Isothermes de partage du RNA de transfert

European J. Biochem. 5 (1968) 474-479

Isothermes de partage du RNA de transfert

J. P. GAREL et P. MANDEL

Centre de Neurochimie du Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Chimie Biologique de la Facult6 de MBdecine, Strasbourg

( R e p le 13 Mai 1968)

Partition isotherms of two kinds of transfer ribonucleic (tRNA) acids from baker’s yeast and calf liver and six yeast tRNAs have been determined a t four temperatures (0, 10, 20, and 30”)) at three pH (6.6, 7.0, and 8.0) in the following solvent system: potassium phosphate buffer 1.5 M-2-methoxyethanol-2-butoxyethanol (300: 100: 30-130, by vol.).

The effect of various parameters on the partition coefficient of tRNA, such as molarity and pH of the buffer, temperature, concentration of the organic components, have been in- vestigated.

The semi-logarithmic variation law of the partition coefficient is expressed with respect to the temperature and the 2-butoxyethanol content of the solvent mixture. Numerical values of some solvent system constants have been calculated.

Advantages of this system for separation and enrichment of specific tRNAs have been dis- cussed for a further application to a counter-current distribution or a column partition chro- matography using a decreasing 2-butoxyethanol or temperature gradient.

Les systbmes solvants B 1’6quilibre, constitubs de deux phases non miscibles B 2 composantes [l], 3 composantes [2,3], 4 composantes [4,5] et 5 composantes [6] ont 6th appliques avec succbs 8. l’isole- ment de plusieurs espkces d’acides ribonucleiques de transfert en utilisant les techniques de distribution B contre-courant [ 1-61 ou de chromatographie de partage sur colonne [7-121.

Travaillant sur divers tRNA d’origine animale, nous nous sommes interesses B un systkme solvant ternaire biphasique propose par Kirby [ 131 pour la separation de fragments de RNA ribosomique. En I’absence d’informations suffisantes sur les proprieths physico-chimiques de ce systkme solvant, nous avons B t B conduit B en approfondir 1’6tude en utilisant du tRNA de levure de boulangerie et de foie de veau l.

MATfiRIEL ET MaTHODES XystBme solvant

Les phosphates mono- et bipotassique ainsi que les butoxy-2 et methoxy-2 ethanol sont des produits Prolabo. Les solvants sont purifies par une distillation B reflux sur de l’amidol (chlorure de diammo- nium-2,4 phenol) B raison d’un gramme par litre, pendant une demi-journee. Seule la fraction pour laquelle I’absorbance B 260 mp et sous 1 cm de profondeur est inferieure B 0,l est recueillie.

Abre‘uiation no@ usuelle. RNA de transfert, tRNA. 1 Ce memoire fait partie de la these de Doctorat 6s

Sciences de J. P. Garel, attach6 de recherches au C. N. R. S.

Les rapports en volume des 3 composantes du systkme solvant sont : tampon phosphate de potassium 1,5 M pH 6,6-8,0-mBthoxy-2 ethanol-butoxy-2 ethanol (300: 100:30-130, en vol.).

La composition du systkme est donnhe dans le texte et les figures en indiquant le pourcentage en volume du butoxy-2 ethanol, seule variable.

RNA de transfert Les tRNA de levure de boulangerie sont fournis

par Boehringer sous le nom de S-RNS-B. Les tRNA de fois de veau sont prepares selon une

methode analogue B celle dbcrite par Kirby [14]. 100 g de tissu lyophilise ou 300 g de tissu frais, broye au mortier et tarnish, sont homoghneishs mecanique- ment pendant deux minutes B 4” environ, avec 1,5 litre d’une solution NaCl (1 g/100 ml), puis agites pendant 15 min avec 1 litre d’une solution phenolique (700 ml de phenol prealablement distill6 sur de la poudre de zinc, 200 ml de m-cr6sol purifie par distillation, 100 ml d’eau dhin&ralis&e, 1 g de hy- droxy-8 quinoleine) e t centrifuges 10 min B 3.000 x g. La phase aqueuse amenee B 3 g de NaC1/100 ml, est extraite deux fois avec un demi-volume de solution phenolique, puis precipitee par deux volumes d’ethanol et abandonnee quelques heures B -20”. Aprbs centrifugation, le culot est lave par une solution Bthanolique b 75 v01.~/,, contenant 10 g d’acetate de sodium par litre, puis repris trois b quatre fois dans une solution d’acetate de sodium 3 M pH 6,O qui solubilise prefhrentiellement le DNA et les tRNA.

VOI. 5, NO. 4, 1968 J. P. GAREL et P. MANDEL 475

Le DNA, present surtout dans les preparations de materiel lyophilish, est Blimin6 par precipitation avec 0,55 volume d’isopropanol. Apres une nouvelle precipitation Bthanolique, le tRNA est debarass6 des traces de RNA ribosomique par chromatographie sur gel de dextrane G-100 selon Virmaux et coll. [15]. Le rendement est d’environ 15mg pour 100g de tissu frais.

Avant usage, les preparations de tRNA sont incubees pendant une heure B 37”, dans du tampon Tris-HC1 1,8 M pH 8,0 (100 mg de tRNA dans 5 ml de tampon) pour Bliminer les acides amin& fixes, precipitees par deux volumes d’6thano1, centrifugees, l ades deux fois par une solution d’ethanol b 75 75 v01.~/, contenant 10 g d’achtate de sodium par litre, puis dissoutes dans un volume d‘eau ad6quat.

Distribution et coefficient de purtage Le systkme solvant est introduit dans un tube de

verre B bouchon rodit, d’un volume de 30 ml, et port6 au bain-marie B la temperature voulue (51”). On ajoute alors 0,4 mg de tRNA prealablement dissout dans 10 pl d’eau. L’ensemble est equilibre apres trois cycles d’agitation manuelle, d’une duree de 30 secon- des chacun. Aprh deux minutes de repos, les deux phases sont compl&tement skparees. La concentration en tRNA de chacune d’elles est determinee par spectrophotometrie B 260 et 280 mp, contre une solution de solvants de composition analogue.

A 1’6chelle preparative, on solubilise 6 mg de tRNA pr6incubi: dans 100 pl de tampon phosphate par tube de distribution. Le RNA insoluble B l’inter- face est negligeable pour une concentration moyenne infhrieure B 2 mg/ml. Apres equilibration, chaque phase est recueillie s6parAment) extraite trois fois avec un volume egal d’6ther diethylique exempt de peroxyde et dialysee contre 100 volumes d’eau d6rnineralisee pendant une nuit B 0-2”, puis lyo- philisBe. Le tRNA obtenu avec un taux de r6cup6ra- tion de 90 & 5O/, est dissout dans 10 pl d’eau et distribue par fractions aliquotes de 20 B 50 pg pour &re utilise directement dans les tests d’activite acceptrice en acides amines.

Prdpuration des L-amino-acides : tRNA-ligases Le surnageant (60 B 80ml) d’un homogenat de

4 foies de rats adultes centrifuge 2 heures L 105.000 x g dans le tampon Tris-HCl 0,05 M pH 7,5 0,025 M en KC1 et contenant 100 g de saccharose par litre, est percole en chambre froide sur une colonne de 4 g de DEAE-cellulose (Serva) A 0,57 mequ/g, avec un tampon identique au precedent, mais sans saccharose. On blue avec la solution tampon Tris-HC1 0,05 M pH 7,5 KC1 0,025 M NaCl 0,25 M. L’effluent et les premieres fractions de 1’6luat (10 ml) sont rassembles et dialyses plusieurs fois.

La teneur en proteines de la solution enzymatique brute est de 8-10 mg/ml (microdosage au biuret). Le rapport des absorbances A,,o/A,,o est de 1,3 environ. La solution enzymatique est conservee B - 90”. Elle permet d’effectuer 1.500 tests d’activit6 acceptrice repartis sur 2 mois. Au bout de ce temps, l’activite residuelle de la solution enzymatique, variable selon les tRNA, est encore de 300/, pour tRNAA18, de 750/, pour tRNAva1 par exemple.

Activitd acceptrice en ucides uminks Une etude prelimhaire de l’influence de chaque

parametre sur le taux optimal d’acylation nous a conduit b adopter les conditions suivantes : Tampon Tris-HC1, 50 pmoles; MgCl,, 10 pmoles; ATP, 5 pmoles; CTP, 1 pmole; tRNA, 20 B 50pg; [14C]-

amino-acides (C. E. A.), 50 nmoles/200 nC; ligase brute, 0,8 1,Omg de la solution protBique brute; volume total, 0,5 ml; pH final, 7,2; temperature d’incubation 35”; duree d’incubation 10 b 15 min.

La reaction d’acylation est bloqu6e par addition de 2 ml d’acide trichloracetique froid B 100 g/l. Le precipith est recueilli sur filtre Whatman GfjC qu’on lave abondamment avec la solution d’acide trichloracetique precBdente, puis avec 0,5 ml environ d’une solution 0,Ol M de l’acide amine Btudie, enfin avec 5 ml d’ethanol. La radioactivite est mesuree au spectrometre B scintillation liquide (Packard Tricarb).

R~SULTATS Les parametres du systbme solvant (molarit6,

pH du tampon, temperature et concentration en butoxy-2 et m6thoxy-2 ethanol) ainsi que l’effet qualitatif de leurs variations sur le coefficient de partage K et le rapport des volumes des phases supkrieure et inf6rieure Vr, sont rassembles dans le Tableau. Leur relation quantitative fait l’objet de l’abaque B points align& de la Fig. 1. Vr est represent6 graphiquemeh en fonction du pH, de la temperature et du pourcentage en butoxy-2 ethanol (BuO) du systeme. La relation mathematique est de la forme:

Pour un pH inferieur B 6,5 on assiste B une precipitation partielle du phosphate bipotassique par le methoxy-2 ethanol. La convergence, B 42”) des courbes de m6me pH indique qu’au delB de cette temperature critique existe seulement une phase et que le tRNA y est transfer8 en totalite. Par contre, entre 0 et - lo”, on peut travailler avec deux phases B condition d’augmenter considerablement le volume de butoxy-2 ethanol pour abaisser le coefficient de partage.

Nous avons renonce B presenter les variation de VT en fonction du volume de mhthoxy-2 6thano1, car

476 Isothermes de partage du RNA cle transfert European J. Biochem.

Tableau. ParamBtres du systbme solvant et leurs variations qualitatives

Molarite PH Temperature Butoxy-2 Bthanol Methoxy-2 Bthanol

"C nil ml

Limites de variation 1,O-2,5 6,6-8,0 0-35 25-150 100-300 V , dbcroit dbcroit d6croit d6croit croit K dbcroit dBcroit d6croit d6croit croit

150 - - E

_J

0 z

.-...

a 100

? X

3 e m

50

0

Fig. 1. Abaque de mesure directe de V,. L'6quation (1) dbfinit, pour un pH donnk, la relation entre 3 variables: la tempbrature porthe sur I'axe gauche des ordonn6es, le volume de butoxy-2 6thanol exprim6 en ml pour le systeme solvant standard (300 ml de tampon phosphate 1,50 M, pH 6,6-8,0, 100ml de mbthoxy-2 6thanol) port6 sur I'axe droit des ordonnbs. Le faisceau de droites di?finit le choix du pH. Les valeurs de V , (rapport du volume des phases sup6rieure et inf6rieure) sont indiqu6es sur la l e courbe B pH 6,6, les lignes paralleles inclinkes rapportent cette m8me valeur pour les autres pH. La valeur cherchbe de V, est lue b I'intersection de la dlroite pH et de la droite joignant les points (temp6rature et butoxy-2 6thanol) port& par les

axes de coordonn6es

elles sont trop rapides pour etre utilisables dans une chromatographie de partage.

La variance v = c + n - 9 de ce systbme est bgale B 4 [c = nombre de constituants indbpendants, n = nombre de facteurs externes (tempbrature, pH), 9 = nombre de phases]. Si I'on tient compte de la molarit6 du tampon, n augmente d'une unit6 et la variance est 6gale B 5.

Les Fig.2 et 3 nous autorisent B affirmer que les isothermes de partage des tRNA, dans notre systkme solvant du moins, sont rbgulihes et obbissent la loi semi-logarithmique suivante, dbterminbe empiri- quement :

log K = B - A . T [BuO] (2)

ou encore sous forme exponentielle :

4 12 16 28 BUTOXY-2 ETHANOL %

Fig.2. Isothermes de partage iC p H 8,O de tRNA de levure. Les coefficients de partage K obtenus par le rapport des absorbances de 0,4 mg de tRNA rBpartis, apr&s Bquilibration, dans les phases supitrieure et inf6rieure du systhme solvant: tampon phosphate de potassium 1,50 M pH 6,6 (12 ml) m6thoxy-2 bthanol (4 ml), butoxy-2 bthanol (1,2-4,8 ml) sont portbs en fonction du volume du butoxy-2 6thanol.

0 , 0'; 0, 10'; ., 20"; 0, 30'

t W W

cr 2 W

c Z

n

w 9 L L

0 0 b 01

I , , ,


Fig.3. Isothermes de partage iC pH 7,O de tRNA de levure. M6mes conditions que celles indiqu6es dans la l6gende de la Fig. 2, mais pour un pH 7,O. O,OO; 0 , 10"; a, 20"; 0, 30"

VOl. 5, NO. 4, 1968 J. P. GAREL e t P. MANDEL 477

avec K = coefficient de partage; B = log KO, constante de base; KO = valeur extrapolbe de K pour une concentration nulle en butoxy-2 ethanol, fonction du pH; A = pente, fonction du pH, de la temperature et de la nature du RNA; T = temperature absolue; [BuO] = fraction du butoxy-2 Bthanol ex- primee en ”,, du volume total du systkme solvant: tampon phosphate de potassium 1’5 M mBthoxy-2 Bthanol (3 : 1 ; v/v).

Pour chaque pH et pour chaque type de tRNA, il existe un faisceau d’isothermes qui convergent sur l’axe des ordonnees pour une valeur maximale du coefficient de partage KO. En effet, en l’absence de butoxy-2 ethanol, le systkme solvant se reduit B un systkme binaire b une seule phase correspondant b la phase superieure du systbme ternaire utilise.

La variation thermique du coefficient de partage, pour un systbme solvant donnB, n’est pas linhaire puisque le facteur A est fonction de T comme celB ressort de 1’6quation (4) :

A = a . p H + b . T - c (4) avec les valeurs numbriques suivantes, valables pour les tRNA de levure et de foie: a = 1,6 x 10-4; b = 0,14 x

On remarquera que A varie linbairement avec le pH. I1 apparait aussi que KO est relie au pH selon 1’6quation ( 5 ) :

c = 45,7 x

KO = 130 (PH - 3’7). (5 ) Le coefficient de partage est vraisemblablement

sensible aux differences de composition en bases. Kirby[13] a montrB que des fragments de RNA ribosomique riches en adenine et appauvris en guanine ont des coefficients de partage plus bleves qui correspondraient, dans notre systkme de repre- sentation, b une constante de base supbrieure et b une pente A plus faible. Pour les tRNA l’existence d’une structure secondaire masque partiellement la contribution de la composition en bases sur la valeur du coefficient de partage. La faible difference dans le rapport des bases ad&nine/guanine = 0,62 et 0,60 pour le melange des tRNA de foie de veau et de levure de boulangerie respectivement expliquerait la grande similitude des isothermes de partage des tRNA de ces deux sources. Les valeurs numeriques des coefficients a, b e t c de 1’6quation (4) sont d& lors applicables B ces deux especes de tRNA.

Les Fig. 4 et 6 representent les coefficients de partage Kt pour six tRNA dif€brents de levure de boulangerie, b pH 8,0 et b lo”, pour des taux variables de butoxy-2 6thanol. A l’exception du tRNAPhe, les isothermes de partage sont des droites plus ou mobs inclinbes par rapport b l’axe moyen de l’isotherme de partage Ks du melange des tRNA telle qu’elle est rapportbe dans les essais de la Fig.2.

L’enrichissement en tRNAde I’une ou de l’autre des phases au cours d’une distribution varie entre 1’1 et 2.

lo i

9 13 17 21 BUTOXY-2 ETHANOL “4

Fig.4. Isothermes de partage B p H 8,O et iC 10” de tIlNA individuels de levure. L’isotherme K s reprhsente la variation du coefficient de partage Ks de l’ensemble des tRNA de levure. Elle est identique B la courbe ( 0 ) de la Fig.2. Les autres courbes representent la variation du coefficient de partage Kt d’un tRNA donnB. Kt est dbfini comme le rapport des radioactivitBs des tRNA [14C]aminoacylbs entre les phases supbrieure e t infitrieure divisb par la valeur de Vr correspondante. 6 mg de tRNA dbbarass6 des rBsidus d’acides aminBs, sont solubilisbs B 10” dam le systeme solvant: tampon phosphate de potassium 1,5 M, pH 8,O (300 ml), mBthoxy-2 Bthanol (100 ml), butoxy-2 Bthanol (40, 50, 60, 80 et 100 ml). Apres Bquilibration, chaque phase est recueillie sBparBment, extraite B 1’6ther dibthylique, dialysBe et 1yophilisBe. Ce tRNA, par fractions aliquotes de 20-50 pg, est test6 pour son activit6 acceptrice en [‘*C]-

amino-acides. 0 , tRNA*la; , tRNAva1; ., tRNAser


Fig.5. Isothermes de partage & p H 8,O et B lo”, de tRNA individuels de levure (suit&). Se rBferer B la lbgende de la

Fig.4. A, tRNAPhe; A , tRNALeU; 0 . tRNALyS

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DISCUSSION Le coefficient de partage moyen K , du melange

des tRNA est la resultante des coefficients de partage individuels Kt des divers tRNA qui le composent. La valeur absolue de K , et ses variations en fonction du pH du tampon, de la temperature, du taux de butoxy-2 ethanol, de la composition en bases des tRNA constitutifs ou de leur concentration relative sont trbs importantes B connaitre, car elles permettent de choisir, a priori, le systbme de separation optimale.

Comment determiner Ks et Kt ? Les quotients des mesures d’absorbance du melange initial de tRNA entre la phase superieure et la phase infbrieure du systbme solvant donnent le coefficient de partage K,. Ce coefficient est independant du volume de chacune des phases car il ditfinit le rapport de deux concen- trations. Par contre les quotients des mesures de la radioactivite du tRNA-[14C]aminoacyle entre les phases superieure et inferieure donnent l’indice de partage d’un tRNA donne ou Gt. On doit maintenant tenir compte du volume des phases superieure V, et inferieure V6 et des relations (6) et (7) suivantes:

(7)

On se rappellera que Kt et G,, respectivement coefficient de partage d’un tRNA donne et indice de partage du melange des tRNA, sont des valeurs calculees B partir des donnees experimentales brutes que reprbsentent l’indice de partage d’un tRNA indi- viduel Gt et le coefficient de partage des tRNA, Ks.

La consideration des isothermes de partage Kt de chacun des tRNA des Fig.4 et 5 conduit L admettre deux types d’isothermes, selon qu’elles coupent K , autour de la valeur unitaire ou qu’elles s’en Bloignent. Cette difference pourrait 6tre attribuee B l’existence ou b l’absence de deux ou plusieurs espbces de tRNA fixant le meme amino-acide. En effet, un tRNA heterogbne compose de plusieurs espbces majeures et mineures doit se comporter comme un sous-groupe du melange des tRNA initiaux. Son isotherme de partage est une resultante dont l’identite avec Ks est d’autant plus grande que les espbces mineures sont plus nombreuses, autrement dit que ce sous- groupe est plus heterogene. C’est le cas pour les tRNALeU, tRNALyS (Fig.4) et tRNAser (Fig.5). Le deuxibme groupe rassemble des tRNA plus indi- vidualises tels les tRNAAla, tRNAVa1 (Fig.5) et probablement le tRNAPhe (Fig. 4).

De plus l’ordre moyen d’klution des tRNA soumis B une chromatographie de partage ou leur apparition dans la phase mobile d’une distribution B contre-courent est fix8 B tout instant. C’est ainsi par exemple que le systbme solvant 20 les fractionne dans l’ordre decroissant de leur coefficient de partage, parallblement B la decroissance du rapport des bases

adenine/guanine: 0,82 pour tRNAPhe; 0’72 pour tRNAserI1; 0,68 pour tRNAVal; 0,59 pour tRNASer1 et 0,34 pour tRNAA1a.

La connaissance des valeurs de Kt permet donc de fixer avec plus de rigueur lea parametres du systkme solvant en fonction du problkme pose (enrichissement d’un tRNA donnt5, fractionnement qualitatif d’un melange de tRNA) et de la technique utilisee (distribution L contre-courant, chromatographie de partage sur colonne). On peut calculer le pouvoir separateur ,5 du systbme solvant [lS] utilise pour une distribution B contre-courant :

B = KtIiKt,

determine le nombre minimal des transferts b effectuer avec un extracteur B contre-courant pour &parer les tRNA tl et t, avec un taux de purete donne.

C’est ainsi que, d’aprbs les Fig.4 et 5 dans le systeme 20, le pouvoir separateur entre les tRNALyS et tRNAAla oh /?Lys-Ala = 15 permet d’esperer leur separation avec 900/, de pureti? en moins de 20 transferts.

La connaissance de tels diagrammes autorise en consequence une selection raisonnable des parambtres pour &parer au mieux deux ou plusieurs espbces de tRNA.

Les avantages de ce systbme solvant resident dans sa composition simplifiee reduite B deux solvants organiques, sa souplesse fondke sur la connaissance de diverses variables, la possibilitk de travailler B basse temperature et de manipuler ainsi des RNA messagers [17]. Le traitement mathematique propose facilite le choix des conditions optimales et permet un gain appreciable de temps et de materiel.

Ses inconvenients ne lui sont pas particuliers et, dans le cas de la chromatographie, proviennent des manipulations aprbs elution et de la necessite de regkn6rer la colonne aprbs emploi.

Le systbme solvent propose constitue un bon outil pour obtenir des preparations enrichies, pr6- alables B un fractionnement B coutre-courant par exemple, en faisant appel, lors d’une chromatographie de partage sur colonne, L un gradient decroissant en butoxy-2 ethanol ou L un gradient decroissant de temperature ou bien b une combinaison simultanee de ces deux variables. On retrouve ici la raison d’etre principale des pr6skparations sur colonne telles que l’indique Zachau [9, lo]. A 1’8chelle analytique, avec des colonnes capillaires de taille rhduite, ce systbme solvant facilite la mise au point de profils d’hlution de tRNA acyles [IS].

I1 s’ajoute aux deux autres systbmes solvants pratiques actuellement ; celui de Zachau [6,9] utilisit en chromatographie de partage par Cantoni et coll. [7,8], Bergquist et Robertson [ I l l et celui de Muench et Berg [12]. Mentionnons enfin la tentative de chro-

Vol.5, Xo.4,1968 J. P. GAREL et P. MANDEL 479

matographie sw colonne d'acide silicique de Holley et coll. [19] avec le systbme solvant: tampon phosphate-formamide-isopropanol.

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J. P. Garel et P. Mandel Centre de Neurochimie du C. N. R. S. Institut de Chimie Biologique de la Facult6 de Mkdecine 11 Rue Hurnann, F-67 Strasbourg, France

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