Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon-CRCLINSERM U1052-CNRS UMR 5286. France

Muriel Le Romancer

La signalisation non génomique des œstrogènesdans les cancers du sein

39èmes journées de la Société française de Sénologie et de pathologie mammaire

8 novembre 2017, Lille

Pas de Conflit d’intérêts à déclarer

Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon-CRCLINSERM U1052-CNRS UMR 5286. France

Muriel Le Romancer

39èmes journées de la Société française de Sénologie et de pathologie mammaire

8 novembre 2017, Lille

E2/ER et cancer du sein

Les oestrogènes sont impliquées dans le développement du cancer du

sein.

70% des tumeurs sont ERα-positive: ERα est un marqueur pronostic et

une cible thérapeutique.

Cependant,environ 50% des patientes sont ou deviennent résistantes aux thérapies endocriniennes

Agents bloquant la synthèse (anti-aromatases) ou les effets

des oestrogènes (anti-oestrogènes).

Signalisation des oestrogènesSignalisation des oestrogènes

Growth factors

Chemokines

Hsp90

ER

Hsp90

Prolifération Survie cellulaire

ERE RE ERE

ERE2E2

E2

E2

ER

ERE2

E2

ER

ERE2

E2

CoRegER

ERE2

E2

CoReg

TFP

ERER

P

RE

TF

CoReg

MAPK

ERER

PP

RTK PI3KSrc

Akt

ERα

ERαE2

E2

ERα

E2

Ras

ERK1/2

Facteurs de croissance

Le Romancer M et al, Endo Rev., 2011

C4

47

PATLocalisation

à la membrane plasmique

EGFR,P56lck,p60c-src

R26

0

PRMT1 Me

S10

6S1

04

DBD LBD AF -2AF -1 HingeERα

P PP PPP P PP P PP PP

S30

5

P

Y53

7

T311

S29

4

S28

2

S10

2

S11

8

S154

S16

7

S23

6

S559

Y52

Y21

9

c-Abl GSK3

CyclinA-Cdk2

MAPK

Cdk7IKKα

MAPK

MAPK

ND

AktS6K1RSKAkt

* *

ND**CK2

PKA

c-Abl* p38 MAPK

Loca

lisat

ion

n

ucl

éai

re

AktPKAPak1

*

*CK2

Calf uterine kinase,p60c-src

**

*

K2

66

K2

68

K29

9

K30

2

K30

3

Ub

Me

Ac

Ub

SUMO-1

p300**

*Ubiquitin

Set7

Dégradation protéosomal

Stabilité

SUM

O

SUM

O

SUM

O

SUM

O

SUM

O

Ac Ac Ac Ac

P

Me

Ub

SUMO

Ac

: palmitoylation: ubiquitinylation

: sumoylation : méthylation

: acétylation : phosphorylation* : transcription

Le Romancer M, Poulard C et al., Endocr Rev., 2011

Les modifications post-traductionnelles de ERa

ERa est un nouveau substrat de PRMT1

ER

2631 180 302 553 595

R G G

260 261 262

ERa

0 5’ 15’ 60’ 24h

ERa

MCF-7 cells

input

Temps (E2)

IP : anti- mERα

A/B C D E F

AF-1 DBD Hinge LBD

Le Romancer et al, Mol Cell,2008

AdoMet

+ +- -

+ +- -

+ + - -

Coloration Coomassie

WB: anti-Met-ERa

GST- ER251-305

GST-ER251-305(R260A)

R G G

555 556 557

Anticorps spécifique de metR260

Le Romancer et al Mol Cell, 2008

Le Romancer et al,Steroids,2010

Teyssier, Le Romancer,TEM, 2010

Le Romancer et al,Endocrine rev 2011

metERa est un prérequis pour la signalisation non genomique

E2

ERa

ERa

Akt activation

PRMT1E2 (5 min)

ERa

ERa

CH3

ERa

ERa

CH3

Src

P

FAK

P P

PI3K

SrcP

FAK

P P

CH3

PI3K

PI3K

PI3KP

I3K

E2 (15 min)

ERa

ERa

ProliferationSurvie

ERα -ERα+ERα+

55% des tumeurs expriment metERa independemment

de l’expression d’ERa nucléaire

IHC : a

nti-

metE

Rα

164 tumeurs

Le Romancer et al., Mol Cell, 2008

Expression de metERa dans le cancer du sein

STRATEGIE: Etudier l’expression de metERα/Src/PI3K et p-Akt dans des tumeurs mammaires.

Outil : Proximity Ligation Assay (PLA)

PI3KSrc

Met

ERα

E2ERα

E2

Est-ce que la signalisation non génomique des

oestrogènes existe in vivo?

ERα/Src/PI3K dans les lignées tumorales (1)

MCF-7 (E2 10-8M )

PI3K

Src

ER Src

ERα/PI3K ERα/Src

ERα/Src/PI3K est localisé dans le cytoplasme

ERα/p300

PLA

ERα/PI3K

ERα/PI3K ERα/Src

ERα/met ERα

PLA

ERα DBD LBD AF -2AF -1 Hinge

HC20metER

Expression de ERα/Src/PI3K dans le sein normal

ERα/PI3K

ERα/PI3K ERα/Src

ERα/met ERα

Dots/cell

ERα/PI3K ERα/Src ERα/metERα

Sample 1 2 2 3

Sample 2 3 3 3

Sample 3 0 0 0

PLA

Expression de ERα/Src/PI3K dans le sein normal

ERα/PI3K ERα/Src ERα/metERα p-Akt

*** p<0.001

PLA IHC

ERα/PI3K 0,79*** 0,75*** 0,29***

ERα/Src 0,73*** 0,30***

ERα/metERα 0,33***

P-Akt

Poulard et al, Embo Mol Med, 2012

Expression de ERα/Src/PI3K dans 175 échantillons tumoraux

ERα/Src interaction

Test (p)0-4 dots/cells (N=79) >4 dots/cells (N=96)

N % N %

Age at diagnosis (years) Chi-2

P = 0.003< 50 16 20.3 40 41.7

>=50 63 79.7 56 58.3

Menopause Chi-2

P = 0.006ND 1 2

No 19 24.4 42 44.7

Yes 59 75.6 52 55.3

Tumor size (mm) Chi-2

P = 0.852< 20 mm 31 39.2 39 40.6

>= 20 mm 48 60.8 57 59.4

Histological grade (SBR) Chi-2

P = 0.3151 17 21.5 15 15.6

2/3 62 78.5 81 84.4

Lymph node involvement Fisher Exact

P = 0.038N0 34 43.0 42 43.8

Micro metastasis 12 15.2 4 4.2

Macro metastasis 33 41.8 50 52.1

Estrogen receptor : % marked cells Chi-2

P = 0.824ND 1 0

< 10% (ERα -) 19 24.4 22 22.9

>= 10% (ERα +) 59 75.6 74 77.1

Progesterone receptor : % marked cells Chi-2

P = 0.834ND 1 0

< 10% 28 35.9 33 34.4

>= 10% 50 64.1 63 65.6

HER2 status Chi-2

P = 0.935ND 9 1

0/+/++FISH- 60 85.7 81 85.3

++FISH+/+++ 10 14.3 14 14.7

CLINICAL P

ARAM

ETERS

175

bre

ast

tu

mo

rs

n=175ERα/Src ERα/PI3K

Poulard et al, Embo Mol Med, 2012

Une forte expression du complexe est associéeà une mauvaise survie des patientes

Confirmation des résultats dans une cohorte de 440 tumeurs mammaires (2001-2003)

Dépourvu des domaines AF-1 et AF-2

Un domaine C-Terminal unique

Localisation cytoplasmique et membranaire

Active la voie MAPK sous E2 et Tamoxifen

Wang et al, BBRC 2005, PNAS 2006

ERa36, un nouveau variant d’épissage d’ER,

acteur de la signalisation non génomique

Génération d’un anticorps anti-ERa-36

Tubulin

ERα

ERα-36

Tumor HBCx-8Tumor HBCx-12A

an

ti-E

Rα

-36

ERα-36

ERα

PR

HER2

Lignée

dérivée

Effet d’E2 sur la croissance tumorale

HBCx12A PDXHBCc-12A cells

Analyse bioinformatique du domaine C-TerminalDomain: D domain pour ERK2

ERa-36 interagit avec Erk2 active

input

GST GST-ERK2

MW

GST

GST-ERK272

55

43

34

26

ER

α-3

6/E

RK

2

0’ 5’

U1026

0’ 5’

E2 5’ E2 0’

E2 5’ E2 0’ E2 15’

E2 (Time)

P-ERK

ERK

ER

α-3

6/E

RK

2

U1026

GST GST-ERK2

Rompre l’interaction ERa-36/ERK2 pour comprendre son rôle

Input

ERα-36*ERα-36

L297A*

GST-ERK2 GST-ERK2

ERα-36*ERα-36

L297A*MW

72

55

43

34

E2 5’ E2 15’

Vecto

rC

TD

CT

D L

297A

E2 0’

ER

α-3

6/E

RK

2

ERK

P-ERK

Vector CTD CTD L297A

0’ 5’ 15’ 0’ 5’ 15’ 0’ 5’ 15’E2 (Time)

Vecto

rC

TD

ERK2/MKP3

E2 0’ E2 5’ E2 15’

CT

D L

197A

a

Vecto

rE

Rα

-36

E2 0’ E2 5’ E2 15’ E2 30’

ERK2/MKP3

P-P

XN

E2 0’ E2 5’ E2 15’

P-E

RK

P-ERK

ERK

PXN

P-PXN

0’ 5’ 15’E2 (Time)

CTD L297A

0’

Cyclin D1

P-PXN

P-ERK

PXN

ERK

5’ 15’ 0’ 5’ 15’ 0’ 5’ 15’

Vector CTD

E2 (Time)

Cyclin D1

P-PXN

P-ERK

PXN

ERK

0’ 5’ 15’ 0’ 5’ 15’

U1026

E2 (Time) 12hr 12hr 12hr 12hr 12hr

La signalisation d’ERa-36 en aval d’ERK dans les cellules

PDX traitées avec E2P

-ER

KP

-PX

NE

R

-36/S

rc

La signalisation d’ERa-36 dans les tissus

Modèle de régulation de l’activation d’ERK

MEK ERK2MPK3

E2

Src

P

E2 5 min

S126

nucleus

Cyclin D1

E2 3 min

P

PXN

ERK2 P

E2 13-15 min

Src

ERα-36

ERα-36

ERα-36

ERα-36

S126P

PXN

E2 12hrE2 7 min

Omarjee et al, Oncogene 2017

ERa-36 est un marqueur de mauvais pronostic dans le cancer du sein

IHC

ER-36

Analysis on 175 operable breast tumors from the Leon Berard Hospital (1999-2001)

Variable ER36 Low No. (%)

ER36 High No. (%)

P value

SBRGrade -Grade1-Grade2-Grade3

13(13.7%)50(52.6%)32(33.7%)

13(20%)21(32.3%)31(47.7%)

P=0.039

Variable ER36 Low No. (%)

ER36 High No. (%)

P value

Metastasis -NoMetastasis-Metastasis

73(76.8%)22(23.2%)

40(61.5%)25(38.5%)

P=0.037

Conclusions

ERα-36 pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique:

ERα-36 active et maintient la voie ERK en inhibant la

déphosphorylation d’ERK par MKP3.

metERα est un prérequis de la signalisation non génomique des

œstrogènes.

ERα/Src/PI3K est un nouveau facteur pronostic du cancer du sein.

Exprimé à la membrane des cellules tumorales et pas des cellules normales

Facteur de mauvais pronostic associé au développement de métastases

Accessible à l’extérieur de la cellule

Pas de ciblage actuellement: les anti-oestrogènes activent ERa-36

Suite des projets…

Ciblage d’ERα-36 en générant un ADC: CovERa36ADC (Covalab,

Villeurbanne).

Déterminer si la valeur pronostique d’ERa-36

est associée à un sous-type, 3ème cohorte.

Ciblage du complexe metERa/Src/PI3K dans des PDXs:

hormonothérapie + inhibiteurs de Src et de PI3K.

(Collaboration avec E. Marangoni, Institut Curie)

Acknowledgements

Olivier Trédan, CLB

Loay Kassem, Le Caire,Egypt

E. Marangoni, Curie, Paris

A. Dejaegere, IGBMC,IllkirchY. Chebaro

A BA B

PLA probe minus

PLA probe plus

A B A B

Proximity Ligation Assay (PLA)

Non genomic partners of ERaE

Rα

-36/S

rcE

Rα

-36/P

I3K

E2 0’ E2 5’ E2 15’

Src PI3K ERα-36