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UE1: fiche de cours ED n°1 Biochimie
I. Les anomalies des gènes ou du génome
Pour comprendre certaines maladies, on peut utiliser différentes
techniques permettant l’exploration de l’ADN mais aussi au niveau
de l’expression des gènes avec l’ARNm et les protéines. La
transcription de l’ADN->l’ARNm simple brin constituée de
nucléotides.
L’ARNm est traduit -> des protéines qui sont constituées
d’acides aminés.
Recherche fondamental et exploration intérêt pour la
médecine
Réalisation d’études fondamentale -> Comprendre le rôle d’un
gène, d’un transcrit, d’une protéine.
Réalisation d’une recherche clinique-> Rôle dans la
physiopathologie des maladies humaines.
Réalisation d’un diagnostic-> En recherchant un biomarqueur
d’une pathologie humaine.
Analyse des anomalies des gènes ou du génome
Niveau de l’ADN :
· Anomalies qualitatives-> single nucleotide variation (SNV),
mutations ponctuelles, insertions/délétions -> repérer par
séquençage.
· Les anomalies quantitatives : aneuploïdie, duplications
et délétions de grandes parties du génome--> repérées par
CHG-array et caryotype.
Niveau de l’ARN :
· Problème d’expression : absence d’expression (pas de
protéine), surexpression/sous expression (trop ou pas assez de
protéine) -> repérés par RT-qPCR (reverse transcriptase
quantitative Polymerase chain reaction) : Retour de l’ARN
(trop fragile) à l’ADN.
Niveau des protéines :
· Anomalies qualitatives : localisation cellulaire,
fonction -> repérées par IF (immunofluorescence), Co-IP
(co-immunoprecipitation), WB(western-blot)
· Les anomalies quantitatives : absence, surexpression/sous
expression -> repérées par WB (western-blot), CMF (cytométrie en
flux)
II. Le séquençage par NGS
Le NGS (next generation sequencing )-> technique pour
séquencer l’ADN :
· Permet de déterminer l’enchainement des nucléotides.
· La plus utilisée.
· Permet de détecter des mutations.
· Se déroule en plusieurs étapes réalisées par une machine.
A) Préparation des librairies
1) ADN génomique (tout l’ADN, pas de partie sélectionnée) du
patient-> fragmenter et dénaturer en ADN simple brin.
2) Ligation : À chaque extrémité de tous nos fragments, on
va venir attacher des adaptateurs. Ces deux étapes vont nous donner
une librairie pour séquençage : qui correspond à l’ensemble
des fragments d’ADN lié aux deux adaptateurs (un à chaque
extrémité).
3) Flowcell : lame de verre où sont accrochées des
séquences complémentaires aux adaptateurs, relativement espacées
sur la surface. La librairie de séquençage va être placée sur le
flowcell, et les adaptateurs vont venir s’accrocher sur leurs
séquences complémentaires fixées sur ce flowcell par
hybridation.
B) Le clustering
4) On va réaliser une PCR (une technique d’amplification
enzymatique qui permet à partir d’un fragment d’ADN, d’obtenir un
grand nombre de copies identiques de ce même fragment) par
pont.
Création de clusters : sur chaque endroit où une séquence
est accrochée, on ne va amplifier que cette séquence la. Chaque
cluster va être spécifique d’un seul fragment d’ADN et tous les
clusters sont totalement différents.
hybridation sur une flowcell par complémentarité Formation de
cluster via les adaptateurs
(Amplification par pont)
C) Le Séquençage
5) Séquençage en 4 étapes :
· Ajout des 4 dNTP couplés chacun à un
fluorochrome différent. Ces nucléotides s’incorpore à la suite
de l’adaptateur, le fluorochrome bloque l’extension. Comme dans un
cluster tous les brins sont identiques, ils vont tous s’arrêter sur
le même nucléotide.
· Lavage : élimination des nucléotides en excès
· Une photo va être prise sur le flowcell ; clusters de
différentes couleurs en fonction du dernier dNTP incorporé.
· Elimination du fluorochrome : Réaction de clivage du
groupement fluorescent bloquant l’extension.
· Retour à l’étape 1 : incorporation des 4 dNTP dans la
solution, lavage, photo, clivage …
D) Alignement et analyses des données
6) Séquences alignées les unes avec les autres sur un génome de
référence. L’appareil indique l’appariement des séquences et repère
les séquences qui se chevauchent-> Génome prêt pour être
analysé.
Les différents clusters sont alignés et comparés à un génome
référence
E) Les différents séquenceurs
Il existe différents types de séquenceur. Pour réaliser un
séquençage complet du génome il faut au moins un séquenceur
« Next Seq ». Si on recherche quelque chose de très
particulier on peut partir sur des machines plus petites.
III. Hybridation génomique comparative sur puce (CGH-array)
CGH-array : Comparaison ADN du patient avec un ADN normal.
Tout va être réalisé en monobrin.
Les étapes :
· Marquage : ADN du patient marqué avec un fluorochrome
rouge/ ADN sain de référence avec un fluorochrome vert.
· Hybridation : Hybridation des deux ADN (en quantité
identique) sur une puce sur laquelle sont fixées des milliers de
sondes (oligonucléotides) représentative du génome.
· Lavage puis lecture de la fluorescence de chaque
« spot » par un scanner.
· Normalisation et calcul : on s’intéresse au ratio [Fluo
rouge/Fluo vert].
Interprétation : Si la couleur observée est jaune, il y a
autant de séquences vertes et rouges hybridées sur la puce :
ratio = 1 -> l’ADN est normal.
Si la couleur observée est rouge, il y a plus de séquences
rouges, ration > 1, on est ici face à une amplification sur
l’ADN rouge par rapport au vert.
Si la couleur observée est verte, il y a plus de séquences
vertes, ratio < 1, on est face à une délétion sur l’ADN rouge
par rapport au vert.
IV. Cheminement pour isoler un gène impliqué dans une
maladie
Objectif : Trouver la gêne responsable de la maladie-->
recherche des régions ou se trouve le gène.
Des milliers de variants sont trouvés par rapport à l’ADN de
référence à l’issue du séquençage.
Facteurs pour trouver le gène : (on prend ici l’exemple du
cours qui est le cas de la Leucémie myélo-monocytaire
juvénile LMMJ) :
1) Recherche dans les exomes (sélection des variants
susceptibles d’être mis en jeu dans la maladie). On sélectionne
donc les variants dans les régions codantes ou issues de
l’épissage, par l’élimination des introns.
2) Observation fréquence de la maladie dans la population
générale : La LMMJ n’est présente que chez moins de 1% de la
population, on ne sélectionne donc que les variants présents chez
moins de 1% de la population.
3) On s’intéresse également aux types de variants (SNV,
insertion/délétion…) et on élimine les variants synonymes qui ne
changent pas la fonction de la protéine.
4) On regarde mutations gain/perte de fonction : On peut
aussi utiliser le type de variant pour prédire l’effet de la
mutation : On sait que l’étiologie des LMMJ est une activation
de la voie RAS. On peut donc s’intéresser dans un premier temps aux
variants faux sens.
5) En regardant les propriétés physico-chimiques des acides
aminés, on peut éliminer les variants ne présentant pas d’écart au
niveau de ses éléments principaux. On peut raisonner sur le type de
changement d’AA. Par exemple remplacement d’un AA chargé + par un
AA non chargé peut entrainer la perte d’une liaison ionique et un
changement de conformation de la protéine.
6) Les séquences génomiques et protéiques sont plus ou moins
conservées entre les espèces. La conservation des séquences reflète
l’importance des AA. Il faut vérifier qu’elle soit bien conservée
et qu’il n’y ait pas d’anomalies à ce niveau.
7) On s’intéresse plus spécifiquement à la voie RAS (voie
impliquée dans la maladie étudiée ici): on ne trouve plus qu’un
variant. Ce variant est situé sur une séquence du génome qui code
pour PTPN11. La base a été lue 342 fois (177 fois un A (la
référence), 165 fois un G) 48% des séquences sont mutées, on
appelle ça la VAF (fréquence allélique du variant).
On réalise un western-blot pour montrer la surexpression d’un
acide aminé de PTPN11on voit que le codon 61 est
modifiésuractivation de la voie RAS
Maintenant qu’on a trouvé le variant, on cherche à savoir si la
mutation est plutôt somatique ou constitutionnelle.
Mutation constitutionnelle : présente dans toutes les
cellules de l’individu (dont les gamètes) et transmissible. Si
mutation de type constitutionnelle, toutes les cellules sont
atteintes, on va regarder la fréquence allélique de la
mutation : elle est soit homozygote soit hétérozygote
Mutation somatique : présente que dans certains tissus de
l’organisme et pas transmissible. Si mutation somatique on va
calculer la VAF (variant allele frequency), qui correspond au taux
de mutation dans le tissu touché. En effet le tissu touché ne
contient pas que des cellules mutées. On peut aussi réaliser une
biopsie dans le tissu touché ainsi que dans un tissu non touché
pour rechercher la mutation et vérifier si elle n’est bien présente
que dans le tissu touché.
A la fin on peut appliquer de nouveaux filtres pour chercher si
d’autres variants peuvent être responsable de la maladie. On
cherche les cas de : certaines mutations perte de fonction sur
les gènes suppresseurs de tumeurs / mutations gain de fonction
sur des oncogènes. On peut donc trouver des mutations
additionnelles en plus de PTPN11, aussi responsables de la
maladie.
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Ronéo 4 ED n°1 UE1 fiche
But
:
déterminer
l’
enchaînement
des
nucléotides
d’un
fragment
d’ADN
.
Permet
de
détecter
les
mutations
.
Principe
:
-
Fragmentation
de
l’ADN
génomique
et
dénaturation
-
Ligation
d’adaptateurs
à
chaque
extrémité
-
hybridation
sur
une
flow
cell
via
les
adaptateurs
-
Formation
de
cluster
(Amplification
par
pont)
-
séquençage
-
les
4
dNTP
couplés
à
une
fluorochrome
(
dATP
,
dCTP
,
dGTP
,
dTTP
)
s’incorpore
à
la
suite
d’une
amorce
qui
s’hybride
à
l’adaptateur
-
Lavage
-
prise
d’une
image
-
élimination
du
fluorochrome
-
alignement
et
analyse
des
données
Interprétation
:
chaque
image
à
chaque
cycle
détermine
la
séquence
de
chaque
cluster
.
Comparaison
avec
séquence
de
référence
Séquençage par NGS
Séquençage
d’un
seul
brin
300 cycles
Flowcell
Amplification par pont
séquençage
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
But: déterminer l’enchaînement des nucléotides d’un fragment
d’ADN.
Permet de détecter les mutations.
Principe:
Fragmentation de l’ADN génomique et dénaturation
Ligation d’adaptateurs à chaque extrémité
hybridation sur une flow cell via les adaptateurs
Formation de cluster (Amplification par pont)
séquençage
les 4 dNTP couplés à une fluorochrome (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
s’incorpore à la suite d’une amorce qui s’hybride à
l’adaptateur
Lavage
prise d’une image
élimination du fluorochrome
alignement et analyse des données
Interprétation:
chaque image à chaque cycle détermine la séquence de chaque
cluster.
Comparaison avec séquence de référence
Séquençage par NGS
Séquençage d’un seul brin
300 cycles
Flowcell
Amplification par pont
séquençage
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
44329
Exome
–
Tri des
variants
20303
2366
1386
1201
74
54
1
Variants dans des régions codantes ou épissage
Fréquence population générale <1%
Variants
faux sens
Variants
non synonymes
Variants non synonymes
Conservation
Voie RAS
44329
Exome – Tri des variants
Variants dans des régions codantes ou épissage
Fréquence population générale <1%
Variants faux sens
Variants non synonymes
Variants non synonymes
Conservation
Voie RAS
20303
54
2366
1386
1201
74
1
