Les Lenti-Vecteurs, des outils pour écrire dans le génome des cellules

vivantesSébastien BONI, PhDIngénieur de RechercheResponsable technique plateforme LentiVecBâtiment IBS-IRIS

4, rue Larrey CHU angers49933 ANGERS Cedex 09Tel : 02.44.68.84.62Fax : 02.41.35.41.64@ : boni.sebastien.pro@gmail.com

14/03/2017 Gen2Bio

Pr Guillaume Podevin. Unité de chirurgie pédiatrique, pôle FME.Responsable scientifique LentiVec, SFR ICAT 4208, IBS-IRIS,

CHU, 4 rue Larrey49933 ANGERSSecr : 02 41 35 42 95Port : 06 68 41 32 41Fax : 02 41 35 36 76

SOMMAIRE

1. Généralités sur les lentivirus

2. Utilisation des vecteurs lentiviraux

3. Nos prestations & services

a. Classification

b. Organisation & expression génomique

c. Cycle viral

d. La reverse transcription

e. L’import nucléaire

f. L’intégration

a. Construction d’un vecteur lentiviral

b. Production des vecteurs lentiviraux

c. Quantification des vecteurs lentiviraux

d. Utilisation des vecteurs en recherche fondamentale & clinique

a. Bactériologie

b. Biologie moléculaire

c. Biologie cellulaire

GÉNÉRALITÉS SUR LES LENTIVIRUSa. Classification

➢ 2 catégories (exo- et endogène), 2 sous familles (orthoretrovirinae et spumaretrovirinae) et 7 genres au total

➢ Trois catégories sur le plan infectieux les oncovirus, les lentivirus et les spumavirus

GÉNÉRALITÉS SUR LES LENTIVIRUSb. Organisation et expression génomique

GÉNÉRALITÉS SUR LES LENTIVIRUSb. Organisation et expression génomique

GÉNÉRALITÉS SUR LES LENTIVIRUSc. Cycle viral Phases précoces

- 1 -Reconnaissance et fixation du récepteur virale au ligand cellulaire

- 2 - Fusion membranaire

- 3 - Décapsidation du génome et reverse transcription

- 4 - Transport du génome vers le noyau

- 5 - Intégration de l’ADN viral au génome cellulaire

Phases tardives

- 6 - Transcription du génome viral

- 7 - Traduction

- 8 - Assemblage et bourgeonnement des particules virales

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GÉNÉRALITÉS SUR LES LENTIVIRUSd. La reverse transcription

Etapes

- 1 -- Hybridation d’une amorce ARN (tRNA-Lys) au niveau du site

primaire d’amorçage (PBS).

- 2 -

- Début de la synthèse du brin (-) d’ADN avec le tRNA-Lyscomme amorce, en 5’ de l’ARN génomique.

- L’ARN du complexe hybride ARN:ADN est dégradé, .- Le brin (-) d’ADN néo-synthétisé est alors transféré à

l’extrémité 3’ du brin (+) d’ARN génomique et s’hybride avecla région R pour continuer l’élongation du brin (-) d’ADN.

- 3 -

- La synthèse de l’ADN se poursuit, tandis que l’activité RNaseH dégrade le d’ARN génomique du complexe ARN:ADN àl’exception de 2 séquences spécifiques (cPPT et 3’PPT).

- L’initiation de la synthèse du brin (+) d’ADN débute enutilisant les séquences PPT comme amorces.

- 4 -- La séquence PBS du brin (-) d’ADN est alors transférée et

s’hybride avec celle du brin (+) et la synthèse d’ADN continueet se finit avec déplacement de brin.

- 5 -- Obtention d’un ADN double brin linéaire bordé par 2 LTR, et

contenant en son centre une structure caractéristique à 3brins.

GÉNÉRALITÉS SUR LES LENTIVIRUSe. L’import nucléaire

Etapes

- 1 -Après décapsidation, la capside interagit avecles microtubules pour être acheminée au noyau

- 2 -Le complexe de transcription inverse (RTC) sedirige par saut rapide sur le réseau microtubulaire vers le compartiment nucléaire.

- 3 -Le RTC migre des microtubules vers lesfilaments d’actines, à proximité ducompartiment nucléaire

- 4 - Les filaments d’actine amène alors le RTC versla membrane nucléaire.

- 5 -Les capsides virales, contenant le génome viral,s’ancrent aux complexes des pores nucléaires.

- 6 -

L’ancrage du RTC au pore nucléaire est plusrapide que la RT 1, la plupart de la synthèse del'ADN viral survient dans une capside viraleintacte amarré au pore nucléaire.

- 7 -

Une fois, la reverse transcription achevée, et laformation d’un brin central d’ADN chevauchant,la capside virale se disloque et le complexe dereverse transcription se mature en complexe depré-intégration (PIC).

- 8 -

Le PIC est transporté à travers le pore nucléaire.Il correspond au génome dimérisé par 2molécules d’intégrases qui se fixent au niveaudes LTR. Le PIC est transporté à travers le porenucléaire. Le PIC subit un transportintranucléaire mal caractérisé. Il est alors soitintègré dans la chromatine hôte cellulaire oucircularisé en 1 ou 2 cercles-LTR.

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GÉNÉRALITÉS SUR LES LENTIVIRUSf. L’intégration

Etapes

- 1 -- Dimérisation de l’IN.- Fixation de l’IN sur l’ADN proviral.

- 2 - - Coupure et élimination de di-nucléotides en 3’ de l’ADN proviral par l’IN.

- 3 -- Fixation du complexe dimérique d’IN couplé à l’ADN proviral sur l’ADN

génomique cellulaire.- Coupure du génome cellulaire en quinconce.

- 4 -

- Jointure des extrémités d’l’ADN génomique et proviral par l’IN.- Elimination des mésappariements de di-nucléotides par des enzymes

cellulaires.- Remplissage des lacunes par des enzymes cellulaires.- Ligation par des enzymes cellulaires.

- 5 -- Intégration de l’ADN proviral.- Apparition de formes circulaires épisomiques à 1-LTR ou 2-LTR.

Développement de vecteurs lentiviraux déficient dans l’intégration

UTILISATION DES LENTI-VECTEURS

Outils unique avec de nombreux avantages

• Système intégratifLongue et stable expression du transgène

• Système non réplicatif

• Infection de cellules quiescentes

• Non immunogène

• SpécificitéPseudotypage et promoteur tissus spécifique

UTILISATION DES LENTI-VECTEURSa. Construction des vecteurs lentiviraux

cPPT PPT

Délétion des séquences virales pathogènes

Insertion de séquencesd’intérêts :

Conservation des séquencesrequises dans :- Transcription inverse- Import nucléaire- Intégration

Séquence promoteur

Gènes rapporteur

Séquences multicistronique

Séquences multidirectionnelles

UTILISATION DES LENTI-VECTEURSb. Production des vecteurs lentiviraux

Plasmide d’encapsidation Plasmide vecteur Plasmide d’enveloppe

Transfection au phosphate de calcium

Lignée 293T

Concentration et/ou purification

Procédure :

➢ Jour -1 : Préparation des cellules (80x103

cellules/cm-2)➢ Jour 0 : Transfection au phosphate de calcium des

cellules à l’aide des 3 plasmides➢ Jour 1 : Observation de l’efficacité de transfection

et changement de milieu➢ Jour 2 : récupération du surnageant, clarification,

filtration et titration

UTILISATION DES LENTI-VECTEURSc. Quantification des vecteurs lentiviraux

Procédure :

➢ Jour -1 : Préparation des cellules (25x103

cellules/cm-2)➢ Jour 0 : Changement du milieu et infection en

dilution limite➢ Jour 4 : Préparation des cellules selon la méthode

de titration

Mesure du nombre de particules infectieuses Mesure du nombre de particules fonctionnelles

Mesure du nombre de particules physique

UTILISATION DES LENTI-VECTEURSd. Utilisation des vecteurs en recherche fondamentale & clinique

NOS PRESTATIONS & SERVICESa. Bactériologie

Bactéries compétentes (JM109, TOP10, Stellar, ...)

Plasmide Transformation (HS ou EP)

Amplification et contrôle qualité du plasmide

Pré-cultures (3-5 mL) & MiniP Culture (300 -500 mL) & MaxiP

260/230 260/280

> 2 1,8 et 2Forme native plasmidique

fondamentalepour l’efficacité de transfection

NOS PRESTATIONS & SERVICESb. Biologie moléculaire

Méthodes de clonage classique remplacées par le système In-Fusion

Procédure :

➢ Jour 1 : Amplification de l’insert par PCR et préparation du vecteur par restriction enzymatique

➢ Jour 2 : Purification de l’insert et du vecteur sur gel, réaction In-Fusion, transformation

➢ Jour 3 & 4 : Validation des clones sélectionnés

Permet d’augmenter la réussite de clonage de vecteurs lentiviraux complexes

Au final système plus simple, rapide,, efficace et flexible(mutagénèse dirigée, clonage one step de plusieurs fragments, ...)

NOS PRESTATIONS & SERVICESc. Biologie cellulaire

Différentes prestations impliquant la production & utilisation de vecteurs lentiviraux

Projet NDFSU4

➢ Objectif : Caractérisation fonctionnelle de l’expression de la copie (+) du gène NFSU4 dans des fibroblastes primaire de patients

➢ Méthodologie & résultats : • Clonage moléculaire du gène sauvage dans un vecteur lentiviral exprimant un gène de sélection

• Production d’un vecteur contrôle LV-RFP-IRES-PURO et du vecteur d’intérêt LV-NDFSU4-IRES-PURO

• Evaluation de l’infectivité des cellules par un vecteur lentiviral exprimant la RFP

• Evaluation de la dose optimale de l’agent de sélection

• Production du vecteur d’intérêt et livraison

In-Fusion

Fibroblastes humain primaires infectés par 1x105 TU/mL de LV-RFP-IRES-PURO

1 µg/mL Puro

- LV + LV

1 µg/mL Puro

Fi le: VP35_2.5.001 Sam ple ID: J1

Gated Events: 9571 Total Events: 10000

Quad Events % Gated % Tota l Y Mean Y Geo Mean

UL 0 0.00 0.00 *** ***

UR 855 8.93 8.55 176.41 141.21

LL 0 0.00 0.00 *** ***

LR 8716 91.07 87.16 3.66 3.06

Fi le: VP35_2.5.002 Sam ple ID: J1

Gated Events: 9537 Total Events: 10000

Quad Events % Gated % Tota l Y Mean Y Geo Mean

UL 0 0.00 0.00 *** ***

UR 4980 52.22 49.80 294.99 208.81

LL 0 0.00 0.00 *** ***

LR 4557 47.78 45.57 5.36 4.10

Fi le: VP35_2.5.003 Sam ple ID: J1

Gated Events: 9319 Total Events: 10000

Quad Events % Gated % Tota l Y Mean Y Geo Mean

UL 0 0.00 0.00 *** ***

UR 8732 93.70 87.32 1535.89 1003.91

LL 0 0.00 0.00 *** ***

LR 587 6.30 5.87 9.81 7.84

R1

R1

R1

87 %

FSC

RFP

CNRS 6214/INSERM 1083

REMERCIEMENTS