LE GREFFON HEMATOPOIETIQUE LE GREFFON HEMATOPOIETIQUE ALLOGENIQUE VU SOUS L’ANGLE DE ALLOGENIQUE VU SOUS L’ANGLE DE

LA THERAPIE CELLULAIRE LA THERAPIE CELLULAIRE

Dr Delphine ReaDr Delphine ReaUnité de Thérapie Cellulaire et Service des Maladies du SangUnité de Thérapie Cellulaire et Service des Maladies du Sang

Hôpital Saint-Louis, ParisHôpital Saint-Louis, ParisAIH JJH 30 septembre 2006AIH JJH 30 septembre 2006

THERAPIE CELLULAIRE

• Thérapie cellulaire:Thérapie cellulaire: administration à un patient de cellules humaines, administration à un patient de cellules humaines, autologues ou allogéniques, dont le but est de prévenir, traiter ou autologues ou allogéniques, dont le but est de prévenir, traiter ou atténuer une maladieatténuer une maladie

• Activité strictement règlementée et contrôlée par l’AFSSAPSActivité strictement règlementée et contrôlée par l’AFSSAPS Autorisation d’établissement et renouvellement d’autorisation Autorisation d’établissement et renouvellement d’autorisation tous les 5 tous les 5

ans ans (décret n°2001-909 du 1(décret n°2001-909 du 1erer octobre 2001) octobre 2001) Encadrement juridique strictEncadrement juridique strict

• Bonnes pratiques de prélèvement, transport, transformation et Bonnes pratiques de prélèvement, transport, transformation et conservation des CSH et CMN à visée thérapeutique (arrêté du 16 conservation des CSH et CMN à visée thérapeutique (arrêté du 16 décembre 1998, décret 2005-440 du 10 mai 2005)décembre 1998, décret 2005-440 du 10 mai 2005)

• Conditions d’autorisation pour la mise en oeuvre d’essais cliniques Conditions d’autorisation pour la mise en oeuvre d’essais cliniques (arrêté du 3 février 2003)(arrêté du 3 février 2003)

• Règles de sécurité sanitaire portant sur le prélèvement et l’utilisation Règles de sécurité sanitaire portant sur le prélèvement et l’utilisation des éléments et produits du corps humain (décret 2005-1618 du 21 des éléments et produits du corps humain (décret 2005-1618 du 21 décembre 2005).décembre 2005).

• Traçabilité draconienne (personnels, cellules, PTA, fournitures, Traçabilité draconienne (personnels, cellules, PTA, fournitures, appareils, réactifs …)appareils, réactifs …)

• Harmonisation des pratiques à l’échelon européen Harmonisation des pratiques à l’échelon européen viavia des directives des directives

STRUCTURE D’UN LABORATOIRE DE THERAPIE CELLULAIRE

Laboratoire de contrôle qualité

Laboratoire de production (ZAC)

Zone de cryobiologie

Laboratoire de transfert (R&D)

Assurance Qualité

Zone de stockage fournitures

Zones annexes

Resp. contrôle qualité Resp. production

Responsable médical

Ing. AQ

Num, CD34, CFU, bactério … Décongélation, transformation …

Congélation, stockage

SECTEUR CONTRÔLE QUALITE

• Responsabilité distincte de celle de la productionResponsabilité distincte de celle de la production

• Compétence du laboratoire vérifiée par contrôles de qualité externes Compétence du laboratoire vérifiée par contrôles de qualité externes pluriannuels réalisés par l’AFSSAPSpluriannuels réalisés par l’AFSSAPS

• Contrôle de la qualité des greffonsContrôle de la qualité des greffons A réception (produit initial)A réception (produit initial) Sur le produit final après transformationSur le produit final après transformation

• Juste avant délivrance au patient (frais ou décongelé)Juste avant délivrance au patient (frais ou décongelé)• Juste avant congélationJuste avant congélation

Eventuellement aux étapes intermédiaires de transformationEventuellement aux étapes intermédiaires de transformation

• Greffons hématopoïétiquesGreffons hématopoïétiques Numération cellulaire sur automateNumération cellulaire sur automate Mesure de viabilité par cytométrie de flux (IP ou 7-AAD)Mesure de viabilité par cytométrie de flux (IP ou 7-AAD) Mesure quantitative des cellules d’intérêt (CD34, CD3 …)Mesure quantitative des cellules d’intérêt (CD34, CD3 …) Evaluation fonctionnelle des cellules souches (CFU-GM)Evaluation fonctionnelle des cellules souches (CFU-GM) Contrôle microbiologique aéro-anaérobieContrôle microbiologique aéro-anaérobie

SECTEUR PRODUCTION• Responsabilité distincte de celle du contrôle qualitéResponsabilité distincte de celle du contrôle qualité

• Zone à pression et atmosphère contrôléesZone à pression et atmosphère contrôlées

• Accès réservé et entrées contrôléesAccès réservé et entrées contrôlées SAS personnel, SAS produits, SAS déchets, SAS fourniture, SAS échantillonSAS personnel, SAS produits, SAS déchets, SAS fourniture, SAS échantillon

• Salles de production: étapes de transformation (sauf descente en Salles de production: étapes de transformation (sauf descente en température et conservation des greffons congelés)température et conservation des greffons congelés) ConcentrationConcentration DéplasmatisationDéplasmatisation DéplaquettisationDéplaquettisation DésérythrocytationDésérythrocytation ImmunosélectionImmunosélection CultureCulture Irradiation UV (PCE)Irradiation UV (PCE) DécongélationDécongélation Thérapie génique si locaux accréditésThérapie génique si locaux accrédités

LA ZAC: ENVIRONNEMENT CONTRÔLELA ZAC: ENVIRONNEMENT CONTRÔLE

ClasseClasse DegréDegré Efficacité Efficacité filtre filtre

terminal terminal (%)(%)

Nb Particules/m2Nb Particules/m2 Max micro-Max micro-organismeorganisme

s/m3s/m30.5 0.5 5 5

100100

1 0001 000

10 00010 000

100 000100 000

A2A2

BB

CC

DD

99.99799.997

9595

3 5003 500

35 00035 000

350 000350 000

3 500 0003 500 000

00

200200

2 0002 000

20 00020 000

< 1< 1

< 500< 500Niveau 1: congélation / délivrance sans transformation préalable autre que par des moyensphysiques en circuit closNiveau 2: transformation selon des procédés réalisés en système closNiveau 3: transformation selon des méthodes nécessitant des étapes en système ouvertMinimum: salle classe D sous PSM classe A

• Contrôles bactériologique et mycologique des surfaces

• Contrôles de l’air: bactériologie, mycologie, particules

SECTEUR CRYOBIOLOGIE

• Descente en température contrôlée des greffons et stockage en azoteDescente en température contrôlée des greffons et stockage en azote Azote liquide à -196°CAzote liquide à -196°C Vapeur d’azote à -135°CVapeur d’azote à -135°C

• Zone à température et humidité contrôlées avec extraction d’air Zone à température et humidité contrôlées avec extraction d’air continu et en cas de teneur en O2 < 19 %, sous alarmecontinu et en cas de teneur en O2 < 19 %, sous alarme

L’ASSURANCE QUALITE

• Repose sur les Bonnes Pratiques:Repose sur les Bonnes Pratiques: PrélèvementPrélèvement TransformationTransformation Contrôle QualitéContrôle Qualité

• Concerne:Concerne: La conception des locaux et le contrôle de l’environnementLa conception des locaux et le contrôle de l’environnement La qualification et la validation des équipementsLa qualification et la validation des équipements La qualification et la formation du personnelLa qualification et la formation du personnel Les matières premières, réactifs et consommablesLes matières premières, réactifs et consommables

• Comprend:Comprend: Le système documentaire (procédures, modes opératoires, instructions)Le système documentaire (procédures, modes opératoires, instructions) La traçabilité des opérations de transformationLa traçabilité des opérations de transformation La traçabilité des cellules donneur/receveurLa traçabilité des cellules donneur/receveur La description des modalités de biovigilance et de rappel des produitsLa description des modalités de biovigilance et de rappel des produits

CIRCUIT DU GREFFON ALLOGENIQUE

Transport Réception et contrôle du greffon initial

Greffon final

CongélationStockage en azote

Décongélation Transport

Transformation Contrôle qualité initial

Validation séro-viro, ABOPrescription de transformation

Création des dossiers patient et produit

Contrôle qualité post décongélationValidation décongélation

Suivi de la greffe- Evénements indésirables à l’administration- Reconstitution hématopoïétique

Demande de transformation par le clinicien

Administration

Contrôle qualité final (J0-J14)Validation production

Prélèvement du greffon intitial

Contrôle qualité final (J0-J14)Validation production

VALIDATION SERO-VIRO - PRESCRIPTION TF• Sérologies règlementaires: < 4 semaines précédant le prélèvement* Sérologies règlementaires: < 4 semaines précédant le prélèvement*

(allogreffe)(allogreffe) Agp24, VIH 1 et 2, Ac anti-HCV, Ag HbS et Ac anti-Hbc, Ac anti-HLTVI ou I/II, Agp24, VIH 1 et 2, Ac anti-HCV, Ag HbS et Ac anti-Hbc, Ac anti-HLTVI ou I/II,

syphilis (TPHA),syphilis (TPHA), Ac anti-EBV (IgG totales ou Ac anti-VCA), Ac anti-CMV (IgM, Ac anti-EBV (IgG totales ou Ac anti-VCA), Ac anti-CMV (IgM, IgG), séro toxoIgG), séro toxo

Dépistage palu selon le risque de transmissionDépistage palu selon le risque de transmission Sérologie West Nile virus (USA en période de transmission)Sérologie West Nile virus (USA en période de transmission)

• En cas de risque de transmissionEn cas de risque de transmission VIH, HCV, HBV, HTLVI ou syphilis, VIH, HCV, HBV, HTLVI ou syphilis, la greffe la greffe est interdite mais il existe des mesures dérogatoires après information et est interdite mais il existe des mesures dérogatoires après information et consentement du patient (hépatite B et C) (décret 2005-1618).consentement du patient (hépatite B et C) (décret 2005-1618).

• Groupes sanguins: examens règlementairesGroupes sanguins: examens règlementaires ABO, Rh, C, E, c e si Rh neg, RAI, Ac anti-A ou B immuns, Hb, HtABO, Rh, C, E, c e si Rh neg, RAI, Ac anti-A ou B immuns, Hb, Ht

• Validation séro/viro au LTC: conforme/non conformeValidation séro/viro au LTC: conforme/non conforme

• Prescription de transformation: selon spécifications du clinicien, type de Prescription de transformation: selon spécifications du clinicien, type de greffon et groupe ABORH – RAI du couple donneur/receveurgreffon et groupe ABORH – RAI du couple donneur/receveur* Décrets 95-195 16/02/1995, 97-928 9/10/1997, 2003-1153 28/1/2003,

LES EXAMENS DU CONTRÔLE QUALITE EN ROUTINE

• Numération Numération Cellules nucléées totalesCellules nucléées totales

• Viabilité des CNTViabilité des CNT En cytométrie de flux: marquage 7-AAD ou iodure de propidiumEn cytométrie de flux: marquage 7-AAD ou iodure de propidium

• Quantification des populations cellulaires d’intérêtQuantification des populations cellulaires d’intérêt Cellules CD34+: marquage CD45/CD34 en cytométrie de fluxCellules CD34+: marquage CD45/CD34 en cytométrie de flux Lymphocytes CD3+ (greffons allogéniques et lympho du donneur)Lymphocytes CD3+ (greffons allogéniques et lympho du donneur)

• Tests fonctionnels: CFU-GM: difficile à standardiser et résultats rendus après Tests fonctionnels: CFU-GM: difficile à standardiser et résultats rendus après 14 jours de culture14 jours de culture

• Contrôle microbiologique sur flacons d’hémoculture aéro-anaérobie (10-14 Contrôle microbiologique sur flacons d’hémoculture aéro-anaérobie (10-14 jours)jours)

MARQUAGE CD34 DES CSH: LA MOLECULE CD34

Domaine extracellulaireFortement N- et O-glycosylé:famille des sialomucines

Domaine trans-membranaire

Domaine intracellulaire:signalisation

• 3 classes d’anticorps selon leur capacité à reconnaître CD34 après traitement 3 classes d’anticorps selon leur capacité à reconnaître CD34 après traitement enzymatique: neuraminidase, O-glycoprotéase et chymopapaïne.enzymatique: neuraminidase, O-glycoprotéase et chymopapaïne.

• Classe III obligatoire: reconnaissance des épitopes résistants aux 3 enzymes: Classe III obligatoire: reconnaissance des épitopes résistants aux 3 enzymes: quelque soit l‘état de glycosylation de la molécule CD34. En association avec quelque soit l‘état de glycosylation de la molécule CD34. En association avec un anti-pan CD45 qui doit reconnaître toutes les isoformes de CD45.un anti-pan CD45 qui doit reconnaître toutes les isoformes de CD45.

• 2 techniques de numération des CD34 (double ou simple plateforme)2 techniques de numération des CD34 (double ou simple plateforme)

MARQUAGE CD34 DES CSH

CD45

CD

34

0.25 0.551.59

SP Moelle CSP

** Cordon Cordon (n=13)(n=13)

Moelle Moelle (n=12)(n=12)

CSP (n=11)CSP (n=11)

mlml

CNT x10CNT x1099

% CD34+% CD34+

Cellules CD34Cellules CD34++ x10x1066

93 93 ± 9± 9

1.75 ± 0.231.75 ± 0.23

0.3 ± 0.060.3 ± 0.06

5.45 ± 1.285.45 ± 1.28

963 963 ± 63± 63

23.02 ± 1.4823.02 ± 1.48

0.99 ± 0.170.99 ± 0.17

227.4 ± 227.4 ± 34.4634.46

172 172 ± 40± 40

37.7 ± 337.7 ± 3

0.77 ± 0.150.77 ± 0.15

277.9 ± 277.9 ± 57.457.4

•Theilgaard-Mönch K et al. •BMT 2001; 28: 1073-1082

TESTS CLONOGENIQUES: PRINCIPE

37°C

5 % CO2

7-14 j7-14 j

moelleou

sang

d = 1,077

CMNCMN

Milieusemi-solide

Milieu IscoveAA, Vitamines

30 % SVF1 % Méthylcellulose

Par ex. : G-CSF + GM-CSF + IL3 + EPO +/- SCF

F

Facteursde croissance

Plaque à 6 puits

CFU-GMComptage

des colonies contenant plus de 50

cellules

CFU-M

TESTS CLONOGENIQUES: RESULTATS

LA PRODUCTION EN ROUTINE• Moelle alloMoelle allo

Filtration systématiqueFiltration systématique Concentration quasi systématique (simple ou par buffy coat)Concentration quasi systématique (simple ou par buffy coat) Désérythrocytation si incompatibilité ABO majeure et selon RAI Désérythrocytation si incompatibilité ABO majeure et selon RAI

donneur/receveurdonneur/receveur

• CSP alloCSP allo Déplasmatisation si incompatibilité ABO mineureDéplasmatisation si incompatibilité ABO mineure Désérythrocytation exceptionnelleDésérythrocytation exceptionnelle Déplaquettisation avec réinjection des plaquettes au donneur si plaq post Déplaquettisation avec réinjection des plaquettes au donneur si plaq post

cyta < 50 000/mm3cyta < 50 000/mm3

• Sang placentaireSang placentaire Congélation/décongélationCongélation/décongélation Pas de réduction de volume pré-congélation à Saint-LouisPas de réduction de volume pré-congélation à Saint-Louis

• CMN alloCMN allo Congélation/décongélationCongélation/décongélation

• Déserythrocytation des moellesDéserythrocytation des moelles Si GR > 125ml: sur séparateur de cellule type Cobe Si GR > 125ml: sur séparateur de cellule type Cobe

Spectra en flux continuSpectra en flux continu Si GR < 125ml: par centrifugation sur gradient de FicollSi GR < 125ml: par centrifugation sur gradient de Ficoll Objectif: GR résiduels < 20-25mlObjectif: GR résiduels < 20-25ml

• Déplasmatisation des CSPDéplasmatisation des CSP Centrifugation dur laveur type Cobe 9221, élimination du Centrifugation dur laveur type Cobe 9221, élimination du

surnageant et resuspension en solution isotoniquesurnageant et resuspension en solution isotonique

• Désérythrocytation des CSP: cas exceptionnelDésérythrocytation des CSP: cas exceptionnel Le volume des GR est toujours < 125mlLe volume des GR est toujours < 125ml Pour désérythrocyter sur Cobe Spectra,Pour désérythrocyter sur Cobe Spectra,

il faut rajouter un CGR de groupe Oil faut rajouter un CGR de groupe O

phénotypé compatibilisé phénotypé compatibilisé

GREFFONS ALLOGENIQUES ET COMPATIBILITE ABO: ASPECTS TECHNIQUES

• Congélation:Congélation: Avec cryoprotecteur et descente en températureAvec cryoprotecteur et descente en température

contrôlée puis stockage en azote liquide ou vapeurcontrôlée puis stockage en azote liquide ou vapeur

• DécongélationDécongélation Rapide au bain marie puis lavage sur Cobe 2991Rapide au bain marie puis lavage sur Cobe 2991 pour élimination du DMSOpour élimination du DMSO

CONGELATION/DECONGELATION:ASPECTS TECHNIQUES

AUTRES TECHNIQUES DE PRODUCTION: IMMUNOSELECTIONEx: sélection CD34

GreffonGreffonBilles +Billes +Anti-CD34Anti-CD34

CellulesCellulesCD34-CD34-

CellulesCellulesCD34+CD34+

Principe identique pour la déplétion CD3 Principe identique pour la déplétion CD3 mais avec conservation de la fraction CD3 mais avec conservation de la fraction CD3 négativenégative

SELECTION CD34 :SELECTION CD34 :TECHNIQUE CLINIMACSTECHNIQUE CLINIMACS

SolutionSolutiond’incubationd’incubation

Cellules à purifierCellules à purifier

Poche de recueilPoche de recueildes cellules purifiéesdes cellules purifiées

Poche de recueilPoche de recueildes cellules négativesdes cellules négativeset des lavageset des lavages

AimantAimant

PompePompepéristaltiquepéristaltique

ProgrammateurProgrammateur

Solution Solution de lavagede lavage

T déplétion > 3 logT déplétion > 3 logRécupération CD34 souvent affectéeRécupération CD34 souvent affectée

• Objectif: augmenter le nombre Objectif: augmenter le nombre de CSH et de progéniteurs de CSH et de progéniteurs mutipotents pour améliorer le mutipotents pour améliorer le taux et la vitesse de taux et la vitesse de reconstitution hématopoïétiquereconstitution hématopoïétique

• Culture Culture in vitroin vitro des CSH en des CSH en présence de cocktail de présence de cocktail de cytokinescytokines

• Particulièrement intéressant Particulièrement intéressant pour le sang placentaire mais pour le sang placentaire mais dvp des greffes doubles cordonsdvp des greffes doubles cordons

• Problème: Engagement massif Problème: Engagement massif des cellules souches vers des des cellules souches vers des précurseurs incapables de précurseurs incapables de soutenir l’hématopoïèse à long soutenir l’hématopoïèse à long termeterme

Modulation expression facteurs transcription

Régulation cycle cellulaire

Sorrentino Nature Reviews Immunology 2004

AUTRES TECHNIQUES DE PRODUCTION: CULTURE/EXPANSIONex expansion des CSH

• OBJECTIF:OBJECTIF: Correction d’un défaut fonctionnelCorrection d’un défaut fonctionnel Apport d’une nouvelle fonctionApport d’une nouvelle fonction

• MOYENS:MOYENS: Insertion génique par transduction grâce à un vecteurInsertion génique par transduction grâce à un vecteur Vecteurs rétroviraux préférables pour une insertion à long termeVecteurs rétroviraux préférables pour une insertion à long terme

• QUELLES APPLICATIONS DANS LE DOMAINE DES CSH?QUELLES APPLICATIONS DANS LE DOMAINE DES CSH? Maladies génétiques constitutionnelles avec gène défectueux Maladies génétiques constitutionnelles avec gène défectueux

parfaitement identifiéparfaitement identifié• Déficits immunitaires congénitauxDéficits immunitaires congénitaux• Hémoglobinopathies sévèresHémoglobinopathies sévères

AUTRES TECHNIQUES DE PRODUCTION: TRANSFERT DE GENE

AU TOTAL

• L’hémato-oncologie est le principal domaine de la L’hémato-oncologie est le principal domaine de la thérapie cellulaire …thérapie cellulaire …

• La thérapie cellulaire doit travailler de concert avec La thérapie cellulaire doit travailler de concert avec les services d’hémato-oncologie et de greffe de les services d’hémato-oncologie et de greffe de moelle.moelle.

• La réglementation est stricte.La réglementation est stricte.

• Le transfert de la recherche aux essais cliniques se Le transfert de la recherche aux essais cliniques se fait fait viavia la recherche et développement dans le la recherche et développement dans le respect des règles régissant la sécurité sanitaire des respect des règles régissant la sécurité sanitaire des produits.produits.