UMR911

Diane Braguer

Les microtubules :Les microtubules :

une cible thérapeutique d’avenir ?une cible thérapeutique d’avenir ?

AcadPharm2010AcadPharm2010

Cytosquelette et progression tumoraleCytosquelette et progression tumorale

Adhésion, Migration,

Polarité, Transport,

Mitose

cellules tumorales et endothéliales

Prolifération

Migration

InvasionNeo-angiogenèse

Agents anti-microtubules

(MTA)

Structure du microtubule et instabilité dynamiqueStructure du microtubule et instabilité dynamique

Cytosquelette microtubulaire et progression tumoraleCytosquelette microtubulaire et progression tumorale

HUVEC (GFP-tubulin)

Instabilité dynamique des microtubulesInstabilité dynamique des microtubules

Dis1/TOG

Structural MAPs (MAP1, MAP2, MAP4, Tau)

+ TIPs and co-polymerizing factors (EB1, CLIP 170, APC, CLASPs)

Instabilité dynamique des microtubulesInstabilité dynamique des microtubules

Depolymerizing Kinesin-13 proteinsStathmin Katanin

Les agents antiLes agents anti--microtubules : de puissants microtubules : de puissants anticancéreuxanticancéreux

Adapté de Moris & Fornier, Clin CancerRes2008Adapté de Moris & Fornier, Clin CancerRes2008

Limites à l’utilisation clinique des MTALimites à l’utilisation clinique des MTA

Augmentation de l’effluxAugmentation de l’efflux

Mutations ponctuelles de Mutations ponctuelles de αααααααα ou ou ββββββββ tubulinetubuline

Modifications postModifications post--traductionnelles d’traductionnelles d’αααααααα--tubulinetubuline

Expression des isotypes de Expression des isotypes de ββββββββ--tubulinetubuline

Altération des MAPs Altération des MAPs

Résistance tumoraleRésistance tumorale

ToxicitéToxicité

HématologieHématologie

Neuropathie périphérique Neuropathie périphérique

Hypersensibilité Hypersensibilité

Recherche de nouvelles cibles thérapeutiques du réseau microtubulaireRecherche de nouvelles cibles thérapeutiques du réseau microtubulaire

Ex : KSP and CENPEx : KSP and CENP--E InhibitorsE Inhibitors

Dynamique des Microtubules et Progression TumoraleDynamique des Microtubules et Progression Tumorale

High concentrationsHigh concentrations

SUPPRESSIONSUPPRESSION

Disturbance of

interphase functions

LowLow concentrationsconcentrations

INCREASEINCREASE

Mitotic block

MTAMTA

MT DynamicsMT Dynamics

CytotoxicityGonçalves, PNAS 2001Honoré, Mol Cancer Ther 2003Honoré, Cancer Res 2004Pourroy, Mol Pharmacol 2004Esteve, Mol Cancer Ther 2006Khawaja, Mol Pharmacol 2008Bourgarel-Rey et al, Biochem Pharmacol 2009

Pasquier et al., Mol Cancer Ther 2004Pasquier et al., Cancer Res 2005Pourroy et al., Cancer Res 2006Honoré et al, Mol Cancer Ther 2008Zaoui et al. J Cell Biol 2008

Anti- migration

Inhibition of endothelial cell

migration and differentiationApoptosis of tumor cells

Inhibition de l’angiogenèse par les MTA à de faibles Inhibition de l’angiogenèse par les MTA à de faibles concentrations nonconcentrations non--cytotoxiquescytotoxiques

VFL 2nMControl

Inhibition of capillary-like tubes on Matrigel®

500

1000

1500

2000

2500

3000

To

tal tu

be

le

ng

th/f

ield

(µ

m)

0

25

50

75

100

0.1 1 10 100 1000

Su

rviv

ing

cell

s (

%)

VFL (nM)

Pasquier et al, Cancer Res 2005Pasquier et al, Cancer Res 2005

Pourroy et al, Cancer Res 2006Pourroy et al, Cancer Res 2006

0-5 0 5 10 15 20 25

VFL (nM)

2939

52 54

-23 -21-40

-20

0

20

40

60

80

0,1 0,5 1 2 5 20

VFL (nM)

Over

all

dynam

icit

yO

ver

all

dynam

icit

y

(% c

han

ge)

(% c

han

ge)

CytotoxicAntiangiogenic (non-cytotoxic)

Control HMEC-1 VFL 2 nMPourroy B et al, Cancer Res 2006

Les MTA à faibles concentrations sont antiLes MTA à faibles concentrations sont anti--migratoiresmigratoires

-20

0

20

40

60

80

100

-30 -20 -10 0 10 20 30

µm

µm

Ra

nd

om

mo

tili

ty

coef

fici

ent

(µm

²/m

in)

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

0 0.5 1 1.5 2VFL (nM)

Velocity : 0.61 µm/min Velocity 0.49 µm/min0.49 µm/min0.49 µm/min0.49 µm/min

La vinflunine est antimigratoire en inhibant le ciblage et les pauses des microtubules au niveau des sites d’adhérence

Controle Vinflunine 1 nM

Tubuline

EB1 Vinflunine 1 nM

La vinflunine inhibe l’accumulation de EB1 à l’extrémité + des La vinflunine inhibe l’accumulation de EB1 à l’extrémité + des microtubulesmicrotubules

ContrôleContrôle

Honore S et al, Mol Cancer Ther 2008

Les MTA délocalisent EB1 de l’extrémité + des microtubulesLes MTA délocalisent EB1 de l’extrémité + des microtubules

U87 patupilone (1 nM)U87 patupilone (1 nM)

A.Pagano A.Pagano

microtubule

APC

CAP-gly

EB1, plateEB1, plate--forme pour des complexes de protéinesforme pour des complexes de protéines

CH CC

Perspective : comprendre l’interaction dynamique du Perspective : comprendre l’interaction dynamique du microtubule au cortex cellulairemicrotubule au cortex cellulaire

Projet 1 : Modifications postProjet 1 : Modifications post--traductionnelles de EB1traductionnelles de EB1

Billes magnétiques SH/SMCC/Anti EB1 (1/100) 2D et IEF2D et IEF

Approche protéomiqueApproche protéomique

EB1

Billes magnétiques SH/SMCC/Anti EB1 (1/100)

µµµµl5555 10101010 20202020

Input C S C S C S

2D et IEF2D et IEF

Digestion Trypsine, MALDI-TOF-TOF

Approche fonctionnelleApproche fonctionnelle

Interaction microtubule / Site d’adhérenceInteraction microtubule / Site d’adhérence

TubulinTubulin--GFPGFP

Vert: videomicroscopieVert: videomicroscopie

Rouge: TIRFRouge: TIRF

EB1EB1

Double TIRFDouble TIRF

TubulineTubuline

PaxillinePaxilline

PaxillinePaxilline

Projet 2 : Partenaires de EB1 avec domaine CAPProjet 2 : Partenaires de EB1 avec domaine CAP--GlyGly

NH2

NH2

NH2

NH2

NH2

H2N

NH2

NH2NH2

NH2

NH2

H2N

H2N

H2N

NH2

H2N

NH2

NH2

NH2

NH2

H2N

Sulfo-SMCCBilles magnétiques

ou agarose

Peptide C-ter (Y/F)

S

Domaine CAP-glyrecombinant

-NH

SPeptide

Criblage pharmacologique Criblage pharmacologique

Lysat cellulaire Lysat cellulaire

±±Migration Migration

Protéines PartenairesProtéines Partenaires

Collaborations

M. Steinmetz, Biomolecular Research, Villigen, Switzerland

N. Galjart, Erasmus Medical Center, Rotterdam, Holland

A. Straube, University of Edinburgh, Edinburgh, Scotland

O. Jensen and P. Roepstorff,University of Southern Denmark, Odense, Denmark

A J HeckA J HeckUtrech University, The NetherlandsUtrech University, The Netherlands

M.-A. Jordan and L. Wilson,

S. HONOREA.PAGANO

G.GAUTHIERM.CARREA.ROVININ.McKay

Equipe 1Equipe 1Cytosquelette microtubulaireCytosquelette microtubulaire

et progression tumorale et progression tumorale

M.-A. Jordan and L. Wilson, University of Santa barbara, California, USA

Y.ColetteY.ColetteINSERM UMR 891, MarseilleINSERM UMR 891, Marseille

X.MorelliX.MorelliCNRS FRE 3083 MarseilleCNRS FRE 3083 Marseille

P. VERDIER-PINARDD. LAFITTE C. VILLARD

D.CALLIGARIS

Microtubule dynamics and cell migration Microtubule dynamics and cell migration

Ruffles

Leading edge

Trailing edge

Actin /MT crosstalk

MT targeting of Focal Adhesion Nucleus

MTOC(MT – ends)

Focal Adhesion turnover

Stabilisation of MT + end at the leading edge (FAK Rho mDia)

Growing MTs + ends(activation of Rac1)

Filipodium

Stress fibersLamellipodiumActin meshwork(High Rac activity,Actin retrograde

flow)

Direction of migration

Focal Adhesion

Focal Complexe

Pausing and Shortening MT + ends

crosstalk

Lamella

(MT – ends)