La lignée mastocytaire RBL : modèle expérimental in vitroet application en pharmacologie clinique

The RBL cell line: an experimental model system for fundamentaland pharmacological studies in mast cells

U. Blank a,*, N. Varin-Blank b

a Inserm unité E-0225, faculté de médecine Xavier-Bichat, 16, rue Henri-Huchard, BP 416, 75870 Paris cedex 18, Franceb Inserm U-567, département d’hématologie, institut Cochin, hôpital Cochin, 27, rue du Faubourg-Saint-Jacques, 75014 Paris, France

Reçu le 14 octobre 2003 ; accepté le 20 octobre 2003

Résumé

La lignée mastocytaire RBL a été établie en 1973. Après son adaptation à la culture in vitro et l’obtention de lignées sécrétrices (RBL-2H3),elle a constitué un modèle privilégié en recherche fondamentale et en pharmacologie clinique pour tester de nouveaux antagonistes de ladégranulation. Grâce à ce modèle, des étapes importantes dans la connaissance de la biologie du mastocyte ont été franchies. Il a notammentpermis la caractérisation précise de l’interaction de l’IgE avec son récepteur (FceRI) au niveau biochimique permettant de purifier ce récepteurde haute affinité. C’est aussi à partir de cette lignée que les sous-unités a, b et c, le constituant, ont pu été décrites et clonées. De nombreusesavancées dans l’étude des mécanismes cellulaires après agrégation des IgE liées au FceRI ont également été réalisées pour ces cellules. Plusrécemment, un modèle humanisé pour le FceRI a été développé et permet l’investigation de la fonction des IgE humaines qui ne peuvent se liersur les cellules de rongeurs. Ce modèle pourrait dans certaines applications remplacer le test de dégranulation des basophiles qui nécessitel’utilisation de sang frais. Il est probable que le modèle RBL serve encore pendant de nombreuses années pour étudier les propriétésbiologiques des mastocytes en recherche fondamentale et pharmacologique.

© 2003 Elsevier SAS. Tous droits réservés.

Abstract

The RBL mast cell line was established in 1973. After its adaptation to in vitro culture and the establishment of a histamine-secretingsubline (RBL-2H3), this cell line has been a preferential model in fundamental research on mast cells and in pharmacological studies thatevaluate the capacity of antagonists to inhibit the degranulation response. Numerous advances on mast cell biology have been achieved usingRBL cells. Notably, this model has enabled the precise biochemical characterisation of the high affinity interaction of the IgE molecule withits receptor (FceRI). It has also allowed the biochemical description and molecular cloning of the a, b and c subunits that compose the FceRIas well as the cellular mechanisms initiated by the aggregation of receptor-bound IgE by an allergen. More recently, a model expressing thehuman FceRI a chain has been obtained, which allows investigating human IgE functions, as this Ig isotype is species-specific and cannot bindto rodent receptors. It is likely that the RBL model will continue to serve for many years as a basic model system to study the biologicalproperties of mast cells in both fundamental and clinical research applications.

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Mots clés : Modèle mastocytaire ; Dégranulation ; IgE ; FceRI

Keywords: Mast cell model; Degranulation; IgE; FceRI

* Auteur correspondant.Adresses e-mail : ublank@bichat.inserm.fr (U. Blank), varin@cochin.inserm.fr (N. Varin-Blank).

Revue française d’allergologie et d’immunologie clinique 44 (2004) 51–56

www.elsevier.com/locate/revcli

© 2003 Elsevier SAS. Tous droits réservés.doi:10.1016/j.allerg.2003.10.009

1. Introduction

Il y a plus de 30 ans, en 1973, le développement d’uneleucémie basophilique a été rapportée par Eccelston et al. [1]chez un rat Wistar nourri avec de la b-chloryléthylamine, unmutagène puissant inducteur de leucémies myéloïdes et lym-phoïdes. Le fait que les tumeurs solides aient été retrouvéesdans le sang du rat a conduit à leurs attribuer une originebasophilique et les cellules ont été appelées RBL (=RatBasophilic Leukemia). Néanmoins, des études ultérieuresont clairement démontré leur origine mastocytaire. Par plu-sieurs critères (propriétés teinctorales, présence de chondroï-tine sulfate protéoglycans, présence de la chymase RMCP-II) les cellules RBL s’apparentaient en fait aux mastocytes detype muqueux [2]. La tumeur a été initialement propagée parinjection intrapéritonéale résultant dans le développementd’une nouvelle tumeur solide. Ces cellules ont finalement étéadaptées à la culture in vitro par deux équipes de manièreindépendante [3,4]. Ces deux isolats initiaux sont à la sourcede tous les travaux ultérieurs menés sur ces cellules.

En dépit de l’origine mastocytaire de ces cellules et del’expression membranaire de récepteurs de haute affinitépour les IgE (FceRI) aucun des isolats initiaux n’a montré decapacités sécrétoires. En 1976, un sous-clone capable desécréter de l’histamine après stimulation par les IgE a étécaractérisé. Ce clone (CBF-MCT) initialement décrit d’ori-gine murine [5] a finalement été réattribué originaire du rat[6] et a été appelé RBL-IV (HR+). En effet, son caryotypeindiquait qu’il dérivait d’un des quatre isolats établis auxNIH et appelés RBL-I, -II, -III et -IV [7]. Un sous-clonagesupplémentaire de la lignée RBL-IV HR+ a finalement per-mis l’isolement du clone RBL-2H3 capable de sécréter desquantités importantes d’histamine ; il reste aujourd’hui celuiutilisé dans la majorité des laboratoires [7].

Depuis son établissement, la lignée RBL a servi en recher-che fondamentale de modèle in vitro à la fois pour disséquerles mécanismes de liaison de l’IgE sur son récepteur, carac-tériser le récepteur au niveau moléculaire et à l’étude de latransduction du signal au travers du FceRI ou d’autres récep-teurs exprimés. Elle a également servi de modèle en pharma-cologie clinique. Au contraire des mastocytes ou basophilesisolés des tissus de ces cellules peuvent aisément être culti-vées en grandes quantités nécessaires aux études biochimi-ques. Plusieurs tests de dégranulation (histamine, sérotonine,b-hexosaminidase, externalisation des phosphatidylsérines)peuvent aussi être effectués facilement avec ces cellules quiadhèrent en culture aux supports plastiques [7–10]. Il existe,de plus, des variants avec des déficiences spécifiques decertains intermédiaires de signalisation qui ont permis dedisséquer les voies d’activation impliquées dans la libérationdes médiateurs inflammatoires [11,12]. Dans cette revue,nous décrirons quelques exemples critiques pour lesquels cemodèle et son utilisation en pharmacologie clinique ontcontribué à élucider des mécanismes responsables de la réac-tion allergique des mastocytes.

2. Rôle des RBL dans la caractérisation du FceRI

Après la découverte de l’IgE, de manière indépendantepar K. Ishizaka [13] et SGO Johannson et H. Bennich [14], lerécepteur de cette immunoglobuline a été activement recher-ché. K. Ishizaka et al. montrèrent tout d’abord que des sitesde fixation de l’IgE existaient sur les polynucléaires basophi-les et que l’agrégation par un antisérum des IgE liées auxcellules provoquait la dégranulation [15]. Cependant, c’estgrâce à la lignée RBL qu’une caractérisation biochimiqueplus détaillée de cette interaction a pu être effectuée. A.Kulzcycki et H. Metzger montrèrent dans ce modèle quel’IgE se lie de manière saturable avec une très haute affinité(de l’ordre de 1010 M–1) sur un récepteur appelé aujourd’huiFceRI [3]. Cette liaison de très haute affinité a permis d’ex-pliquer que le facteur anaphylactique décrit par Portier et C.Richet [16] puisse se fixer fortement à des tissus, commel’avaient montré Schultz et Dale en 1910 [17]. Le groupe deH. Metzger réussit également par un travail minutieux decaractérisation biochimique dans le modèle RBL à démon-trer que le récepteur était un complexe membranaire multi-mérique composé d’une chaîne a liant le ligand, l’IgE [18],une chaîne b [19] et deux chaînes c liées par des pontsdisulfures [20] importantes pour la signalisation. Des cultu-res extensives de ces cellules ont permis l’isolement et lapurification des différentes sous-unités afin d’obtenir desséquences peptidiques et de cloner ces différentes chaînes[21–23]. La nécessité des trois chaînes pour l’expression desADNc dans des cellules COS a finalement démontré quecelles-ci représentent l’unité fonctionnelle de ce récepteur[21].

3. Rôle des RBL dans l’analyse de la signalisation viale FceRI

En plus de leur utilisation dans la caractérisation biochi-mique et le clonage du FceRI, les cellules RBL ont rapide-ment représenté un modèle privilégié pour l’étude des méca-nismes de signalisation après agrégation par un antigène ouun allergène des IgE liées au FceRI. Un grand nombre d’étu-des initiales se sont focalisées sur la dissection du signalcalcique dont l’importance dans la réaction anaphylactiqueavait déjà été décrit en 1958 [24]. Ceci a permis notammentde corréler le signal calcique au catabolisme des phospholi-pides membranaires [25]. Grâce aux développements denouveaux indicateurs calciques fluorescents et à une mesurede la sécrétion au niveau unicellulaire par ampéromètrie uneanalyse détaillée du lien entre le signal calcique et la libéra-tion du contenu granulaire a été réalisée dans ces cellules.Ces expériences ont montré que le taux de sécrétion desmédiateurs est directement corrélé à l’amplitude des picscalciques [26].

Depuis une décennie les étapes en amont du signal calci-que ont aussi été largement disséquées notamment par l’uti-lisation du modèle RBL. Le clonage des sous-unités compo-

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sant le FceRI et leur comparaison avec d’autres récepteurs àreconnaissance antigénique tels que les récepteurs des lym-phocytes B (BCR) et T (TCR) a mis en évidence de nombreu-ses similitudes. L’analyse détaillée de la structure primaire deces récepteurs a conduit à l’identification d’un motif dans lesrégions intracytoplasmiques des chaînes b et c, appelé ITAM(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) caracté-risé par la présence de résidus tyrosines espacés de manièrerégulière [27]. Une fois phosphorylé après agrégation durécepteur, ce motif permet le recrutement de plusieurs protéi-nes tyrosines kinases qui vont amplifier la réponse en phos-phorylant à leur tour de nombreux substrats cellulaires etainsi propager le signal initié à la membrane. Après la des-cription initiale des motifs ITAM, leur phosphorylation aucours de la stimulation a été démontrée expérimentalement.Par le biais de ces motifs phosphorylés des chaînes b et c sontalors associées aux protéines tyrosines kinases lyn et syk[28–31].

Un autre motif, appelé ITIM (Immunorecepteur tyrosine-based Inhibition Motif) a également été décrit. Il est présentdans d’autres récepteurs exprimés par les mastocytes et res-ponsables d’une inhibition du signal généré. Ces récepteurscomprennent notamment le FccRIIB (Ligand IgG), legp49B1 (ligand = intégrine a5b3), le PIRB (ligand inconnu)et MAFA (ligand inconnu). Leur caractérisation a été, aumoins partiellement effectuée dans les cellules RBL [32–34].

Malgré le fait que les cellules RBL aient souvent servi demodèle initial dans l’analyse biochimique des étapes de si-gnalisation, elles présentent, cependant, certaines limitationsà cette approche. Ceci est essentiellement lié à l’état tumoralde ces cellules dont le taux basal d’activation est très élevé ;en effet, le niveau de protéines phosphorylées sur résidustyrosine, en absence de stimulation, est important dans cescellules par rapport aux mastocytes primaires tels les masto-cytes dérivés de la moelle osseuse (BMMC). Il en est demême pour l’activation de la PI3Kinase (J. Rivera, commu-nication personnelle). Ainsi, plusieurs études portent mainte-nant plutôt sur l’analyse de cellules primaires, comme lesBMMC qui présentent l’avantage d’avoir un niveau d’activa-tion basal faible et qui peuvent être aisément obtenues à partirde souris déficientes pour une molécule de signalisationspécifique dont on veut analyser le rôle. Ces cellules consti-tuent maintenant une sorte de relais aux cellules RBL pourapprofondir la signalisation dans les mastocytes.

4. La machinerie moléculaire de sécrétion

Les cellules RBL ont également été au centre d’étudesvisant à caractériser la machinerie moléculaire spécialiséedes mastocytes qui permet la sécrétion de médiateurs inflam-matoires. La lignée sécrétrice peut, en effet, comme lesmastocytes des tissus et les basophiles libérer presque toutson contenu granulaire en quelques minutes. Cette dégranu-lation implique un mécanisme d’exocytose spécialisée, appe-

lée exocytose composée ou cumulative, qui est caractériséepar la fusion d’abord des granules entre eux, puis avec lamembrane plasmique. Nos études récentes dans la lignéeRBL ont permis l’identification de nombreux effecteurs quiseraient membres de la machinerie de fusion membranairedans les mastocytes. Parmi eux, les protéines SNAREs, loca-lisées sur des membranes opposées et initialement caractéri-sées dans les terminaisons synaptiques des neurones [35,36],peuvent former un complexe multimoléculaire extrêmementstable qui catalyse la fusion par le rapprochement des mem-branes [37]. Ce complexe de fusion est composé d’une pro-téine v-SNARE (famille de protéines VAMP) qui peut s’asso-cier avec deux t-SNAREs (famille des syntaxines et SNAP23/25). Dans les mastocytes et les cellules RBL à la fois lest-SNAREs syntaxine 4 et SNAP-23 ont été impliquées dansla dégranulation [38,39]. Parmi les protéines VAMP, plu-sieurs candidats (VAMP-2 et VAMP-8) semblent être retrou-vés [36]. S’ajoutent à ces protéines SNAREs d’autres effec-teurs, tels que les protéines Munc18 capables de se lier àcertaines syntaxines [40], des petites protéines G Rab3D [41]et une kinase associée (Rak3D) [42] qui pourraient intervenirdans la régulation de ce processus en reliant cette machinerieaux mécanismes précoces d’activation cellulaire et aux mé-canismes de remaniement du cytosquelette, également cru-ciaux pour la dégranulation.

Une comparaison entre mastocytes primaires et cellulesRBL montre qu’ils expriment la même famille de moléculespour cette machinerie moléculaire. Leurs différences sontessentiellement liées à la maturation du compartiment granu-laire et sont probablement dues à la prolifération rapide descellules RBL. En effet, en fonction des stades de culture,seulement un certain pourcentage des cellules contient desgranules aux caractéristiques similaires à celles des cellulesdifférenciées avec notamment la présence de la chymaseRMCP-II (environ 2 à 10 % des cellules selon la cultureexaminée) [40].

5. Les cellules RBL en pharmacologie clinique

Les maladies allergiques sont en accroissement constantdans les pays industrialisés. Elles sont la conséquence del’exposition à des substances normalement inoffensives (al-lergènes) capables d’activer les mastocytes au travers desrécepteurs IgE. Cette réponse physiologique inappropriée estle résultat d’un déséquilibre croissant de l’adaptation dusystème immunitaire à un environnement, dans les paysindustrialisés, où l’exposition à des agents infectieux (bacté-ries, parasites, virus) est de plus en plus importante [43]. À cejour, les stratégies utilisées pour le traitement sont souventsymptomatiques ou essaient de prévenir le déclenchement dela réaction allergique en réduisant le risque d’exposition àl’allergène.

Une recherche active, ayant pour but de définir des inhibi-teurs pharmacologiques qui interviendraient directementdans l’activation cellulaire, existe depuis de nombreuses an-nées. Depuis leur adaptation à la culture in vitro et la dériva-

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tion de clones sécréteurs, les cellules RBL-2H3 constituentun modèle privilégié dans ces investigations de pharmacolo-gie clinique, elles permettent notamment d’évaluer l’effet decertains dérivés chimiques sur la dégranulation du mastocyte[44–47]. À cette fin, différents tests de sécrétion de média-teurs inflammatoires, développés dans ces cellules, permet-tent un criblage rapide et efficace d’un grand nombre desubstances. Leurs cibles sont différents intermédiaires desvoies de signalisation qui sont bien caractérisées dans cescellules.

Une des stratégies utilisées est d’empêcher la liaison del’IgE à son récepteur et, dans le cas où l’IgE est déjà liée,d’inhiber l’agrégation allergène dépendante. La premièreapproche a déjà permis la mise en place d’une immunothéra-pie des maladies allergiques en utilisant des anticorps huma-nisés anti-IgE bloquants [48]. Dans sa phase initiale, cettestratégie a été fonctionnellement évaluée dans les cellulesRBL transfectées avec la chaîne a du FceRI humain (voirprochain chapitre) [49]. La seconde approche, fondée surl’inhibition de l’agrégation des récepteurs, a récemment étédéveloppée en utilisant un ligand bivalent rigide. Ce ligandempêche la fixation de l’allergène natif ; il permet cependantune réponse de phosphorylation, mais est incapable de stimu-ler une réponse calcique [50]. Ainsi le développement deligands de hautes affinités bivalents et rigides avec une spé-cificité allergénique connue pourrait être une nouvelle appro-che pour prévenir certaines allergies monospécifiques.

Les stratégies actuelles visent non seulement à bloquer lesétapes initiales de fixation du ligand et de l’agrégation maischerchent également des moyens d’interférer avec les diffé-rentes étapes de signalisation. Parmi les molécules identi-fiées, en utilisant la lignée RBL, il y a par exemple l’agentpharmacologique ER 27319 qui inhibe fortement l’activationde la protéine tyrosine kinase syk en empêchant son recrute-ment aux motifs ITAM de la chaîne c [51]. Ceci conduit à unblocage de la dégranulation et de la production du TNFa dansles cellules RBL et les mastocytes primaires. Bien que syksoit exprimée dans de nombreux lignages hématopoïétiques,le mécanisme semble être spécifique des mastocytes. Eneffet, cet inhibiteur pharmacologique reste inefficace dansdes cellules B stimulées par le BCR recrutant syk via lesITAM de la sous-unité Igb. Le composé ER 27319 sembledonc cibler spécifiquement l’interaction de syk avec lachaîne c du FceRI.

D’autres moyens d’interférer dans les mécanismes designalisation sont possibles et ont, dans certains cas, déjà ététestés dans les cellules RBL. Ces approches pourraient ciblervirtuellement chacune des voies menant à la sécrétion demédiateurs inflammatoires donc non seulement les protéinesdu complexe lié aux récepteurs mais aussi d’autres kinases,des molécules adaptatrices et les intermédiaires de la sécré-tion. Le défi reste à trouver des molécules pharmacologiquesde petite taille pouvant interférer de manière suffisammentspécifique avec l’activation des mastocytes.

6. Les cellules RBL-huFceRI, un modèle pour étudierla fonction de l’IgE humaine

La liaison de l’IgE chez l’homme est spécifique d’espèce.Ceci signifie que les IgE provenant du sérum de patientsallergiques ne peuvent pas se lier aux cellules RBL de rat. Àce jour, il n’existe pas de lignée mastocytaire humaine. Ainsiles tests fonctionnels reposent sur l’utilisation de polynu-cléaires basophiles et nécessitent des cellules fraîchementprélevées du sang. Les autres études physiopathologiquesreposent sur des dosages immunochimiques ou encore destests cutanés directement chez les patients (test Prick) afind’évaluer la spécificité et la fonctionnalité de leurs IgE [52].Ces derniers examens ne peuvent être effectués qu’avec desallergènes déjà bien caractérisés et ne sont donc pas toujoursapplicables en recherche fondamentale. Il y a environ dixans, plusieurs équipes ont réussi à établir des lignées RBL-2H3 transfectées avec la chaîne a du FceRI humain [53–55].La chaîne a humaine est capable de s’associer aux sous-unités endogènes du FceRI de rat. Il y a alors expression soitde récepteurs complets ahu(bc2)rat soit de récepteurs incom-plets ahu(c2)rat , mais tous confèrent à la cellule RBL unespécificité de liaison pour les IgE humaines [56].

L’expression de ce récepteur chimérique permet de testerles IgE sériques de patients allergiques dans un test de dégra-nulation après sensibilisation avec un allergène auquel ilssemblent répondre. Un de ces transfectants a été utilisé pourévaluer la capacité d’un anticorps anti-IgE humaine à inhiberla fonctionnalité des IgE sériques de patients allergiques. Cetanticorps a récemment eu l’approbation de la FDA améri-caine (Food and Drug Administration) dans le traitement decertaines affections asthmatiques.

Bien que ces transfectants RBL humanisés pour le FceRIaient pu être ponctuellement utilisés, ils ne peuvent actuelle-ment pas remplacer complètement ou se substituer aux testsde dégranulation des basophiles. Un des problèmes inhérentsà leur utilisation reste le relativement faible niveau d’activa-tion de ces cellules. La raison en est que la majeure partie desrécepteurs exprimés à la surface sont sous la forme incom-plète ahu(c)2rat. La chaîne b, absente de ces complexes a étémontrée primordiale à l’amplification de la réponse de signa-lisation [57]. Un autre problème lié à cette utilisation est latoxicité de séra humains sur ces cellules ce qui nécessite desdilutions importantes pour les essais de culture in vitro. Cesraisons nous ont récemment amené à développer un nouveautransfectant qui, après plusieurs sous-clonages, possède unetrès grande sensibilité fonctionnelle. Cette dernière est ac-quise par incubation pendant 48 heures des IgE sériquesdiluées en présence de l’eau lourde (D2O), un agent quipermet d’amplifier la capacité de signalisation [49]. Ce trans-fectant, appelé RBL-2H3.E5.D12.8 a déjà été utilisé pourévaluer les propriétés fonctionnelles d’IgE sériques de plu-sieurs patients allergiques [58]. La capacité de dégranulationde ces cellules en présence de l’allergène spécifique est alorscomparée à des données immunochimiques afin de détermi-ner la contenance et la proportion d’IgE allergène spécifique.

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En tenant compte des limites imposées par ces tests fonction-nels (problème de toxicité de certains séra, concentration enIgE totale ou proportion très faible des IgE spécifiques parrapport aux IgE totales) nos résultats montrent qu’il existepeu de corrélation entre la contenance en IgE allergène spé-cifique et la capacité à dégranuler. Ces nouveaux résultats,bien que devant encore être confirmés sur un échantillon pluslarge et être comparés aux tests cutanés mettent encore unefois en évidence la complexité de la réponse sécrétoire.Néanmoins, la capacité d’activation du mastocyte sembledépendre de paramètres autres que la contenance et la pro-portion en IgE spécifiques. Certains facteurs présents dans lesérum pourraient altérer la capacité de liaison de l’IgE, demême l’affinité intrinsèque d’une IgE qui n’est pas évaluéedans un test immunochimique pourrait également fortementinfluencer sa capacité à interagir efficacement avec son aller-gène.

7. Conclusion

Depuis plusieurs années un certain nombre de lignéesd’origine mastocytaire ont été développées (malgré l’ab-sence notable d’une lignée humaine sécrétrice), les cellulesRBL restent cependant un modèle privilégié pour les étudesfondamentales et en pharmacologie clinique. Leur facilité deculture, leur propriété d’adhérence au plastique et la possibi-lité de culture en grandes quantités permettent de les utiliserà la fois dans des tests fonctionnels ou d’analyse biochimi-que. Le développement des lignées humanisées pour leFceRI permet également d’envisager leur utilisation en dia-gnostic en remplacement de sang frais dans certains testscomme celui de la dégranulation des basophiles. Du fait de safacilité d’utilisation ce modèle humanisé permettra égale-ment de rechercher des réactivités ou des allergènes peucaractérisés.

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