La modulation de l’apoptose dépendante du récepteur Fas :

Étude des événements précoces de la voie de signalisation

apoptotique dans un modèle de lymphocytes T humains.

UMR CNRS 5164 BordeauxPr Jean-François Moreau

Directeur de thèse : Jean-Luc Taupin

Marie Bénéteau

Présentation Nice 08/03/07

FADDDISC

Caspase 8

Apaf-1Cytochrome c

ApoptosomeCaspase 9

Caspase 3

APOPTOSE

Fas

Introduction : le récepteur Fas et sa voie de signalisation apoptotique

N

C

1

66

112

149

214

298317

CRD1

CRD2

CRD3

DM

PLAD

D’après Bidère et al., Annul Rev Immunol, 2006

Mutations du gène Fas

Maladies auto-immunes (ALPS)Cancers (lymphomes)

Itoh et al., Cell, 1991.Oehm et al., J Biol Chem, 1992.

Voie de type II

Voie de type I

c-FLIPL c-FLIPS

APOPTOSE

Voie de type II

Voie de type I

Muppidi et Siegel, Nature Immunol, 2004.

Legembre et al., Mol Cell Biol, 2005.

Legembre et al., J Immunol, 2006.

Microdomaines :

Zones compactes flottant dans la membrane plasmiqueEnrichies en certains lipides et protéines

Implication des microdomaines dans le signal Fas

Introduction : le récepteur Fas et les microdomaines membranaires

I II

Problématique :

Étude des événements précoces de la voie de signalisation apoptotique

De la résistance à l’anticorps agoniste et de l’implication de c-FLIP

Dominant-negative Fas mutation is reversed by down-expression of c-FLIP.Cancer Res. 2007 Jan 1;67(1):108-15.

I.

FasLIgM

anti-Fas

95%

Fas

Cellule Jurkat

100%Maximum d’apoptose

5%

7C11

IgFasL

Concentration (ng/ml)

0

20

40

60

80

100

0,1 1 10 100 1000

% c

ellu

les

mort

es

JKR#2

Sélection de cellules résistantes

Constatation : différence anticorps agoniste et ligand de Fas

JK77JKR#2

IgFasL

0

20

40

60

80

100

0 100 200 300 400

Concentration (ng/ml)

I. 1. Sélection de cellules résistantes

Sensibilité à différents activateurs de Fas

Résistance aux anticorps agonistes.

Sensibilité maintenue mais diminuée au FasL.

7C11

0

20

40

60

80

100

0 100 200 300 400

% c

ellu

les

mort

es

Concentration (ng/ml)

• Pas de modification de la quantité de Fas à la membrane.• Pas de différence de quantité des protéines de la voie de signalisation apoptotique.• Pas d’activation de la caspase 8 dans les Jurkat R traitées par le 7C11

EAKIDEIKNDNVQDTAEQKVQLLRNWHQLHGKKEAYDTLIKDLKK 3 4 5

DTAEQKVQLLDTAEKKVQLLnormal

mutant

I. 2. Analyse de la résistance

2.1. Séquence du récepteur Fas

Présence d’une mutation au statut hétérozygote dans le domaine de mort : Q257K

Huang et al., Nature, 1996.

Intensité de fluorescence

contrôle Fas FasQ257K

WR19L Splénocytes murins

Anti-Fas

Isotype

Jurkat

Nom

bre

de c

ellu

les Marquage Fas murin

Cellules parent

Marquage Fas humainTransfection WR19L

0 200 400

7C11

0

20

40

60

80

100

WR19LsFasL

0 50 100 1500

20

40

60

80

100

Concentration (ng/ml)

% c

ellu

les

mort

es

WR19L FasQ257K

I. 2. Analyse de la résistance

2.2. Conséquences de la mutation Q257K

Dans un contexte homozygote, le Fas Q257K ne transmet aucun signal apoptotique.

Méthode : transfection des WR19L

WR19L Fas

Dans un contexte hétérozygote, résistance à l’apoptose plus marquée avec l’anticorps qu’avec FasL et selon le niveau d’expression de la forme mutée.

> Mutation responsable du phénomène de résistance.

Nom

bre

de c

ellu

les

Hypothèse : seuil de sensibilité

FADD

Fas

Caspase 8

ARN interfére

nt

Apoptose

Mutant

c-FLIP

Apoptose Apoptose

Normal

7C11

II. 3. Restauration de la sensibilité

Inhibition de c-FLIP : analyse de la sensibilité à l’apoptose

L’inhibition de c-FLIP restaure la sensibilité à l’apoptose.(restaure l’activation des caspases et la formation du DISC)

Méthode : ARN interférent

Jurkat-R/ ARNi FLIP #1

Jurkat-R/ ARNi FLIP #2

Jurkat-R/ ARNi contrôle

Transfection stable

7C11

0

20

40

60

80

0 100 200 300 400

Concentration (ng/ml)

% A

DN

fra

gm

en

té

100

C ARNi

Jurkat-R

FLIPL -

Casp-8

FLIPs -

Conclusion et perspectives (I) :

Différences entre anticorps agoniste et FasL

Agrégation versus conformationSeuil d’activation du récepteur Fas

Implication dans la physio-pathologie des ALPS :

Syndrome multi-factoriel

Agrégation nécessaire :

- Anticorps agoniste IgM ou IgG3

- FasL soluble multimérique

Normal Mutant

7C11

Conformation importante :

Anticorps agoniste ne joue pas sur la conformation.

Perspectives :• Sensibilisation par d’autres molécules ? Ex. : banques de molécules

chimiques• Accessibilité de c-FLIP au DISC ? Immunoprécipitation

- ultracentrifugation sur gradient de saccharose- microscopie à fluorescence

De la relocalisation de Fas dans les microdomaines par l’inhibition de la PI3K

II.

Le récepteur Fas et la voie PI3K

Gajate et Mollinedo, Blood, 2001.

EdelfosineL’édelfosine induit un signal de mort dépendant

de Fas et impliquant les microdomaines.

1.

L’édelfosine est un inhibiteur de la PI3K.

LY294002Wortmannine

P-Akt

Akt

- + - + 2.

PIP3PIP2

AKTp85 p110

PI3K

P

P

PAKTVoie PI3K

Edelfosine

- +

Question : L’inhibition de la PI3K induit la relocalisation de Fas dans les microdomaines ?

• Apoptose induite par inhibition de la PI3K (LY294002 et wortmannine)• Localisation de Fas par rapport aux microdomaines

?

CEM JurkatH9 (Type I)

Type II

Edelfosine

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12

(µg/ml)

LY294002

0

20

40

60

0 20 40 60 80 100 120

10

30

50

% c

ellu

les m

ort

es

(µM)

70

concentration

Spécificité de l’inhibition

Type II Type I

CEM JK H9

P-Akt

Akt

L’inhibition de la PI3K conduit à la mort cellulaire,

préférentiellement dans les cellules de type II.

II. 1. Apoptose induite par inhibition de la PI3K

0

20

40

60

0 10 20

LY294002 Wortmannine0

20

40

0 10 20 30

% A

DN

fra

gm

en

téConcentration (µM)

Isotype Fas

CEM

CEM IRC

Intensité de fluorescence

Nom

bre

de c

ellu

les

Analyse de la sensibilité de cellules déficientes en Fas

Le signal de mort nécessite une voie Fas fonctionnelle.

sFasL

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60concentration (ng/ml)

% c

ellu

les m

ort

es

CEMCEM IRC

II. 1. Apoptose induite par inhibition de la PI3K

LY2940020

20

40

60

0 20 40 60

Wortmannine0

20

40

60

0 5 10 15 20

Jurkat FasQ257KJurkat

25concentration (µM)

% C

ellu

les m

ort

es

ContrôleAnti-FasL

0

20

40

60

80

100

% c

ellu

les

mort

es

sFasL0

20

40

60

80

100

120

ContrôleAnti-Fas

sFasL

Analyse de l’interaction entre Fas et FasL

Le signal de mort est indépendant :

- de l’expression de FasL

- de l’interaction entre Fas et FasL.

Méthode : anticorps bloquants

II. 1. Apoptose induite par inhibition de la PI3K

LY294002 LY294002Edelfosine Edelfosine

Hypothèse :

l’inhibition de la PI3K permet la relocalisation de Fas dans les microdomaines

EdelfosineLY294002

Wortmannine

PIP3PIP2

AKT

p85 p110

PI3K

P

P

PAKT

Méthode : Immunofluorescence

Anticorps anti-FasAlexaRed

CTX-FITC

MicrodomainesFas Superposition

II. 2. Localisation de Fas et des microdomaines

Inte

nsi

té d

e

flu

ore

scen

ce

Distance (unités arbitraires)

L’inhibition de la PI3K induit la colocalisation de Fas et des microdomaines.

Edelfosine LY294002 WortmannineContrôle

Technique : Linescann

IECB F De Giorgi et F Ichas

APOPTOSE

Voie de type I

Activation de la transcription

Voie de type IIPI3K

2

1

Conclusion (II) : EdelfosineLY294002, Wortmannine

Restimulation TCR

Perspectives

1. Inhibition spécifique de la PI3K ?

- Utilisation de formes inhibitrices de la p85 (cellules de type II)

- Utilisation de formes constitutivement actives de la p110 (cellules de type I)

2. Implication de l’ezrine comme adaptateur entre Fas et actine :

- Utilisation de formes tronquées de l’ezrine

- Mise en évidence du domaine de liaison à l’ezrine dans le récepteur Fas. Actine

Fas

Ezrine

Journal of Immunology, 2003

Cutting Edge:

SDS-Stable Fas Microaggregates: An Early Event of Fas Activation Occurring with Agonistic Anti-Fas Antibody but Not with Fas Ligand

Patrick Legembre, Marie Beneteau, Sophie Daburon, Jean-François Moreau, and Jean-Luc Taupin.

Des agrégats de haut poids moléculaire du récepteur Fas

C 0 15  30 60 90 120 180 Temps (minutes)

JK 77 + anticorps agoniste

Monomère Fas

Agrégats Fas250

50

Constatation : présence de formes de haut poids moléculaire de Fas.

Les agrégats de Fas

Caractéristiques : - résistants aux SDS et au -mercapto-éthanol,

- résistants à la dénaturation thermique.

Questions :

1. Apparition avec le FasL ?

2. Corrélation à l’apoptose ?

3. Limitation aux cellules Jurkat ?

?

7C11

3 0,25 0,5 1 1,5 2 3 3 0,25 0,5 1 1,5 2 3 6 0,5 1,5 3 4,5 6

250

50

Temps (h)

IgFasL 1A12C C C

% a

pop

tose

L’apparition des agrégats de Fas : - est due à l’anticorps agoniste - n’est pas indispensable à l’apoptose.

Les agrégats de Fas

1. Dans les cellules Jurkat stimulées par différents activateurs

% a

popto

se

7C11

5 0,5 2 5 0 0,5 2 5

250

50

Temps (h)

C IgFasL 7C11

5 0,5 2 5 0 0,5 2 5

C IgFasL 7C11

5 0,5 2 5 0 0,5 2 5

C IgFasL

Les agrégats de Fas

Observation du même phénomène quelque soit les lignées testées.

2. Dans plusieurs lignées lymphocytaires

Type II Type I

CEM SKW6.4 H9

Les agrégats de Fas

Lymphocytes non activés Activés

3. Dans les lymphocytes sanguins

7C11C IgFasL7C11

5 0,5 2 5 0 0,5 2 5

C IgFasL

Temps (h) 5 0,5 2 5 0 0,5 2 5

Dans les lymphocytes, les agrégats apparaissent de la même manière

et ne sont pas corrélés avec l’apoptose.

% a

pop

tose

Conclusion

1) La formation des agrégats de Fas résistants au SDS dans la lignée cellulaire Jurkat est induite par l’anticorps agoniste mais pas par le FasL, qu’il soit sous forme soluble ou membranaire.

2) Les mêmes résultats sont obtenus avec plusieurs lignées lymphocytaires et les lymphocytes sanguins.

3) L’anticorps agoniste et le FasL fonctionnent différemment.

Lymphocytes et PI3K

Analyse de la voie PI3K au cours de l’activation

P-Akt

Akt

0 1 2 3 4 5 Temps (jours)

Isolement PHA IL2

Restimulation du TCR

Restimulation

Type II Type I

Anti-CD3C

P-Akt

Akt

0 6 0,5 1 3 6 h

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 2 4 6Incubation (heures)

rati

o P

-AK

T/A

KT

0

10

20

30

C CD3% A

DN

fra

gm

enté

Analyse de la voie PI3K au cours de la restimulation

La restimulation du TCR inhibe la voie PI3K.

Lymphocytes et PI3K