La constitution de l′acide hyaluronique. Sur les polysaccharides aminés III

Volumen xxxiv, Fasciculus 111 (1951) - No. 115. 939

115. La constitution de I’acide hyaluronique. Sur les polysaccharides aminCs 1111)

par Kurt H. Meyer, J. Fellig et Ed. H. Fischer. (21 I11 51)

L’acide hyaluronique est un polysaccharide d’origine animale is016 pour la premihre fois de l’humeur vitreuse de l’ceil par Meyer & Palmer2) en 1934. I1 a Bgalement 6th preparb par la suite it partir du liquide synovial de bovid6s3), des cordons ombilicaux humainsa), de la peaus) e t d’une tumeur it virus du poulet, le sarcome de Rousa). E n 1936, Meyer et al.’) isolent du pneumococque un enzyme capable de winder l’acide hyaluronique qu’ils nomment hyaluronidase. On connaissait depuis 1928 le ((spreading factors de Duran- ReynaW) qui facilite la diffusion de virus, de toxines8) e t de substances inertes comme des colorantslo) dans le derme. Des ((spreading factors]) ont 6tB preparks it partir de testi- culess-ll), de bact6ries12) ou de venins de serpent13). En 1939 la aimilitude entre l’hyaluronidase et le ((spreading-factor)) testiculaire est d6montr6e14)ls) e t la purification de l’enzyme est entreprise16). L’enzyme intervient dans le mecanisme de I s fertilisation: se trouvant dans Ie sperme, il facilite la p6dtration du spermatozoxde dam I’oeufle). L’enzyme qui semble Bgalement intervenir dans la pathoghie de I’arthritel’), est uhilis6 en clinique parce qu’il facilite la diffusion e t la rhsorption dcs substances actives inject&esls). I1 ressort des

l) Communication 11: K. H. Meyer & D. E . Schwartz, Helv. 33, 1651 (1950). 2, K. Meyer & J . W . Palmer, J. biol. Chem. 107, 629 (1934).

K . Meyer, E. M. Smyth & M . H. Dawson, J . biol. Chem. 128, 319 (1939); A . G. Ogston & G.E.Stanier, Biochem. J. 46, 364 (1950); W . Robertson, M . W . Ropes & W . Bauer, J. biol. Chem. 133, 261 (1940).

*) K. Meyer & J . W . Pulmer, J. biol. Chem. 114, 689 (1936); E. Eichenberger, These BLle 22.6.1945; G. Blix & 0. Snellman, Ark. Kemi 19, 32 (1945); 2. Hadidian & N . W . Pirie, Biochem. J . 42, 260 (1948); J . Rogers, Biochem. J. 39, 435 (1945); R. W . Jeanloz& E. Forchielli, J. biol. Chem. 186, 495 (1950); J . Madinaveitia & M . Stucey, Biochem. J. 38, 413 (1944); D. McClean, Biochem. J. 37, 169 (1934).

5, K. Meyer & E . Chuffee, J . biol. Chem. 138, 491 (1941). s, J. H. Warren,E.C. Williams, H. E.Alburn& J.Seifter,Arch.Biochem.20,300(1949). 7, K. Meyer, R. Dubos & E. M. Smyth, Proc. SOC. exp. biol. Med. 34, 816 (1936). 8 ) F. Duran-Reynals, C. r. SOC. Biol. 99, 6 (1928). s, E . Boyland & D. McClean, J. path. a. bact. 41, 553 (1935).

lo) F. Duran-Reynuls& B. C. Hoffman, Science 72, 508 (1930); D. McClean, J.path.

11) J . Madinaveitia, Biochem. J . 32, 1806 (1938). 12) F. Duran-Reynals, J. exper. Med. 58, 161 (1933); D. McClean, J. path. a. bact.

13) F. Durun-Reynals, Science 83, 286 (1936); J. exper. Med. 69, 69 (1939). l4) E. Chain& E.S.Duthie, Nature 144,977 (1939); Brit. J.exp.Path. 21,324 (1940). 16) D. McClean, Biochem. J . 35, 159 (1941); L. Hahn, Ark. Kemi 19 A, 1 (1945);

H. Tint & R. Bogash, J. Biol. Chem. 184, 501 (1950); J . Madinaveitia, Biochem. J. 33, 347 (1939); 35, 447 (1941).

16) R. Kurzrock, S. L. Leonard & H . Conrad, Am. J. Med. I, 491 (1946); E . Eichen- berger, Gynecologia 121,298 (1946); Z.Vit. Horn. u. Ferm.Forsch. 2,126 (1948); D. McClean & I . W . Rowlands, Nature 150, 627 (1942); I . W . Rowlands, Nature 154, 32 (1944).

l7) F. Guerra, J. Pharmacol. a. exp. Therap. 87, 193 (1946); Science 1113, 686 (1946). H . Gibian, Ang. Chem. 63, 105 (1951). Bibliographie tres complete.

a. bact. 33, 1045 (1930); 34,459 (1931).

42, 477 (1936); H. J . Rogers, Biochem. J. 38, XXXIII (1944); 42, 633 (1948).

940 HELVETICA CHIMICA ACTA.

nombreux essais faits sur le ((spreading-factor)) que l’acide hyaluroniqne jouant en quelque sorte le rBle d’une nsahstancc-barrikres, est un regulateur de la permkabilitk tissulaire’). L’intkitt biologique du polysaccharide nous a incites iL aborder l’etude de sa constitution dans le cadre de nos travaux Bur les polysaccharidcs aminbs2).

On sait que l’acide hyaluronique est form6 de N-ac6tylglucosamine et d’acide glucuronique dans la proportion de 1:l. La glucosamine a B t B identifi6e cornme chlorhydrate ap rh hydrolyse acide3) et la N-ac6- tylglucossmine a pu &re isolBe aprks hydrolyse en~yrnatique~). L’acide glucuronique a 6t6 transform6 en acide saccharique par hydrolyse et oxydation nitrique du poly~accharide~) 5 ) . I1 a aussi 6t6 caract6ris6 comme sel de plomb dans un hydrolysat enzymatiques), ainsi que comme amide du trimethyl-2,3,4-cr-m6thyl-~-glucopyruronoside, et identifie par chromatographie sur papier, d’hydrolysats d’acide hyaluronique’). Cependant le mode d’enchainement des restes d’hexose n’ayant pas encore 6t6 Btabli, il nous avait paru int6ressant d’aborder ce probl&me*). Depuis lors un travail parut sur le m6me sujetg) et dont les rksultats diffbaient de ceux que nous obtenions. Nous avons done poursuivi nos recherches et le prksent travail rapporte nos conclusions.

Isolement et purif ication de l’acide h yalurolzique. Comme materiel de d6part,nous avons choisi les cordons ombilicaux

humains parce qu’ils sont relativement riches en acide hyaluronique. DiffOrentes mCthodes d’extraction e t de purification de l’acide hyaluronique ont BtB

dbcrites. Les cordons ombilicaux contenant toujours un peu de sang, certains auteurs ex- traient d’abord I’hbmine des cordons broyks par I’acide acktique afin d’obtenir un produit in~olore~)’~) . L’extraction du polysaccharide peut s’effectuer soit par de I ’ e a ~ ~ ) ~ ’ ) , par des solutions de NaC112) ou d’acktate13), soit par du phknol dilub’4). La digestion enzymatique des cordons broyks par la pepsine et la trypsine a B t B mise It profit pour faciliter l’extraction du polysaccharidel2)16). Lea mbthodes de purification comprennent une precipitation en milieu acide d’un complexe polysaccharide-protCine (mu~in-clot)~)’~) , ainsi que des prbcipitations par l’&han013)~’)~2), par 1’6thanol saturC en acetate de potassium16)’7), par la pyridine12) ou le sulfate d‘ammonium12)18). Le phknol concentr6l8) a k tk utilisk pour extraire

l) T. D. Day, Nature 166, 785 (1950). 2, K. H. Meyer & D. E. Schwartz, Helv. 33, 1651 (1950). 3, K. Meyer & J . W . Palmer, J. Biol. Chem. 114, 689 (1936). 4, L. Hahn, Ark. Kemi 22 A, 2 (1946). 6, F. E. Kendall, M . Heidelberg & M . H. Dawson, J. biol. Chem. I 18, 61 (1937). ‘I) K. Meyer, E. M . Smyth& M . H. Dawson, J. biol. Chem. 128, 319 (1939). ’) M . A . cf. Kaye & M . Stacey, Biochem. J. 48, 249 (1951). *) K. H. Meyer & J . Fellig, Exper. 6, 186 (1950). g, R. Jeanloz, Exper. 6, 52 (1950). lo) E . Eichenberger, ThGse BDle 22.6. 1945. 11) G. Blix & 0. A‘nellman, Ark. Kemi 19, 32 (1945). 12) 2. Hadidian & N . W . Pirie, Biochem. J. 42, 260 (1948). 13) K. Meyer, Phys. Rev. 27, 335 (1948). la) K. Meyer, J. biol. Chem. 176, 993 (1948). 16) S. 0. Byers, A . A . TyteZZ& M . A . Logan, Arch. Bioch. 22, 66 (1949). la) J . Rogers, Biochem. J. 39, 435 (1945). l’) S. Harris & T. N . Harris, J. Immunology 63, 233 (1949). 18) R. W . Jeanloz & E . Forchielli, J. biol. Chem. 186, 495 (1950).

Volumen XXXIV, Fasciculus 111 (1951) - No. 115. 941

le polysaccharide, et pour Bliminer les protBines, on s’est semi de l’adsorption sup l’hydro- xyde de zinc, le kaolin ou le reactif de LZoyd1)2), e t principalement de la mBthode de Sevaga).

Nous avons renonc6 B extraire l’hemine des cordons broyes par l’acide acdtique, car ce traitement nous a donne un produit final de viscosite moindre, indiquant une degradation probable du polysaccharide. Nous extrayons les cordons broyes par I’eau, et la solution d’acide hyaluronique ainsi obtenue est filtree sur Filter-Cel. Le filtrat obtenu est soumis B plusieurs prBcipitations fractionnees a differents pH, d’abord par l7ac6ttone, puis par l’6thanol sature en aektate de potassium. Le reste des proteines est Blimine par plusieurs traitements selon Sevag3). On obtient ainsi le sel de potassium de l’acide hyaluronique. L’acide libre peut &re prepare par dialyse et Blectrodialyse.

Propriek‘s de l’acide hyaluromipue. L’Blectrophorbse de l’acide hyaluronique a B t B effectube B pH 8’6.

Le diagramme obtenu indique la presence de 3 composants (fig. 1; tableau I). Le composant principal (11) migrant anodiquement a B t B identifie comme &ant I’acide hyaluronique. Le composant I, B migra- tion plus rapide, doit posseder une charge encore plus Blevee que l’acide hyaluronique et nous supposons qu’il s’agit d’un peu de polysaccharide sulfate. Le troisibme gradient (111) qui ne migre pas, n’est pas uniquement dii B la presence de sels. Nous avons en effet isole une partie de ce produit aprbs Blectrophorbse et montre qu’il s’agit d’un hydrate de carbone, par la reaction b l’anthrone (polysaccharide 111). Par chromatographie sur papier d’hydrolysats d’acide hyaluronique, on observe, en plus des spots dus b l’acide glucuronique et it la glucosamine, une tache correspondant b un hexose, probablement le glucose, qui semble provenir du polysaccharide 111.

111 I1 I -f JII I11 +

a) b) Fig. 1.

a) Acide hyaluronique, pH 8,6, p = 0,1, rising, 30 min. b) Acide hyaluronique Blectrod6cant-5 6 fois, p H 8,0, ,u = 0,1, rising, 40 min.

1) R. Meyer & J . W . Palmer, J . Biol. Chem. I 14, 689 (1936). 2) J . Rogers, Biochem. J. 39, 435 (1946). 3 ) M . 8evag, Biochem. Z . 273,419 (1934).

942 H E L V E T I C A CHIMICA ACTA.

Tableau I. Mobilite 106 em2 sec-l volt-I.

Composant

1 I1

I11

~~

Produit non Blectrod6cnnt6

Mobilit6 1 Pourcentage I

16,2 16,8 15,9 19,0 12,4 47,6 11,7 1 708 I - 1,2 35,6 - 4,4 11,o

Par dlectroddcantation rdp6tde, nous avons pu sdparer l’acide hyaluronique d’une partie du polysaccharide 111, la couche d6posBe &ant en effet enrichie en acide hyaluronique. Aprks 6 dlectrodkcan- tations, le diagramme dlectrophordtique de l’acide hyaluronique nous montre une trks faible composante due au polysaccharide I11 (fig. I). Cette mdthode est malheureusement d’un mauvais rendement et ne permet pas d’o~tenlr un produit pur.

Poids molekulaire. En se basant sur des mesures de birefringence d’6coulement et de

viscositd, Blix & Snellmanl) ont propose pour l’acide hyaluronique un poids mol6culaire (P. M.) de 200000 500000. Ces valeurs sug- gbrent quo les particules en solution sont composdes de plusieurs mold- cdes au sen8 chimique du mot, c’est-&-dire de plusieurs chaines a valence primaire. Aussi avons nous cherchd a determiner le P.M. de ces dernibres par une mdthode chimique.

En considdrant qu’il doit y avoir un seul groupe alddhydique par moldcule d’acide hyaluronique nous en avons determind le P.M. en dosant le pouvoir reducteur du polysaccharide par une mdthode stechiomdtrique. Nous nous sommes adressds B la methode de Will- stiitter & Schude12) (modification de MacLeod & Robison3)). Des essais prelimhaires nous ont montr4 que la glucurone et la N-acdtylglucosamine consomment un equivalent d’iode par mole. Nous obtenons ainsi pour un produit dont la viscositd est de l’ordre de celles obtenues par BZix& Snellmanl), un P.M. c’himipue de 23300, correspondant a un degrd de polymerisation de 56, le poids maldculaiTe de la periode constitude d’un reste acdtylglacosaminyl-glucuronique Btant de 41 7 [ sel po tassique).

iV atzcre du sucre re’dzlcteur de l’acide h yalzcronique. Nous avons constat6 que l’acide glucuronique et la N-acdtylglu-

cosamine rdagissaient diffbremment B l’acide dinitr0-3~5-salicylique dans les conditions du dosage colorimdtrique dBja utilisk par NoeZting4)

l) G. Blix & 0. LJneZlman, Ark. Kemi 19, 32 (1945). 2, R. Willsttitter & G. Schudel, B. 51, 780 (1918). 3, M . McLeod & R. Robison, Biochem. J. 23, 517 (1929). 4, K. H. Meyer, P. Bernfeld, P. Giirtler & G. Ndting, Helv. 3 I , 108 (1948).

Volumen XXXIV, Fdsciculus 111 (1951) - No. 115. 943

et Schochl) pour la determination du P.M. des composants de l’amidon. Comme l’indique la figure 2, les droites obtenues en portant l’extinction en fonction de la quantite de produit ont une pente nettement diffBrente. En d’autres termes cela indique qu’en prBsence d’acide dinitro-3,5-salicylique un Bquivalent d’acide glucuronique a un pouvoir rdducteur Bgal a celui de 2,3 Bquivalents de N-acBtylglucosamine.

Fig. 2. RBaction avec l’acide dinitro-3,5-salicylique.

0 Acide glucuronique. o N-acBtylglucosamine.

Nos essais ont montrB que le pouvoir reducteur d’un equivalent d’acide hyaluronique correspond environ B celui d’un equivalent d’acide glucuronique, alors qu’il Bquivaudrait Q une quantitB beaucoup supdrieure de N-acBtyl-glucosamine. Nous croyons pouvoir conclure de ces observations que le groupe rdducteur de l’acide hyaluronique appartient B un reste glucuronique.

Constitzctiofi. Pour determiner la structure de l’acide hyaluronique, nous l’avons

soumis a une oxydation par l’acide periodique. Nous avons constat6 une consommation de 0’08 a 0’09 moles de periodate par pBriode (3’5 4 moles de periodate par mole de polysaccharide), ce qui indique

l’absence d’attaque le long de la chaine. Les restes hexose doivent done &re lies de telle fapon qu’il n’y ait pas de groupes hydroxyle libres sup deux carbones voisins. Les restes hexose possBdant une structure pyra- nosique2), ceci n’est possible pour le reste glucuronique que si l’hydroxyle en 3 est bloqu6, c’est-&dire lib au groupe glucosaminique voisin. Quant au reste N-acBtylglucosaminique il doit, pour des raisons sem- blables, &re l i B par l’hydroxyle en 3 ou 4, selon le schema I (p. 944).

1) S. Lanslcy. M . Kooi & T. J . Schoch, Am. SOC. 71, 4066 (1949). 2, M . A . G. Kaye & M . Stucey, Biochem. J. 48, 249 (1951).


JeanZoxl) s’est prononce en faveur de la liaison par l’hydroxyle en 3 du reste de N-ac6tylglucosamine. I1 a observe qu’une mole de N-acdtylglucosamine consomme 4,7 moles de periodate, et il en a de- duit qu’il devait y avoir ((scission complBte entre les carbones 2 et 3 D. Puisque la chaine d’acide hyaluronique ne consomme pas de periodate, cette scission ne peut avoir lieu et Jeadox en a conclu que la N-ac6tyl- glucosamine devait 6tre liee en 3.

Schima I . COOH

H OH Reste d’acide glucuronique lik en 1-3.

CH,OH CHzOH H I o H ,f-0,

\‘O /I \ ’\

/ H / H -0-4 OH H?Lo\ -“A,( yL \ H NHAc H NHAc

Restes de N-acktylglucosamine li6s en 1-3 ou en 1 4 .

Nous n’avons pas pu nous rallier B l’opinion de Jealzlox. Dans nos conditions exp6rimentales une mole de N-ac6tylglueosamine ne consomme que 3,3 moles de periodate, ce qui exclut pratiquement la pos- sibilit6 d’une scission entre les carbones 2 et 3 puisque 3 moles de periodate sont n6cessaires pour la scission des liaisons entre les carbones 3-4, 4 - 5 et 5-6. I1 n’est done pas necessaire d’admettre une liaison par le carbone 3 du reste N-acetylglucosaminique, et nous avons cherch6 8, determiner le mode de liaison de ce reste en examinant la nature des produits resultant de la methanolyse de l’acide hyaluronique m6thyl6.

L’acide hyaluronique a Bt6 mkthyle par le sulfate de mdthyle A 35O. Aprh 10 mdthylations successives, nous avons obtenu un produit contenant 26,9 % de OCH, (85 % de la thhorie), que nous avons mdtha- nolys6. Le groupe N-aebtyle, qui n’est pas hydrolys6 au cours de la mdthylation, est quantitativement scind6 pendant la methanolyse comme le montre le dosage des groupes amino libres (methode de vaw SZyke). Selon le mode de liaison de la N-acdtylglucosamine dans le polysaccharide, on obtiendra soit le mdthylglucoside de la dimdthyl- 3,6-glucosamine (liaison originale en 4) ou le mdthylglucoside de la dim~thyl-4,6-glucosamine (liaison originale en 3) (schema 11). Si l’on

l) R. Jeanloz, Exper. 6, 52 (1950).

Volumen xxxw, Fasciculus 111 (1951) - No. 115. 945

soumet ces substances h l’attaque au periodate on aura (le groupe amino reagissant au periodate comme un groupe hydroxyle), dans le cas du dim6thyl-4,6-m~thylglucosaminide, une consommation d’une mole de periodate pour deux restes hexose, alors que dans le cas du dimkthyl-3,6-m&hylglueosaminide, il n’y aura aucune attaque. En

Schdm II. CH,OH CH,OH

I h NHAc H N H A ~

MBthylation, mbthanolyse

CH,OCH, C H 0 C H

H +o\ OCH,

H,CO H NH, H NH,

t Pas d’attaque par le periodate Lieu d’attaque par le periodate

traitant le produit methanolyse au periodate nous constatons qu’un seul reste hexose sur 7’8 est attaqu6. En raison de la mkthylation in- eomplkte du polysaccharide, nous consid4rons cela comme un rdsultat negatif et concluons h la prdsence du dimdthyl-3,6-mkthylglucosami- nide provenant de la N-ac6tylglucosamine like par l’hydroxyle en 4 dans le polysaccharide. La rotation optique negative indique des liaisons glucosidiques du type #?. Ceci nous permet d’attribuer h l’acide hyaluronique la constitution suivante :

Xchdma III. COOH CH,OH ~

~ H OH

Viscositt? des solutions d’acide h yaluroniyue. Les mesures de viscosite ont souvent Btd utilisbes pour contr6ler

jusqu’h quel point une dkgradation a pu &re Bvitee pendant la prk- paration de l’acide hyaluroniquel).

1) 8. Hadidian & N . W . Pirie, Biochem. J. 42, 260 (1948). 60

946 HELVET1C.I CHIMICA ACTA.

Rappelons rapidement la notation utilishel). La viscosit@ relative (qrel) est donn6e par le quotient du temps d’hcoulement de la solution sur le temps d’ecoulement du solvant. La viscositk sphcifique (qsp) s’obtient en soustrayant 1 de la viscosite relative. La valeur extrapol6e B la concentration 0 de qap/c e t designee par [q] = lim qsp/c est appelhe visco-

site limite ou viscositb intrinsi?que, I& concentration &ant toujours exprimhe en gjl00 01213. c+o

Puoss2) a montre que la viscosite d’une solution d’un polymkre Blectriquement neutre Btait beaucoup moins BlevBe que celle d’une solution d’un polymkre charg6, de P.M. semblable, et que cette der- nikre baisse fortement en presence d’hlectrolytes, jusqu’h atteindre une valeur semblable h la viseosit6 donnee par les polymkres neutres.

Nous avons pu verifier ces observations pour l’aeide hyaluronique. Laviscosite (q&) d’une solution d’aeide hyaluronique (c = 0,2 yo) tombe en effet de 29,2 pour une concentration enNaClde m/20, ii 19,4pour NaCl l-m. (fig. 3). I1 faut par consequent toujours travailler en prBsence de la m6me quantite de sels si on veut obtenir des mesures comparables.

I I

gt l2S 45 1 mokr2e’h Nac/ Fig. 3.

Viscositi: des solutions d’acide hyaluronique en fonction de la concentration en NaCI.

Pour rechercher si la grande viseosite des solutions d’acide hyaluronique Btait due a la formation d’un complexe polysaccharide-pro- tBine3) nous avons mesure la variation de la viscosite en fonction de la purete de l’acide hyaluronique. Nous avons exclusivement employ6 la methode de Sevag pour Bliminer les proteines et nous avons prelevB et analyse des Bchantillons au cours du traitement. En portant la viscositB de ces Bchantillons en fonction de leur teneur en azote, nous observons que la viscositB augmente avec la purete de l’acide hyaluronique et n’est done pas due la formation d’un complexe polysaccharide-protBine (fig. 4, p. 948).

l) I ! . H . Meyer, Natural and SyntheticHighPolymers, 2. ed., p. 32 (Interscience 1950). 2, R. M . Fuoss, Science 108, 545 (1948); J. Polym. Sc. 3, 602 (1948). 3, A. C. Ogston d3 C. E . Btanier, Biochem. J. 46, 364 (1950).

Volumen XXXIV, Fasciculus 111 (1951) - No. 115.

SchCm de la pripurution de l’acide hyaluronique.

Cordons ombilicaux humains conserves 2 4 semaines dans ac6tJone.

I I

Broy6s deux fois dans machine B hgcher.

Extraits par l’eau, 1-2 semaines ii 5 O (2 fois). Filtration sup gaze.

947

I I Rdsidu rejet6

Rdsidu rejete

Liqueur + Filter-Cel. Filtration.

Liqueur -f pH 4.5 (CH,COOH) + 2 vol. ac6tone. 1 I I I

Liqueur rejetbe Pr6cipit6 (= 10% N) redissous dans l’eau j. p H 9,0 par KOH+ 1,25 vol. 6thanol 95% satur6 en acetate de K (365g/l)

I

I I Liqueur rejetee Precipit6 redissous dans l’eau.

Repeter precipitation prkcddente.

I I

I I I

I I I

I

Liqueur rejetee PrecipitC (3,574 N) redissous dam l’eau -+ pH 7,O+ chloroforme contenant 20% d‘alcool amylique. Agitation au Vibro-Mischer.

Gel de prot6ines rejet6

Liqueur: traitement r6p6t6 6 fois.

Liqueur -f pH 9,0 (KOH) + 1,25 vol. 6thanol B 95% sature en acetate de K (365 g/l).

Hyaluronate de K (2,8-3% N).

Dialyse, Blectrodialyse, cong6lation et sechage au vide pouss6.

Liqueur rejethe

Acide hyaluronique (acide libre).

Nous avons determink la viscositd limite de l’acide hyaluronique en effectuant deux series de mesures, la premiAre en prdsence de NaCl m/20, la seconde en presence de NaCl m. (fig. 5) . La theorie prdvoit que la viseosite limite extrapolke doit Btre la, meme dans les deux cas et nous trouvons en effet deux valeurs trAs proches, soit 9,0 et 8,6. Ces valeurs sont du mBme ordre de grandeur que celles obtenues par Blix & #nellmanl).

l) G. Blix & 0. Snellman, Ark. Kemi 19, 32 (1945).


5 ri % N 44 48 $2 4J 2 $0 cone.

Fig. 4. Fig. 5. Viscosite des solutions d’acide hyaluronique en fonction de la teneur en protkines.

Viscositi: limite de l’acide hyaluronique o dans NaCl 1-rn dans NaCl0,05-m.

Part i e e xp Br im en t a1 e. Purification de l’acide hyaluronique. Les cordons ombilicaux humains qui doivent

contenir le moins de sang possible sont conserves dans 1’aci:tone. Quand ils sc sont con- venablement durcis, ils sont broyks par deux fois dans une machine A hbcher. Le brei obtenu est mis en suspension dans 3 fois son volume d’eau distillbe ( + quelques ern3 de tolukne) e t on laisse l’extraction se poursuivre pendant 1 A 2 semaines A 4 O . On filtre la masse sur plusieurs Bpaisseurs de gazc dans un grand buchner en ajoutant du NaCl(50 g/l ) pour diminuer la viscositi: e t faciliter la filtration. On extrait A nouveau le residu et reunit les filtrats. La solution rouge-brungtre est trouble e t t r h visqueuse. On ajoute environ 50 g de Filter-Cel (Celite-535, Johns Mansuille, U.S.A.) par litre de filtrat e t agite pendant 2 heurcs. On filtre la suspension sur un grand buchner dont le papier filtre a Bt6 recouvert d’une mince couche de Filter-Cel. Le filtrat est pratiquement limpide et color6 en jaune.

La liqueur est amenee A pH 4,5 par l’acide acetique glacial e t l’acide hyaluronique cst prbcipiti? on ajoutant lentement, de 4 entonnoirs B robinct e t sous bonnc agitation, 2 volumes d’arBtone B 96%. Le prkcipitk est centrifugk, triture 4 fois par de I’ethanol, 1 fois par de 1’6ther e t skchi: au vide. La poudre brun clair obtenue contient environ 40% d’acide hyaluronique et 60% de protkines (environ 10% PIT, Kjeldhal).

La poudre est dissoute dans I’eau (4 g/l) e t la solution portbe ?I pH 9 par KOH 1-n. (en solution alcaline, travailler rapidement e t 8 froid pour 6viter toute degradation d u produit). Ajouter lentement e t sous forte agitation (Vibro-Mischer, AG. fur Chemie-Appa- rutebau, Zurich) 1,25 volume d‘kthanol saturk en acetate de potassium (365 g/l). Quand tout l’bthanol a &ti: introduit on continue d’agiter pendant 15 min. e t centrifuge. Le pr6- cipiti: est trituri: 4 fois par l’ethanol, 1 fois par ]’ether, puis skchk. On le rcmet en solution dans I’eau (3g/l) e t repete la nGme pr6cipitation. Le produit obtenu contient environ 3 3 % d’azote.

I1 est dissous dans I’eau (2 g/l) e t le pH est ajust6 B 7,O. On ajoute 0,25 volumes de chloroforme contenant 20% d’alcool amylique et secoue fortement. Apres centrifugation on siphonnc la solution do polysaccharide du gel do protkines d8naturBes. Les secouages prolonges peuvent avantageusemcnt dtre remplacks par l‘agitation violente fournie par le Vibro-Mischer. On peut ainsi traiter en une fois 3 B 4 1 de solution. Les premieres agitations ne doivent pas durer plus de 3 3L 4 min. pour ne pas former un gel trop volumineux qui

Volumen XXXIV, Fasciculus 111 (1951) - No. 115. 949

pourrait entrainer des quantitks appreciables do polysaccharide. Les dernieres agitations durent de 15 B 20 min. A p e s 5 B 6 Sevag, lorsqu’il ne se forme plus qu’un voile de proteines dhnaturkes, ajuster le pH b 9,0 par KOH 1-n. et prbcipiter I’hyaluronate de potassium par 1,25 vol. d‘itthanol saturk en acetate de potassium comme pr6cbdemment. L’hyaluronate de potassium est triturk 4 fois par I’ethanol, 1 fois par ]’&her, puis s6ch6 au vide. On obtient une poudre blanche, legere et hygroscopique (2,s B 3,3% N Ejeldahl).

Afin de preparer l’acide libre, dialyser une solution d’hyaluronate de potassium dans un tube de ccCellophanex (The Visking Corporation, Chicago, U.S.A.) contre de l’eau distillee que I’on change pendant 2 B 3 jours (chambre froide). On introduit ensuite la solution dans le compartiment central d’un appareil b irlectrodialyse, les compartiments anodique et cathodique 6tant remplis d’eau distillbe. On fait passer un courant de 300 volts et on renouvelle I’eau des compartiments B l’hlectrode quand l’ampkrage atteint 60 mA environ. Quand on ne depasse plus 10 mA on arr6te I’electrodialyse et congele la solution d’acide hyaluronique dans le melange de neige carbonique et d’acktone. Evaporer l’eau au vide pousse sur silicagel. On obtient une masse blanche spongieuse se broyant difficilement et tres hygroscopique. [aJg = - 65O.

(C,,O,,H,,,NK), Calcule C 40,OO H 4,80 N 3,35 Acetyle (COCH3) 10,03% Trouv6 ,, 33,63,) ,, 4,75,) ,, 3,34 3 , 10,23x1)

Electrophorkse. Les BlectrophorBses sont effectuees B pH 8,6 (tampon Verona1 acetate

Rhction & l’anthrme. Nous avons utilisb la methode de Morris2). Electroddeantation. Nous utilisons l’appareil d’6lectrodialyse. La solution d’hyaluro-

nate de potassium (1%) est placee dans le compartiment central, les compartiments B 1’6lectrode Btant remplis d’eau distillbe. Avant de faire passer le courant (environ 150 volts et 60 mA), on ajoute 1 om3 de solution de carbonate de sodium B 5% au compartiment central. AprBs 1 A2 heures il se forme B la surface une couche limpide tandis qu’un gel tr& visqueux se dkpose au fond du compartiment. On siphonne la couche superieure e t rajoute le mdme volume d’eau en melangeant bien. Repeter 6 fois ce traitement, le dernier gel Atant conge16 et s6ch6 comme dkcrit prhcbdemment.

Chromatograp?& sur papier, des sucres. 20 mg d’acide hyaluronique sont hydrolyses en tube scellt5 au bain-marie pendant 24 heures par 1 cm3 de HCl6-n. Pour la chromatographie, nous utilisons la mbthode descendantes). Les solvants suivants B phases entiAre- ment miscibles nous ont donnit une separation satisfaisante (rhvhlation au phtalate d’anilined)) :

+NaCI, p = O,l), concentration du polysaccharide 0,75% environ.

t.-butanol 5 alcooliso-amylique. . . . . . 5 pyridine . . . . . . . . . 5 pyridinc . . . . . . . . . . 4

. . . . . . . . .

e a u . . . . . . . . . . . . 1 e a u . . . . . . . . . . . . . 1

Poids moldculaire. 1. Mdthode de Willstatter & Schudel (modification de MacLeod & Robison) : A 2 b 3cm3

de la solution neutre contenant respectivement 0,5 B 1 mg d’hexose, 40 b 50 mg d‘hyaluronate de potassium et places dans un petit flacon B peser (10 cm3), on ajoute 0,2 cm3 d’une solution de carbonate de sodium ti 5%, puis on introduit sous la surface du liquide 3 cm3 d‘une solution d’iode 0,0241. en se servant d’une petite burette munie d’un tube effiI6 (pH final 10,5 Q lo,?’). On bouche le flacon et le Iaisse B I’obscuritB B temperature ordinaire pendant 1 heure. On acidule ensuite la solution par 1 cm3 d’acide sulfurique 0.5-11. e t titre rapidement I’iode par le thiosulfate 0,l-n. en 8e servant d’une microburette B pointe effilke et en ajoutant une goutte d’une solution d‘amidon soluble peu avant la fin

l) Dosages exhcutes par A. Peisker, Brugg. ,) D. L. Morris, Sc. 107, 254 (1948).

4, S. M . Partridge, Nature 169, 443 (1949). S. M . Partridge, Biochem. J. 42, 238 (1948).


du titrage. La solution d’acide hyaluronique &ant trbs visqueuse, il faut avoir soin de bien l’agiter en ajoutant les rbactifs. Un blanc sans hexose est trait6 parallklement 8. chaque dbtermination. Pour la N-acktyl-glucosamine et la glucurone la precision du dosage est de 2%. La glucosamine consomme bien plus d‘un Bquivalent d’iode, ce qui est probablement dB au fait que le groupe amino reagit aussi avec I’hypoiodite. Des dosages similaires ont Bt6 effectuBs sur 100 mg d’hyaluronate dms 10 em3 d’eau, en doublant la quantite de carbonate.

2. Mkthode colorimktrique par l’acide dinitro-3,5-salicyliyue : Le reactif contient 1 g d’acide dinitro-3,5-salicylique, 20 cm3 de NaOH 2 4 . e t 30 g de sel de Seignette dans 100 01113. On ajoute 2 om3 de ce rkactif ti 2 cm3 d’une solution neutre contenant environ 20 mg d‘acide hyaluronique, on m61ange et chauffe au bain d‘eau & 65O pendant 60 min. On refroidit e t ajoute 20 om3 d’eau. Determiner ]’extinction au photombtre de Klett, filtre vert No. 54. On Btablit des courbes Btalon avec des quantites d6terminBes (0,25 it 2 mg) du glucurone et dc N-aeBtylglucosnmine (fig. 2).

Mktkylation de I’acide hyaluroniyuel). 5 g d’hyaluronate de potassium sont introduits dans un bellon placO dans un bain marie maintenu & 35O et dissous dans 135 cm3 do NaOH 1%. I)e 2 entonnoirs b robinet on fait couler goutte b goutte pendant 7 heures e t sous forte agitation, 35 om3 de sulfate de methyle e t 43,5 cm3 de NaOH & 30%. I1 ne faut pas que le p H tombe au-dessous de 10 (indicateur jaune d’alizarine R, virage rouge). On arrhttc l‘agitation 30 niin. aprhs que tout le reactif a 6th ajout6 puis precipite le polysaccharidc m6thyl6 par 800 cm3 d’acktone. On laisse reposer une nuit b Oo, centrifuge et lave le pr& cipit6 2 fois & l’acttone. Cette methylation est r6pBtPe 10 fois de suite; aprks la dernikrcz mbthylation, la solution est introduite dans un sac de ((Cellophane)) (The Visking Corp., Chicago, U.S.A.) et dialyshe pendant 48 heures contre de l’eau courante, puis pendant 48 heures contre de l’eau distillee. La solution est concentree au vide b 35O, puis congelke dans le m6lange neige carbonique-acBtone, e t la glace sublimee au vide pouss6 sur silicagel. La substance est ensuite skch6e au vide poussB b 65O sur P,O,. On obtient 2 g d‘une substance incolore formant des paillettes brillantes, L 26,9% de OCH, (85% de la th6orie).

Mkthanolyse du produit mdthyle‘. 250 mg d’acide hyaluronique methyl6 sont dissous dans 10 cm3 de methanol anhydre contenant 4,7% de HC1 e t chauffes b reflux au bain- marie pendant 24 heures. Le refrigerant est muni d’un tube iL silicagel. Le methanol est ensuite BvaporB au vide sur silicagel e t KOH et le produit repris 2 fois par l’eau puis con- centre B sec. La substance est ensuite sechee au vide pousse, pes6e et dissoute dans 10 om3 d’eau (solution brune) .

Ozydation au periodatel). On ajoute & 100 mg d’acide hyaluronique (acide libre) dans 5 cm3 d’eau, 5 cm3 de tampon acetate 8. p H 4,5 I-m., 10 om3 de metaperiodate de sodium (Na10,,3H20) m/45 et porte le tout & 25 om3 par l’eau. On melange e t prklbve immbdiate- ment 2 fois 1 cm3 qu’on introduit dans 2 erlenmeyers de 10 cm3. On leur ajoute 2 It 3 (31113

d’eau ainsi qu’un exchs de KI, bouche les erlens e t les garde 15 min. b I’obscurit6 L temperature ordinaire. On titre alors l’iode par le thiosulfate 0,l-n. en se servant d‘une microburette munie d’une pointe effilbc. La solution est gardke & l’obscurit6 e t & Oo. On pork sur un graphique en fonction du temps la diffhence entre la quantite de thiosulfate utilisee au temps zkro e t celle utilisBe lors des dosages ultBrieurs qu’on fait de 12 en 12 heures pendant 100 heures environ. On obtient un palier 16ghrement incline e t l’on extrapole pour le temps zero. La valeur obtenue indique la quantite de periodate consommee (1 cms de thiosulfate 0,l-n. = 0,05 ,u moles c( glycol). On fait un essai parallkle en absence de polysaccharide.

20° dans un viscosimitre d’0stwald avec 5 cm3 de solution. On utilise, sauf indication contraire, un tampon phosphate p H 7,O 0,05-m. contenant NaCl0,05-m. Temps d’8coulement du tampon: 28 secondes.

Pour mesurer l’influence des proteines sin la viscosite de l’acide hyaluronique, 100 om3 d’un extrait brut sont amen& b pH 4,7 (acide acktique) e t prOcipit6s par 250 cm3 d‘acktone. Le precipith est lave 4 fois L I’Bthanol, 1 fois b I’kther e t sQch6 au vide. I1 con-

Mesures de viscositk. Toutes les mesures ont 6th effectuhs

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1) K. H. Meyer, M . E. Odier & A . E . Siegrist, Helv. 31, 1400 (1948).

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tient 8,9% de N. La viscositb d’une solution B 0,2% de ce produit est de 16,25. L’extrait brut est trait6 plusieurs fois de suite selon Sevag e t des prises prAlev6es entre les traitements sont precipitkes e t analyshes comme indiquk plus haut. Pour suivre la variation de la viscosit6 en fonction de la teneur en azote, on la portc sur un graphique (fig. 4). Aprhs 16 swags nous trouvons une teneur en azote de 3,674 et une viscosite de 29,2. La grandc viscosit6 des solutions d’acide hyaluronique n’est donc pas due a la presencc de prothines.

L’influence du chlorure de sodium su r la viscosit6 d‘une solution B 0,20/, d’acide hyaluronique a 6t6 determinee dans une sbrie de tampons phosphate 0,05-m. de p H 7,O contenant respectivement 1-m., O$-m., 0,25-m. et 0,l-ni. de NaC1 (fig. 3).

La viscosit6 limite [q] a 6th dhterminhe par extrapolation sur une skrie de mestires effectuees des concentrations d’acide hyaluronique variant de 0,2 B 0,04%, en prbsencc de NaCl 0,05-m. ou I-m. (fig. 5). La valeur obtenue cst pratiquement la mkme dam les deux cas, soit 9,0 e t 8,6.

Nous remercions vivement MM. les Professeurs H . de WutteviEZe (Genthe), R. Rochat (Lausanne), de Bumun (Fribourg), H . Guggisberg (Berne), E. Anderes (Zurich) et E. Held (St-Gall) d’avoir rnis & notre disposition les cordons ornbilicaux.

Nour remercions la Fondatzoiz Rockefeller de son appui.

RESUM&.

lo L’acide hyaluronique de cordons ombilicaux humains a 6t4 purifie par des precipitations fractionnees, puis par des traitements selon Xevag.

2 O L’BlectrophorBse du produit montre que l’acide hyaluronique cst accompagnd de faibles quantitds d’un polysaccharide probablement sulfate et d’un polysaccharide neutre contenant du glucose (dkcele par vhromatographie sur papier).

3O Par une methode rdductomdtrique, un degre de polymdrisation de 56 a B t B trouvd pour un produit de viscosit6 limite &gal B 9, correspondant a un poids molkculaire chimique de 23 300.

4O Le groupe alddhydique libre de l’acide hyaluronique semble itppartenir a un reste glucuronique.

50 La haute viscositd des solutions d’acide hyaluronique ne peut %re attribude a la presence de protdines. Elle baisse fortement en presence de sels.

6 O Par oxydation au periodate de l’acide hyaluronique natif, ainsi que des produits resultant de la mkthanolyse du polysaecharide me- t,hyld, une structure ~(1,4)glucopyruronosido-(1,3)N-aedtyl-gluco- pyranosaminylique lui est attribuBe :

I COOK CH,OH I

I I H OH

Laboratoires de chimie organique et inorganique de I’Universitd, Genbve.

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La constitution de l′acide hyaluronique. Sur les polysaccharides aminés III