La technologie des fermentations...Table des matières 1.2- La production des antibiotiques par les actinomycètes 38 2-Les enzymes 39 2.1-Les amylases 40 2.2-Les glucoamylases 40

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA

RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE LARBI BEN M’HIDI OUM EL BOUAGHI

FACULTE DES SCIENCES EXACTES ET SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

DEPARTEMENT DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

Cours

La technologie des fermentations

Proposé par :

Dr. Lamia AOUAR

Destiné aux étudiants :

1ère

année Master Microbiologie Appliquée

Année universitaire 2015/2016

Il n’existe aucun domaine de l’activité humaine, que ce soit

l’industrie ou l’agriculture, l’alimentation, les problèmes de

construction ou d’habillement, le maintien de la santé humaine ou

animale et le combat contre les maladies, où le microorganisme ne

joue un rôle important et souvent dominant.

SELMAN A. WAKSMAN, 1943

Préface

Les microorganismes sont capables de croître sur une large gamme de substrats et peuvent

produire de nombreux métabolites. La technologie de fermentation est un terme générique

appliqué au processus commerciaux qui repose sur la capacité des microorganismes à

produire des molécules utiles. La majorité des microorganismes utilisés commercialement

pour réaliser des fermentations, comme des actinomycètes sont aérobies, ne poussent pas dans

des conditions anaérobies et ne réalisent pas une fermentation.

La technologie de la fermentation est née avec les premières civilisations, qui ont

exploitées les capacités des microorganismes à produire des boissons alcoolisés, du pain et du

fromage. Durant la première moitié du vingtième siècle, les productions de vin et de bière, du

vinaigre et de levure de boulangerie, sont passées des méthodes artisanales anciennes aux

techniques scientifiques établies. Ainsi, les processus microbiens à grande échelle pour

l’industrie de production des acides citrique et lactique ont été développés. Aussi, l’acétone, le

butanol et l’éthanol étaient produits par fermentation.

La seconde moitié du vingtième siècle a connu des changements considérables dans

l’industrie de la fermentation. La plupart de ces changements ont pour origine la découverte

des antibiotiques comme arme efficace contre les maladies. D’autres produits générés par les

microorganismes, incluant des vitamines, des stérols, des acides organiques, des acides

aminés, des agents aromatiques, des enzymes et des boissons ou aliments fermentés ont pris

une grande importance commerciale. En plus le développement des manipulations génétiques

a permis d’étendre le spectre des métabolites produits par des microorganismes et de

développer de nouveaux procédés.

La fermentation industrielle a donné des produits qui ont influencé directement notre

vie de multiples façons. Ces produits ont profondément changé notre vie et espérance de vie.

Il y a les produis industriels et agricoles, les additifs alimentaires, les produits

pharmaceutiques pour la santé humaine ou animale et les biocombustibles.

Ce cours a été rédigé afin de présenter aux étudiants le domaine remarquable de la

technologie des fermentations. Les quatre chapitres traitent les différents aspects de la

fermentation industrielle à savoir : l’obtention et l’amélioration des microorganismes

industriels, la description des procédés et les principaux produits de fermentation

commercialisés; ainsi que leurs utilisations dans divers domaines.

Table des matières

Préface

Chapitre 1

1-Isoler les microorganismes industriels 1

1.1-Isolement et sélection des souches microbiennes productrices d’enzymes 1

1.2-Isolement des microorganismes producteurs d’antibiotiques 2

1.2.1-Isolement des souches d’actinomycètes 2

1.2.2-L’isolement des champignons 3

2-Criblage de souches pour la recherche de nouveau antibiotiques 3

2.1-Recherche de nouveaux antibiotiques 4

2.2-Tests sur animaux 5

3-L’amélioration des microorganismes industriels 5

3.1-Mutagénèse 7

3.1.1-Agents physiques 7

3.1.2-Agents chimiques 7

3.1.3-Combinaison de traitements 8

3.2-Manipulation du génie génétique 8

3.2.1-Les protoplastes 8

3.2.1.1-Les avantages des protoplastes 8

3.2.1.2-Obtention et régénération des protoplastes d’actinomycètes 9

3.2.1.3-Fusion des protoplastes d’actinomycètes 9

3.3-L’insertion de courtes séquences d’ADN 9

3.4-Modification de l’expression des gènes 10

4- Les critères de choix d’un microorganisme industriel 10

Chapitre 2

1-Le choix des matières premières 11

2-Les éléments du milieu 12

2.1-L’eau 12

2.2-Les sources de carbone et d’énergie 12

2.2.1-Les oses et leurs dérivés 12

2.2.2-Les acides gras et leurs dérivés 13

2.3-Les sources d’azotes 13

2.4-Les sels minéraux 13

2.5-Additifs 13

2.6-Les gaz dissous 14

3-L’élaboration du milieu 14

4-Stérilisation 14

5-Composition de quelques milieux de culture industriels 15

5.1-Milieux pour production d’enzymes d’origine microbienne 15

5.2-Milieux de production d’acides organiques 15

5.3-Milieux de production d’antibiotiques 15

5.4-Milieu de production de l’endotoxine de Bacillus thuringiensis 16

5.5-Milieu de production des acides aminés 16

Table des matières

5.6-Milieux de production des vitamines 16

5.7-Milieu de production de l’acide gibbérellique (A3) 17

5.8-Milieu de production de l’éthanol. 17

Chapitre 3

1-Les fermenteurs 18

1.1-Fermenteur à agitation mécanique 18

1.2-Les fermenteurs à agitation d’air 19

1.3-Les fermenteurs à boucles 19

2-Les critères de choix d’un procédé de fermentation 20

3-Systèmes de fermentation 20

3.1-Systèmes en phase liquide 20

3.1.1-Culture en discontinu 20

3.1.2-Culture discontinue alimentée 21

3.1.3-Culture continue 22

3.1.3.1-La technique du turbidostat 22

3.1.3.2-La technique du chémostat ou bactogène 22

3.2-Systèmes en phase solide 24

3.3-Systèmes immobilisés 26

4-Mesure et contrôle des paramètres de culture 26

4.1-Les paramètres physico-chimiques 28

4.2-Les paramètres microbiologiques 30

4.2.1-Population cellulaire 30

4.2.2-Les paramètres de cultures à contrôler 31

5-Paramètres utilisés lors de la production 32

5.1-Paramètres de croissance 32

5.2-Cinétique d’apparition des produits, quantification 33

5.3- Bilan l’apparition des produits de fermentation 34

Chapitre 4

1- Antibiotiques 36

1.1-Exemples de quelques antibiotiques produits par voie microbienne 36

1.1.1-Pénicilline 36

1.1.2-Céphalosporines 36

1.1.3-Streptomycine 37

1.1.4-Érythormycine 37

1.1.5-Rifamycine

1.1.6-Rifampicine 37

1.1.7-Tétracyclines 37

1.1.8-Spiramycine 37

Table des matières

1.2- La production des antibiotiques par les actinomycètes 38

2-Les enzymes 39

2.1-Les amylases 40

2.2-Les glucoamylases 40

2.3-Les protéases 40

2.4-L'asparaginase 41

2.5-Les pénicillines acylases 41

2.6-La Taq polymérase 41

2.7-Autres enzymes 41

3-Les acides organiques 42

3.1-L’acide lactique 42

3.2-L’acide glutamique 42

3.3-L'acide citrique 42

3.4-L'acide itaconique 43

3.5-L’acide succinique 43

3.6-Autres acides organiques 43

4-Les acides aminés 44

5-Les vitamines 45

5.1-La vitamine B12 45

5.2-La riboflavine 45

5.3-La vitamine C 46

6-Biocides 46

7-Les protéines d’organismes unicellulaires (POU) 46

8-Biogaz 48

8.1-Production du biogaz 48

8.2-Les utilisations de biogaz 49

8.3-Biogaz et environnement 49

9-Biocarburants 50

9.1-Biodiesel 50

9.2-Bioéthanol 50

10-Les biosurfactants 51

11-Les biopolymères 51

12-Hormones 52

12.1-L’hormone de croissance humaine 52

12.2-L’insuline humaine 53

13-Vaccins 53

14-Autres produits de fermentation industrielle 54

15-Biotransformations 55

Bibliographie 56

Chapitre 1 Isolement, criblage et amélioration des microorganismes industriels

Dr Lamia AOUAR 1

Les microorganismes qui produisent un composé dans leurs conditions naturelles, sont

susceptibles de le produire en quantité accrues dans des conditions de laboratoire. Aussi, une

croissance non optimale en laboratoire peut également conduire à l’expression de

l’information génétique spécifique, et à la production accrue de certains métabolites tels que

les antibiotiques.

La sélection et l’emploi des microorganismes en microbiologie industrielle et en

biotechnologie requièrent une bonne connaissance de la culture et de la manipulation des

microorganismes ainsi que leurs interactions avec les autres microorganismes. Avant tout

processus en microbiologie industrielle, il est nécessaire d’abord d’identifier ou de créer un

microorganisme qui effectue le processus désiré da la façon la plus efficace. Pour obtenir ces

microorganismes, plusieurs approches sont disponibles qui vont de l’isolement du

microorganisme à partir de l’environnement, jusqu’aux techniques moléculaires sophistiquées

pour modifier un microorganisme déjà existant.

1-Isoler les microorganismes industriels

Dans le but d’isoler des microorganismes possédant les caractéristiques voulues, des

échantillons naturels sont analysés. Ainsi, des cultures de matières naturelles (sol, eau, etc.)

provenant de toutes les parties du monde ont été analysées. Dans la plupart des milieux

seulement une partie des microorganismes ont été isolés et cultivés. Ainsi, l’effort se poursuit

à travers le monde pour trouver de nouveaux microorganismes même dans les milieux qui ont

été explorés depuis des décennies.

1.1-Isolement et sélection des souches microbiennes productrices d’enzymes

Les microorganismes qui sont capables de produire des enzymes de dégradation de certains

composés sont généralement localisés où ces substances sont abondantes. Par exemple, des

microorganismes secrétant des cellulases sont nombreux dans les sols des forêts. Les

méthodes d’isolement sont des méthodes classiques avec des milieux sélectifs. Dans le milieu

sélectif idéal, le substrat de l’enzyme est la seule source de l’un des éléments vitaux. Par

exemple, L’amidon comme seule source de carbone pour isoler les microorganismes

possédant une amylase. Les souches isolées pour être définitivement retenues doivent

présenter un certain nombre de caractéristiques :

- Se développer sur un milieu simple bon marché

- Produire le moins possible de métabolites secondaires, comme les antibiotiques


Dr Lamia AOUAR 2

- Excréter l’enzyme de façon à ce que celle-ci soit facilement séparée et purifiée et ne

pas conduire à différents polluants

- Ne pas être pathogène ou produire des composés toxiques

- Si la préparation enzymatique va entrer en contact avec les aliments, la souche doit

avoir le caractère d’alimentarité, c’est-à-dire faire partie des souches G.R.A.S.

(Generaly Recognizer As Safe).

La capacité de production de la souche doit être préservée et tout risque de

contamination doit être éliminé. Pour cela, il faut éviter un trop grand nombre de cultures

successives. Il est préférable d’ensemencer un flacon de milieu gélosé directement à partir de

la souche lyophilisée puis, à partir de cette culture, d’ensemencer un seul fermenteur qui

servira lui-même d’inoculum pour le fermenteur industriel. Le volume de l’inoculum

représente généralement de 3 à 10 % du volume du milieu de production.

1.2-Isolement des microorganismes producteurs d’antibiotiques

Le sol est devenu le principal réservoir de microorganismes producteurs d’antibiotiques. La

grande majorité de souches productrices d’antibiotiques a été isolée du sol. Cependant,

d’autres niches écologiques contiennent des microorganismes potentiellement producteurs de

métabolites secondaires : matériaux en décomposition, des sédiments, des excréments, des

eaux marines ou douce, des lichens, des mousses et plantes.

L’un des objectifs d’isolement est la recherche de nouvelles souches avec l’espoir

qu’elles produisent de nouveaux métabolites secondaires. Les actinomycètes et surtout les

Streptomyces sont de meilleurs producteurs d’antibiotiques. Cependant, les Streptomyces ont

été très exploités. Il faut continuer à isoler des espèces de ce genre mais en essayant de

trouver des espèces rares.

1.2.1-Isolement des souches d’actinomycètes

Certaines souches détectées par observation directes ne se développent pas en condition de

laboratoire. Le choix du milieu est un point critique, trop de substrats favorisent les

champignons et les bactéries à croissance rapide. Pour se débarrasser de ces germes

envahisseurs et sélectionner d’autres espèces, un traitement des échantillons et le

développement de milieux appropriés sont indispensables. Il n’existe pas une méthode

universelle pour l’isolement de tous les types d’actinomycètes.


Dr Lamia AOUAR 3

-Pour certain groupes d’actinomycètes l’isolement est parfois aisé : les actinomycètes

acidophiles sont les seuls capables de se développent à pH 4,5. Il existe également des germes

basophiles ou halophiles qui seront isolés sur des milieux appropriés par exemple à 4,5%

NaCl. Les actinomycètes carboxytrophes, capables d’utiliser le monoxyde de carbone comme

seule source de carbone et d’énergie, peuvent être isolés en utilisant un milieu minimal en

présence de monoxyde de carbone, qui agit comme agent sélectif idéal pour sa haute toxicité

pour les autres microorganismes.

-Les contaminations par les champignons sont supprimées par l’addition d’antifongiques tels

que l’actidione et la nystatine (50 µ/ml). Cependant les bactéries sont éliminées par les

antibactériens tels que le chloramphénicol, la kanamycine et la tétracycline.

-Dans certains cas l’objectif est de trouver des microorganismes producteurs d’une famille

particulière d’antibiotiques, le procédé est basé sur le fait qu’un microorganisme producteur

d’un antibiotique est plus résistant que les autres à cet antibiotique. Cette stratégie a été

utilisée avec succès dans le cas des glycopeptides et des aminosides.

1.2.2-L’isolement des champignons

L’isolement des champignons est devenu plus facile après la découverte d’agents

antifongiques spécifiques, ainsi des milieux spécifiques pour Phytophotora et Fusarium ont

été créés. Pour l’isolement des champignons producteurs d’antibiotiques, l’addition d’agents

surfactants ou de cyclosporine limite la taille des espèces à croissance rapide. Ainsi, la

formation de colonies à dimension réduite permet d’obtenir une population plus variés et

facilite la mise en culture pure.

2-Criblage de souches pour la recherche de nouveau antibiotiques

- Parmi les microorganismes du sol, la production de métabolites antimicrobiens est une

propriété banale. Mais la question qui se pose aujourd’hui n’ai plus savoir si l’on peut isoler

des souches possédant une activité antimicrobienne mais comment faire pour découvrir de

nouvelles molécules thérapeutiques humaines.

- Si les nouveaux antibiotiques naturels ne sont pas directement utilisables en clinique, ils

peuvent être utilisés comme structure de base dans la synthèse chimique. Par exemple en

1984, 60 molécules semi synthétiques à utilisation clinique en médecine humaine contre 11

molécules naturelles seulement.

-Selon les méthodes de criblage et les objectifs, la découverte d’un antibiotique nécessite

l’examen de quelques centaines à plusieurs milliers de souches :


Dr Lamia AOUAR 4

*pour la recherche de nouveau glycopeptides une souche positive a été détectée parmi 320

microorganismes testés.

*les invermectines ont été trouvés après l’examen in vitro de 2000 cultures

*par contre, le criblage de plus de 20000 cultures était nécessaire pour la découverte de

nouveaux aminosides.

*plus d’un million de bactéries ont été analysées pour la découverte de nouveaux types de

bêta-lactame.

Stratégie de criblage : elle met en œuvre 3 étapes :

Criblage primaire : consiste à tester les souches cultivées sur milieux solides en utilisant la

technique des cylindres d’agar ;

Criblage secondaire : a pour but la production en milieu liquide ;

Criblage tertiaire : constitue une étape de caractérisation précoce des métabolites

potentiellement originaux.

2.1-Recherche de nouveaux antibiotiques : le critère indispensable pour la recherche de

toute molécule nouvelle est le développement d’un système appelé tri, criblage ou screening.

Que le criblage soit réalisé pour des inhibiteurs, de nouvelles enzymes ou des acides

organiques ou aminés, un dosage efficace est indispensable. Une des procédures possibles

pour la recherche d’antibiotiques est la suivante :

Identification d’une source de producteurs potentiels. dans la recherche d’antibiotiques,

toutes les expériences passées indiquent que les actinomycètes constituent les

microorganismes les plus intéressants à trier. Les meilleures sources pour en récolter sont les

sols, composts ou boues à pH neutre ou légèrement alcalin.

Isolement des organismes : l’isolement est généralement réalisé en étalant des dilutions

convenables de sol sur la surface de boîtes de Pétri contenant de la caséine hydrolysée

(origine animale), du soja (origine végétale) et des extraits de levures (origine microbienne).

Le contenu en sucre doit être maintenu bas pour limiter la croissance rapide des Pseudomonas

et des Bacillus par rapport à la croissance lente des actinomycètes. Les colonies compactes

d’actinomycètes sont apparentes et facilement identifiables pour un technicien expérimenté.

Le test préliminaire sur boîte : la capacité des microorganismes isolés à produire une

substance antibiotique est recherchée en utilisant un test sur boîte d’agar. Streptomyces et

d’autres actinomycètes forment des colonies compactes lorsqu’elles sont « striées » sur une

boîte. Après plusieurs jours, les organismes tests sont étalés à la perpendiculaire de

l’actinomycète. Des bactéries Gram-positives et Gram-négatives sont généralement utilisées


Dr Lamia AOUAR 5

pour réaliser ce test. Une mycobactérie peut être utilisée pour sélectionner des antibiotiques

antituberculeux et une levure pour les antifongiques.

Si la zone d’inhibition est significative pour au moins un des quatre organismes testés,

l’actinomycète est retenu pour l’étape suivante.

Essai pour une nouvelle activité : compte tenu du vaste nombre d’antibiotiques connus, la

très grande majorité des activités découvertes sont dues à un antibiotique déjà décrit. Il est

ainsi primordial que les producteurs d’antibiotiques déjà décrits soient éliminés rapidement du

tri.

Criblage avancé de cultures : à cette étape, si l’activité apparaît nouvelle, le

microorganisme isolé est soumis à une série de procédures pour augmenter la production.

L’expérience nous indique que les microorganismes nouvellement isolés produisent

seulement quelques microgrammes d’antibiotique par millilitre, et synthétisent généralement

une série d’antimicrobiens apparentée de sorte qu’aucun d’entre eux n’est produit en quantité

significative. Des paramètres variés sont testés pour leurs effets positifs sur la production

d’antibiotique : pH, aération, substrat de croissance, durée de fermentation, et d’autres

conditions. Ces efforts pour augmenter la quantité d’antibiotique produit sont suivis par des

techniques de dosage pour s’assurer que l’activité antimicrobienne détectée est identique à

celle de l’isolat original. Des résultats favorables vont conduire à la production dans des

fermenteurs à l’échelle du laboratoire. Des chimistes sont alors mis à contribution pour

identifier la substance antimicrobienne. Si le composé apparaît toujours nouveau, des tests sur

animaux sont réalisés.

2.2-Tests sur animaux : des tests sur des souris sont réalisés pour déterminer si le composé

est toxique ou s’il est détruit par les enzymes de mammifères. De tels tests déterminent si

l’antimicrobien est effectif in vivo. Si tout se déroule bien, l’antibiotique est testé sur des

animaux supérieurs puis sur des humains avant, en de rares cas, de se retrouver en pharmacie.

Les antibiotiques peuvent être classés en fonction de leur spectre antimicrobien, leur

mécanisme d’action, la souche productrice, la voie de biosynthèse ou la structure chimique.

3-L’amélioration des microorganismes industriels

Quand une souche est isolée pour la première fois d’un environnement ou sélectionnée à

partir d’un stock d’une collection de culture, ce producteur potentiel de produits d’intérêt

industriel n’est pas très différent des espèces proches. Cependant, l’amélioration rigoureuse


Dr Lamia AOUAR 6

des souches à partir de la culture originale est nécessaire avant une exploitation commerciale

rentable du produit synthétisé.

Les microorganismes industriels utilisés pour la synthèse des produits commerciaux

sont des spécialistes hautement sélectionnés qui ne survivraient pas probablement pas dans

des conditions autres que les conditions de laboratoires. Choisis pour leur stabilité génétique

au cours des processus de fermentation et leur efficacité de production, ils présentent une

croissance rapide et produisent des molécules d’intérêt dans une période de temps

relativement courte. De telles souches ne doivent généralement pas être nuisibles à l’homme

ni à l’environnement.

Deux procédures standards sont utilisées pour améliorer les microorganismes

susceptibles de générer des métabolites utiles : la mutation et la sélection. Cette technique a

augmenté considérablement la production, le cas de la pénicilline est le plus connu. Suite à

l’amélioration la production est passée de quelques milligrammes à 40 g/l. La production de

la lancomycine produite par Streptoverticillium kitasatoensis a été améliorée par la mutation –

sélection (Tableau 1).

Tableau 1 : amélioration de la souche Streptoverticillium kitasatoensis productrice de la

lancomycine.

Nombre de cycle de mutation-sélection Production de lancomycine mg/l

Souche originale 70

10 1200

20 2800

30 5600

40 9200

50 11000

L’objectif principal de la mutation-sélection est l’augmentation de la production mais

aussi d’autres types de mutants peuvent être recherchés : la synthèse d’un seul métabolite

secondaire, la production de nouvelles molécules, la capacité de produire des métabolites sur

des milieux bon marché.

Le taux de mutation naturelle est de l’ordre de 10-5

à 10-10

ce taux peut être augmenté

jusqu’à 10 -2

à 10-3

par l’utilisation d’agents mutagènes. L’homogénéité et la pureté de la

souche sont d’abord contrôlées avant de passer à la mutation. Les procédés utilisés pour


Dr Lamia AOUAR 7

l’amélioration de la souche sont : les agents physiques, les agents chimiques, la combinaison

de traitement et les méthodes de manipulation génétique.

3.1-Mutagénèse

3.1.1-Agents physiques

La lumière ultra violette (254 nm) et les radiations ionisantes ont été couramment utilisées.

Les UV induisent des substitutions et surtout des erreurs lors de la réparation de l’ADN

(fonction SOS). Les UV sont facile à utilisés est sont peu dangereux. Le traitement s’effectue

par la mise en suspension des cellules dans un tampon TES à pH7 dans une boite de Pétri en

verre. La suspension est maintenu homogène par agitation. La lampe bactéricide est fixée à

une distance de 20 à 30 cm.

Les radiations ionisantes, rayons X ou gamma provoquent des dommages et des

modifications très importantes du matériel génétique, sont à déconseillées dans un programme

d’amélioration de souches.

3.1.2-Agents chimiques

a/ Les agents alkylants

Parmi les substances chimiques, les agants alkylants sont les plus utilisés entre autres :

-L’éthyl-méthansulfonate (EMS) : dans le cas de traitement (EMS), les cellules en phase de

croissance sont incubées dans un tampon potassium additionné de 0,5 à 3 % EMS et ceci

durant 15 à 20 minutes.

-N-méthyl-N’-nitro-N nitrosoguanidine (NTG) : le NTG induit plusieurs changements de

bases de l’ADN au niveau de la fourche de duplication.

Il existe d’autres agents alkylants, entre autres le méthyl-méthansulfonate (MMS) et le

diépoxybutane (DCP).

b/ Les agents non alkylants

-l’hydroxylamine

-4 nitroquinoline-oxyde (NQQ) ou l’acide nitreux.

c/ Les bases analogues

-5-bromouracile (analogue de la thymine)

-2 aminopurine (analogue de l’adénine)


Dr Lamia AOUAR 8

d/ Agents intercalants

-acridine orange

-bromure d’éthidium

Les agents intercalants comme l’acridine orange ou le bromure d’éthidium, ainsi que

les analogues de bases nucléiques telles que le 2-aminopurine et la 5-bromouracile ne sont pas

efficaces dans l’induction de mutations stables chez les actinomycètes et les champignons.

NB : tous ces agents mutagènes sont cancérigènes et doivent être manipulés avec une grande

prudence.

3.1.3-Combinaison de traitements

Il est possible de traiter les cellules avec un agent mutagène chimique puis avec la lumière

UV. En plus, l’addition de certaines substances augmente le taux de mutation. La caféine par

exemple inhibe les mécanismes de réparation de l’ADN et l’acide nalidixique augmente le

taux de réparations erronées.

3.2-Manipulation du génie génétique

3.2.1- Les protoplastes

Le terme protoplaste désigne une structure cellulaire exempte des composants de la paroi.

L’obtention des protoplastes viables a révolutionné les techniques génétiques permettant les

fusions intraspécifiques avec des taux élevés, certaines fusions interspécifiques et des

transformations.

Actuellement, la fusion des protoplastes est largement utilisée. Pour la préparation des

protoplastes on cultive les cellules dans une solution isotonique tout en les traitant par des

enzymes tels que la B-galacturonidase. Les protoplastes sont ensuite régénérés en utilisant des

stabilisateurs osmotiques comme le saccharose. Lorsqu’il y a formation d’hybrides les

recombinants désirés sont identifiés par les techniques sélectives d’étalement sur boites.

Après régénération de la paroi, le produit de la fusion des protoplastes peut servir à des études

antérieures.

3.2.1.1-Les avantages des protoplastes

-fusions interspécifiques : un grand avantage de la technique de fusion des protoplastes est de

pouvoir fusionner des protoplastes de différentes espèces microbiennes même si elles ne sont

pas très proches. Par exemple on a fusionné des protoplastes de Penicillium roqueforti et de

Penicillium chrysogenum. Même des protoplastes de levures et des érythrocytes peuvent être

fusionnés.


Dr Lamia AOUAR 9

-taux élevé de recombinant : il est généralement élevé pour toutes les régions du chromosome

et plus important que celui obtenu avec la conjugaison (10-3

à 10-7

) ;

-taux élevé de Crossing-over multiple : ils peuvent atteindre une fréquence de 25% contre 1 à

2% pour la conjugaison ;

-utilisation possible de plus de deux parents.

3.2.1.2-Obtention et régénération des protoplastes d’actinomycètes

- La croissance des cellules dans un milieu contenant de la glycine (empêche la

formation du peptidoglycane). La fin de la croissance logarithmique (dans beaucoup

de cas : 48 à 72 heures) constitue la phase idéale pour l’obtention des protoplastes.

- La lyse totale du mycélium par incubation dans une solution osmotiquement stable

(lysozyme à 2 mg/ml, saccharose, sulfate de magnésium)

- Régénération des protoplastes : par passage de la solution sur laine de verre suivi

d’une centrifugation ou bien on utilise un gradient de saccharose. La solution des

protoplastes est diluée dans un milieu osmotiquement stable contenant le Ca+2

et Mg+2

.

3.2.1.2-Fusion des protoplastes d’actinomycètes: pour être optimale la fusion nécessite

l’intervention d’agents chimiques dits fusogènes, le plus efficace est le polyéthylène glycol

(PEG) (Pm 1000 avec 50% P/V). La fusion est stimulé par les ions Ca+2

et parfois le diméthyl

sulfoxyde qui augmente la fréquence des fusions. Une à quelques minutes suffit à la fusion

dans un milieu tamponné en présence du PEG. Les protoplastes fusionnés sont étalés sur des

milieux nutritifs gélosés de régénération. Le taux de recombinants peut être augmenté jusqu’à

30% grâce au rayons UV ou bien grâce au chauffage de la solution des protoplastes de l’une

des souches parentales.

3.3-L’insertion de courtes séquences d’ADN

Courtes séquences d’ADN synthétisées chimiquement peuvent être insérées dans des

microorganismes hôtes. Donc on peut créer de petites modification génétiques qui induisent

le changement d’un ou de plusieurs acides aminés dans la protéine cible. On a constaté que

dans beaucoup de cas des changements mineurs entrainent des modifications inattendues dans

les caractéristiques des protéines et donnent de nouveaux produits : enzymes plus résistantes

aux conditions environnementales.

Cette technique ou approche fait partie du domaine de l’ingénierie des protéines.

Grace à cette approche on peut construire des enzymes et des peptides biologiquement actifs

avec des caractéristiques nettement différentes (stabilité, cinétique, activités, etc.). Un des


Dr Lamia AOUAR 10

domaines les plus intéressants est la conception de sites actifs d’enzymes qui pourrait

modifier les substrats non naturels (la biodégradation du plastique).

3.4-Modification de l’expression des gènes

En plus d’insérer des gènes nouveaux dans certains microorganismes, il est aussi possible de

modifier la régulation génétique en touchant à la transcription, en fusionnant des protéines et

en supprimant des contrôles de rétrorégulation. Ces approches permettent de surproduire une

large variété de produits. Cette approche peut aussi consister en un changement intentionnel

de voies métaboliques par inactivation ou dérégulation de gènes spécifiques. C’est le domaine

de l’architecture des voies métaboliques. La production de la pénicilline a ainsi été améliorée

par ingénierie des voies métaboliques. Cette technique a permis aussi de produire des

variantes de l’érythromycine par blocage des étapes biochimiques spécifiques dans les voies

de biosynthèse d’un précurseur de l’antibiotique, conduit à des produits finals modifiés.

4- Les critères de choix d’un microorganisme industriel

1-Les caractéristiques nutritionnelles du microorganisme: il est souvent nécessaire qu'un

processus de fermentation soit effectué à l'aide d'un milieu le moins coûteux.

2-La température optimale de croissance: l'utilisation d'un microorganisme ayant une

température optimale supérieure à 40 ° C permet de réduire considérablement les coûts de

refroidissement d'une fermentation à grande échelle.

3-L'aptitude du microorganisme à s’adapter au type de procédé mis en œuvre.

4-La stabilité du microorganisme et sa susceptibilité aux manipulations génétiques

5-La productivité du microorganisme, mesurée par sa capacité à convertir le substrat en un

produit et à obtenir un rendement élevé de produit par unité de temps.

6-La facilité de récupération du produit à partir de la culture.

Les microorganismes subissent des traitements de manipulations génétiques dans le but :

- d’augmenter leur productivité spécifique

- de diversifier leur capacité à utiliser efficacement certaines matières premières pour faire

face à des difficultés d’approvisionnement

- d’améliorer les caractéristiques rhéologiques des cultures car l’emploi des souches rendant

le milieu de culture trop visqueux est à éviter

- de modifier le spectre de métabolites produits.

Chapitre 2 Milieux de cultures dans les procédés industriels

Dr Lamia AOUAR 11

Le milieu de culture industriel approprié doit :

- favoriser la croissance de la souche à toutes les étapes de la production;

- assure une production maximale : c-à-d la quantité de produit formé pendant la phase de

production est plus ou moins proportionnelle à la biomasse formée pendant la phase de

croissance (trophophase).

1-Le choix des matières premières

Le milieu de culture d’un microorganisme est critique parcequ’il peut influencer la

compétititivité économique d’un procédé particulier. Fréquement, des matières brutes peu

coûteuses servent de sources de carbones, d’azote, de phosphore et de facteurs de croissance.

C’est le cas des hydrolysats végétaux bruts. Les sous produits de barsseries sont aussi souvent

employés car il ne coûtent pas cher et sont diponibles en quantité. Il ya d’autres sources de

carbone, comme les melasses et le petit-lait obtenu lors de la fabrication du fromage.

-Les mélasses de betteraves et de canne à sucre : riches en saccharose, permettent

d’obtenir des biomasses protéiques ou des levures pour la panification.

-Le lactosérum : est un exelenet milieu de culture permettent le developemet des levures

utilisant le lactose

-Les liqueurs sulfiriques : résidus de la fabrication de la pate à papier, riche en pentose anisi

que les hydrolysats cellulosiques provenant de dechets forstiers.

-L’amidon : est utilisé comme matière première pour la production industrille des protéines.

Les cultures en fermenteurs utilisent des matières premières ne garantissent pas toujours une

production maximale, leurs critères de choix sont :

- Le prix d’acquisition et de stockage : certains prix sont instables et dépendent des

marchés internationaux, surtout les protéines (farine de soja…) qui peuvent varier au

double. De 15 à 25% sont représentés par le milieu de culture.

- Leur disponibilité et la constance de leur qualité : dans le cas de qualité inconstante de

matières premières, la même souche cultivée de la même manière peut donner des

variations de production de plus de 20%.

- Leur stabilité au stockage.

- Le cout de stérilisation qui peut varier en fonction de la viscosité du milieu (présence

d’amidon)

- Leurs caractéristiques rhéologiques et tensio-actives : une viscosité élevée est

défavorable à l’aération et l’homogénéisation du milieu, et demande une plus forte


Dr Lamia AOUAR 12

énergie d’agitation. La présence de mousses entraine des débordements de la cuve et

la consommation excessive de produits anti-mousses.

- Ces matières doivent être exemptes de substances toxiques

- Utilisation des procédés d’extractions aussi simples que possible.

2-Les éléments du milieu

2.1-L’eau

Les fermentations industrielles utilisent en général des eaux provenant des nappes

phréatiques, ces eaux ne sont jamais pures et leur qualité est adaptée à chaque type de

fermentation. L’eau adoucie, déminéralisée, déionisée sont obtenues par des techniques de

filtrations sur membranes et la résine échangeuse d’ions. La qualité d’eau est déterminée par

les traces de matières qu’elle contient. La qualité d’eau est un élément important pour obtenir

des cultures optimales et reproductibles.

2.2-Les sources de carbone et d’énergie

On trouve dans cette catégorie, les oses, les polyholosides, les acides gras, les triglycérides.

2.2.1-Les oses et leurs dérivés

Le glucose est une excellente source de carbone très répondue pour stimuler la croissance

microbienne. Mais le glucose peut avoir des effets indésirables sur la production de

métabolites secondaires. Cet effet peut être réduit par :

- L’addition du glucose pendant la phase de croissance (technique d’alimentation en

continue ou Fed batch), pour favoriser au maximum la croissance au début de la

fermentation et ne fournir pendant la phase de production que des quantités minimales

non inhibitrices.

- L’emploi de source lentement métabolisées, comme par exemple le lactose, pour la

production de la pénicilline. Le lactose est d’abord hydrolysé en glucose et galactose,

le glucose est hydrolysé en premier puis le galactose sera converti pour suivre la

même voie que le glucose. Donc la concentration en glucose reste faible et n’inhibe

pas la synthèse.

- D’autres sucres à consommation lente sont le saccharose et les polymères de glucose

hydrolysables par la cellule tels que dextrines, amidon, etc. Les mélasses de sucres

sont souvent préférées au saccharose à cause de leur prix moins élevé. Elles sont

riches en saccharose mais elles contiennent aussi d’autres métabolites.


Dr Lamia AOUAR 13

2.2.2-Les acides gras et leurs dérivés

Ils se trouvent dans les huiles sous forme de triglycérides. Les huiles les plus utilisées sont les

huiles de soja, d’arachide, de mais et de colza. Les acides gras peuvent remplir des fonctions

multiples :

- Ils peuvent être utilisés comme source de carbone et d’énergie.

- Ils exercent des actions physico-chimiques liées à leur propriété tensio-actives :

formation d’émulsion, encapsulage de matériaux hydrophobes, réduction des mousses,

etc.

2.3-Les sources d’azotes

Le microorganisme est normalement capable de synthétiser toutes ces molécules azotées à

partir de l’ion (NH4+), cette synthèse demande de l’énergie et du temps. Il est possible que la

souche ayant subi plusieurs traitements ait perdu quelques capacités prototrophiques.

Dans les milieux synthétiques l’ion ammonium est apporté sous forme de chlorure

d’ammonium, dans les cultures industrielles par contre on utilise des sources d’azotes

naturelles comme les farines de soja ou d’arachide. Ces farines de soja sont riches en

protéines et apportent en même temps des acides nucléiques, des vitamines, des oligo-

éléments, des lipides, des sucres, du soufre et du phosphate.

NB : en plus de son rôle de fournisseur d’azote, l’ion ammonium a la capacité de réguler

certaines étapes qui participent à la production d’antibiotiques. Il est important de maitriser la

concentration de l’ion ammonium dans le milieu de culture.

2.4-Les sels minéraux : les rôles joués par les sels minéraux sont très divers :

-éléments constitutifs des antibiotiques (P, S, Cl…)

-éléments constitutifs de la biomasse (Mg, P, Cl, Ca, Fe,..)

- responsable de la pression osmotique (NaCl, KCl,….)

-modificateur de pH (NaH2PO4, CaCO3,….)

-intermédiaire d’oxydo-réduction (Cu++

, Fe (CN)6 -3

)

-agent de complexation et de précipitation (SO4-2

, HPO4-2

, CO3-2

,…)

-catalyseurs de réaction (Mg+2

, Mn+2

, CO+2

, Fe+2/+3

, Zn+2

, Mo++

).

2.5-Additifs

Le terme additif désigne les produits qui stimulent la synthèse par exp : les antibiotiques.


Dr Lamia AOUAR 14

Les précurseurs : c’est des molécules intermédiaires qui servent de substrats de

départ aux réactions suivantes, au cours de la biosynthèse des antibiotiques par

exemple.

- Dans une production de pénicilline, l’acide phénylacétique est le précurseur.

- La cystéine est un précurseur dans la synthèse de céphalosporines.

Les régulateurs de biosynthèse : la biosynthèse des molécules peuvent être régulées

par des activateurs, des inducteurs ou répresseurs. Par exemple le glutamate stimule la

production de pénicillines.

Autres additifs : il existe d’autres additifs qui agissent par exemple sur la

perméabilité de la paroi ou qui complexe les molécules inhibitrices.

2.6-Les gaz dissous

Parmi les gaz dissous qui intervient dans le métabolisme des microorganismes producteurs de

molécules, le seul important est l’oxygène. Dans les cultures du laboratoire l’oxygène est

disponible à partir de l’air ambiant mais dans le fermenteur à partir de l’air comprimé et

stériliser par filtration. La difficulté consiste à le dissoudre rapidement pour couvrir les

besoins du microorganisme qui sont souvent élevés, surtout en période de croissance

logarithmique. Le manque d’oxygène provoque non seulement la chute de croissance mais

provoque aussi des modifications du métabolisme, qui peuvent être néfastes à la production.

La capacité d’oxygénation d’un fermenteur est une caractéristique essentielle

3-L’élaboration du milieu

La formulation d’un milieu optimal est une tâche complexe parce que les facteurs influents

sont nombreux. L’optimisation se fait d’abord au laboratoire ensuite à des échelles plus

grandes, où elle peut s’effectuer avec des méthodes de planification expérimentale permettent

d’analyser simultanément plusieurs facteurs et de déterminer la composition optimale.

4-Stérilisation

Un milieu doit être débarrassé de la présence de tout microorganisme avant d’être ensemencé

par la souche productrice. Le traitement thermique est le moyen le plus utilisé pour stériliser

le milieu, il présente l’inconvénient d’altérer et de modifier les qualités du milieu à cause de :

-dégradation de polymères tels que : protéines, acide nucléiques

-dégradation des vitamines et d’acide aminés comme le tryptophane et l’asparagine

-formation de produits de dégradation toxiques ou inhibiteurs de croissance comme la

dégradation des sucres et de la vitamine C en furfural et hydroxyfurfural.


Dr Lamia AOUAR 15

-réaction de Maillard entre sucre et protéine.

-complexation d’ions métalliques telle que la précipitation de phosphore, de magnésium et de

calcium.

5-Composition de quelques milieux de culture industriels

5.1-Milieux pour production d’enzymes d’origine microbienne

Les matières premières comptent pour 60 à 80 % du prix de revient dans une production

d’enzyme par fermentation. La composition du milieu doit être définie avec soin et beaucoup

de travaux de recherche ont pour objet le remplacement de composés chers par d’autres,

disponibles en plus grandes quantités, de moindre prix. Ces composés doivent être utilisés le

plus complètement possible pour réduire les rejets. La composition du milieu de culture doit

tenir compte des étapes de production et d’extraction. Pour la production de pectinase,

cellulase, catalase, invertase, B-galactosidase, les milieux employés sont composés de :

Source de C : Farine de céréales : soja, amidon, pomme de terre, riz, son, mélasses.

Source de N : farine de poisson, gélatine, farine de soja, de son et de peptone.

Facteurs de croissance : extrait de levure.

5.2-Milieux de production d’acides organiques

L’acide citrique : microorganisme producteur est Aspergillus niger, la synthèse de l’acide

citrique se fait quand le milieu est déséquilibré. L’aconitase nécessite du fer comme cofacteur.

On trouve cette enzyme dans les cellules en voies de croissance, mais non pas en cours de la

production de l’acide citrique. Il est possible de bloquer l’aconitase par l’utilisation du cuivre

comme antagoniste du fer. La teneur en saccharose est de l’ordre de 14%, peu d’azote pour

éviter la formation de l’acide oxalique (0,25 % NO3NH4), la teneur en phosphate est inférieur

à 0,25 %, sinon il y a formation de l’acide oxalique et l’acide gluconique.

L’acide acétique : le microorganisme producteur Acetobacter aceti. Les milieux sont de type

suivant : sucre de maïs, 4,5 kg; NH4 HPO4, 2 kg; Mg SO4, 0,5 kg; citrate de potassium, 0,5

kg; pantothénate de Ca, 5 g; pour 450 litres.

5.3-Milieux de production d’antibiotiques

L’érythromycine : c’est un antibiotique non polyène c-à-dire absence de double liaison

conjuguée. Le microorganisme producteur est Streptomyces erythreus, la composition du

milieu de culture en g/l est la suivante : l’amidon, 25; glucose, 25; farine de soja, 47; corn

steep liquor, 10; extrait de levure, 5; NaCl, 5; CaCO3, 2; CaCl2, traces ; le pH 7,2. L’aération


Dr Lamia AOUAR 16

doit être intense. Le propionate et le propanol sont des précurseurs de la synthèse

d’érythromycine.

La streptomycine : le milieu de production pour Streptomyces griseus est : farine de soja, 4

% ; glucose, 2,5 %; NaCl, 0,25; pH 7,3-7,5. Forte aération et agitation, température de 25-30°

C.

Pénicilline : glucose ou mélasses, 10 %; corn steep liquor, 4-5 %; acide phényle acétique,

0,5-0,8 %; huile végétale 0,5 %; pH 6,5-7,5.

La bacitracine : le microorganisme producteur est le Bacillus licheniformis. Les milieux de

cultures employés sont les suivants (Tableau 2) :

Tableau 2 : les milieux employés pour la production industrielle de la bacitracine

Milieu de culture Méthode Temps Bacitracine Unités/ml

Tryptone, infusion de viande Surface 3-5 j 10-26

Farine de soja, amidon, lactate de calcium Surface 7 jours 88

Farine de soja, lactate CaCo3, amidon submergée 26 h 80-90

Farine de coton et de soja, CaCo3, dextrine submergée 24 h 125

Farine de soja, amidon, CaCo3 submergée 24 h 325

5.4- Milieu de production l’endotoxine de Bacillus thuringiensis

Mélasses, 0,4 %; farine de soja, 2-6 %; K2HPO4, 0,5 %; KH2PO4, 0,5; MgSO4 7H2O, 0,005

%; MnSO4 4H2O, 0,003 %; FeSO4, 0,0001 %; CaCl2, 0,005 %; Na(NH4)2 PO4 4 H2O, 0,15

%; Lysine; mélasses de canne blackstrap, 20 %; farine de soja, 1,8 %; agent anti-mousse.

5.5-Milieu de production des acides aminés

Tryptophane : la souche productrice est un mutant de Corynebacterium glutamicum. Le

milieu contient : 10 % en équivalent glucose de mélasses de canne; 0,05 % KH2PO; 0,025

MgSO4 7 H2O; 2 % (NH4)2 SO4; 1 % corn steep liquor; 2 % CaCO3.

5.6-Milieux de production des vitamines

La vitamine B 12 : la production commerciale utilise seulement le Propionibacterium ou le

Pseudomonas ; les milieux employés ainsi que les microorganismes utilisés sont portés dans

le Tableau 3.


Dr Lamia AOUAR 17

Tableau 3 : milieux de production de la vitamine B 12.

Souche Milieu Durée de

fermentation

Rendement

mg/l

Propionibacterium

shermanii

Corn steep, glucose, cobalt,

ammoniaque

80 h 23

Streptomyces olivaceus Farine de soja, glucose,

cobalt, sels minéraux

144 h 5,7

Bacillus megaterium Mélasses, (NH4)2 HPO4 18 h 0,45

Pseudomonas denitrificans Saccharose, bétaines, acide

glutamique, acide oxalique,

cobalt, 5,6 diméthyl

benzimidazole

48 h 15

La vitamine B2 (riboflavine) : la souche utilisée est Ashbya gossypii pour cette vitamine les

hydrolysats peptidiques de tissus animaux sont très stimulateurs, le milieu employé est le

suivant : glucose, collagène, huile de soja et glycine.

B-carotène (précurseur de la vitamine A) : les microorganismes producteurs sont Blakeslea

trispora et Mycobacterium smegmatis, le milieu est composé de mélasses, huile de soja, B-

ionone, thiamine, hexadecane.

5.7-Milieu de production de l’acide gibbérellique (A3)

La souche productrice est Fusarium moniliform la forme imparfaite de Giberella fujikuroi,

cette phytohormone est utilisée en malterie car elle augmente la teneur en amylase tout en

réduisant le développement des radicules de l’orge germé. Le rendement est de 1 g/l. Il faut

peu d’azote dans le milieu (NH4+), du saccharose, Mg

+2, K

+, PO4

-2, SO4

-2, supplément en

farines végétales. Le glycérol augmente la quantité produite. La température est de 31-32° C

pour la croissance, 29° C pour la production, l’aération est forte.

5.8-Milieu de production de l’éthanol.

Des souches de Saccharomyces cerevisiae sont sélectionnées pour être cultivées à 39° C. La

croissance est inhibée mais la synthèse d’alcool est stimulée. Le milieu de culture : glucose,

100g ; NH4 Cl, 8 g; extrait de levure, 8 g; Na2 HPO4, 3,9 g; KH2PO ; 0,5 g; MgSO4, 0,5 g ;

CaCl2, 0,28 g; acide citrique, 4,3 g; Na citrate, 1,25 g.

Chapitre 3 Procédés des fermentations industrielles

Dr Lamia AOUAR 18

Le terme fermentation se réfère à la production à grande échelle de molécules biologiques dans

des fermenteurs. Les fermentations se différencient en fermentation continue et discontinu. Dans

la fermentation discontinue, les microorganismes sont cultivés dans une cuve (ou fermenteur)

souvent de grand volume, pour récolter ou extraire les produits formés après une période de

temps déterminé. Ces fermenteurs appartiennent au groupe des bioréacteurs : enceinte

permettent la culture de tous type de cellules (animales, végétales, microorganismes), avec des

paramètres physico-chimiques de cultures contrôlés et pilotés (pH, température, agitation,

substrats, produits, etc.).

1-Les fermenteurs

Enceintes hermétiquement close, les fermenteurs doivent permettent une stérilisation facile et le

maintien de l’asepsie pendant toute la durée de la culture. Ils doivent résister aux vibrations (lors

de l’agitation), aux surpressions et à la corrosion. En généra,l le volume total ne représente que

4/5 du volume total de la cuve. Pour les petits volumes inférieurs à 10 litres la cuve est en général

fabriquée en verre. Pour les volumes supérieurs, ce sont des enceintes en métal inoxydable avec

des hublots permettent un contrôle visuel de la culture. Selon le mode d’agitation Il existe deux

types de fermenteurs.

1.1-Fermenteur à agitation mécanique : c’est le modèle le plus employé, parce que c’est le plus

simple. Le fermenteur à agitation mécanique existe en volumes allant d’un litre à 500.000 litres,

sa conception tient compte de toutes les tâches qui doivent être réalisée.

-Le conteneur : il doit pouvoir contenir le volume désiré, résister aux vibrations résultant de

l’agitation, et résister aux surpressions de gaz lors de la stérilisation

-Le stérilisateur : avant l’ensemencement de la souche productrice le milieu doit être stérilisé.

Pour les petits bioréacteurs, la stérilisation de l’ensemble (cuve + milieu) peut être assurée par

autoclavage sous pression 120-125° C. Les fermenteurs plus importants pourront être constitués

d’une double enveloppe permettant une circulation de vapeur autour du corps ou être pourvus

d’une simple résistance métallique plongeant dans le milieu (une tyndallisation est réalisée pour

éviter la détérioration du milieu). Le milieu peut être aussi stérilisé par injection directe de vapeur

sous forme de pression par le système d’aération. Toutes les sorties de prélèvement et les entrées

(substrats, antimousse, inoculum, aération, bases ou acides, etc.) doivent être stérilisables et ne

pas comporter d’espaces morts.


Dr Lamia AOUAR 19

-L’aérateur : le fermenteur doit posséder un système d’aération qui injecte de l’air dans le milieu

en formant des bulles qui montent à la surface. La dissolution de l’oxygène est aidée par le

système d’agitation de la cuve.

-Homogénéisateur : le système d’agitation doit assurer le brassage du liquide en favorisant la

dissolution de l’oxygène de l’air et les échanges de températures, il existe nombreux types

d’agitation :

Agitateur de type radial : turbine à pales droites, turbines à pales incurvées (Figure 1)

Agitateur de type axial : hélice type marine, hélice à grande pale mince.

Figure 1: système d’agitation de type radiale

1.2-Les fermenteurs à agitation d’air : l’injection d’air peut servir à agiter le milieu soit par

effet siphon, soit par la force d’injection, sans autre dispositif mécanique.

-Les fermenteurs à jet d’air : utilisant des pompes centrifuges spéciales qui propulsent un

mélange air-milieu à haute vitesse dans le réservoir principal, ce qui assure agitation et aération.

Des essais pilotes avec des moisissures et des actinomycètes ont montré une capacité

d’oxygénation de 150 mMoles d’O2 par litre et par heure, contre 30 à 50 pour les fermenteurs à

agitation mécanique.

-Les fermenteurs à effet siphon : l’effet siphon est obtenu par la diminution de densité

provoquée par la présence de bulles d’air. Dans le fermenteur on provoque un effet de cheminé

qui favorise la dispersion des bulles à l’aide de chicane.

1.3-Les fermenteurs à boucles : le principe est de faire circuler le milieu dans un circuit fermé

soit par adjonction d’un tube latéral (pompage par le bas et réinjection par le haut), soit par une

réalisation entièrement tubulaire.


Dr Lamia AOUAR 20

2-Les critères de choix d’un procédé de fermentation

Il existe non seulement différents types de fermenteurs mais aussi différents procédés de

fermentation selon que l’on travaille en milieu solide, en milieu liquide ou avec les systèmes

immobilisés. Les caractéristiques de la souche productrice, le milieu utilisé et certaines

considérations économiques déterminent le type de fermenteur idéal pour une production

optimal. Les critères de choix sont :

-La demande en oxygène du microorganisme: le système doit être capable de satisfaire la

consommation de la biomasse, certains microorganismes sont exigeants (Bacillus);

-La fragilité du microorganisme : beaucoup de fermenteurs sont équipés d’une agitation

mécanique pour la mise en solution de l’oxygène et l’homogénéisation, si l’agitation est trop

importante elle peut désintégrer les cellules. Le choix de l’agitation doit tenir compte du type de

biomasse recherchée : cellules séparées ou agglomérées en flock ou pellets;

-Les propriétés hydrauliques du milieu : une mousse plus importante lors de l’injection d’air

provoque des problèmes, la mousse peut colmater les filtres de sortie de gaz. Aussi, la viscosité

du milieu conditionne également le type d’agitation et de bioréacteur : une viscosité excessive

interdit les procédés basés sur l’immobilisation des enzymes;

-Les propriétés du produit vis-à-vis de la cellule : si le produit inhibe le microorganisme, il est

préférable de choisir un réacteur qui permet d’éliminer l’antibiotique en même temps qu’il est

produit (exp. utiliser un procédé continu).

3-Systèmes de fermentation

3.1-Systèmes en phase liquide : trois procédés peuvent être utilisés :

3.1.1-Culture en discontinu (batch en anglais) : le volume est constant sans renouvellement de

milieu. Un même volume de milieu sert à réaliser les phases de croissance, de production et

d’accumulation du produit. Tout le bouillon obtenu est ensuite retiré du fermenteur. En fin de

culture tout est traité et le bioréacteur doit être nettoyé pour une prochaine culture (Figure 2).

Elle est pratiquement la seule technique utilisée en production d’antibiotique. Ce système doit

assurer un brassage continu du milieu pour l’homogénéité de la culture et la dissolution de

l’oxygène injecté sous forme d’air comprimé.


Dr Lamia AOUAR 21

Figure 2: schéma d’un fermenteur en discontinu et de ses accessoires

3.1.2-Culture discontinue alimentée (Fed-batch en anglais) : avec addition contrôlé de certains

composants en cours de fermentation. Par exemple, lors de la production de la pénicilline, la

concentration en glucose est maintenue à des valeurs précises au cours du temps.


Dr Lamia AOUAR 22

3.1.3-Culture continue : dans ce système continu, la culture microbienne reste sous un volume

constant, tout en recevant un débit de milieu neuf. La concentration cellulaire varie en fonction de

la vitesse spécifique de croissance en phase exponentielle (µx expo, taux de croissance) de

l’espèce : dX/dt = (µx expo-D) . X , où X = biomasse initiale; D = vitesse spécifique de dilution

(rapport du débit d’entrée sur le volume du milieu h-1

); t = temps.

Ce système consiste à maintenir le fermenteur et son contenu dans un même état le plus long

possible, par prélèvement du milieu fermenté et apport de milieu frais en continu. Deux

techniques sont possibles :

3.1.3.1-La technique du turbidostat : ce dispositif assure une culture continue ou la vitesse

spécifique de croissance est maximale (µx expo max) et une biomasse constante X, qui sera choisie

en phase exponentielle et restera constante grâce à une régulation de D c-à-d : µX expo = D.

L’appareillage est très simple, comprend une cellule photoélectrique réglée, sur une valeur de X

choisie, et reliée à la vanne d’entrée du milieu neuf. Il s’agit d’une autorégulation de D en

fonction de la biomasse mesurée à la sortie (Figure 3).

Figure 3 : turbidostat

3.1.3.2-La technique du chémostat ou bactogène : dans ces dispositifs µX expo > D : l’effet de

dilution est moins important que celui de la croissance. La vitesse spécifique de croissance

n’atteint jamais µX expo max, sa valeur est liée à la concentration d’un facteur limitant dans la

chambre de croissance, tous les autres aliments étant en excès. Quand D augmente, la

concentration en facteur limitant s’accroit et la biomasse, elle, diminue (on dilue le milieu) et

donc µx expo augmente (loi de Monod). Quand D diminue, c’est l’inverse (Figure 4).


Dr Lamia AOUAR 23

Figure 4 : chémostat

La limitation du système provient de la dégénérescence de la souche souvent entre 5 et 20

jours. On peut dans le cas de production de métabolites secondaires, d’utiliser des systèmes

multi-étages mettant en batterie des fermenteurs en continu (Figure 5).

Figure 5 : fermenteur en continu multi-étages

À l’heure actuelle, ce sont les systèmes en discontinus qui présente à la fois le plus de

flexibilité, de simplicité de conception et de sécurité, mais ceci au détriment du cout pour lequel

les systèmes en continus, surtout le chémostat, sont le plus rentables.

Dans ces trois systèmes, l’agitation est un facteur important de la réussite de la culture. Le

choix de la vitesse et le type des pales est important. Pour les microorganismes dont les cellules

sont relativement résistantes, on utilise des agitateurs de type radial et une vitesse importante.


Dr Lamia AOUAR 24

Dans certains cas l’agitation peut présenter un gros inconvénient créant des forces de

cisaillements trop importants. Les systèmes mécaniques peuvent être remplacés par l’agitation

par air (air-lift): système d’injection d’air par le bas (tower) utilisé par exemple dans la

production d’acide citrique par A. niger (Figure 6). Un autre système d’injection par le haut

(deep shaft reactors) dans le cas des traitements des eaux usées. Le gros inconvénient de ces

systèmes est leur cout élevé.

Figure 6: agitation par air (air lift) de type tower

3.2-Systèmes en phase solide

Dans ces systèmes, les substrats sont simplement humidifiés et non solubilisés ou en suspension.

Les substrats les plus utilisés sont les grains céréales, les copeaux de bois, la paille, etc. Les

microorganismes doivent avoir la particularité de présenter une tolérance à un AW faible : c’est

le cas des levures et des champignons filamenteux. Plusieurs types de systèmes sont utilisés :

colonnes à lits fixe, plateaux, fermenteur rotatif (Figure 7). Leurs principaux avantages résident

dans leur simplicité, la forte productivité obtenue et le peu d’énergie exigée.

-Les avantages de la fermentation solide

Parmi les avantages des fermentations solides :

-C’est une technique simple à réaliser et ne nécessitant pas d’équipement sophistiqué;


Dr Lamia AOUAR 25

-L’absence d’eau libre permet de réduire considérablement le volume des installations de

fermentation et les contaminations bactériennes;

-Elle assure une forte productivité en métabolites;

-Il n’y a pas de production de mousses lors des fermentations solides, contrairement aux

fermentations liquides;

Figure 7: système en phase solide, (a) plateaux, (b) fermenteurs rotatifs


Dr Lamia AOUAR 26

-Cette fermentation ne nécessitant pas obligatoirement une stérilisation du substrat. Ce qui réduit

le coût énergétique nécessaire;

-En cas de production d’aliments pour animaux, tout le produit est utilisé, sans rejet d’eau usée.

Les frais de séchage éventuels sont réduits.

-Inconvénients des fermentations solides

-Les microorganismes utilisés sont limités, seuls les microorganismes se développant en faible

Aw peuvent être utilisés;

-Les problèmes de transfert d’oxygène et de chaleur rendent difficile l’augmentation d’échelle

des procédés;

-La nature solide et hétérogène des substrats utilisés complique le suivi direct des paramètres de

fermentation;

-Le contrôle on line des paramètres de culture tels que le pH, l’humidité et la concentration des

nutriments, est assez aléatoire;

-Les microorganismes étant inséparables du substrat, l’estimation de la biomasse est délicate.

3.3-Systèmes immobilisés

Dans ce type de procédé, les microorganismes producteurs n’évoluent pas librement dans le

milieu, mais sont immobilisés sur un support ou une matrice. À l’entrée il y a introduction du

milieu frais qui alimente la biomasse et à la sortie un milieu fermenté qui contient le produit

désiré. La chlorotétracycline, la céphalosporine et la bacitracine ont été produites grâce aux

cellules immobilisées. La mise au point de ces systèmes présente, au niveau théorique plusieurs

avantages :

-Conservation du matériel biologique en fin de culture qui est réutilisable pour d’autres cycles;

-Opération de récupération des produits facilités, la souche n’étant pas dispersées dans le milieu

réactionnel;

-Accroissement de la densité cellulaire et des vitesses de réaction.

En principe tous les types de cellules peuvent être immobilisés par des processus divers, dérivées

des techniques utilisées pour l’immobilisation des enzymes. Quatre types d’immobilisation

peuvent être utilisés.


Dr Lamia AOUAR 27

-L’adsorption, qui est un processus ancien utilisé lors de la fabrication du vinaigre, dans lequel

les Acetobacter sont adsorbés sur des copeaux d’hêtre. Maintenant, on utilise des billes de PVC,

de DEAE cellulose (exp : Nocardia erythropolis : conversion des stéroïdes).

-L’inclusion, avec incorporation des microorganismes dans une matrice d’un polymère rigide tel

que l’alginate de sodium (Sc. cerevisiae : production d’alcool, Methanosarcina barkeri :

production de méthane, polyacrylamide (Arthrobacter simplex : production d’hydrocortisone, B.

subtilis : production d’alpha- amylase, Aspergillus niger : production d’acide citrique). Plusieurs

réalisations sont possibles : le gel peut être mis dans une colonne, dans laquelle circule le milieu

frais qui en ressort avec les produits de biosynthèse. Les gels peuvent être utilisés en batch ou

culture continue dans des bioréacteurs classiques.

-La liaison covalente, qui est moins utilisée pour les microorganismes. Il s’agit d’une liaison

covalente chimique irréversible qui met en jeu les groupements des chaines latérales des acides

aminés et un ligand fixé sur le support. Outre l’irréversibilité, ce système présente l’inconvénient

d’utiliser comme ligand des réactifs souvent toxiques pour les microorganismes;

-La floculation, système par lequel on provoque l’agrégation des cellules, par exemple par

l’addition de polyélectrolytes (chitosane). Elle met en jeu des liaisons hydrogènes et de Wan der

Waals. Elle est notamment utilisée dans le traitement des eaux résiduaires en boues activées.

Divers processus sont utilisés dans les systèmes immobolisés :

*Réacteurs à lit fixe : entassement des billes dans une colonne, l’aération et les divers contrôles

étant effectués par un système externe (Figure 8 a).

*Réacteurs à lit fluidisé : où l’on évite un colmatage des billes en ajustant leur densité et la

vitesse d’écoulement, ceci permettant de meilleurs transferts de matière.

*Réacteurs à fibres creuses : on fait circuler le milieu de culture au travers de fibres creuses où

les cellules se développent (Figure 8 b).

*Réacteurs à plaques semi perméables : voisin du précédent, les fibres étant remplacées par des

membranes semi-perméables.


Dr Lamia AOUAR 28

Figure 8 : systèmes immobilisés, (a) lit fixe, (b) fibres creuses

4-Mesure et contrôle des paramètres de culture

4.1-Les paramètres physico-chimiques

C’est un aspect fondamental des fermentations industrielles permettant d’arriver à une

optimisation maximale des cultures. Tous les paramètres doivent être contrôlés, c’est-à-dire

mesurés avec précision. Leur mesure fait appel soit à des capteurs spécifiques ou sondes

sensibles, soit à une technique externe après prélèvement d’un aliquote de culture. Les sondes


Dr Lamia AOUAR 29

doivent être précisément calibrées, fiables et donner des renseignements exactes. Elles sont, en

général, connectées au système de pilotage et de régulation de culture. L’utilisation in situ de ces

sondes reste cependant très délicate : installation couteuse et complexe (électrolytes, membrane à

changer, etc.), maintien de la stérilité. Bien souvent, on aura à s’orienter vers des systèmes de

mesures après prélèvement et, ainsi, l’usage d’échantillonneurs automatiques pouvant effectuer

plusieurs dosages à partir d’un prélèvement se répand de plus en plus.

La régulation est assurée par les divers systèmes imposant les paramètres choisis à la

culture (chauffage-refroidissement, aération, agitation, adjonction d’acide et de base, antimousse,

etc.). Les Tableaux 4 indiquent les types de systèmes de mesures des paramètres physico-

chimiques et leurs systèmes de régulation éventuelle. Le Tableau 5 donne les principaux

paramètres biochimiques et biologiques mesurés et les techniques appropriés.

Tableau 4 : méthode de mesure de principaux paramètres physico-chimiques

Paramètres Capteurs Actionneurs

Température Thermomètre à résistance de platine Résistance plongeante ou double

enceinte à circulation d’eau chaude.

Circuit d’eau froide commandé par

électrovanne.

Agitation Capteur de proximité (électrique)

ou de positionnement (optique)

Moteur électrique/axe/pales.

Volume de milieu Pièzo résistance Vidange

Mousses Sonde à résistance électrique Injection d’antimousse.

Viscosité Viscosimètre

pH Électrode Injection acide ou base par pompe

péristaltique

O2 dissout Électrode type électrode de Clark Aération

CO2 dissout Électrode type pH avec solution

de tampon bicarbonate

Ions Électrodes sélectives

Gaz à la sortie Analyseur paramagnétique (O2),

analyse infrarouge (CO2)


Dr Lamia AOUAR 30

Tableau 5 : méthodes de mesure des paramètres biochimiques

Systèmes de mesure Paramètres mesurés

Électrodes spécifiques à enzyme immobilisées Glucose (glucose oxydase), urée (uréase),

acide aminé (décarboxylase), acétylcholine

(estérase)

Fluorimétrie en sortie sur prélèvement NADH+H+, NADPH+H

+

Bioluminescence en sortie sur prélèvement ATP

Chromatographie en phase gazeuse (CPG) en sortie Composés volatils (éthanol, arômes), lipides

Chromatographie à haute pression en phase liquide

(HPLC) en sortie

Molécules organiques en solution

Biomasse en sortie sur un prélèvement Absorbance, poids sec

4.2-Les paramètres microbiologiques

Cet examen obligatoirement discontinu, permet de se rendre compte de l’état de croissance de la

souche, de la morphologie et de déceler la présence d’un contaminant.

4.2.1-Population cellulaire : la mesure de la biomasse dans le milieu de culture est le meilleur

moyen pour vérifier le développement de la culture. Une mesure exacte est difficile car le milieu

contient beaucoup d’insolubles. Il existe plusieurs techniques et sont toutes sujettes à des

critiques :

-Mesures indirectes

-La plus simple est le volume de décantation. La prise d’un volume déterminé du bouillon de

culture est centrifugée dans des conditions précises d’accélération de géométrie de récipient et de

temps. Le volume du culot est mesuré, celui-ci comprend les insolubles et le mycélium. La valeur

obtenue ne donne ni un nombre de cellules, ni un volume de biomasse, mais l’expérience permet

d’en déduire le stade de la fermentation. Au début le culot est constitué des insolubles.

Progressivement, le mycélium se développe et s’ajoute au culot, mais modifie en même temps le

milieu en hydrolysant les farines et d’autres polymères. Le résultat global est une évolution du

volume de culot qui traduit plus ou moins fidèlement une évolution de la fermentation.

-La mesure de la viscosité du milieu fournit une information globale d’état d’avancement de la

culture.


Dr Lamia AOUAR 31

-La méthode de turbidité est peu utilisable dans le cas des fermentations industrielles à cause des

matières insolubles.

-Dénombrement des microorganismes

Le dénombrement est possible sur des volumes microscopiques connus grâce à des

hémacytomètres mais la méthode est impossible avec des microorganismes filamenteux.

-Estimation de la biomasse

La biomasse peut être estimée par le dosage d’un constituant cellulaire (azote, ADN) ou par la

consommation d’un métabolite (ATP) ou la production d’une molécule donnée.

-Cultures d’échantillons

La mise en culture d’échantillon (1 ou 2 par jour) dans des milieux favorables aux éventuels

contaminants permet le développement rapide de ceux-ci et leur détection rapide.

4.2.2-Les paramètres de cultures à contrôler

L’aération, l’agitation, les transferts de chaleur et le contrôle de la formation des mousses

représentent des éléments importants de la réussite d’une culture en bioréacteur; il est donc

primordial de savoir les maitriser correctement.

L’aération : le transfert correct de l’oxygène vers les cellules est un élément essentiel pour une

fermentation industrielle. L’oxygène se dissout mal dans l’eau (maximum 10 mg/L). Il faut donc

en fournir en permanence en maitrisant bien la façon dont il va être transférer aux cellules. Ce

transfert gaz-liquide va être évalué par la mesure d’un paramètre, KLa : coefficient de transfert

de masse volumétrique (exprimé en h-1

). Il varie en fonction du débit de l’aération, de la vitesse

d’agitation, de la température et de la technique du bioréacteur.

L’agitation : Pour assurer une bonne optimisation de la culture, le facteur homogénéisation est

essentiel. Il faut en effet assurer un accès optimal des cellules aux substrats et à l’oxygène, et

éviter les mauvaises répartitions des cellulaires. Il faudra donc prendre en considération le type

d’agitation choisi en fonction des cellules, son intensité et la composition physique du milieu

(viscosité) qui pourra être amené à se modifié (excrétion des polymères, développement de

mycélium, etc.). Ce facteur important peut être quantifié par un paramètre, le nombre de Reynold,

qui varie en fonction de la vitesse d’agitation, du diamètre du système d’agitation (pales), de la

densité cellulaire du milieu et de la viscosité.


Dr Lamia AOUAR 32

Le transfert de chaleur : pour assurer en permanence aux cellules une température optimale, il

est nécessaire non seulement de posséder un système de chauffage efficace mais aussi de

permettre une élimination de chaleur dégagée par les microorganismes en mettant en place un

système de refroidissement. Le système d’agitation dépendra donc de la qualité de ces systèmes

ainsi que la géométrie de la cuve, des caractéristiques du milieu, de l’agitation et de l’aération.

Ainsi, en présence de cellules fragiles pour lesquelles on sera obligé de diminuer la vitesse

d’agitation, on sera amené à augmenter la hauteur de la cuve par rapport à son diamètre afin

d’accroitre la surface de contact entre le système de refroidissement et le milieu.

Les mousses : leur apparition dépend essentiellement de deux facteurs. La composition du milieu

(protéine) et l’intensité d’aération. Les mousses empêchent l’élimination du Co2 produit et

risquent d’occasionner des débordements, il faut absolument les éliminer. On utilise pour cela des

silicones ou des huiles, en s’étant assuré préalablement que ces produits n’ont pas d’influence sur

les cellules. Les quantités à rajouter peuvent être contrôlées par l’intermédiaire d’une sonde

détectrice couplée à un système de contrôle et un système d’injection automatique.

5-Paramètres utilisés lors de la production

5.1-Paramètres de croissance

-Vitesse spécifique de croissance μx ou Qx : exprimée en h-1

, est égale à la vitesse de croissance

en biomasse rapportée à l’unité de biomasse (X = biomasse en g. L-1

; t = temps en h). Pendant la

phase exponentielle, μx est constant et maximal. Il est alors appelé μx expo.

-Vitesse volumique de croissance, est le rapport dX / dt, elle représente l’augmentation de la

biomasse par unité de volume et par unité de temps (par exemple en g. L-1

. h-1

).

-Temps de génération (G) est le temps de doublement de la biomasse X pendant la phase

exponentielle (ou le temps de doublement de l’absorbance pour un suivi spectrophotométrique) :


Dr Lamia AOUAR 33

-La vitesse volumique de consommation d’un substrat est le rapport dS /dt.

-La vitesse spécifique de consommation d’un substrat (QS), d’expression dS/dt . 1 / X.

5.2-Cinétique d’apparition des produits, quantification : l’apparition des produits de

fermentation peut être quantifiée de la même manière que l’évolution de la biomasse, on

exprime :

-La vitesse volumique de production : notée rp d’expression dP/dt et exprimé en g. L-1

. h-1

-La vitesse spécifique de production notée Qp, d’expression dP/dt . 1/X, c’est à dire vitesse de

production rapportée à la biomasse. Cette cinétique va dépendre de produits formés. On distingue

généralement trois cas :

*Les produits dits associés (sous-entendu associés à la croissance), c’est-à-dire dont l’apparition

dans le milieu est concomitante à l’évolution de la biomasse (Figure 9 a). C’est le cas de la

production d’éthanol lors de la fermentation alcoolique. Dès sa formation, celui-ci est exocyté

dans le milieu;

*Les produits dits non associés, appelés aussi métabolites secondaires, c’est-à-dire dont

l’apparition se manifeste en phase stationnaire. Ils ne sont libérés dans le milieu que lors de la

lyse cellulaire (Figure 9 b);

*Les produits mixtes ou intermédiaires, apparaissant dans le milieu au cours de la phase

exponentielle (Figure 9 c).

Figure 9 : cinétique de formation du produit; associé, non associé, intermédiaire.


Dr Lamia AOUAR 34

5.3- bilan l’apparition des produits de fermentation : peut être exprimée de quarte manières.

-La productivité volumique horaire : c’est la masse de produit apparu par unité de volume de

milieu et par unité de temps (g. L-1

. h-1

).

-La productivité horaire globale : c’est l’évaluation de la productivité au volume total du

milieu (g. L-1

. h-1

).

-Le rendement total , par rapport au substrat principal, noté R p/S : rapport de la masse de

produit formé sur la masse de substrat utilisé à la fin du processus. On le désigne aussi sous le

nom de rendement de conversion.

-Le rendement de croissance RX/S est le rapport de la biomasse formée sur la masse de substrat

consommé.

Chapitre 4 Produits des fermentations industrielles et leurs utilisations

Dr Lamia AOUAR 35

Certains métabolites sont synthétisés et apparaissent dans le milieu de culture au cours de la

phase de croissance, et d'autre apparaissent lorsque le microorganisme entre dans la phase

stationnaire. Les métabolites primaires sont ceux produits durant la phase de croissance et les

métabolites secondaires sont ceux produits lorsque la phase stationnaire est atteinte.

Un métabolite primaire est généralement issu du métabolisme énergétique et il est nécessaire

pour une croissance continue du microorganisme.

La production de métabolites secondaires est le résultat de réactions complexes qui ont

lieu dans les phases tardives de la croissance. Les métabolites secondaires présentent la

caractéristique majeure de n’être produits que par une seule ou par peu d’espèces. Chez les

microorganismes produisant des métabolites secondaires, la phase de croissance est appelée

trophophase. La phase impliquée dans la production de métabolismes secondaires est appelée

l’idiophase. Dans certains cas, des enzymes impliquées dans la trophophase sont également

impliquées dans la production de métabolites au cours de l’idiophase.

La fermentation citrique par Aspergillus niger est un exemple de produit résultant d’un

changement de métabolisme. Au cours de la trophophase, un substrat tel que le glucose est

principalement utilisé comme source d’énergie et aussi pour les synthèses. En générant de

l’énergie, la majorité du glucose est oxydée en CO2. Au cours de l’idiophase, le glucose est

majoritairement converti en métabolite secondaire, l’acide citrique.

Dans la production des antibiotiques, qui sont également des métabolites secondaires, un

scénario différent est impliqué. Un actinomycète qui produit un antibiotique synthétise une

batterie d’enzymes nouvelles à la fin de la phase exponentielle de croissance et au début de la

phase stationnaire. Ces enzymes sont responsables de la synthèse de l’antibiotique. Plus de 300

gènes sont, par exemple, impliqués dans la synthèse des enzymes responsables de la production

de la chlorotétracycline par Streptomyces aureofaciens. Au moins 72 intermédiaires de réaction

sont formés et seulement 27 ont été isolés et identifiés. Cependant, seules quelques enzymes

impliquées dans la synthèse de la chlorotétracycline sont nécessaires pour la croissance cellulaire.


Dr Lamia AOUAR 36

1- Antibiotiques

Environ 10000 antibiotiques différents ont été caractérisés, et environ 160 sont préparés

industriellement et commercialisés. Les antibiotiques sont des substances organiques secrétées

comme des métabolites secondaires par certains microorganismes ou produits par synthèse

chimique. Les microorganismes producteurs d’antibiotiques sont en nombre très restreint. Les

principaux groupes utilisés dans la production industrielle d’antibiotiques sont des bactéries

filamenteuses du genre Streptomyces et des moisissures des genres Penicillium et

Cephalosporum. L’expérience montre cependant que les bactéries présentant un cycle de vie

incluant la formation de spores (des endospores ou d’autres types de spores) sont les plus

efficaces pour la production d’antibiotiques utiles.

De nombreux antibiotiques sont actuellement disponibles pour la profession médicale,

mais la recherche de nouveaux antibiotiques continue, notamment contre les bactéries, les

champignons, les virus et les tumeurs. Un des problèmes majeurs dans l’utilisation des

antibiotiques et des thérapeutiques chimiques est le développement de résistances chez les agents

pathogènes. Des résistances aux antibiotiques apparaissent également par des processus de

mutation et de sélection. Ainsi, la recherche d’antibiotiques se poursuit pour combattre les

résistances qui se développent vis-à-vis de ceux actuellement utilisés Il est clair que de nouveaux

agents efficaces contre les bactéries, les champignons, les virus ou les tumeurs sont actuellement

nécessaires.

1.1-Exemples de quelques antibiotiques produits par voie microbienne

1.1.1-Pénicilline : est produite par Penicillium chrysogenum et contient un cycle β-lactame

inhabituel dans les systèmes biologiques. Cet antibiotique est utilisé depuis plus de 50 ans, et le

développement de microorganismes résistants devient un réel problème. Des pénicillines semi-

synthétiques sont plus efficaces contre les microorganismes résistants au produit naturel, et sont

des antibiotiques de choix pour les applications cliniques.

1.1.2-Céphalosporines : cet antibiotique, également de la famille des β-lactames, est produit par

le champignon Cephalosporium acremonium. Les céphalosporines sont moins toxiques que la

pénicilline et leur spectre d’action antimicrobien est plus large. Elles sont aussi résistantes aux


Dr Lamia AOUAR 37

pénicillinases produites par les microorganismes résistants à la pénicilline. Les céphalosporines

sont produites par fermentation, et certains dérivés semi-synthétiques sont générés par

modification chimique.

1.1.3-Streptomycine : de nombreux antibiotiques sont des dérivés de sucres, et la streptomycine

est un antibiotique de ce groupe produit par Streptomyces griseus. Le milieu de fermentation

employé contenant du soja avec du glucose comme source de carbone. La streptomycine est

composée de sucres aminés liés à d’autres sucres par une liaison glycosidique. Sa découverte eut

une grande importance médicale car ce fut le premier médicament efficace contre le fléau de la

tuberculose. La résistance à la streptomycine a posé de sérieux problèmes dans les thérapies

contre la tuberculose, et des combinaisons de médicaments sont maintenant administrées pendant

un temps donné.

1.1.4-Érythormycine: c’est antibiotiques appartenant à la famille des macrolides, il possède de

grands cycles lactone liée à des sucres. Il est produit par Streptomyces erythreus.

1.1.5-Rifamycine est un antibiotique de type lactone macrocyclique produit par Nocardia

mediterranei.

1.1.6-Rifampicine : est un inhibiteur spécifique de l’ARN polymérase bactérienne, ADN

dépendante ; elle est utilisée dans le traitement de la tuberculose associé à l’isoniazide et la

pyrazinamide.

1.1.7-Tétracyclines : les tétracyclines constituent un groupe d’antibiotiques majeurs efficaces à

la fois contre des bactéries Gram-positives et Gram-négatives. Elles sont également efficaces

contre Rickettsia, Mycoplasma, Leptospira, Spirochetes et Chlamydia. Certains dérivés semi-

synthétiques ont aussi été développés pour contrecarrer les problèmes d’émergence de résistances

bactériennes.

1.1.8-Spiramycine : c’est un antibiotique de la famille des macrolides. Ces derniers sont des

molécules lipophiles basiques composés d’un macrocycle lactonique ou aglycone. Le

microorganisme producteur Streptomyces ambofaciens


Dr Lamia AOUAR 38

1.2- La production des antibiotiques par les actinomycètes

Les actinomycètes tiennent une très grande importance dans le domaine de la biotechnologie des

antibiotiques, malgré les progrès de synthèses chimiques. En effet, 45% des antibiotiques connus,

sont naturellement issus des actinomycètes et plus particulièrement du genre Streptomyces qui

sont à l'origine de 75% des antibiotiques produits (Figure 10). Quelques antibiotiques produits

par les actinomycètes sont cités dans le Tableau 6.

Figure 10 : Origine des antibiotiques ;

■ bactéries non actinomycétales ; ■ actinomycètes ; ■ champignons microscopiques

Tableau 6 : quelques antibiotiques produits par les actinomycètes

Actinomycètes producteurs Antibiotiques

Streptomyces griseus Candicidine,

Streptomyces lydicus Streptolydigine

Streptomyces lindensis Rétamycine

Marinispora sp. Marinomycine

Verrucosispora Abyssomycine

Streptomyces venezuelae Chloramphénicol

Streptomyces nataensis Natamycine

Nocardia lurida Ristocétine

Streptomyces orientalis Vancomycine

Streptomyces fradiae Fosfomycine

Streptomyces aureofaciens Auréomycine


Dr Lamia AOUAR 39

2-Les enzymes

Dans la nature, les microorganismes utilisent les enzymes pour dissocier les protéines, l'amidon,

la pectine, les lipides et d'autres grandes molécules insolubles. Ces dernières sont réduisent en

monomères, servant de sources de carbone et d'énergie pour eux-mêmes ou pour d'autres

organismes présents dans l'environnement. Ces enzymes hydrolytiques sont généralement

extracellulaires ou localisées sur la surface de bactéries ou de champignons. En tant qu'enzymes

extracellulaires, elles peuvent être récupérées très aisément du milieu de culture. Les enzymes

sont utilisées dans toutes les industries de la fermentation, que ce soit pour les produits

agroalimentaires, dans l’industrie pharmaceutique (antibiotiques, acides divers, vitamines),

l’industrie biomédicale (protéines recombinantes, réactifs), les industries du nettoyage et de la

décontamination (détergents, traitement de l’eau et des surfaces) (Figure 11).

Figure 11 : parts de marché occupées par les enzymes dans différents secteurs

La production de protéases bactériennes est un processus industriel important en volume

et en valeur. Plus de 500 tonnes de ces enzymes sont produites chaque année. Elles sont

majoritairement utilisées dans la fabrication de détergents et de fromages. Les enzymes utilisées

dans les détergents sont des protéases de souches sélectionnées de Bacillus amyloliquefaciens.

Elles sont ajoutées aux détergents pour augmenter la solubilisation des taches présentes sur le

matériel à laver. Un des problèmes majeurs soulevés par l’utilisation de protéases dans les

détergents est la réponse allergique aux protéines bactériennes.

La production industrielle des enzymes est obtenue à partir des cultures industrielles des

bactéries et des champignons par fermentation, une fois la fermentation est achevée, les enzymes

sont purifiées, et elles sont alors commercialisées sous des formes variées : liquide, concentrée,


Dr Lamia AOUAR 40

poudre. Les enzymes les plus répandues, parmi celles qui sont produites à l’échelle industrielle

sont les protéases et les amylases.

Dans l’utilisation industrielle des enzymes, qui sont de nature soluble, il est souvent

bénéfique de les immobilisées sur un support insoluble. Les enzymes sont immobilisées de 3

manières principales :

Fixation : l’enzyme est fixée sur un support insoluble (charbon actif, cellulose modifié, verre

poreux, etc.) par divers types de liaisons.

Inclusion : c’est l’incorporation physique des enzymes dans des structures semi-perméables :

microcapsule, gels, dans ce type d’immobilisation, l’enzyme garde sa forme soluble initiale qui

est bien sur la plus avantageuse.

Polymérisation : les molécules enzymatiques sont liées les uns aux autres en réseau, grâce à des

agents de liaisons bifontionnels tel que le glutaraldehyde, les liaisons entre enzymes sont

covalentes et donnent des structures insolubles et à haut poids moléculaire.

2.1-Les amylases : sont des enzymes qui hydrolysent l’amidon. Plusieurs amylases microbiennes

hydrolysent l’amidon par différentes voies pour générer des polymères de courte chaîne

(dextrine) et du maltose. D’autres enzymes hydrolysent les dextrines et le maltose en glucose.

Les α-amylases clivent les liaisons internes α-1,4 glycosidiques et sont produites par des bactéries

thermophiles du genre Bacillus, formant des endospores. Des champignons tels que des espèces

d'Aspergillus produisent également ces enzymes.

2.2-Les glucoamylases clivent le glucose de l'extrémité non réductrice de l'amidon. Ces enzymes

sont commercialisées pour la fabrication des sirops de fructose. Le fructose est plus doux que le

glucose et est le sucre préférentiel des sirops et des boissons sucrées. Aspergillus niger est un

producteur de glucoamylase. La conversion du glucose en fructose peut être accomplie par une

glucose isomérase bactérienne dont les producteurs principaux sont des espèces de Streptomyces

et Bacillus coagulans.

2.3-Les protéases

Les protéases hydrolysent les protéines et les peptides, en leurs unités constitutives : les acides

aminés. Les protéases alcalines sont utilisées dans l’industrie des lessives, industrie de la viande,

industrie fromagère. Les microorganismes utilisés dans la fabrication industrielle d’enzymes


Dr Lamia AOUAR 41

protéolytiques sont des bactéries appartenant aux genres Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces,

Streptococcus et des champignons des genres Penicillium et Aspergillus.

2.4-L'asparaginase est utilisée dans le milieu médical pour traiter certaines leucémies et

lymphomes. Le métabolisme de ces cellules tumorales nécessite l'acide aminé L asparagine.

L'asparaginase clive l'asparagine en acide aspartique et ammoniac, empêchant ainsi la cellule

tumorale d'utiliser son substrat. La production commerciale de cette enzyme s'effectue par des

mutants sélectionnés d’Escherichia coli, d’Erwinia carotovora et d'autres espèces.

2.5-les pénicillines acylases, sont produites par différentes bactéries et champignons, mais la

production industrielle s'effectue par des mutants sélectionnés d’E. coli. Ces enzymes clivent la

pénicilline en acide 6-amino pénicillanique et acide phénylacétique. Ainsi, l'amine libre de l'acide

6-amino pénicillanique peut être chimiquement modifiée pour produire des pénicillines semi-

synthétiques variées.

2.6-La Taq polymérase

La Taq polymérase est employé pour les réactions de polymérisation en chaine cette enzyme est

produite par Thermus aquaticus, une bactérie thermophile dont la température optimale de

croissance est de 70° C, est de ce fait cette enzyme est stable à la chaleur. Elle est largement

employée en recherche pour réaliser la PCR, diagnostic et en médecine légale.

2.7-Autres enzymes, produites industriellement sont citées dans le Tableau 7.

Tableau 7 : enzymes microbiennes et leurs applications commerciales.

Enzymes Microorganismes Utilisation

Lipases Micrococcus Production de fromage

Β-glucanase Bacillus sublilis, A. niger Brasserie

Β-galactosidase A. niger, Candida pseudotropicalis Suppression lactose du lait

Cellulase A. niger, Trichoderma reesii Hydrolyse cellulose

Invertase Sc. cereviseae Hydrolyse saccharose

Pectinase A. niger, Trichoderma reesii Clarification jus de fruit.

Rénine Alcaligenes, Aspergillus, Candida Fabrication du fromage

Catalase A. niger, Micrococcus lysodeikticus Stérilisation lait, beurre


Dr Lamia AOUAR 42

3-Les acides organiques : Les principaux acides organiques issus de l’industrie microbienne

sont : l’acide acétique, l’acide glutamique, l’acide lactique, et surtout l’acide citrique. Ils

totalisent une production annuelle supérieure au million de tonnes.

3.1-L’acide lactique : sa production à l’échelle industrielle est réalisée avec des cultures

fermentaires d’Aspergillus niger, qui peuvent atteindre des rendements de 125 g/l du milieu.

3.2-L’acide glutamique : est industriellement fabriqué à partir de la fermentation des mélasses

par Clostridium glutamicum.

3.3-L'acide citrique : c’est un acide organique important synthétisé par une fermentation

microbienne. Plus de 130 000 tonnes sont produites par an dans le monde. L'acide citrique était

extrait à l'origine à partir de citron (un citron contient 7 % à 9 % d'acide citrique). En 1923, une

fermentation microbienne produisant des taux élevé d'acide citrique a été développée, et le prix a

diminué avec l'augmentation de la production. Environ les deux tiers de l’acide citrique produit

et commercialisé sont destinés aux aliments et aux boissons, tels que les boissons sucrées, les

desserts, les confiseries, les fruits glacés, les compotes, les gelées et les crèmes glacées.

Dans l'industrie pharmaceutique, le citrate de fer constitue une source alimentaire de fer.

L’acide citrique est également utilisé comme conservateur du sang stocké, de médicaments et de

pommades. Le citrate a également remplacé les polyphosphates dans les détergents, en raison de

l'élimination des phosphates qui constituent des polluants environnementaux.

La majorité de l’acide citrique provient de fermentations dans des grands fermenteurs en

acier inoxydable, en utilisant des souches du champignon Aspergillus niger. Le saccharose est

également le substrat pour la production de l'acide citrique en tant que métabolite secondaire au

cours de l'idiophase. Durant la trophophase, le mycélium est produit et du CO2 est libéré. Au

cours de l'idiophase, le glucose et le fructose sont métabolisés directement en acide citrique. Peu

de CO2 est produit. Dans les conditions optimales, environ 70 % du sucre est converti en acide

citrique. Les taux de fer et d'autres minéraux inhibiteurs constituent des facteurs critiques au

cours de la fermentation. Le fermenteur doit ainsi être en inox ou recouvert de verre, et

l'utilisation du cuivre est prohibée.


Dr Lamia AOUAR 43

3.4-L'acide itaconique : utilisé dans les résines à méthacrylate en tant que copolymère. L'ajout

de ce produit à raison de 5 % à de l'encre d'impression augmente la capacité de celle-ci à se fixer

sur le papier. C'est également un détergent potentiel. L'organisme impliqué dans la production de

l'acide itaconique est une souche d'Aspergillus terreus. En fermentation submergée, le taux de

production à partir de mélasses de betterave est de 85 % du taux théorique.

3.5-L’acide succinique est un intermédiaire du cycle de l’acide tricarboxylique et un des

produits résultant du métabolisme anaérobie. Il est synthétisé par la majorité des cellules

microbiennes, végétales et animales. De nombreuses recherches ont été menées pour développer

des procédés de production biologiques d’acide succinique en utilisant des souches telles que

Aspergillus niger ou Saccharomyces cerevisiae et des souches recombinantes d’Escherichia coli

et en travaillant sur leur métabolisme pour améliorer les rendements de production.

Actuellement, parmi les bactéries, Actinobacillus succinogenes et Mannheimia

succiniciproducens semblent être les meilleures souches productrices d’acide succinique. Cette

production pourrait s’élever à plus de 66 g/l en 84 heures (pour une consommation de 98 g/l de

glucose).

3.6-Autres acides organiques : sont utilisés comme additifs alimentaires.

Tableau 8: utilisation des acides organiques comme additifs alimentaires.

Additifs

alimentaires

Microorganismes

producteurs

Exemples d’utilisations

Acide acétique Acetobacter aceti Agent de conservation dans les

mayonnaises, produit pharmaceutiques.

Acide

gluconique

Aspergillus niger

Penicillium chrysogenum

Acidulant pour viandes, renforce le gout

dans la margarine, etc.

Acide

fumarique

Rhizopus

Mucor

Acidulant dans les jus de fruits, desserts à

la gélatine, biscuits secs, lait en poudre.

Acide malique Penicillium brevicompatum

Leuconostoc

Aspergillus oryzae

Acidulant dans les confiseries, jus de

fruits, crème glacée, etc.

Acide tartrique Penicillium notatum Acidulant pour boissons, gelées, etc.

Acide

propionique

Propionibacterium sp. Agent de conservation de nombreux

aliments, dont les pâtisseries, etc.


Dr Lamia AOUAR 44

4-Les acides aminés : sont des produits industriels majeurs avec une production mondiale

annuelle excédant les 400 000 tonnes. Les principales utilisations des acides aminés sont

indiquées dans le Tableau 9. Les acides aminés sont utilisés pour améliorer la qualité des

aliments, en médecine ou comme éléments de base pour la synthèse chimique. L’acide aminé

produit en plus grande quantité est l'acide glutamique (80% de la production totale), suivi de la

lysine (10%). La forme biologiquement active des acides animés est la forme L, isomère produit

par fermentation. La synthèse chimique conduit à un mélange des isomères D et L.

Tableau 9: les utilisations de quelques acides animés.

Les acides animés sont synthétisés par des microorganismes qui se distinguent en fonction

du métabolite précurseur utilisé comme élément de base pour la synthèse. Par mutation et

sélection, des microorganismes ont été développés pour produire des quantités importantes de la

plupart des acides animés courant. La majorité des processus de fabrication des acides animés ont

été initiés au japon et certaines souches utilisées industriellement. Les principaux

microorganismes produisant l'acide glutamique nécessite un apport en biotine.

-L-lysine, peut être produit en grande quantité par fermentation directe en utilisant un mutant de

Brevibacterium flavum qui nécessite un apport en homosérine et en leucine. La lysine est alors

excrétée dans le milieu par transport actif (Tableau 10).

Acide animé Utilisations

Glutamate de sodium Exhausteur de goût

L-méthionine, L-thréonine, L-tryptophane Antioxydant dans le lait en poudre

L-histidine, Aspartate Amélioration du goût des jus de fruits

L-aspartyl-L-phénylalanine Méthy1-ester

(aspartame)

Édulcorant faiblement calorique

L-lysine Ajout aux aliments d'origine végétale Pour

augmenter la qualité nutritionnelle

Mélange d'acides animés Solutions pour des patients post-opératoires


Dr Lamia AOUAR 45

Tableau 10: rendements et sources de carbone dans la production de quelques acides aminés.

Acide aminé Microorganisme Rendement (g/l) Source de carbone

L-glutamate Corynebacterium glutamicum > 100 Glucose

L-lysine Corynebacterium 39 Glucose

L-lysine Brevibacterium flavum 75 Acétate

L-thréonine E. coli K12 55 Saccharose

5- Les vitamines

Les processus de mutation et de sélection pouvant conduire au développement de souches

microbiennes prototrophes capables de produire en grande quantité quasiment toutes les

vitamines B. Cependant, seules deux vitamines B, la riboflavine (vitamine B2) et la

cyanocobalamine (vitamine B12), sont produites par fermentation, car la synthèse chimique des

autres est moins coûteuse. La vitamine B12 est une molécule complexe qui n'est synthétisée que

par des microorganismes procaryotes. Nécessaire aux humains, elle est apportée par

l'alimentation ou produite par la flore microbienne intestinale normale. Des anémies peuvent

apparaître chez des humains présentant des taux insuffisants en vitamine B12.

5.1-La vitamine B12 : la production annuelle de vitamine B12 est d'environ 10 000 kg. La

vitamine B12 non purifiée est ajoutée à l'alimentation des volailles à raison d'environ 12 mg par

tonne, ceci montre son efficacité à des concentrations excessivement faibles. La vitamine B12 est

synthétisée par des bactéries à partir d'intermédiaire commun à la synthèse des hèmes. Les micro-

organismes impliqués dans la fabrication de la vitamine B12 sont Propionibacterium shermanii et

Pseudomonas denitrificans. Ce dernier produit environ 60 mg par litre dans des conditions de

culture appropriées.

5.2-La riboflavine (vitamine B2), est présente naturellement dans les œufs, le lait, la viande et

d'autres aliments. Elle est ajoutée comme complément alimentaire dans le pain, le lait et d'autres

aliments pour augmenter la valeur nutritionnelle. Des levures telles que Ashbya gossypii sont

utilisés pour la fabrication industrielle de la riboflavine, qui peut alors produire des quantités

excédant 7g par litre.


Dr Lamia AOUAR 46

5.3-La vitamine C (acide ascorbique) : est produite par une combinaison de synthèse chimique et

microbiologique. Elle est également utilisée comme antioxydant. La production mondiale

dépasse les 35 000 tonnes par an. Le substrat de départ, le D-glucose, est réduit chimiquement en

D-sorbitol, et une oxydation microbienne conduit à la transformation du D-sorbitol obtenu en L-

sorbose, lequel est chimiquement converti en acide ascorbique. Acetobacter suboxydans est le

microorganisme impliqué dans la déshydrogénation du D-sorboiol en L-sorbose..

6-Biocides

Le produit commercial le plus connu est celui généré par un microorganisme pour le contrôle des

populations d’insectes, est une protéine synthétisée par Bacillus thuringiensis. Cette protéine

apparait comme un cristal parasporal au cours de la sporulation. Elle est libérée avec la spore lors

de la désintégration de la bactérie sporulante. La cellule végétative de Bacillus thuringiensis n’est

pas toxique, mais le cristal de protéine est efficace en tuant les lépidoptères. Cette molécule est

très efficace contre les insectes ayant un pH intestinal alcalin, car la protéine toxique est

solubilisée à des pH élevé. Les protéines des spores ingérées sont clivées par des protéases

intestinales et les toxines détruisent les cellules épithéliales de l’intestin. Les contenus de

l’intestin passent dans le sang, entrainant une paralysie et la mort de l’insecte. La toxine est

inefficace contre les animaux en raison de leur pH intestinal neutre ou acide.

Bacillus thuringiensis se multiplient aisément en fermenteur submergé, et produit dans les

conditions appropriées des spores et des corps parasporaux en trente heures. Après l’inoculation

du milieu de culture dans le fermenteur, les spores et les cristaux sont récupérés et incorporés

dans un adjuvant inerte avant d’être vendus comme insecticide a pulvérisé sur les plantes. Le

produit actif est naturel, et est dégradé par les microorganismes du sol.

7-Les protéines d’organismes unicellulaires (POU)

La recherche de nouvelles ressources alimentaires est l’une des préoccupations de ce siècle et de

nombreux pays doivent faire face. A l’heure actuelle, le régime alimentaire de beaucoup de pays

accuse un grave déficit en protéines animales et particulièrement en viandes rouges. Ses besoins

protéiques sont essentiellement couverts par les protéines végétales (céréales, légumineuses).

Cependant, les protéines d’origines animales sont de qualité supérieure aux protéines végétales,

car mieux équilibrées en acides aminés indispensables.


Dr Lamia AOUAR 47

Les protéines d'organismes unicellulaires (P.O.U.), ou S.C.P. (de l’anglais Single-Cell

Protein) sont une source non conventionnelle de protéines. Ces protéines sont obtenues à partir

de culture de microorganismes (levures, champignons filamenteux, bactéries, cyanobactéries)

utilisant le plus souvent des substrats non comestibles pour l’homme afin de combler le déficit

alimentaire (aussi bien humain qu’animal. Les protéines d’organismes unicellulaires sont très

importantes dans l’alimentation humaine et assurent une sécurité alimentaire car elles sont mieux

équilibrées en acides aminés indispensables que les protéines végétales et contiennent une forte

teneur en acides aminés essentiels.

Les POU sont intéressantes dans les régions où les conditions climatiques sont

défavorables aux cultures, où les terres cultivables sont rares, et pour les populations soumises à

un risque élevé de famine. Les microorganismes constituent des sources alimentaires attractives

pour différentes raisons :

Croissance rapide

Croissance généralement indépendante du climat

Faible encombrement des unités de production

Substrats peu coûteux pour leur croissance.

Les sources potentielles de POU sont la biomasse de levures et de bactéries. Par rapport

aux bactéries, les levures et les champignons filamenteux sont plus prometteurs comme source

d’alimentation humaine. Les levures, qui se multiplient en présence de substrats peu d’azotés et

riches en carbone et en lipides, présentent un taux protéique plus élevé si elles sont cultivées en

présence de substrats riches en azote. Les critères qui guident le choix du microorganisme :

Taux de croissance élevé.

Facilité pour la récolte.

Bonne résistance aux variations dans les conditions de production.

Non pathogène.

Contenu en protéines élevé

Avantages des POU

permet de résoudre un problème environnemental.

la croissance rapide de la biomasse (50 fois plus rapide que la production bovine).


Dr Lamia AOUAR 48

demande peu d'espace et peu d’eau.

la production est indépendante des conditions climatiques.

offre un contenu protéique élevé.

génère peu de résidus.

permet la modification génétique des microorganismes.

Inconvénients des POU

peuvent produire des toxines ou autres métabolites nuisibles.

possèdent des propriétés physiologiques qui peuvent ne pas convenir à la consommation.

directe par les humains.

présentent un contenu élevé en acides nucléiques.

8-Biogaz

Le biogaz est un mélange contenant principalement du méthane (50 à 60%), du dioxyde de

carbone, de l’eau, de l’azote, de l’hydrogène sulfuré et de l’oxygène. Ce processus s’observe

fréquemment dans certains milieux naturels comme par exemple les marais (gaz de marais).

Cependant, Il peut être initié artificiellement dans des enceintes closes (digesteurs) où sont

associés des substrats organiques solides ou liquides (d’origine végétale ou animale) et des

cultures bactériennes et les différentes réactions fermentaires sont contrôlées et optimisées. Du

fait d’une forte concentration en méthane, le biogaz est un bon fournisseur d’énergie (1m3 de

biogaz a un pouvoir calorifique de 6 kWh soit l’équivalent de 0,6 litre de fuel).

8.1-Production du biogaz

Les réactions qui se déroulent dans un fermenteur anaérobie (digesteur) sous l’action de

populations bactériennes (Methanobacillus, Methanococcus et Methanosarcina) comprennent

trois phases :

-Hydrolyse et acidogénèse : la matière organique (lipides cellulose, amidon, protéines)

complexe est hydrolysée en molécules simples, en sucres fermentescibles, qui sont utilisées par

des bactéries acidogènes qui vont produire des alcools, des acides organiques, H2, CO2.


Dr Lamia AOUAR 49

-Acétogénèse : cette étape permet de transformer les divers composés de l’étape précédente

(alcools, acides organiques, acétate, H2, CO2) en précurseurs directs du méthane (acétate, H2,

CO2). On distingue des bactéries productrices obligées d’H2 et CO2; et des bactéries acétogènes,

dont le métabolisme est orienté pour produire l’acétate.

-Méthanogénèse : Elle est assurée par des microorganismes anaérobies stricts appartenant au

domaine Archaea. Cette étape aboutie à la formation du méthane à partir du Co2, acétate et H2.

Les produits de la digestion sont du biogaz (environ 60% de méthane dans les meilleurs

cas, le reste étant principalement du CO2, mais aussi des composés azotés et soufrés. Le biogaz

est utilisé pour la production de chaleur ou d’électricité. Le digestat, résidu de la fermentation

anaérobie, est transformé en compost. La qualité de ce compost est variable et dépend du type de

déchets. Plus les déchets sont fermentescibles, meilleur est le compost.

8.2-Les utilisations de biogaz

combustion dans un moteur à gaz ou une turbine, pour produire de l'électricité et de la

chaleur en cogénération ;

alimentation de centrale thermoélectrique, cimenterie, chaufferie collective, etc.) quand il

en existe près de la source;

chauffage et enrichissement en CO2 de serres.

- Les avantages

réduction des émissions de gaz à effet de serre ;

substitut à d'autres énergies exogènes (fossile et nucléaire), source de revenus pour

l'exploitant qui économise sur ses dépenses énergétiques ;

diminution de la charge en carbone des déchets végétaux.

8.3-Biogaz et environnement : la production et l’utilisation du biogaz ont un impact positif sur

l’environnement. En effet, le biogaz se substitue très fréquemment aux énergies fossiles ce qui

contribue à réduire les émissions de gaz à effet de serre, responsables en partie du dérèglement

climatique. Au cours de leur transformation, les matières organiques végétales utilisées

directement ou indirectement pour produire du biogaz émettent la même quantité de CO2 que

celle absorbée pendant leur croissance ou leur production.

http://fr.wikipedia.org/wiki/Cog%C3%A9n%C3%A9ration

http://fr.wikipedia.org/wiki/Gaz_%C3%A0_effet_de_serre


Dr Lamia AOUAR 50

9-Biocarburants

Les biocarburants proviennent de plantes cultivées (tournesol, betterave, colza, etc.), les produits

obtenus sont le bioéthanol ou l'ETBE (Ethyl tertio-butyl ether) et le biodiesel ou EMHV (Esters

méthyliques d'huiles végétales).

9.1-Biodiesel

On obtient le biodiesel suite à un processus chimique dit transestérification à partir d’un mélange

d’huile végétale ou de graisse animale avec un alcool en présence d’un catalyseur. L’huile

servant à la production de biodiesel peut provenir de n’importe oléagineuse. Les plus

couramment utilisés sont le colza en Europe et le soja au brésil et aux états unis d’Amérique. On

emploie également de faible volume de graisse animale provenant de l’industrie de

transformation des poissons et des produits animaux.

Le biodiesel peut être mélangé avec le diesel habituellement utilisé comme carburant, ou

utilisé tel quel dans les moteurs à allumage par compression. Sa teneur en énergie équivaut 88-95

% de celle du diesel. La forte teneur en oxygène du biodiesel favorise une combustion plus

complète, ce qui réduit les émissions dans l’atmosphère des particules polluantes de monoxyde

de carbone et des d’hydrocarbures.

9.2-Bioéthanol

Tout matériau pouvant être converti en sucre tel que la cellulose ou l’amidon peuvent servir à

produire de l’éthanol. L’éthanol commercialisé actuellement est produit à partir de sucre ou

d’amidon. Les principales cultures sucrières sont la canne à sucre et la betterave à sucre. Les

amylacés les plus courantes sont le mais, le blé et le manioc.

Pour obtenir du bioéthanol (ETBE) on procède à partir de végétaux sucrés tels que la

canne à sucre, les betteraves, les céréales ou pommes de terre. Un traitement permet d'obtenir du

sucre, et sous l'action des levures, une fermentation alcoolique donnera outre l'éthanol quelques

sous-produits. Ensuite par un processus de synthèse dans lequel intervient de l'isobutène, l'éthanol

devient ETBE ou bioéthanol. Le bioéthanol peut être mélangé à de l’essence ou utilisé dans sa

forme pure dans des moteur à combustion interne légèrement modifiés. Un litre d’éthanol

contient 66 % de l’énergie fournie par un litre d’essence. Il améliore la combustion

d’hydrocarbure des véhicules en réduisant ainsi l’émission du monoxyde de carbone,

d’hydrocarbure non brulé et des particules cancérigènes.


Dr Lamia AOUAR 51

10-Les biosurfactants

Les biosurfactants sont des molécules tensioactives produites par certains microorganismes. Leur

nature tout comme leur pouvoir tensioactif, sont fortement dépendants du type de micro-

organisme utilisé (bactéries, levures, champignons), de la souche testée ainsi que du substrat

nutritif disponible pour le développement cellulaire. On obtient souvent de bon rendement avec

des substrats insolubles. Parmi les différents biosurfactants recensés, on trouve aujourd’hui des

glycolipides, des lipopeptides, des phospholipides, des lipides neutres, des acides gras ou des

lipopolysaccharides. Les biosurfactants d’origine microbienne les plus largement utilisés sont les

glycolipides.

Ces composés possèdent des régions hydrophiles et hydrophobes distinctes. Ils peuvent

avoir des propriétés émulsifiantes, moussantes, mouillantes ou encore dispersantes, mais

également des propriétés plus spécifiques (propriétés antibiotiques). Certaines de ces propriétés

peuvent être conservées dans des conditions extrêmes d’utilisation telles que pH acides,

températures élevées, etc. Compte tenu de leurs potentialités et de leur innocuité, ils sont

aujourd’hui utilisés dans différents domaines d’application tels que l’environnement, l’industrie

pétrolière, l’agronomie ou encore la cosmétologie.

De nombreux surfactants utilisés dans des buts commerciaux sont produits par synthèse

chimique. Mais les biosurfactants suscitent actuellement de plus en d’intérêt, car ils trouvent des

applications particulières importantes dans le domaine de l’environnement, où l’on exige des

substances biodégradables

11-Les biopolymères : sont des polymères produits par des microorganismes. Ils modifient la

fluidité des liquides et servent d’agent gélifiant. Ils sont utilisés en de nombreux domaines des

industries pharmaceutiques, alimentaires et du papier (Tableau 11). L’avantage d’utiliser les

biopolymères microbiens est que leur production est indépendante du climat. On utilise 75 %, au

moins, de tous les polysaccharides extracellulaires microbiens comme agents stabilisants ou pour

disperser les particules, former des biofilms ou faciliter la rétention d’eau dans des produits

divers. Les polysaccharides aident à maintenir la texture de nombreux aliments congelés soumis à

des modifications drastiques de températures.


Dr Lamia AOUAR 52

Tableau 11: polysaccharides extracellulaires microbiens.

Polysaccharides microorganismes Utilisation

Xanthane Xanhomonas campestris Modification de la viscosité, entre dans

la composition des gels, émulsions

cosmétiques

Dextrane Aerobacter sp.

Streptococcus bovis

Leuconostoc mesenteroides

Stabilisation de plasma (sang),

polyélectrolytes, anti-adhésif.

Alginate Pseudomonas aeruginosa

Acetobacter vinelandii

Stabilisateurs dans des yogourts,

gélifiant alimentaire.

Gomme de

gellane

Pseudomonas elodea Entre dans la composition de gels pour

des solutions microbiennes.

Zanflo Erwinia tahitica Agent épaississeur pour peinture

Curdlane Alcaligenes faecalis Entre dans la composition de gels

alimentaires

Pullulane Aureobasidium pullulans Floculant

Heteroglycane Flavobacterium uliginosum Marqueur (traitement anti-cancéreux)

12-Hormones

Des hormones naturellement présentes telles que la progestérone, la testostérone, l'œstrone et

celles du cortex peuvent actuellement être synthétisées par des microorganismes et à faible coût.

12.1-L’hormone de croissance humaine : ou HGH (Human Growth Hormone) utilisée pour

traiter les déficiences hypophysaires entrainant le nanisme (hypopituitarisme), était

précédemment obtenu on prélevant les glandes pituitaires d’humains décédés. Obtenir

suffisamment d’hormone était à la fois difficile et coûteux, l’utilisation de cette hormone était très

limitée. L’hormone de croissance extraite des animaux n’est pas efficace sur l’homme. Le gène

pour la synthèse de l’hormone de croissance a été introduit chez E. coli, et cette bactérie

génétiquement modifiée, constitue à présent, la source commerciale de l’hormone. Près de 30 000

enfants prenaient cette hormone aux États-Unis.


Dr Lamia AOUAR 53

12.2-L’insuline humaine : Avant de produire l’insuline par des microorganismes, on utilisait

celle, extraite des porcs ou des bœufs. Du point de vu structural, ce n’est pas précisément la

même que l’insuline humaine, et elle n’est de ce faite pas aussi efficace. En plus, Le nombre de

cas de diabètes augmentant continuellement, il a fallu trouver une autre méthode afin de produire

de l’insuline en grande quantité et à faible coût. Avec le développement du génie génétique, on

s’est donc tourné vers les microorganismes. Depuis 1984, la production à grande échelle de

l’insuline est réalisée commercialement avec la bactérie E. coli génétiquement modifiée. En

1987, on a également commencé à produire de l'insuline avec la levure Saccharomyces

cerevisiae.

13-Vaccins

Les antigènes génétiquement modifiés sont maintenant une réalité grâce aux avancées des

biotechnologies. Ces antigènes présentent plusieurs avantages par rapport aux antigènes extraits

de bactéries pathogènes ou de virus, et sont généralement plus efficaces que les préparations

bactériennes ou virales atténuées. Les antigènes générés par des bactéries sont moins couteuses,

plus facilement purifiés et exempte de contaminants par d’autres protéines. L'hépatite B est une

maladie du foie causée par le virus HBV (Hepatitis B Virus). Afin de prévenir l’infection causée

par ce virus, on a mis au point un vaccin qui, en administrant au corps de petits fragments du

HBV, lui permet de beaucoup mieux se défendre lorsque le virus complet se présente.

Le premier vaccin contre l'hépatite B provenait du sang de personnes infectées par le virus

HBV. On isolait, dans le sang de personnes malades, un fragment de virus susceptible d'être

reconnu par notre système immunitaire. Administré à des personnes saines, ce fragment donnait

alors l’occasion au corps d’identifier le virus pour ensuite l’éliminer. Cette méthode de

vaccination comportait des risques. Malgré les étapes de purification, il pouvait parfois arriver

qu’un virus complet se retrouve dans le vaccin. Sans le vouloir, c’est alors la maladie elle-même

qu’on donnait à une personne saine. Par ailleurs, le recours à des personnes malades pour

fabriquer un vaccin n'est plus pratiqué. On s'est donc tourné vers les microorganismes afin de

produire des fragments du virus.

Le sang d’individus chroniquement contaminés par ce virus présente une particule

protéique appelée Hbs. Cette particule n’est pas toxique en elle-même mais elle constitue un


Dr Lamia AOUAR 54

inducteur efficace pour la production d’anticorps anti-hépatite B. Cette protéine a été clonée chez

Saccharomyces cerevisiae et constitue maintenant la source d’antigène pour l’immunisation

humaine.

14-Autres produits de fermentation, ainsi que leurs utilisations sont portés dans le Tableau 12

Tableau 12: exemples de produits de fermentations industrielles et leurs applications.

Production Microorganismes Utilisation

Produits pharmacologiquement actifs

Ergotamine Claviceps purpura Migraine

Valiomaline Streptomyces hygroscopicus Diabète

Compactine Penicillium. citrinum Cholestérol

Cyclosporine Tolypocladium inflatum Immunosuppresseurs

Prednisone Curvularia lunata

Corynebacterium simplex

asthme et dans le cas d'autres

allergies

Arômes

Anis-aldéhyde Trametes suavolens Anis

Géraniol Ceratiocystis variospora Rose

Méthyl-phénylacétate Trametes odorata Miel

Hormones végétales

Gibbérelline Phaecosphaeria sp. Suppression de la dormance,

floraison

Lipides Aspergillus Fumigatus, Mucor

miehi, Penicillium spinulosum

Alimentation

Pigments

Bêta-carotène Blakeslea trispora

Rhodotorula gracilis

Colorants

Nucléotides

5’ IMP

5’GMP

ATP

Bacillus subtilis

B. ammoniagenes

B. ammoniagenes


Dr Lamia AOUAR 55

15-Biotransformations

Les biotransformation ou bioconversion sont des réactions biochimiques réalisées par des

microorganismes ou catalysées par leurs enzymes. Elles permettent la transformation chimique

d’un substrat donné en un produit spécifique, il existe divers types de bioconversions pratiquées à

l’échelle industrielle. Parmi les principales biotransformations d’antibiotiques on peut citer

(Tableau 13):

Tableau 13: quelques bioconversions d’antibiotiques

Réactions de

biotransformation

Microorganismes Substrats Produits

Β-lactames Ps. aeruginosa Pénicilline Acide pénicillanique

Peptides Alcaligenes sp. Novobiocine Novenamine

Acylation Streptomyces griseus Chloramphénicol Chloramphénicol 3 acétate

Phosphorylation Bacillus circulans Kanamycine Kanamycine 3 ortho-phosphate

Sulfoxydation Streptomyces armentosus Lincomycine Lincomycine sulfoxyde

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Dr Lamia AOUAR 56

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Documents

La technologie des fermentations...Table des matières 1.2- La production des antibiotiques par les actinomycètes 38 2-Les enzymes 39 2.1-Les amylases 40 2.2-Les glucoamylases 40