des infections digestives a C. difficile mais aussi comme

methode de depistage des selles positives a C. difficile dans les

etudes epidemiologiques.

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