La cytométrie en flux en immunologie et en hématologie : Quelques aspects pratiques essentiels

Rev. Fr. Transfus. H6mobiol., 1989, 32, 467-481 467

TECHNOLOGIE TRANSFUSIONNELLE

La cytom6trie en flux en immunologie et en h6matologie :

quelques aspects pratiques essentiels

p a r C. Do ine l* , Ph. B o u r i n * *

* INSERM U 76, INTS, 6, rue Alexandre-Cabanel, 75739 Paris Cedex 15.

** CTSA Jean-Julliard, 1, rue du Lieutenant Raoul-Batany, 92140 Clamart.

RESUME

La cytomdtrie en flux, avec l 'appoint des anticorps monoclonaux, a contribud largement ~ l ' identification cellulaire et en particuIier dans le champ de l ' immunologie clinique et de l'hdmatologie.

Les applications de cette technique sont nombreuses, dos lors que le typage qualitati[ et l 'analyse quanti tative des populat ions de celIules du systOme immunai ta ire permet tent une aide au diagnostic et gt la thdrapeutique. Toute[ois, ces indications ndcessitent de bien cerner tous les diffdrents aspects mdthodologiques, y compris les [acteurs propres au sujet : ~ge, sexe, Ies [acteurs propres au prdtOvement sanguin : heure, quantitds, les conditions de prdparation de l'Ochantillon gt tester. Les valeurs ,, de rd[irences ,,, indispensables pour l'interpr~tation des rdsultats, n 'auront un sens que si elles sont dd[inies darts ces limites de validitd.

Les tentatives effectudes pour dd[inir une valeur biologique representative de l'dtat immuni ta ire d 'un sujet, telle que par exemple Ie rapport CD4/CD8, ne sont malheureusement plus justi[ides aujour- d 'hu i d la lumiOre des connaissances concernant les interactions cellulaires et l'hdtdrogdn~iti [onctionnelle des cellules impliqudes dans la rdponse immune .

Requ le 9 octobre 1989. Accept6 le 16 novembre 1989.

468 C. DOINEL et coll.

S UMMAR Y

Flow cytometry, supported by monoclonal antibodies, has widely contributed in the cellular identification, notably in the clinical and haematological fields.

This technique has found several applications since the qualitative phdnotyping and the quantitative analysis of the immune system's cell populations are helpful in the diagnosis and the therapy. Besides, these indications require an appropriate knowledge of several methodological aspects including factors related to the sample donor : age and sexe ; sampling : time and quantity ; and the sample preparation conditions. References values, needed for the results interpretation, have a meaning only if they are defined within these validity limits.

Previous trials have been done in order to define a biological value representative of the immunological status, such as the CD4/CD8 ratio. Infortunatly this ratio is not justified in the scope of "new knowledge concerning the cellular interactions and the fonctional heterogeneity of cells involved in the immune system.

I N T R O D U C T I O N

A la fronti~re de la recherche immunologique et de la pathologie, l'immunologie clinique est confront6e/~ la diversit6 et ~ la complexit6 des diff~rents param6tres cellulaires et mol6culaires constituants le systbme immunitaire. Deux raisons essentielles ont limit~ pendant longtemps les progr6s du diagnostic et l'aide/~ la th6rapeutique en h6matologie et en immunologie clinique : la dispersion des cellules et par cons6quent une absence de syst6matisation en tissus, et, pour certaines cellules, une morphologie quasi-identique pour des fonctions diff6rentes. Ainsi, dans le cas des lymphocytes T aucune difference morphologique ne permet de distinguer les cellules cytotoxiques des lymphocytes auxiliaires.

La biochimie, les anticorps monoclonaux, et plus r6cemment la biologie mol6culaire, par des approches diff&rentes, permettent l'identification cellulaire et apportent des renseignements fonctionnels qui facilitent le diagnostic et le suivi th6rapeutique.

Les anticorps monoclonaux constituent une m6thode de choix qui a donc &t6 largement appliqu6e pour le typage qualitatif et l'analyse quantitative des populations lymphocytaires dans les d6ficits immunitai- res g~n6tiques ou acquis [13, 32, 54, 68, 83, 83], la surveillance immunologique des greffes d'organes [34] ou de mo6lle hdmatopo'i6tique [5, 7, 11, 20, 53, 66], l'aide au diagnostic et h la d6cision th6rapeutique dans les prolif6rations lymphoYdes et my61o'ides malignes [10, 77]. Dans les maladies auto-immunes et, en dehors des leucdmies, en canc6rologie, l'int6r&t de l'immunoph6notypage rel6ve encore seulement de la recherche, il ne fournit pas d'informations utiles au diagnostic ou au pronostic.

CYTOMETRIE EN FLUX E N IMMUNOLOGIE 469

D'autres applications en pneumo-allergologie [22] et en parasitologie [67] ont 6galement 6t6 propos6es.

Enfin, il faut noter que de nombreuses tentatives d'association entre pathologie et dds6quilibre des populations lymphocytaires, exprim6 sommairement par le rappor t des cellules lymphocytaires h activit6s auxiliaire et suppressive (CD4/CD8) ont 6t6 publi6es [40].

L'int6r6t indiscutable des anticorps monoclonaux dans ces applications est grandement renforc6 par l 'association avec la cytom6trie en flux. Grfice /t l ' informatique, cette m6thode d'analyse de suspensions cellulaires sur des crit6res optiques de diffraction de la lumibre, repr6- sente un puissant outil d'acquisitions de donn6es. Elle autorise aussi, par l 'utilisation conjointe de deux, voire trois anticorps monoclonaux marqu6s par des f luorochromes diff6rents, la dissection d 'une population cellulaire en sous-ensembles ph6notypiques ou fonctionnels [49, 57].

Cependant, si l ' importante capacit6 d'acquisition des 6v6nements repr6sente un facteur favorable h la validit6 et/~ la fiabilit6 des r6sultats, la puissance d'amplification des machines constitue une arme/~ double t ranchant . I1 est donc justifi6 d ' accorder une attention particulibre g la qualit6 des 6chantillons test6s, aux phases de pr6paration et de trai tement pr6c6dant l 'analyse, aux t6moins utilis6s, /l l ' interpr6tation finale des r6sultats par rappor t aux normes 6tablies dans le laboratoire. Dans ce contexte, la mise en oeuvre de protocoles de contr61e de qualit6 inter- laboratoires est non settlement souhaitable, mais n6cessaire [52].

Darts cet article, nous ne reviendrons pas sur les principes techniques r6gissant la CMF; ils sont maintenant bien connus et en tout cas accessibles dans d 'autres articles [41, 57]. Par contre, nous souhaitons approfondir certains aspects m6thodologiques de base concernant : les pr61bvements, la pr6paration des 6chantillons sanguins et cellulaires, les r6percussions sur la valeur et la signification des r6sultats. Ceci dans le cadre des typages lymphocytaires. Enfin, nous ferons le point sur la notion de rapport CD4/CD8 qul a 6t6 souvent utilis6 comme valeur repr6sentative de l '6tat immunitaire, notion qui est raise en cause par l '6clatement des donn6es de l ' immunologie cellulaire et le d6veloppe- ment des connaissances sur les interactions cellulaires.

PRELEVEMENT ET CONSERVATION

Dans la pratique du laboratoire de routine, il est possible de pratiquer les analyses sur des pr61hvements sanguins effectu6s sur EDTA-Na 2 ou K 2 ou sur CPD [80], et conserv6s a temp6rature ambiante [29], dans un d61ai de 24 heures. Nous avons montr6 dans une 6tude comparat ive que la conservation pendant 24 h et ~ 4 o C des cellules mononucl6es pr6pa- r6es sur gradient de densit6, lav6es et suspendues en RPMI, ne modifie pas de fa~on significative la num6rat ion des lymphocytes B (CD20), et des lymphocytes T (CD4 et CD4-2H4 ou CD4-CD45 R) [12]. Par contre le pourcentage de lymphocytes portant le marqueur CD8 est significati


vement augment&, ce qui rend cette mTthodologie (Tab. I) suspecte en pratique courante, e t a justifi6 la recherche et la validation d'autres m&thodes.

Tab leau I

Influence de la conservation des cellules mononucldes pendant 24 h d 4 °C sur la numdration lymphocytaire : les cellules mononuclddes sont prealablement sdpardes sur gradient de densitd, puis les hdmaties sont lysdes. Les cellules mononuclddes ont alors dtd lavdes en PBS, et ajustdes entre 1 000 et 2 O00/mm ~en RPM11640. Puis les cellules ont dtd analysdes immddiatement (t O) ou aprds 24 h (t 24).

Les rdsuItats sont exprimds en cel lules/mm 3.

CD 20 CD 2 CD 4 CD 8 CD4 CD45R(2H4)

tO 137,9 ± 71,6 1 579,8 ± 583,8 805,6 ± 225,7 448,5 ± 325,9 400,9 :k 191 t 2 4 151,9 ± 70 1 553,7 ± 577,6 777 ± 235,2 516,6 ± 315,4 398,6 :k 176

( t24- t0) 14 ± 57,8 -26,1 ± 92,8 28,6 ± 128,1 68,1 ± 106,1 -2 ,3 ± 102,6 SignificativitT* N.S. N.S. N.S. >~ 1% N.S.

* Test de Student pour sTries appariTes quand la population cellulaire est normale, sinon test de Wilcoxon.

PREPARATION DE L'ECHANTILLON

Plusieurs protocoles techniques sont utilisables selon que le traitement par les anticorps monoclonaux est effectu& sur le prd~vement de sang total ou sur des cellules mononuclTes pr&alablemem sdpar&es.

En simple marquage, c'est-~-dire utilisant un seul anticorps, le marquage des cellules par incubation directe du sang total avec l'anticorps monoclonal est largement utilis6 et les sociTtTs productrices mettent sur le march& des kits performants. Lorsque les antigbnes ou les rTcepteurs cellulaires /~ analyser sur une population cellulaire donn+e sont 6galement prTsents sur d'autres cellules de l'Tchantillon, fl est toujours recommand6 de vdrifier que les quantitTs d'anticorps utilisTes sont en excTs par rapport au nombre de sites antigTniques globalement prfisents dans l'Tchantillon test&. Si l'analyse ne peut &tre effectu&e dans les dix minutes suivant la prTparation et la lyse des hTmaties, il est g&nTralemem possible de conserver les cellules h 4 o C et ~ l'obscuritT, apr6s centrifugation, dTcantation et remise en suspension en PBS. Aprbs l'incubation en pr&sence de l'anticorps, les cellules peuvent &tre trait&es par un agent de fixation tel que la paraformaldThyde [36, 42, 58]. Certains tampons de lyse commercialis&s contiennent ce type d'agent de fixation qui a 6galement quelque activit6 virucide et stTrilisante. Cepen- dant ce type de traitement peut interfTrer, pour certains anticorps, avec le maimien d'une bonne fixation.

FrTquemmem, l'analyse des anfig&nes lymphocytaires /~ l'aide de deux anticorps, en double fluorescence, n&cessitera l 'dimination prTala- ble des cellules polynuc166es [44]. La technique la plus courante est la prTparation des cellules mononuclT&es par sTparation sur gradient de densit6 [15]. Bien que permettant la concentration des populations cellulaires ~t analyser, cette &tape de manipulation supplTmentaire

CYTOMETRIE EN FLUX EN IMMUNOLOGIE 471

n'est pas exempte d'inconv6nients. Citons la perte de temps, le cofit du milieu de sdparation, et la possibilit6 difficilement contr61able de modifi- cation des proportions relatives des sous-populations cellulaires [23, 24, 73], en particulier si les pr616vements de sang total sont conserv6s/t 40 C pendant 24 h avant d'6tre trait6s par centrifugation en gradient de densit6 [6].

Nous devons signaler que pour l'analyse en routine de marqueurs tels que CD4 et CD8, des kits fiables d'analyse simultan6e en double fluorescence, utilisables sur sang total, sont maintenant disponibles.

R6cemment, nous avons ddvelopp6 une technique sur sang total lys6, qui est simple, rapide et reproductible. Elle a pu 6tre valid6e, non seulement pour l'analyse des populations cellulaires classiques CD3, CD4, CD8, CD20, mais aussi pour l'analyse en double fluorescence de sous- populations d6finies par les marqueurs CD3 CD8, CD3 CD57 (Leu 7), CD8 CD57 (leu 7), CD3 CD16, CD8 CD16, CD8 CDll b (leu 15) [503. La reproductibilit6 est excellente comme le montre les r6sultats bruts obtenus sur quinze 6chantillons test6s en triple (Tab. II).

Tableau II Reproductibilitd comparde des numdrations lymphocytaires mesurdes aprds traitement de l'dchantillon par lyse sur sang total (Mansour et al., 1989) et apr~s s4paration par centrffugation sur gradient de densitd, 3 Chaque valeur correspond d la m~diane (exprimde en ce l lu les /mm ) des 15 aliquotes d 'un mdme prdldvement testds en paralldle. Entre parenthdses : les coefficents de dispersion.. Les analyses

ayant dt~ effectudes en triple, nous donnons trois valeurs pour chaque marqueur cellulaire.

CD3 CD4 CD8 CD20 CD3- CD16 ÷

Lyse/sang total* 1 212 (243) 833 (215) 522 (184) 131 (55) 200 (151) 1 232 (234) 848 (190) 516 (190) 106 (49) 223 (142) 1 213 (240) 820 (224) 519 (185) 111 (56) 204 (163)

Gradient densit6 1 198(322) 819(105) 504(150) 119(64) 178(135) 1 212 (295) 777 (172) 557 (184) 180 (55) 215 (166) 1 250 (262) 829 (169) 514 (166) 82 (39) 220 (122)

* Mansour et aL, (1989).

Enfin il faut signaler les probl6mes qui peuvent se poser pour purifier les lymphocytes de sujets ayant des infections bact6riennes, lorsque les pr6parations lymphocytaires obtenues sur gradient de densit4 sont for- tement contamin6es par des granulocytes immatures [25]. Les 6chantil- lons sanguins provenant de nouveau-ntis peuvent aussi pr6senter le m~me type d'inconv6nients [3].

VALEURS DE REFERENCE

I1 est difficile de ddfinir des valeurs de r6f6rence, car elles sont d6pendantes d'un certain nombre de paramhtres techniques, tels que le choix des anticorps monoclonaux utilisds, la m6thode de ddtermination par immunofluorescence directe ou indirecte, l'analyse sur sang total ou


sur ceUules s6par6es, la mesure par monomarquage ou par marquage simultan6 avec deux anticorps.

A titre indicatif, nous donnons (Tab. III) les valeurs observ6es sur des 6chantillons sanguins pr61evfs le matin entre 8 et 9 heures et trait6s parallblement selon notre technique de lyse-sang total (Mansour et al.) et sur gradient de densit6. Ces valeurs de num6rat ion concernent les populations lymphocytaires les plus cou ramment suivies, elles sont significativement identiques pour certains marqueurs , mais ce n 'es t pas touj0urs le cas, car les techniques de s6paration sur gradient de densit6 induisent des s61ections pour certaines populations cellulaires [6, 24, 50, 73].

Tab leau III

Valeurs de r~f~rences, exprim~es en ce l lu les /mm 3 : m~diane et (valeurs extremes), des populations lymphocytaires courantes mesur~es sur 42 sujets sains de moyenne d'dge 38 ans (22 ~ 59 ans). Les pr~ldvements effectu~s entre 8 et 9 heures, ~taient test~s en immunofluorescence directe, paralldlement sur le sang total lys~ (Mansour et aL, I989) et sur les celIules mononuc l~es prdpar~es par centrifuga-

tion sur gradient de densitY.

Lyse/sang total*

Cellules mononu- c166es

[.yrnphocytes B

CD20

131 (38-443',

101 (27-295

Lymphocytes T

CD3 CD4 CD8

1 149 (590-1 87 )717 (323-1 265,480 (192-1 121

1 132 (620-1 92 )732 (316-1 336,472 (193-1 24(

* Mansour et al., (1989).

Cellules NK

CD CD5T CD3 CD16 ÷

)102 (11-359 213 (56-606)

b118 (14-297 223 (45-604

Pour les 4tudes en double marquage, il est r ecommand6 de proc6der dans tous les cas /~ une 6tude comparat ive pr6alable. En effet, si les d6terminants reconnus par les anticorps rnonoclonaux sont situ6s ~t proximit6 Fun de l 'antre sur la membrane , la fixation des anticorps peut &re limit6e par emp6chement st6rique. De plus, la fixation de l 'un des anticorps peut inhiber, voire amplifier la fixation du second, ainsi l'activation par un anficorps CD3 fera apparakre des marqueurs d'activation. Le marquage par deux, et a fortiori par trois anticorps, oblige ~ un min imum de contr61es pour validation: incubation des cellules avec chacun des anticorps seul, incubations successives avec les diff6rents anticorps, incubation avec les deux anticorps simultanhment.

De nombreux autres facteurs interviennent 6galement, et ne peuvent &re n6glig6s dans les 4tudes comparatives. Chez le sujet sain adulte, il faudra, si l 'on veut interpr6ter des r6sultats dans tm contexte pathologi- que, consid6rer les valeurs en fonction de l'gtge et du sexe [64]. Nous donnons (Tab. IV) les valeurs observ6es sur un 6chantillon relat ivement restreint de sujets no rmaux hommes et femmes test6s dans des conditions identiques. I1 faut r emarquer que les valeurs rapport6es dans la litt6rature sont parfois trbs diff6rentes entre elles, en particulier relative- ment/~ l '6volution avec l'~ge [1, 17, 31, 56, 63, 78].


Tableau IV Valeurs compar~es h o m m e s - f e m m e s : dtude r~alisde sur 18 h o m m e s et 11 f emmes , d'~ge compris entre 24 et 40 ans. Rdsultats : moyenne :t: ~cart-type, exprim~s en ce l lu les /mm< Les pr~l~vements effectuds entre 8 et 9 heures, dtaient test~s en immunofluorescence directe, aprds preparation des cellules

mononucl~es par centrifugation sur un gradient de densitd.

Monocytes Lymphocytes totaux

Lymphocytes B CD20

Lymphocytes T

CD2 CD4 CD8

~Femmes 440 ± 110 1 190 ± 190 80 ± 30 1 020 ± 140 540 ± 100 360 ± 80 H o m m e s 430 ± 140 1 690 ± 630 160 ± 70 1 450 ± 540 730 ± 220 600 ± 340

Dans le cadre transfusionnel, il saut savoir que le don de sang total et la cytaph6rbse sont des pararn~tres qui peuvent interf6rer sur les nurn6rations lyrnphocytaires. Ainsi quelques auteurs ont signal6 une baisse significative des lymphocytes circulants chez les sujets sournis des cytaph6r6ses [43, 79]. Darts une 6tude r6trospective portant sur 312 donneurs et sur pros de 5 ans, Le Frangois et al., 1986, trouvent une diminution significative des lyrnphocytes T (23,8 %, p < 0,01). Celle-ci, qui sernble toucher anssi bien les lyrnphocytes CD4 que CD8, est observ6e apr6s le 6 e don et d6pendrait donc davantage du nornbre de cytaph6rbses que de leur fr6quence. II n'est pas non plus indiff6rent d'utiliser comrne t6rnoins de r6f6rence des tubes-6chantillons pr61ev6s en fin de don de sang total, c'est-h-dire apr6s une ponction d'environ 400 ml de sang total. Pour avoir 6t6 confront6 h des discordances inter-essais, nous avons entrepris une 6tude comparative rapport6e dans le t ab leau V, qui montre une diminution corr616e des rnonocytes et des lyrnphocytes totaux. Celle-ci affecte surtout les lyrnphocytes T, et en part±culler les CD8 [55].

Tableau V Influence du don de sang sur la numdration lymphocytaire : la numdration est real±sale sur sang total, en immunofluorescence directe avec des ant±corps monoclonaux FITC. Les r~sultats sont exprim~s en c e l l u l e s / m m 3 ± un dcart-type. Cette dtude comparative a ~td effectude sur 24 sujets diff~rents, s a u l la

numdration des lymphocytes B (n x 14).

Monocytes

Avant le don 540 ± 170 Apr6s le don 430 ± 150 Significativit6* p < 0,01 Diminution (%) 20 ± 10

Lymphocytes totanx

1 560 ± 450 1 240 ± 360

p < 0,01 20 ± 9

Lymphocytes B CD20

110 ± 50 100 ± 60

N.S.

Lymphocytes T

CD2 CD4 CD8

1 260 ± 390 660 ± 250 470 ± 180 1 010 ± 310 560 ± 180 360 ± 140

p < 0,02 p < 0,1 p < 0,02 19:i- 10 13 ± 10 24 ± 13

* Test de Student pour s6ries appari6es quand la population cellulaire est normale, sinon test de Wilcoxon.

Un facteur important quant/: la valeur des r6sultats et/~ la possibilit6 de les interpr6ter est l'heure du pr616vement, puisque la num6ration des cellules lyrnphocytaires et rnonocytaires au niveau du sang pdriph6rique est sournise ~t des variations cycliques [2, 16, 45, 46, 47, 74]. L'ampleur de ces variations circadiennes ne peut &re n6glig6e dans l'interpr6tation d'un r6sultat, cornme le rnontre les r6sultats du laboratoire rapport6s dans le t ab l eau VI. Noter l'heure du pr61bvement devrait donc 6tre une

474 C. D O I N E L et coll.

Tableau VI

Amplitude journali~re (max.-min.) des variations des numdrations des cellules p~riph~riques, expri- m~e en pourcentage de la valeur journalidre moyenne ( ± Ocart-type). Etude rdalisie sur 14 hommes

sains pr~levds toutes les 4 heures, soit 7lois dans les 24 h.

Leuco- Mono- Lympho- Lymphocytes T Cellu- cytes cytes cytes B les NK

CD20 CD2 CD3 CD4 CD8 CD4 + CD3" CD45 R CD16 +

15,3 ± 6,3 1 0 ± 1( 54,9 ± 11,( 30,2 ± 7,4 19 ± 4 37,1 ± 8 25 ± 9,! 48,9 ± 10,~ 23 ± 13

attitude normale, d'autant que, selon les individus, les proportions relatives des populations lymphocytaires peuvent ~tre modifi6es de faqon variable au cours du nycth6m6re, comme nous le verrons ci-dessous/~ propos du rapport CD4/CD8. Enfin, il faut savoir que les num6rations lymphocytaires sont 6galement soumises/~ des cycles saisonniers et que l'amplitude des variations peut changer dans d'importantes proportions en particulier/~ certaines heures de la journ6es et pour des populations cellulaires telles que CD3, CD4 et NK [46].

REMARQUES SUR LE RAPPORT CD4/CD8

Dbs qu'il a 6t6 possible, grftce aux anticorps monoclonaux, de diff6rencier les lymphocytes B et T, et parmi ces derniers, ceux qui avaient un r61e effecteur (CD8 : cytotoxiques/suppresseurs) de ceux qui avaient un r61e de r6gulation (CD4 : auxiliaires), les immunologistes ont essay6 de corr61er les modifications observ6es/t certaines affections [26, 68-70]. Le rapport CD4/CD8 a ainsi 6t6 utilis6 parce qu'il 6tait cens6 refl6ter les proportions relatives des deux populations de lymphocytes T et qu'il permettait de pallier aux facteurs techniques d'erreur de num6ra- tions exprim6es en valeurs absolues ou en pourcentage de la population lymphocytaire totale.

Dbs 1980, des auteurs avaient montr~ que le rapport CD4/CD8 pouvait &tre diminu6 dans un certain nombre de pathologies virales, telles que l'h6patite B [9], les infections par le virus d'Epstein-Barr [71 ] ou le cytom6galovirus [19]. Certains ont postul6 une relation entre les modifications cellulaires exprim6es par CD4/CD8 et des 16sions h6pati- ques [39]. D'autres ont sugg6r6 l'utilit6 de CD4/CD8 pour aider ~ la discrimination entre infections virales et bact6riennes [28], et orienter les choix th6rapeutiques en urgence. En r6sum6 de nombreuses pathologies ont 6t6 associ6es avec des modifications de CD4/CD8 [8, 40]. De nombreux travaux ont 6galement 6t6 publi6s darts le domaine de la surveillance immunologique de la transplantation, rnais la valeur diagnostique de CD4/CD8 n'a pu ~tre d6montr6e [21, 38], et les recherches portent actuellement sur les marqueurs d'activation [35].

CYTOMETRIE E N FLUX E N IMMUNOLOGIE 475

700

%

Q

I III JI Q u

• CD4 [] CO8

1000

400 8h30 12h30 16h30 20h30 Oh30 4h30 8h30

heure

1,4

t,3

1,2

1,1

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

I

+,,J~ /

d / /

/ /

/

+, "%

+-,\

! " I I I " !

4- CD4/CD8

\,

8h30 t2h30 16h30 20h30 Oh30 4h30 8h30

heure

FIG. 1. - Variation individuelle des num6rafions des lymphocytes CD4 et CD8, et du rapport CD4/CD8, au cours du nycth6m6re.

Le d6veloppement de l'immunod6ficience acquise li6e aux virus de l'immunod4ficience humaine (VIH), lesquels pr6sentent un tropisme pour la mol6cule CD4, a contribu4 /t la vulgarisation de la notion de rapport CD4/CD8 [4, 14, 48, 51, 81].

476 C. DOINEL et coil.

En fait, il convient d '6tre tr6s prudent quant /~ l 'at tr ibution d 'une quelconque valeur diagnostique ou pronost ique au rapport CD4/CD8. I1 ne doit 6tre interprbt6 qu 'au regard des valeurs absolues des cellules CD4 et des cellules CD8 [8]. Les facteurs responsables de variation des cellules CD4 et CD8, individuellement ou simultan6ment, sont nombreux, /i commencer par l'~ge et le sexe [64], l 'heure de pr616vement ou la saison [2, 16, 18, 45, 46, 74], sans compter les facteurs individuels. Ainsi dans une 6tude ponctuelle por tant sur 30 sujets normaux, pr61ev6s en f6vrier, /~ 9 heures le matin, nous avons observ6 des valeurs de CD4 entre 315 et 915 cellules par m m a, avec une moyenne de 598 + 177. Les num6rat ions des CD8 6taient comprises entre 150 et 620 (moyerme 336 + 126). Ces facteurs inNviduels, actuellement non d6termin6s, sont importants puisque sur 60 sujets t6moins pr61ev6s entre 8 et 10 heures le matin, 14 % avaient un rapport CD4/CD8 inf6rieur /~ 1 (moyenne 0,75 :k 0,1). La f igure 1 mont re les variations observ6es chez un sujet appartenant/~ ce dernier groupe.

Sur le plan fondamental , l 'h6t6rog6n6it6 fonctionnelle et ph6notypi- que des sous-populations CD4 et CD8 est telle que le rappor t CD4/CD8 devient sans valeur indicative [37, 59-62, 75, 76, 84].

CONCLUSION

I1 est certain que la cytom6trie en flux est une technique tr6s performante pour l 'analyse cellulaire. A c e titre elle peut contr ibuer au diagnostic clinique et aider all suivi th6rapeutique. De plus d a m un futur proche, avec le d6veloppement des th6rapeutiques immunologiques utilisant des techniques d ' immunoadsorp t ion s61ective, des i m m u n o m o - dulateurs ou des immunosuppresseurs sp6cifiques, des anticorps monoclonaux anti- r6cepteurs ou anti-antigbnes membranai res [27, 30], la CMF sera un outil indispensable pour assurer le suivi immunologique et la surveillance th6rapentique.

Mais les aspects techniques discut6s plus haut doivent 6tre pris en consid6ration. Ainsi, afin de rendre des r6sultats utilisables pour les cliniciens, il faut d6finir un ou plusieurs protocoles standardis6s pour lesquels ont 6t6 6prouv6es les techniques de pr616vement, de s6paration cellulaire, ~ventnellement, de marquage et de lecture. Enfin, les r6sultats doivent ~tre rendus avec les valeurs normales du laboratoire, pour la technique utilis6e et en tenant compte de l'fige, du sexe du patient et si possible de l 'heure de pr61~vement.

R E M E R C I E M E N T S . - - N o u s remercions les nombreux stagiaires et chercheurs du laboratoire de cytom6trie de I'INTS, et en particulier I. Mansour, Claudine Gastal et H61bne Roquin, pour leurs contributions.


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La cytométrie en flux en immunologie et en hématologie : Quelques aspects pratiques essentiels