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La Mort Cellulaire
en Radiothérapie
C. HENNEQUIN,Hôpital Saint-Louis, Paris
S. RIVERAGustave Roussy, Villejuif
Mort cellulaire:Définition
Mort cellulaire ou mort clonogénique:
perte de la capacité proliférative
Effet recherché en radiothérapie
Tests clonogéniques
Mort cellulaire
1/ Cellules proliférantes perte de la capacité de prolifération
Intérêt dans le traitement du cancer
Disparition des cellules clonogéniques
2/ Cellules différenciéesCellules nerveuses, musculaires, secrétoires, … Perte de la fonction
Tissus sains +++ Toxicité
Cell response to ionizing radiation
IR
DNA double strandbreak induction
DNA double strandbreak repair
Tolerance ofresidual damage
• Hypoxia• Free radical scavengers• Chromatin structure
• Cell cycle arrestto allow repair
• Repair enzymes- production in response to damage- rate and accuracy of repair
Cell lives
Cell dies
Cell death
Effets cellulaires des radiations ionisantes
-Formation de lésions sur l’ADN
- Activation de voies de signalisation
=> Expression génique modifiée
=> Synthèse/dégradation protéique
- Mutations/ aberrations chromosomiques
- Altération de la progression du cycle cellulaire
- Modifications du phénotype
- Mort cellulaire
Types de lésions crées
Lésions létales:Ne peuvent pas être réparéesEntraînent la mort cellulaire rapide
Lésions potentiellement létales (PLD)> Peuvent être réparées si les caractéristiques
Du milieu s’y prêtent
Lésions sublétales (SLD):> Peuvent être réparées si on leur laisse le temps
Concept de SLDLésion sub létale
Lésion potentiellement réparables si on laisse le temps aux réparations d’avoir lieu
1 2 3 4 5
FractionSurvivante
Heures
Délai entre deux fractions
Temps de réparationVariable d’un tissu à l’autre
RI
Réparation ad integrum
Défauts de réparation
Réparation
TempsPhasecycle
Chromosomes
Apoptose
Oncose (nécrose)
Mort différéeInstabilité génomique
TranslocationsInversions
Capture télomèresDélétions
AcentriquesDicentriques
Cassures
p53P
Sénescencep21Waf1
Evènements conduisant à la Mort cellulaire radio-induite
Autres???
Les différents types de mort cellulaire
Mort immédiate
Senescence Mort mitotiqueOncose (nécrose)
Mort différée
Apoptose
Non programmée
Programmée Non programmée Programmée
Cellules épithéliales
Fibroblastes Cell. ÉpithélialesMutations/délétions
pT53
LymphocytesThymocytes
ProstateAcini salivaires
Cryptes intestinalesCell. endothéliales
Mort immédiate
Survient quelques minutes/heures après l’irradiation
Forte dose de rayonnement
Hyperactivation de la PARP
Perte de l’intégrité membranaire, activation des lysosomes,Dégradation rapide des organites intra-cellulaires
Sénescence/ Quiescence ou arrêt en G1
Arrêt en G1 irréversible : fibroblastes
Disparition complète des cyclineset perte irréversible du pouvoir de prolifération
« Dose unique de 40 à 60 Gy »Fibroblastes métaboliquement actifs pdt de longues durées,(utilisés en cocultures comme supports)
Fibroblastes en cultureLes cell. Jeunes sont petites et fixent peu la b-Galactosidase.Les cell. agées sont grandes,Multinucléeset positives pour la b-galactosidase
Sénescence
Perte définitive de la capacité de prolifération tumorale
Mise en évidence par:
secrétion accrue de b-galactosidase
foci d’hétéro-chromatine spécifique
Impliquée dans les effets de la RT sur les cellules prostatiques
Voie métabolique:
DNA damage ----> p53 ----> p21 ----> Arrêt du cycle cellulaire
Pas de sénescence chez les P53 mutées!
Autophagie
Processus de digestion cellulaire
Dégradation lysosomale des protéines et organites
Création d’un autophagosome au sein de la cellule
contenant protéines/organites
puis fusionnant avec les lysosomes
Régulé génétiquement
autophagy-related genes
Mécanismes de mort des cellules cancéreuses
Mort cellulaire autophagiqueMort cellulaire de type 2
La mort cellulaire par autophagie
Mort cellulaire
Mécanismes principaux: Mort mitotique et Nécrose (Oncose) Apoptose
Necrose et mort mitotique Survienent quand des lésions non réparées débouchent sur des aberrations chromosomiques
(dicentriques, acentriques, …)Aux mitoses suivantes, ces aberrations conduisentÀ des « catastrophes mitotiques »
Mécanismes de mort des cellules cancéreuses
Mort cellulaire autophagiqueMort cellulaire de type 2
NécroseMort cellulaire de type 3
La mort cellulaire par catastrophe mitotique
Divisions cellulaires asymétriques
Mort mitotique
• Aberrations chromosomiques graves:- Non transmises à la descendance- Conduisent à la mort cellulaire rapide
• Aberrations « bénignes »(translocations, inversions, courtes délétions)
• Compatibles avec une survie clonogénique• Mais instabilité génomique/chromosomique• Responsables d’une mort cellulaire future• Faible potentiel clonogénique => microcolonies
Mort mitotique différée
Après irradiation,Les cellules finissent par mourirmais après un nombre variable de divisions (jusqu’à 20)(Thompson, IJRB, 1969)
Mort mitotique différée
• Secondaire à des aberrations chromosomiques transmisesRéarrangements complexes/dicentriques: Diminution de 30% et 50% à chaque mitose
• Ou acquises après quelques divisions (Instabilité génomique)Augmentation de la fréquence des mutations de novo,des aberrations chromosomiques, et de la létalité
Þ Diminution de la capacité proliférative (Plating efficiency)des cellules irradiées
De 15 à 20% par passage
(Little, IJRB, 1990; Motherhill, IJRB, 1997; Hendry, Radioth. Oncol, 2001)
Mort mitotique
• Incapacité à accomplir avec succés une mitose,
• Conséquence de l’accumulationde lésions chromosomiques non réparées
• Apparition de cellules binuclées et géantes,et de micronoyaux
• Mort cellulaire prépondérante ds les cell. Épithéliales
• Peut déboucher sur nécrose (oncose) ou apoptose
Nécrose (Oncose)Reproductive cell death-Caractérisée par sa spécificité pour les cell. proliférantes
- Augmentation de la perméabilité membranaire- Diminution rapide des synthèses protéiques- gonflement des mitochondries, puis de la cellule
-Corrélation entre oncose et:
- quantité de lésions crées sur l’ADN- aberrations chromosomiques (Ward, IJRB, 1990)
-Se traduit par un épaulement de la courbe de survie(lésions toxiques potentiellement réparables)
Incapacité pour la cell. à réparer complétement et correctement les lésions de l’ADNAnomalies biochimiques/métaboliques
NECROSE
Kerr, 1965: Observations morphologiques
• Gonflement du cytoplasme et des organites
• Accroissement de la perméabilité membranaire(entrée des colorants: éosinophilie)
• Condensation puis lyse chromatiniennesans oligomères de nucléosomes
• Perte des organites cellulaires et vacuolisation
• Infiltration par des cell. inflammatoires
La mort cellulaire par nécrose
Nécrose cellulaire
V79 irradiés à la dose de 5 Gy après 7 joursA: colonie normaleB,C: colonies irradiées
Apoptose
Décrit initialement comme une mort en Interphase(ne nécessitant pas de mitoses)
Décrite chez les lymphocytes, les cell. Seminomateuseset les ovocytes
Processus actif, necessitant la synthèse de nbres protéines
Mort programmée
Evenements déclenchantl'apoptose
- selon les types cellulaires
• Différenciation cellulaire lors du dévellopement
• Suppression hormonale ou de facteurs de croissance
• Signal de mort (récepteur FasAPO-1/CD95 des lymphocytes)
• TGF-ß, TNF, corticoïdes, …
• Perte d’adhésion (anoikis)
• DNA-damaging agents: Drogues, toxines, Rayons X, …
Apoptosis
Apoptotic signals
Initiator caspases
Effector caspases
Coactivators Inhibitors
Biochimie de l'apoptose:Activation des Endonucléases
• Endonucléases: coupent l'ADN entre les nucléosomes
=> fragments mutiples de 185 bp
=> "Apoptotic ladder" sur gel d'agarose
• Reconnaissance topologique et non d'une séquence d'ADN
• Activation: - endonucléases DNAse I et II - NUC-18 (Thymocytes)
Apoptose: vue généraleVoie extrinséque Voie intrinséque
Signals TNF-related proteins - GF withdrawal- X-rays, Chemo
Caspase activators Death effectors:FADD, TRADD
Cytochrome CRelease
Initiator caspases Caspases 8, (10) Apaf-1Caspase 9
Effector caspasesCaspases 3, (6-7)
APOPTOSE
Voie intrinséque
CytochromeC
Bcl2 Bax
Cytotoxic signals
Apaf-1
Caspase 9
Caspase 3
Apo
ptos
ome
IAPs Diablo
IAPs: Inhibiteurs de l’apoptose
La mort cellulaire par apoptose
Apoptose radio-induite
Survient classiquement dans les 48 hr suivant RT avant la mitose mort en interphase (Stephens, Rad Res, 1991)
déclenchée par les DSB (Story, IJRB, 1994)
DNA damage
Radiation sensors
P53 activationSignal transduction
P21; RbMdm2Gadd45
Growth arrest
CaspasesBaxFas
Apoptosis
Apoptose Radio-Induite
- Requiert la p53 (+++)(Kastan, Cancer Res., 1991; Kuerbitz, PNAS, 1992)
- L’irradiation accroît l’activité p53 cellulaire( Zhan, Mol Cell Biol, 1993)
- Les cellules p53 mutées seraient donc plus radio-résistantes (Lowe, Science, 1994)
Thymocytes des souris p53 -/-: pas d’apoptose radio-induite(Clarke, Nature, 1993; Lowen, Blood, 1993; Lowe, Nature, 1993)
Cell. Cryptiques intestinales: souris Nles: apoptose souris p53 -/-: pas d’apoptose
(Clarke, Oncogene, 1994)
p53 status and the Efficacyof Cancer Therapy In Vivo
Lowe, Science, 1994
Fibrosarcoma cell lines p53 +/+ or p53 -/-
Injected in nude mices
Irradiation (7Gy oy 14 Gy) or Adriamycin treatment
Death by apoptosis after irradiation or chemotherapy
7 Gy
14 Gy
Adria
Lowe, Science, 1994
p53 +/+
p53 -/-
Radiation-induced apoptosis
p53
Bax (Noxa)
Relarguage du cytochrome Cdes mitochondries
Apaf-1/casp-9
Bcl2
DNA damage outcomes
DNA-DSBATM DNA-PK
(p450, Ku 70/86)
p53
Bax Bcl2
Apoptosis
p21
G2/S/G1 delay
Repair Reproductive integrity
P53 au centre de la réponse aux dommages radio-induits
P53: gardien du génome
P53:Acteur direct de la réponse aux lésions de l’ADN
Liaison aux protéinesXPD, XPB et CSB (Hélicases)
Du Nucléotide-excision repair (NER)(Wang, Nature Genet, 1995;Leveillard, EMBO J, 1996)
Liaison aux Hélicases:WRN: Sdr de WernerBLM: Sdr de BloomRECQ4: Sdr deRothmund-Thomson
Facilite la « base excision repair »(Offer, FEBS Lett., 1999)
Action directe de la P53sur la réparation des DSBs
Réparation des DSBsSelon le statut p53
(Test de la comète en hautEt Foci H2AX en bas)
Lignée HCT116 wP53carrés noirs
Ou déficiente en p53carrés blancs
Mirzayans, IJROBP, 2006
Role de Baxdans l’apoptose radio-induite
-Augmentation p53 dépendante de Bax après RT Démontrée dans plusieurs lignées cellulaires
-Mais:- Induction d’Apoptose par p53
observée sans augmentation de Bax
- Les souris Bax -/- ont une apoptose p53 dépendante post-RT nle
Quatre voies apoptotiques
P53 --> BAX ---> Voie intrinsèque DNA damage ---> Ceramide synthase ---> Voie
intrinséque Atteinte membranaire
> ---> activation de la sphingomyélinase> ---> transformation de la sphingomyéline en céramide> ---> activation de la voie intrinséque
Activation de la voie extrinséque
Target for Radiation-induced Apoptosis:The plasma membrane ?
RT
Activation directe
de la sphingomyelinase membranaire
Ceramide Sphingomyelin
Apoptose
Voie métaboliqueDu stress
(Santana, Cell, 1996Chumura, Cancer Res, 1997)
Quatre voies apoptotiques
DNA damage
Ceramidesynthase
Ceramide
Sphingomyelinase
p53 Bax
Fas
DeathReceptor
Caspase 8Apoptose
Apoptose et Réponse à l’irradiation
Importance du phénoméne apoptotique après irradiation ?• Dépend des tissus étudiés• Très variable d’une tumeur à l’autre• par ex., les fibroblastes ne meurent pas d’apoptose
(Yanagihara, IJRB, 1995)• alors que c’est le principal mode de mort
des cell hématopoïétiques
L’induction d’apoptose semble corrélée au contrôle tumoral
Dans certaines lignées, pas de corrélationentre apoptose radio-induite et survie cellulaire(Alridge, Br J Cancer, 1995)
Comparisonof apoptotic responsein 15 different tumours
Apoptose et irradiation fractionnée
Chen, Rad Res, 1994 -
Rat embryo cells
- Survie avec apoptose: 0.53- Survie sans apoptose: 0.67
A 2 Gy:
Apres32 fractions
- Survie avec apoptose: 1.5.10-9
- Survie sans apoptose: 2.7.10-6
=> Prob. de contrôle local diminuée de 30%
Apoptose spontanéedans les tumeurs
- Rare- Dans le cancer du col utérin:
Entre 0 et 4% des cellules(Levine, Lancet, 1994, 344: 472)
-Facteur pronostique avant radiothérapie ?=> Données contradictoires
Nouvelles hypothéses
La cible: l ’ADN
La cible: membrane/cytoplasme
Bystander effect
Entose ou cannibalisme cellulairePost-Doc2
Mort cellulaire non apoptotique
Internalisation d’une cellule vivante dans une cellule vivante
Elimination de la cellule internalisée par les lysosomes de la cellule hôte
Overholtzer et al. Cell. 2007.
Pleural effusion
MUC-1b-cat
Breast tumor
b-cat
Cano et al, EMBO Molecular Medicine
(2012)
Florey et al, Nature Cell Biology (2011)
Krajcovic et al, Nature Cell Biology (2011)
Guadamillas, Journal of Cell Science (2011)
Yuan, et al, Genes and Development (2010)
Wang et al, Cell Research (2009)
Overholtzer et al, Cell (2007)
White et al, Cell (2007)
Cannibalisme cellulaire dans les tumeursPost-Doc2
Cytokeratin 5b-cat
Melanoma
Conclusion: mort cellulaire en radiobiologie
= Perte de la capacité de division et non disparition physique de la cellule!!!
Une cellule morte peut métaboliser La létalité avec la dose mais la cinétique de ↗
réparation est constante