BIOCHIMIE, 1972, 54, 1147-1155.

Isolement de " RNA mcssager " de haut poids moldculaire partir de polysomes de cellules animales.

Claude ¥F.l~fiEm

Laboratoire d 'Immunologie, Insti lut Gustave-Roussy, 94-Vi l le ju i[ (Groupe de Recherche n ° 8 du C.N.R.S.).

(22/3/1972).

Summary. - - High molecular weight polysomal << messenger RNA >> was isolated f rom ~arious animal cells.

Polysomes f rom various animal cells were prepared in high ionic s trength buffer, in order to minimize the polysomal messenger RNA degradation.

A comparat ive study of the sedimentat ion behaviour of the mRNA recovered f rom polysomes prepared ei ther in isotonic TKM buffer or hypertonic TKNM buffer was perfor- med wh i th mouse ascitic tumour cells labelled for 15 min wi th EaH] Uridine. 30 p. cent of the mRNA extracted from polysomes isolated in TKM buffer sedimented fas ter than 18 S. In contrast , when the polysomes were prepared in TKNM buffer 65 p. cent of the mRNA sedimented faster than 18 S.

Using TKNM buffer, heavy polysomal mRNA was also isolated f rom [3H] pulse labelled chicken cells. 40 p. cent of the mRNA from cultivated embryonic cells and {30 p. cent of the mRNA from leukaemic myeloblasts infected with Avian Myeloblastosis Virus, sedimented ahead of 28 S.

The possibi l i ty tha t heavy mRNA recovered f rom cells lysed in TKNM buffer repre- sents nuclear RNA was examined. Unlabelled cells were homogenized in TKNM buffer with pulse labelled nuclei prepared in T KM buffer and the heavy polysomes were ~edimented f rom the postuuclear snpernatant . Very small amounts of labelled RNA sedimenting faster than 18 S were recovered. This suggests tha t the heavy mRNA extracted f rom the << TKNM polysomes >> does not originate f rom discrupted nuclei.

The isolat ion of << heavy mRNA >> from the << TKNM polysomes >> could be explained by an efficient inhibi t ion of the RNase action after d isrupt ion of the cells. In addit ion, the proport ion of heavy mRNA seems increased by the e l iminat ion of the f ragmented polysomes (polysomes no more engaged in protein synthesis) . A << protective>> effect due to a modification of the mRNA structure in high salt concentrat ion is also discussed.

The method we have described seems a very convenient and reproducible procedure for the isolat ion of undegraded polysomal mRNA from various animal cells.

INTROD!UCTION.

La s y n t h 6 s e d ' u n e nouve l l e c lasse de R.NAs mes - s age r s a p u 6tre ra ise en 6 v i d e n c e duns des ce l lu les e m b r y o n n a i r e s au c o u r s de la d i f f 6 r e n c i a t i o n [1], d a n s des ce l ln les s o u m i s e s h F a c t i o n d ' h o r m o n e s [2] ou duns des ce l lu les i n fec t6es p a r un v i r u s [3]. Ce g e n r e d ' 6 t u d e se h e u r t e c e p e n d a n t h u n e diffi- cul t6 m a j e u r e qu i est d ' i s o l e r u n RNA m e s s a g e r p o l y s o m a l n o n d6grad6 .

P r 6 c 6 d e m m e n t nous av ions essay6 de m e t t r e en 6 v i d e n c e un RNA m e s s a g e r sp6c i f ique du Vi rus de la My61oblastose Av ia i r e (AMV) en i so l an t le RNA r a p i d e m e n t m a r q u 6 des p o l y s o m e s de ce l lu les leu- c 6 m i q u e s de p o u l e t i n f ec t6e s p a r I 'AMV [4].

Darts ]e p r 6 s e n t t r ava i l , n o u s a v o n s am61ior6 la t e c h n i q u e d ' i s o l e r n e n t des p o l y s o m e s , afin d ' ob t e -

n i r des <~ RNAs m e s s a g e r s >> auss i p e u d6grad6s

que pos s ib l e . P l u s i e u r s a u t e u r s a y a n t m o n t r 6 que

l ' u t i l i s a t i o n de m i l i e u de f o r t e s c o n c e n t r a t i o n s

s a l ines p e r m e t d ' a u g m e n t e r la p r o p o r t i o n de po ly -

s o m e s de coe f f i c i en t de s 6 d i m e n t a t i o n 61ev6 [5,

6, 7], n o u s a y a h s vou lu v6r i f ie r si des t e c h n i q u e s

s i m i l a i r e s d ' i s o l e m e n t des p o l y s o m e s p e r m e t t e n t

d ' o b t e n i r des << RNAs m e s s a g e r s >) de h a u t p o i d s

rnol6cula i rc .

La m i s e au p o i n t des m 6 t h o d e s d ' i s o l e m e n t du

RNA m e s s a g e r p o l y s o m a l a 616 ef fec tu6e s u r des

ce l lu les d ' a s c i t e t u m o r a l e F L S de s o u r i s [8]. La

t e c h n i q u e qui n o u s a d o n n 6 les m e i l l e u r s r6su l ta t s

a 6t6 u t i l i s6e p o u r i so le r les ¢ RNAs m e s s a g e r s >>

de p o l y s o m e s de ce l lu les de p o u l e t i n f e c t 6 s ou n o n

p a r le v i ru s de la my61oblas tose a v i a i r e (AMV).

1148 Claude Verger .

MATI~RIEL ET MI~THODES. 0.4

A. PREPARATION ET MARQUAGE DES CELLULES.

Les ce l lu les d ' a s c i t e t u m o r a l e FLS on t 6t6 m a r - 02 qu6es de la fa~on s u i v a n t e : 20,0 ~Ci d ' U r i d i n e [3H] ou 1 mCi de [32p] on t 6t6 in jec t6s p a r voie i n t r a p 6 r i t o n 6 a l e fi des s o u r i s de s o u c h e S w i s s ino- cul6es 2 j ou r s a u p a r a v a n t avec e n v i r o n 5 X 10 3 ee l lu les t u m o r a l e s FLS. Les ee l lu les on t 6t6 pr61e- 0.4 v6es apr6s 15 m i n u t e s ou 45 m i n u t e s p a r p o n c t i o n p6 r i t on6a le , p u i s s 6 d i m e n t 6 e s p a r u n e c e n t r i f u g a - t i o n h b a s s e v i tesse . 0.~

Les ce l lu les l e u c 6 m i q u e s de p o u l e t on t 6t6 iso- 16es fi p a r t i r de s a n g p 6 r i p h 6 r i q u e h 6 p a r i n 6 et i n c u b 6 e s in vitro se lon u n e t e c h n i q u e d6j& d6c r i t e E

G [4]. E n v i r o n 4 X 1:09 ce l lu les s u s p e n d u e s d a n s lif0 ml de mi l i eu on t 6t6 m a r q u 6 e s p e n d a n t 15 ra in avec 40.0 ~Ci d ' U r i d i n e [aH]. <

Les f i b rob l a s t e s de p o u l e t on t 6t6 eul t iv6s in 0.2

vitro d a n s du m i l i e u de Eag le avee 5 p. c e n t de s 6 r u m de veau. E n v i r o n 3 X 107 ee l lu les p r o v e n a n t de la p r i m o c u l t u r e on t 6t6 e n s e m e n e 6 e s en f l acons de R o u x de 9,0,0 ml. Apr6s 2 j o u r s de c u l t u r e h 37~C, le v o l u m e de m i l i e u a 6t6 r6du i t h 30 ml et les ee l lu les ( e n v i r o n 8 × 107 ee l lu les p a r f lacon) on t 6t6 m a r q u 6 e s avec 1 mCi d ' U r i d i n e [3H~ p e n - d a n t 15 m i n . Les ee l lu les on t 616 lav6es avee 80 ml de m i l i e u de Eag le s ans i s o t o p e r a d i o a e t i f , p u i s les p o l y s o m e s on t 6t6 e x t r a i t s i m m 6 d i a t e m e n t .

B. ISOLEMENT DES POLYSOMES.

Les p o l y s o m e s on t 6t6 isol6s en t a m p o n TKM (Tris-HC1 0,0,1 M, KC1 0,1 M, MgCA2 0,0.2 M, p H 7,4) ou en t a m p o n TKN~M .(Tris-HC1 0,0~1 M, KC1 0,2 M, NH 4 C1 0,2 M, MgCi 2 0,01 M, p H 7,4).

A

J [ i I

~ C

5 10 15 20 F R A C T I O N 5

FIG. 1. Profil de s6dimentat ion des polysomes de cellules tumorales FLS de souris en gradient de sac- charose 10-40 p. cent en tampon TKM, 120 min h 24 0D0 rev . /min d ans le rotor S~¢¢ 25 Spinco.

A. 1 X 108 cellules ont 6t6 lys6es dans 20 ml de tampon TKM par 0,5 p. cent de Nonidet P 40. Les polysomes ont 6t6 purifi6s en tampon TKM.

B. 2 × 108 cellules ont 6t6 lys6es dans 20 inl de tampon TKNM par 0,1 p. cent de Nonidet P 40. Les polysomes ont 6t6 purifl6s en tampon TKNIVI.

C. Polysomes pr6par6s comme en B h par t i r de 1 X 108 cellules.

Fro. 2. --- Profil de s6dimentat ion du RNA des potysomes de eellules d'aseite FLS pr6par6s en tampon isotonique TKM ou en tampon hyper tonique TKNM.

2 )(. 10s cellules marqu6es in oivo par un isotope radioaet if ont 6t6 lys6es dans 20 m] de t ampon par le Nonidet P 40 et les polysomes contenus dans le surnageant post- nucl6aire ont 6t6 s6diment6s dans 90 ml de tampon sauf pour E ou le volume 6fair de 180 ml.

Le RNA polysomal a 6t6 centrifug6 pendant 18 h h 180,0,0 a~ev./min (A) ou h 16000 r ev /min dans les autres cas, en gradient de saccharose 5-20 p. cent en tampon NTE-BRIJ-SDS.

A e t B. Profil de s6dimentat ion du RNA des polysomes T KM marqu6s par l 'Uridine [3H] pendant 45 inin (A) ou 15 rain (B). Pour A une forte proport ion du RNA marqu6 est d 'origine r ibosomale ; pour B 32 p. cent du RNA marqu6 s6dimente au delh de 18 S.

C. Profil de s6dimentat ion du RNA des p.olysomes TKM-TKNM marqu6s pendant 15 min par l 'Uridine [3H]. La proport ion de RNA radioact if qui s6dimente au delh de 18 S est de 47 p. cent.

D, E et F. Profll de s6dimentat ion du RNA des polysomes TKNM marqu6s pendant 15 min par l 'Uridine [~H] (D et E) ou par [a2p] (F.). La proport ion de RNA marqu6 qui s6dimente au delh de 18 S est de 63 p. cent pour D et de 75 p. cent pour E. La composit ion en bases du RNA messager lourd marqu6 par [32p] (fractions 1 h 15 de la figure F) 6tait la suivante :

C = 23,0 p. cent, A ---- 21,3 p. cent, G = 25,4 p. cent, U ---- 30,3 p. cent.

BIOCHIM1E, 1972, 54, n" 9.

1149

10

17..

Trois m6thodes de pr6paration des polysomes ont 6 t 6 util is6es :

1. Isolement des polysomes en tampon isotoni- que TKM (polysomes TKM). Environ 2 × 10 s eel- lules FLS marqu6es ont 6t6 lys6es dans 20 ml de tampon TKM en pr6sence de 0,5 p. cent de Nonidet P 40 pendant 1 minute environ, puis ]es noyaux ont 6t6 s6diment6s par une centrifugation de 10 min fi 10 000 rev . /min . Le volume du surnageant post nucl6aire (20 ml) a 6t6 compl6t6 h 90 ml avec

A

I 5

FRACTIONS

1.. =

1

I o

I 1

E c0.~ o

<

I I I 10 15 20

20

1° I

o

Z o. o

du tampon TKM puis les po lysomes ont 6t6 s6di- ment6s par une eentrifugation de 20 rain h 20 000 rev./min dans le rotor 42 Spinco.

2. Isolement des polysoInes en pr6sence de tam- pon TKM puis de tampon TKNM (polysomes TKM - TKNM). Environ 2 × 108 eel lules non marqu6es plus 2 × 108 ee]lules marqu6es ont 6t6 lys6es dans 20 ml de tampon TKM avee 0,5 p. cent de Nonidet P 40 puis le surnageant post nuel6aire a 6t6 corn-

1

I E O-5

<

D

I I I I 5 10 15 20

FRACTION5

% 2.5~

(i. t j

25

Z5

I 0.5

E c 0.25 o

<

Z5

'I L S ~

(J

5 10 15 20 25 FRACTIONS

0.75

I 0.S

E c 0.2=

o~

E

I I I I 5 10 15 20

FRACTIONS 25

2 so

[I- ¢3

0.7~ =

10

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 9.

C

d I

FRACTIONS

RNA messager polysomal de haul poids moldculaire.

FIG. 2.

0.75 7.5

.I 2 s °

(1 o

10 115 210 25

i 0.5

~ 0.25

< - v v -

FRACTIONS

o

Z ¢L O

1150 Claude Verger.

p16t6 /i 90 ml avec du tampon TKNM. Les poly- somes ont 6t6 eentrifug6s connne dans la m6- thode 1.

3. Isolement des polysomes en t ampon hyperto- nique TKNM (polysomes TKNM). Les cellules mar- qu~es (2 X 10 s cellules FLS de souris ou 4 × 109 cellules leuc6miques de poulet) ont 6t6 lys6es dans 20, ml de tampon TKNM avec 0,1 p. cent de Noni- det P 40 puts les noyaux ont 6t6 s6diment6s imm6- diatement. Le surnageant post nucl6aire a 6t6 com- p16t6 h 90 ml - - (ou 18,0 ml) - - puts les polysomes ont 6t6 centrifug6s comme pr6c6demment .

Les fibroblastes de poulet (SX 107 cellules mar- qu6es) ont 6t6 lys6es dans 20 ml de surnageant post nucl6aire de cellules F, LS elles-mSlnes lys6es en tampon TKNM selon les condi t ions d6crites sous la figure 5 B.

~ . ~SOLEMENT DES POLYSOMES D 'ASCITE TUMORALE

F L S DE s o u n I s ET ANALYSE EN GRADIENT DE SACCHA-

I~OSE.

Les << polysomes TK~M >> ou les << polysomes TKNM >> ont 6t6 pr6par.6s comme en B sauf qne les condi t ions de s6dimentat ion des polysomes 6talent diff6rentes. Le surnageant post nucl6aire a 6t6 d6pos6 sur une conche de 6 ml de saccharose 2 M en tampon TKM ou TKNM selon le cas puis cen- trifug6 pendan t 20 heures h 20 000 r ev . /m in dans le rotor SW 25 Spinco.

.Le culot de polysomes a 6t6 homog6n6is6 dans 1 ml de t ampon TKM puis l 'homog6nat a 6t6 cen- trifug6 pendan t 120 ln in ~ travers un gradient de saccharose 10-40 p. cent en tampon TKM, dans ]e rotor SW 25.

L 'absorpt ion en U.V. de chaque fract ion a 6t6 mesur6e ~ 260 nm.

D. ETUDE DUR, NA I~OLXrSOMAL.

Le RNA a 6t6 extrait h pa r t i r des polysomes pr6- par6s et s6diment6s selon les trois m6thodes d6- crites en B.

Le fond du tube eontenant le eulot de poly- somes a 6t6 d6coup6, et le culot a 6t6 homog6n6is6 dans 1,5 ml de t ampon N T E - B R I J ' - S D S (NaC1 0,05 M, Tris-HC1 0,01 .M pH 7,4, EDTA 0,00.1 M, BRIJ 58 0,5 p. cent, dod6cyl-sulfate de sodium ou SDS 0,5 p. cent) puts d6pos6 imm6dia tement sur un gradient 5 - 2 0 p. cent de saccharose en tam- pon NTE-BRIJ-SDS et centrifug6 h 10°C pendan t 18 h ~ 14 000 rev . /min , 16 00.0 r ev . /min ou 18 0,00 r ev . /min selon les cas dans le rotor SW 25.

La densit6 optique des fract ions a 6t6 d6termi- n6e h 260 nm et la radioactivi t6 mesur6e clans un compteur fi scint i l la t ion, apr6s homog6n6isat ion

de chaque f ract ion avec 10 ml d'Aquasol (Beck- man) .

La composi t ion en base du RNA messager mar- qu6 au [32p] a 6t6 d6termin6e apr6s hydrolyse alealine, pnis 61ectrophor6se sur papier , en pr6- senee de RNA t ranspor teur .

RES,ULTATS.

1 °) Pro[ils de s~dimentation en gradient de saccharose des polysomes de cellnles tumorales FLS.

La figure 1 i l lustre l 'am61ioration des profils de s6dimentat ion des polysomes que nous avons obte- nus de fa~on reproduct ib le en ut i l isant un tampon de force ionique 61ev6e ( tampon TKNM). La pro- por t ion de polysomes << lourds >> (polysomes des fract ions 1-10) est plus 61ev6e dans les polysomes isol6s en tampon TKNM (fig. 1 C) que dans les poly- somes iso16s en tampon isotonique TKM (fig. 1 A). Le profil de s6dimentat ion des polysomes varie aussi suivant le nombre de cellules lys6es pa r rap- port au volume de tampon : la p ropor t ion de poly- somes<< lourds >> est plus 61ev6e si 1 × 10 s cellules sont lys6es dans 20 ml de tampon TKNM (fig. 1 C) que s i u n nombre double de cellules sont lys6es dans un m6me volume de t ampon TKNM (fig. 1 B). Laga et co11. [6] qui ont isol6 les polysomes en pr6- sence de fortes concent ra t ions de KC1 et de CINH 4 ont constat6 que l ' augmenta t ion de p ropor t ion de polysomes lourds 6tait essentiel lement due h la pr6- senee d'EDTA. Nous n 'avons pas pu mettre en 6vidence de diff6rences, ni quali tatives ni quant i - tatives, lorsque de I 'EDTA 0,0005 M a 6t6 ajout6 au tampon TKNM. Ceci pour ra i t s 'expl iquer par le fait que nous avons utilis6 des concent ra t ions celhflaires beaucoup plus faibles que Laga et coll.

2 °) Marquage du << RNA >> messager >> polysomal de cellnles d'ascite tumorale FLS.

Nous avons choisi le temps de 15 nfin comme dur6e de marquage pour 1'6rude des RNAs messa- gers, iso16s h pa r t i r de polysomes de cellules d'as- cite tumorale FLS de souris et de celIules leuc6- miques ou normales de poulet. En effet, aprbs un marquage de 45 nf in par l ' u r i d ine [3H], une forte radioactivi t6 est d6jh associ6e avec les pics de RNA ribosomal 18 S e t 28 S (~fig. 2 A) isol6 par t i r de polysomes pr6par6s en tampon T'KM. Par contre, aprbs un marquage de 15 minutes seule- ment , le profi l de s6dimentat ion en radioact ivi t6 est tr6s diff6rent et pr6sente un pic vers 4-10 S. Seule une trbs faible p ropor t ion de RNA marqu6 s6dimente au n iveau du pic de RNA r ibosomal 28 S (.fig. 2 B).

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 9.

1151

0.75

3 °) Influence de la m~thode d'isolement des polysomes sur la constante de s~dimentation dll (<RNA messager >> des cellnles d'ascite tumorale FLS de souris.

L o r s q u e le RNA cst isol6 "h p a r t i r de p o l y s o m e s p r 6 p a r 6 s e n t a m p o n i s o t o n i q u e TK~I f P o l y s o m e s TKM), la p r o p o r t i o n de << RNA m e s s a g e r >> de c o n s - t a n t e de s 6 d i m e n t a t i o n s u p d r i e u r e h 18 S es t de l ' o r d r e de 30 p. c e n t (fig. 2 B). L o r s q u e les p o l y - s o m e s s o n t p r d p a r 6 s p u t s s 6 d i m e n t 6 s e n t a m p o n de f o r c e i o n i q u e p l u s 61evde (m61ange de 20 m l de t a m p o n TKM Jr 70 m l de t a m p o n TKN~M), la p r o - p o r t i o n de RNA m a r q u 6 de c o n s t a n t e de s 6 d i m e n - r a t i o n s u p 6 r i e u r e h 18 S es t d ' e n v i r o n 50 p. c e n t (fig. 2 C). Le r e n d e m e n t e n p o l y s o m e s es t d i m i n u 6 e n v i r o n de m o i t i 6 p a r r a p p o r t a u x p o l y s o m e s TKM ( r6su l t a t de 3 e x p 6 r i e n c e s ) ce qu i n o u s a c o n d u i t h d o u b l e r le n o m b r e de ce l lu l e s (vo i r m a - t 6 r i e l et m d t h o d e ) af in d ' o b t e n i r u n cu lo t de p o l y - s o m c s su f f i san t . L o r s q u e la lyse des ce l lu l e s et la s d d i m e n t a t i o n des p o l y s o m e s o n t 6t6 e f fec tu6es e n t a m p o n h y p e r t o n i q u e TKNM ( p o l y s o m e s TKNM), la p r o p o r t i o n de RNA r a p i d e m e n t m a r q u d de c o n s - t a n t e de s d d i m e n t a t i o n s u p 6 r i e u r e h 18 S a v a r i 6

I 0.5

E 0.25

<

. . . . . f f ~ ~ ~ 10 15 20 F 'RACT ION5

RNA messager po ly somal de hau t poids moldculaire.

lO

~5

o 2,5

o_ t)

FJ6. 3. - - Profil de sdd imenta t ion du RNA des poly- somes TKNM isolds en prdsence de noyaux marquds de cellules d'ascite t umora l e FLS.

2 × 10s celluies ont dtd prdlevdes chez l ' an ima l 15 min apr6s une inocula t ion in t rapdr i tondale de 200 ttCi d 'Ur id ine EaH]. Les cellules ont dtd lysdes clans 20 ml de t ampon TKM par 0,5 p. cent de Nonidet P 40.

Les noyaux ont (~t6 sddimentds pa r cen t r i fuga t ion h basse vitesse. Le culot de noyaux marquds a dtd homo- gdndisd avec 2 × 10s cellules non marqudes dans 20 ml de t a m p o n TKNM con tenan t 0,1 p. cent de Nonidet P 40. Les noyaux (noyaux marques et non marqu6s) out 6t6 s6dimentds et le su rnagean t post -nucl6ai re a 6t6 compl6td h 90 ml avec du t a m p o n TKNM. Les polysomes ont dtd sddimentds pa r une cen t r i fuga t ion d,e 20 m i n h 2~0000 rev . /min . Le RNA a 6td ext ra i t du culot de polysomes et a dtd centrifugal pendan t 18 h h 14.00.0 r e v . / m i n darts ]e gradien~ hab i tue l (voir figure 2).

La propor t ion de RNA marqu6 de cons tante de sddi- men ta t i on sup6rieure h 18 S est de 40 p. cent.

de 63 p. c e n t (fig. 2 D) h 67 p. c e n t q u a n d les p o l y s o m e s on t 6td s 6 d i m e n t 6 s d a n s u n v o l u m e de 90 ml de t a m p o n TKNM ( r6su l t a t s de 3 exp6- r i e n c e s ) . D a n s u n e e x p 6 r i e n c e o h les p o l y s o m e s o n t 6t6 s 6 d i m e n t 6 s d a n s 180 m l de t a m p o n , ce t te p r o p o r t i o n a a t t e i n t 75 p. c e n t (fig. 2 E).

2 10

1.5 Z5

2 ~ a_

< ] I L I I 5 10 15 20 2 5

F f ~ A C T I O N5

FIG. 4. - - Profil de sdd imenta t ion du RNA marqud ex t ra i t des polysomes TKNM prdpards en prdsence de su rnagean t post nucl6aire de cellules lysdes en t a m p o n TKM.

2 × 10s eellules d 'asci te t umora l e FLS marqudes pendan t 15 min in oivo par l 'Ur id ine [ZH] (voir fig. 3) ont dtd lysdes dans 10 ml de t a m p o n TKNM par 0,1 p. cent de Nonidet P 40. Le su rnagean t post-nucldaire a dt6 a jout6 au su rnagean t post-nuel~aire de 8 × 108 cellules d 'asci te FLS non n~arqudes lysdes dans 80 ml de t a m p o n TKM con tenan t 0,5 p. cent de Nonidet P 40. Les polysomes ont dtd sddimentds en culot (voir figure 3). Le RNA polysomal a dtd centrifugal pendan t 18 h fl 1'6 00O r ev . /m in dans l e gradien4 habi tne l . La propor t ion de RNA marqu6 qui sddimente au delh de 18 S est de 72 p. cent.

L o r s q u e les ce l lu le s o n t 6t6 m a r q u 6 e s p a r u n e f o r t e dose de [a2p! in vivo, le p r o f i l de s 6 d i m e n - r a t i o n en r a d i o a c t i v i t 6 p r 6 s e n t a i t u n p i c de ¢ RNA m e s s a g e r >> l o u r d a v e c u n m a x i m u m ve r s 30 S (fig. 2 F) . La r a d i o a c t i v i t 6 t r6s 61ev6e des f r a c t i o n s 16g6res (de c o n s t a n t e de s 6 d i m e n t a t i o n i n f 6 r i e u r e h 10 S) p e u t 6 t re e x p l i q u 6 e e n g r a n d e p a r t i e p a r u n e i n c o r p o r a t i o n r a p i d e du E~uP] darts le t -RNA. La c o m p o s i t i o n e n b a s e s du RNA de c o n s t a n t e de s 6 d i m e n t a t i o n s u p 6 r i e u r e h 20 S a m o n t r 6 q u ' i l s ' ag i t d ' u n RNA d e t y p e m e s s a g e r , r i c h e en a c i d e u r i d y l i q u e ( v o i r c o m m e n t a i r e de la f igure 2 F).

4 °) Origine du RNA polysomal rapidement mar- qu~ isol~ h partir des polysomes TKNM.

N o u s a v o n s v6r i f id que l ' a m 6 1 i o r a t i o n d u p ro f i l de s 6 d i m e n t a t i o n d u (( RNA m e s s a g e r >> des po ly - s o m e s TKNM n ' e s t p a s d u e h u n e < ( c o n t a m i n a - t i o n >> p a r d u RNA n u c l 6 a i r e qu i s e r a i t l i b6 rd l o r s de la lyse des ce l lu le s e n t a m p o n h y p e r t o n i q u e TKNM. Des n o y a u x m a r q u 6 s , p r o v e n a n t de ce l lu l e s

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 9.

1152 Claude Verger.

lys6es e n t a m p o n TKNM, o n t 6t6 h o m o g 6 n 6 i s 6 s e n t a m p o n TKNM e n p r 6 s e n c e de ee l lu le s n o n m a r - qu6es ( v o i r fig. 3). Le RN A e x t r a i t de p o l y s o m e s p r 6 p a r 6 s d a n s ces c o n d i t i o n s a 6t6 c e n t r i f u g 6 en g r a d i e n t de s a c c h a r o s e .

La c o m p a r a i s o n des f igu res 3 et 2 D m o n t r e que la r a d i o a c t i v i t 6 q u i p r o v i e n d r a i t des n o y a u x n e r e - p r 6 s e n t e que 16 p. c e n t de ce l le d u RNA e x l r a i t des p o l y s o m e s TKNM, b i e n que les n o y a u x a i e n t s u b i d e u x t r a i t e m e n t s s u c c e s s i f s e n t a m p o n i so to- n i q u e p u i s h y p e r t o n i q u e . E n o u t r e , la p r o p o r t i o n de R N A l o u r d de c o n s t a n t e de s 6 d i m e n t a t i o n sup6- r i e u r e h 18 S es t de 40 p. c e n t s e u l e m e n t ( e o n t r e 63 p. c e n t p o u r le RNA m a r q u 6 de l a f igu re 2 D), ce qu i m o n t r e que le R N A m a r q u 6 l o u r d des po ly - s o m e s TKNM n e do l t p a s p r o v e n i r de n o y a u x lys6s . L a c o n t a m i n a t i o n des p o l y s o m e s p a r des p a r t i c u l e s r i b o n u c l 6 o p r o t 6 i q u e s d ' o r i g i n e n u c l 6 a i r e [9-10] do l t 6 t re m i n i m e e n r a i s o n de la f a i b l e c o n s t a n t e d e s ~ d i m e n t a t i o n de ces p a r t i c u l e s p a r r a p p o r t h ce l le des p o l y s o m e s l o u r d s .

On no t e u n e s i m i l i t u d e e n t r e les p ro f i l s de s6di - m e n t a t i o n des RNAs m a r q u 6 s de la f igure 2'C (RN,A des p o l y s o m e s TKM-TKNM) et de la f igu re 3, ce qu i s u g g b r e q u ' u n e p a r t i e de la r a d i o a c t i v i t 6 i so l6e d a n s le cas de l a f igure 3 p o u r r a i t p r o v e n i r de p o l y s o m e s d u c y t o p l a s m e p 6 r i n u c l 6 a i r e n o n d6ta- ch6 des n o y a u x m a r q u 6 s .

Des r 6 s u l t a t s c o m p a r a b l e s ~ ce lu i de la f igure 3 o n t 6t6 o b t e n u s p o u r t r o i s e x p 6 r i e n c e s .

5 °) Recherche d'une activit~ ribonucl~asique associ~.e auz polgsomes TKM.

Les d i f f 6 r e n c e s e n t r e les c o n s t a n t e s de s 6 d i m e n - t a t i o n des p o l y s o m e s et d u RNA p o l y s o m a l , s e lon que les p o l y s o m e s s o n t p r 6 p a r 6 s e n t a m p o n TKM ou TKNM, p o u r r a i e n t 5 t re e x p l i q u 6 e s p a r F a c t i o n d ' u n e R N a s e q u i r e s t e r a i t 1i6e a u x p o l y s o m e s TKM. L a p r o t e c t i o n d u RNA m e s s a g e r des p o l y s o m e s TKN.~I p o u r r a i t 6 t re d u e h u n e i n h i b i t i o n de Fen - z y m e o u ~ s o n d ~ t a c h e m e n t sous l ' e f fe t de f o r t e s c o n c e n t r a t i o n s s a l i n e s [5].

I 2,

c o ,o

A

5 10 15 20 F R A C T I O N S

20 2

1.5

'°I I' .¢

5 b c 0.5

C)

B 7.5

FI6. 5. - - A. Profil de s6d imenta t ion du RNA rap idemen t marqu6 isol6 & pa r t i r de poly- somes TKNM de eellules leuc6miques de poulet.

4 × 109 cellules leuc6miques ont 6t6 marqu6es pendan t 15 min avee 400 ttCi d 'Ur id ine [~3H] dans 100 ml de mi l i eu 199 con tenan t 50 p. cent de s~rum: de Poulet. Les cellules out ~t6 lav~es dans 50 ml de mi l ieu 199 puis lys6es dans 20 ml de t a m p o n T KNM eon tenan t 0,1 p. cent de Nonidet P 40. Le su rnagean t post-nuel6aire a 6t6 eompl6t6 & 90 ml avee du t a m p o n TKNM, puis les polysomes out ~t6 eentr ifug6s comme p r6c6- demment . Le RNA polysomal a 6t6 centr ifug6 dans le g rad ien t hab i tue l pendan t 18 h h 14 00,0 rev . /min . La p ropor t ion de RNA marqu6 qui s6dimen~e au de l/i de 28 S est de 62 p. cent.

B. Profil de s6d imenta t ion du RNA polysomal r ap idemen t marqu6 des polysomes TKNM de f ibroblastes de poulet.

E~v i ron 4 × 108 eellules d 'asei te FLS ont ~t6 lys6es dans 50 ml de t a m p o n TKNM avee 0,1 p. cent de Nonidet P 40. Les noyaux ont 6t6 s6diment6s et 20 ml du su rnagean t post-nuel~aire ont 6t6 pr61ev6s pour lyser les f ibroblastes de poulet en culture.

Env i ron 8 × 107 f ibroblastes out 6t6 m a r q u i s par 1 mCi d 'Ur id ine ~SH] dans les condi t ions d6erites dar~s mat6r ie l et m6thodes. Aprbs Iavage des cellules avec du mi l ieu non marque, 20 m~[ du su rnagean t T KNM de eellules d 'asei te FLS ont 6t6 r6par t is de fa~on aussi un i fo rme que possible sur la couche monocel lu la i re des f ibroblastes. Apr~s pipetage doux pendan t 1 mit t environ, la major i t6 des eellules out 6t6 lys6es et d6coll~es du verre. Le h, sa t eel lulaire a 6t6 centrifug6 h basse vitesse. Le su rnagean t post-nue]6aire a 6t6 ajou't6 aux 30 ml res tan t s de su rnagean t post-nucl6aire de cellules d 'asei te FLS. Apr6s avoir amen6 le volume h 90 ml avec du t a m p o n TKNM, les polysomes ont 6t6 s6diment~s en culq~. De RNA p olysomal a 6t6 centrifug~ pendan t •8 h h 18 000 rev . /min .

La p ropor t ion de RNA marqu6 qui s6dimente au delh de 18 S est de 66 p. cent et au delh de 28 S de 38 p. cent.

BIOCHIMIE, 1 9 7 2 , 5 4 , n ° 9 .

_ 2 5 m'o

I I I I 5 10 15 20 2S

F R A C T I O N S

R N A messager po lysomal de hau l poids moldculaire. 1153

Le surnageant post-nucl6aire de cellules mar- qu6es, lys6es en t ampon TKNM, a 6t6 m61ang6 avec un volume 8 fois plus grand de surnageant post- nucl6aire de cellules non marqu6es, lys6es en tam- pon TKNM (voir 16gende figure 4). Seule une tr6s faible p ropor t ion du RNA radioact i f extrai t des polysomes pr6par6s dans ces condi t ions a pu 6tre d6grad6, comme le mont re le profil de s6dimenta- t ion de la figure 4.

Ces r6sultats semblent ind iquer que la forte pro- por t ion de polysomes lourds TKNM et de RNA lnessagers lourds ex~raits de ces polysomes ne peut 6tre expliqu6e par une moindre d6gradation des polysomes survenant aprbs la lyse cellulaire.

6 °) Analyse par centrifugation en gradient de saccharose du RNA polysomal rapidement marqud isold dt partir de cellules leucdmiques de poulet et de fibroblastes normaux de poulet, les polysomes dtant isol~s en tampon TKNM.

La m6thode d ' isolement du RNA polysomal h par t i r des cellules leuc6miques de poulet marqu6es par l 'Ur id ine [aH] pendan t 15 minutes ne diff6re pas de celle utilis6e pour l ' is01ement des poly- somes TKNM de cellules d'ascite ELS de souris (voir 16gende de la figure 5 A). La figure 5 A mon- ire que dans le RNA de cellules leuc6miques de poulet isol6 h pa r t i r de polysomes TKNM, la pro- por t ion de ~NA marqu6 qui s6dimente au del~ de 28 S est de 62 p. cent. Lorsque les polysomes avaient 6t6 isol6s selon une m6thode classique, en tampon isotonique [4], seulement 20 p. cent du RNA marqu6 s6dimenta ient au delh de 28 S.

Le << RNA messager >> des fibroblastes de poulet en cul ture a 6t6 isol6 h par t i r de fibroblastes lys6s h l 'a ide d 'un surnageant post nucl6aire de eellules d'ascite FLS de souris (voir 16gende de la figure 5 B). Les cellules d'aseite ayant 6t6 lys6es en tampon TKNM, les polysomes d'ascite F.LS ne ris- quent pas de d6grader les polysomes de fibro- blastes. La lyse des fibroblastes par le surnageant d 'aseite FLS est beaueoup moins brutale que lors- que le t ampon TKNM eontenant 0,1 p. cent de Nonidet P 40 est utilis,6 seul, ce qui 6vite l '6clate- ment des noyaux. D'autre part , les polysomes TKNM de cellules d 'ascite jouent le r61e de ¢ poly- somes en t ra ineurs >> et permet tent de rep6rer plus faci lement le culot de s6dimenta t ion des poly- somes. La figure 5 B mont re que 66 p. cent du RN,A marqu6 des polysomes TKNM de fibroblastes de poulet s6dimentent au delh de 18 S e t 38 p. cent au delh de 28 S.

DISCUSSION.

Dans une 6tude ant6rieure eonce rnan t l ' isole- ment de polysomes h par t i r de ee l lu les tumorales

ascitiques de souris et de my61oblastes leue6mi- ques de poulet, nous avions observ6 que ces eel- lules n '6elatent pas par homog6n6isat ion en mi l ieu hypoton ique ou isotonique (r6sultats non publi6s). Par contre, les d6tergents permet ten t de lyser tr6s faci lement ces cellules dont la membrane est tr~s r6sistante ; no.us avons obtenu les meil leurs r6sul- tats avee le Nonidet P 4.0 [4].

Cette m6thode pr6sente eependant r ineonv6- n ien t de lyser des organites eellulaires r iches en r ibonucl6ases (lysosomes) qui r i squent de d6gra- der les polysomes. Anssi, dans le pr6sent travail , nous avons modifi6 les m6thodes classiques de p r6para t ion des polysomes h l 'a ide du Noni- det P 40. D 'une part , nous avons augment6 le volume du tampon par rappor t au volume des eellules lys6es, dans le but de di luer au ma x i mum les RNases lib6r6es au eours de la lyse cellulaire. Les cellules ont 6t6 dispers6es dans 20 fois leur volume de tampon au cours de la lyse eellulaire, puts le surnageant post nucl6aire a ~t6 dilu6 4 lois avant la s6dimentat ion des polysomes. D'autre part , afin d ' i nh ibe r Fact ion des r ibonucl6ases lib6- r6es, nous avons effectu6 la lyse en t ampon de force ionique 61ev6e ( tampon TKNM). Nos r6sul- tats exp6r imentaux semblent confirmer cette hypo- th6se : lorsque les cellules tumorales ascitiques de souris ont 6t6 lys6es par le Nonidet P 40 dans un grand volume de tampon hyper ion ique TKNM, la p ropor t ion de RNA polysomal rap idement marqu6 qui s6dimente au del'~ de 18 S Oait de 65 p. cent env i ron (fig. 2D et 2E). Un r6sultat s imilaire a 6t6 observ6 pour les my61oblastes leuc~miques de pou- let (fig. 5A).

Le tampon hyper ton ique TKNM en outre favo- r iserai t l ' i solement de polysomes lourds en 61imi- nant les polysomes << non actifs ~ dont le RNA messager serait plus ou moins d6grad6 [11, 12]. Nous avons en effet constat6 que lorsque les poly- somes isol6s en tampon isotonique TKNM sont s6diment6s en prbsence de fortes concent ra t ions en sels, une part ie des polysomes est 61imin6e et le profil de s6dimentat ion du ¢ RNA messager >> est am61ior6 (fig. 2C).

La << protect ion >> des polysomes par le t ampon TKNM pour ra i t en par t ie 6tre expliqu6e par une modif ica t ion de leur s tructure, sous forme de par- t icules plus compactes qui r6sis teraient mieux aux ruptures provoqu6es par des forces m6caniques, lots des centr i fugat ions [13]. La s t ructure du I~NA monocat6nai re devient en effet beaueoup plus compacte lorsque celui-ci est mis en pr6sence de fortes concent ra t ions salines [14].

La lyse des cellules en t ampon hyper ton ique par le d6tergent est tr6s rapide, ce qui 6vite aux poly-

BIOCH1MIE, 1972, 54, n ° 9.

1154 Claude Verger.

s 0 m e s de r e s t e r en c o n t a c t avec les r i b o n u c l 6 a s e s ce l lu l a i r e s , d a n s des ce l lu les d o n t la m e m b r a n e p l a s m a t i q u e ne s e r a i t que p a r t i e l l e m e n t r o m p u e . Cette m 6 t h o d e p r 6 s e n t e t ou t e fo i s le r i s q u e d ' 6 c l a t e r des n o y a u x et de l i b 6 r e r des p a r t i c u l e s r i b o n u c l 6 o - p r o t 6 i q u e s d 'o r ig ine ' nuc l6a i r e , qu i e o s 6 d i m e n t e - r a i e n t avec les p o l y s o m e s [9, 10]. Nous a v o n s v6r i - fi6, en t r a i t a n t des n o y a u x m a r q u 6 s , en t a m p o n h y p e r t o n i q u e , que la p r o p o r t i o n de RNA r a p i d e - m e n t m a r q u 6 , qu i s e r a i t 6 v e n t u e l l e m e n t isol6e /~ p a r t i r de ces p a r t i c u l e s , es t fa ib le ; et, d ' a u t r e p a r t , sa c o n s t a n t e de s 6 d i m e n t a t i o n est r e l a t i v e m e n t p e u 61ev6e (fig. 3).

La m 6 t h o d e que n o u s a v o n s ra ise au p o i n t p o u r les ce l lu les t u m o r a l e s a sc i t i ques de sou r i s a 6t6 m o d i f i 6 e p o u r i so l e r les RNA m e s s a g e r s p o l y s o - m a u x de f i b rob l a s t e s de p o u l e t en cu l t u r e (fig. 513). Les f i b rob l a s t e s on t 6t6 lys6s en u t i l i s a n t le s n r n a - gean t pos t n u c l 6 a i r e de ce l lu les t u m o r a l e s asc i t i - ques de sour i s , ces ce l lu les a y a n t 6t6 lys6es p a r le N o n i d e t P 40 en t a m p o n h y p e r t o n i q u e T K N ~ clans la p r o p o r t i o n h a b i t u e l l e de 1 v o l u m e de ce l lu les p o u r 20 v o l u m e s de t a m p o n . Cet te m 6 t h o d e p e r m e t de l y s e r u n e fa ib ie quan t i t6 de f i b rob l a s t e s d a n s un g r a n d v o l u m e de t a m p o n , s a n s r i s q u e r d ' e n - d o m m a g e r les n o y a u x des f i b rob l a s t e s p a r u n exc6s de d 6 t e r g e n t ; F a c t i o n du d 6 t e r g e n t s u r les f i b rob l a s t e s s e m b l e << r a l e n t i e >> p a r la p r 6 s e n c e de m a t 6 r i e l ce l lu l a i r e p r o v e n a n t des ce l lu les t u m o - t a l e s de sour i s .

I1 s e m b l e que les m 6 l h o d e s que nous a v o n s d6- c r i t e s d o i v e n t p e r m e t t r e d ' i s o l e r des I~NA m e s s a - ge rs p o l y s o m a u x h p a r t i r de ce l lu les a n i m a l e s t r6s d i f f6 r en t e s et, en p a r t i c u l i e r , ~ p a r t i r d ' u n n o r n b r e r 6 d u i t de ce l lu les en cu l tu re .

polysomes 6taient pr6par6s en tampon TKNM, environ 65 p. cent du RNA marqu6 avaient une constante de s6dimentat ion sup6rieure h 18 S.

Des RNAs messagers de constante de s~dimentat ion 51ev6e ont 6galement 5t6 isol6s des polysomes pr6- pards en tarapon TKNM h part i r de cellnles normales ou leuc6miques de poulet, marqu6es pendant 15 rain par l 'ur idine [3H]. Environ 40 p. cent du RNA messa- get des fibroblastes d 'embryons normaux, contre 60 p. cent environ du RNA messager des my6loblastes leu- cdmiques infect6s par le virus de la My61oblastose Aviaire, sddimentaient an delh de 28 S.

Des expdriences ont 6t6 effectu6es pour pr6ciser l 'origine dn RNA << lourd >> rap idement marqn6 isol6 h par t i r des polysomes pr~par6s en tampon TKNM. Des noyaux marqu6s, p.r6par~s en tampon T:KM, ont 5t6 homog6n6is6s avec des cellules non m~arqu6es en tampon TKNM, et les polysomes du surnageant post- nucl6aire ont 6td s6diment6s selon la technique habi- tuelle. Une tr6s faible quantit6 de RNA marqu6 s6di- men tan t au delh de 18 S a pu 8tre isol6e h par l i r de ces polysomes, ce qui nmntre que le RNA lonrd rapi- dement m.arqud, extrai t des polysomes pr6par6s en tampon TKNM, ne provient pas de noyaux lys~s.

L ' isolement de RNAs messagers de constante de s6- d imenta t ion 61ev6e h par t i r de polysomes pr6par6s en tampon TKNM de force ionique 51evde, pourrai t ~tre expliqu6 par une inhibi t ion tr6s rapide de Faction de la RNase ]ib6r6e par la lyse cellulaire. De plus, la proport ion de RNA messager lourd est accrue en rai- son de l '~limination, par les fortes concentrat ions salines du tampon TKNM, des polysomes dont le RNA messager est par t ie l lement d6grad6 (polysomes ne par t ic ipant plus h la synth6se des prot6ines). Un effet << protecteur >> dfi h nne modification de la structure du RNA messager dans un tampon de forte concentra- t ion saline est 6galement envisag£

La m6thode d6crite ici permet d ' isoler de faqon rapide et reproductible des RNAs messagers polyso- maux de tr6s haut poids mob3culaire h par t i r de diff~- rentes cellules animales.

Remerciements.

Nous tenons h remercier le D ~ F. Laeour, ainsi qne le D ~ J. Harel pour l 'aide qn' i ls nous ont apport6e pour la r6daction de ce manuscri t .

Nuns remercions 6galement M a~ A. Barbe pour la raise en culture des cellules et M. G. Frezoul qui a d6termin6 la composi t ion en bases des RNAs marqu6s par ~2p.

R~SUM'~.

Des polysomes de diverses cellules animales ont ~t~ prepares en presence de fortes concentrat ions salines dans le but d'~viter la d~gradation des RNAs messa- gers polysomanx.

Une ~tude comparat ive des coefficients de s6dimen- ta t ion des RNAs messagers, extrai ts de polysomes pr~- pards en tampon isutonique T.KM ou en t ampon hyper- tonique TKNM, a ~td effeetu6e h par t i r de cellules de tumeur ascitique de souris marqudes par l 'Ur idine [~H] pendant 15 minutes. Environ 30 p. cent du RNA marqu6 extrai t des polysomes isol~s en tampon TKM s~dimentaient an delh de 18 S. Par contre, lorsqne les

ZUSAMMENFASSUNG.

Bei s tarker sal inischer Konzent ra t ion wurden Poly- some verschiedener t ier iseher Zellen mit dem Ziel, die Degradation ihrer m-RNS zu vermeiden, pr~ipariert.

Eine vergleichende Untersuchung der extrahier ten m-RNS, die in e inem isotonischen TKM-Tampon oder in einem hyper tonischen TKNM-Tampon pr~ipariert wurden, wurde ausgehend von Zellen eine Maus Aszitestumors, die w~ihrend 15 Minuten mit Uridin(3tI) markier t wurden, durchgeffihrt . Ungefiihr 30 p. cent der markier ten RNS, die ans den im TKM- Tampon i~so,lierten Polysomen ext rah ier t wurden, sedimen~iere.n fiber 18S. Wenn die Polysomen im TKNM- Tampon pr/ipariert wurden, ha t ten 65 p. cent der markier ten RNS eine Sedimenta t ionskonstante h6her als 18S.

m- RNS m~t hoher Sedimenta t ionskonstante xvurden gleichermaBen aus in TKNM pr~iparierten Polysomen.. die arts normalen oder lenk~misehen Zellen des Hfihnchens s tammten, die w&hrend I5 Minuten mit Uridin(ZH) markier t wurden, isoliert. Ungefiihr 40 p. cent m-RNS der F ibrob las ten der normalen Embryos gegenfiber 60 p. cent der m-RNS der leuk~imisehen Myeloblasten, die vom Vogelmyeloblastosevirus infi- ziert waren, sediment ieren jensei ts 28S.

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 9.

R N A m e s s a g e r p o l y s o m a l

U m die H e r k u n f t d e r << s c h w e r e n >> schne l l m a r - k i e r t e n RNS, die a u s g e h e n d v o n i m TKNM- T a m p o n p r i i p a r i e r t e n P o l y s o i n e n i s o l i e r t w u r d e n , zu p r i i f en , w u r d e n U n t e r s u c h u n g e n d u r c h g e f i i h r t . M a r k i e r t e im TKM- T a m p o n p r / i pa r i e r t e K e r n e w u r d e n m i t n i ch t m a r k i e r t e n Z e l l e n i m TKNM- T a m p o n h o m o g e n i s i e r t , u n d die P o l y s o m e d e r n i c h t s e d i m e n t i e r t e n K e rne w u r d e n m i t t e l s de r g e w S h n l i c h e n T e c h n i k s e d i m e n - t ier t . E ine s e h r s c h w a c h e Menge m a r k i e r t e r RNS, die f iber 18S s e d i m e n t i e r t , k o n n t e , a u s g e h e n d v o n i h r e n P o l y s o m e n , i so l i e r t w e r d e n , w a s zeigt , da]~ die << s c h w e r e >> schne l t m ~ r k i e r t e RNS, die a u s in e i n e m T K N M - T a m p o n p r h p a r i e r t e n P o l y s o m e n e x t r a h i e r t w u r d e , n i c h t v o n d e n g e l 6 s t e n K e r n e n h e r r i i h r t .

Die I s o l i e r u n g d e r m - R N S m i t e i n e r h o h e n Sedi- m e n t a t i o n s k o n s t a n t e , a u s g e h e n d v o n i m TKNM- T a m - p o n p rhpar i , e r t en Po lyso .men m i t h o h e r Ionens t [ i rke , konnt , e d n r c h ein.e s e h r s e h n e l l e I n h i b i t i o n de r Ti i t ig- ke i t d.er d u r e h die Zellys.e f r e i g e s e t z e t e n R Nase erkl~irt w e r d e n . F e r n e r i s t a u f G r u n d d.er A b s p a l i u n g de r P o l y s o m e , d e r e n m - R N S t e i lwe i se d e g r a d i e r t is t ( P o l y s o m e , die n i c h t m e h r a n de r P r o t e i n s y n t h e s e t e i l h a b e n ) , d ie Menge de r << s e h w e r e n >> m - R N S d u t c h s t a r k e sa l in isch ,e Ko~nzentrati 'on e r h S h t . E i n << S c hu i z - effek.t >> a n f G r n n d e i n e r Modi f ika t ion d.er S t r u k t u r de r m - R N S in e i n e m T a m p o n m i t s t a r k e r s a l i n i s c h e r K o n z e n t r a t i o n w i r d g l e i c h e r w e i s e in B e t r a c h t gezogen.

Die h i e r b e s e h r i e b e n e Methode e r l aub t , a u s g e h e n d von v e r s c h i e d e n e n t i e r i s c h e n Ze l len , s ehne l l n n d r e p ro -

d e h a u t p o i d s m o l d c u l a i r e . 1 1 5 5

d u z i e r b a r m - R N S de r P o l y s o m e m i t h o h e m Moleku- l a r g e w i c h t zu i so l i e ren .

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