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Les sillons de l ’ADN. L’ ADN sous forme B. Observer la différence entre le grand sillon le petit sillon Intéressant pour la reconnaissance des protéines. Les sillons de l ’ARN. L’ ARN sous forme A. le petit sillon le grand sillon. Large et peu profond. Étroit et profond. - PowerPoint PPT Presentation
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Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Les sillons de l ’ADN
Observer la différence entre
le grand sillon
le petit sillon
Intéressant pour la reconnaissancedes protéines
L’ ADN sous forme BL’ ADN sous forme B
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
L’ ARN sous forme AL’ ARN sous forme A
Les sillons de l ’ARN
le petit sillon
le grand sillon
le petit sillon
le grand sillon
Large et peu profond
Étroit et profond
donc propriétés de reconnaissancecomplètement différentes de celles de l’ADN.
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Forme
Nombre de paires de bases par tour
Angle de torsion par paire de base
Pas de l'hélice
Distance axiale entre les paires de bases
Angle de basculement
Largeur des sillons Grand
Petit
Distance du phosphore à l'axe de l'hélice
B
10 (10,4)
36°
34 Å
3,4 Å
voisin de 0
11,4 Å
6,0 Å
9,3 Å
A
11
32,7°
29 Å
2,6 Å
à peu près 20
2,4 Å
11,0 Å
9,5 Å
Forme
Nombre de paires de bases par tour
Angle de torsion par paire de base
Pas de l'hélice
Distance axiale entre les paires de bases
Angle de basculement
Largeur des sillons Grand
Petit
Distance du phosphore à l'axe de l'hélice
B
10 (10,4)
36°
34 Å
3,4 Å
voisin de 0
11,4 Å
6,0 Å
9,3 Å
A
11
32,7°
29 Å
2,6 Å
à peu près 20
2,4 Å
11,0 Å
9,5 Å
Caractéristiques des formes canoniques A et B des AN34
Å3,
4Å
Forme B
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
A : rappels sur le génome
Les acides nucléiquesLe DNA circulaire
La chromatine
B: Les outils de la biologie moléculaireEnzymes qui coupent les acides nucléiquesEnzymes qui changent les contraintes des ANEnzymes qui travaillent sur les phosphatesEnzymes qui recopient les acides nucléiques
C: Les techniques de la biologie moléculairePurification des acides nucléiquesElectrophorèse sur gelMéthode de transfert d’après SouthernTechnique de l’amplification géniqueLe séquençage de l’ADN
Plan du cours : première partie
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
L’ADN Circulaire
l’ADN circulaire
Une forme particulière de l’ADN
DéfinitionSens des super enroulementsNotion de topoisomèresImportance des ADN circulaires
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Molécule d’ADN circulaireMolécule d’ADN circulaire
5’
5’ 3’
3’
La chaine d’ADN peut ce circulariser et chaque brin se refermer sur lui même par des liaisons phosphodiester
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
LE SUPERENROULEMENT POSITIFLE SUPERENROULEMENT POSITIF
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
LE SUPERENROULEMENT NÉGATIFLE SUPERENROULEMENT NÉGATIF
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
LE SUPERENROULEMENT LE SUPERENROULEMENT
POSITIFPOSITIF
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
LE SUPERENROULEMENT LE SUPERENROULEMENT
NÉGATIFNÉGATIF
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
ADN circulaire : topoisomèresADN circulaire : topoisomères
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Relaxée Torsadée Super torsadée
Topoisomères de l’ADN circulaireTopoisomères de l’ADN circulaire
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
La Chromatine
La structure de l’ADN dans la cellule
la chromatine
Pourquoi compacter l’ADN dans la cellule ?
La machinerie de compaction
Les histones
Le nucléosome
Les superstructures de l’ADN
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Compaction de l’ADNCompaction de l’ADN
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Modèle de compaction de l’ADNModèle de compaction de l’ADN
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Double hélice d ’ADN
Double hélice d’ADN + histones
Fibre dechromatine
ChromatideChromosome
Compactions de l ’ADNCompactions de l ’ADN
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
- Comprend de l'ADN (environ 200 pb)
-Des protéines :
-des histones sous forme d'octamères:
2 x H2A, 2 x H2B, 2 x H3 et 2 x H4
et des protéines non histones.
- La protéine histone H1 est extérieure à la partie
principale du nucléosome. Elle est sous forme
d'une protéine unique.
LE NUCLÉOSOMELE NUCLÉOSOME
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Le nucléosomeLe nucléosome
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
200 pb 200 pb d'ADNd'ADN
Histones : 2 X H2A, 2 X H2B, 2 X H3 et 2 X H4Histones : 2 X H2A, 2 X H2B, 2 X H3 et 2 X H4
LE NUCLÉOSOMELE NUCLÉOSOME
Histone H1
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Empaquetage de l’ADNEmpaquetage de l’ADN
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Chromosomes humainsChromosomes humains
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Les outils de la biologie moléculaire
• Enzymes qui coupent les acides nucléiques
• Enzymes qui changent les contraintes des AN
• Enzymes qui travaillent sur les phosphates
• Enzymes qui recopient les acides nucléiques
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
C A G
3’
PP P P
3’ 3’
5’ 5’ 5’
Polarité de la chaîne d’ADNPolarité de la chaîne d’ADN
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Les nucléases
Les enzymes de restriction
La DNase I
La nucléase S1
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Les enzymes de restriction
DéfinitionLe palindromeSymétrie de la coupureCoupure à bouts collantsCoupure à bouts francsRestriction et méthylation de l’ADN
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Les enzymes de restriction sont des outils utilisés pour couper l’ADN.La coupure de l’ADN se fait en un site particulier reconnu par l’enzyme.Chaque enzyme reconnaît une séquence d’ADN qui lui est spécifique.
Les enzymes de restriction appartiennent à la classe des endonucléasesc’est-à-dire des enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entredeux nucléotides à l’intérieur d’un acide nucléique
Les endonucléases se différencient des exonucléases qui dégradent la molécule d’ADN à partir de l’une de ses extrémités (3’ ou 5’).
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
Les enzymes de restrictionLes enzymes de restriction
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Enzymes de restrictionEnzymes de restriction
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Les séquences de nucléotidesReconnues par les enzymes derestriction sont habituellementdes séquences dites palindromiques.Les séquences palindromiques sontdes séquences où la succession desnucléotides lue dans le sens 5’3’(gauche - droite) pour le premier brinest identique à la séquencelue dans le sens droite - gauche pourle second brin (sens 5’3’).Ces séquences palindromiques sontle plus souvent constituées de 4 ou 6 paires de bases.
LAVALMot palindromique
Séquence palindromique
5’- GAATTC -3’3’- CTTAAG -5’
PalindromePalindrome
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Sites de restrictionSites de restriction
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Symétrie des enzymes de restrictionSymétrie des enzymes de restriction
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LES COUPURES À BOUTS COLLANTSLES COUPURES À BOUTS COLLANTS
Enzyme Eco RIEnzyme Eco RI : :
5'5' -- G G A A T T C - A A T T C - 3'3'
3'3' -- C C T T A A T T A A G - G - 5'5'
5’ – G – 3’OH 5’P – AATTC – 3’5’ – G – 3’OH 5’P – AATTC – 3’
3’ –3’ – CTAAGCTAAG – 5’P 3’OH – G – 5’– 5’P 3’OH – G – 5’
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
LES COUPURES À BOUTS FRANCSLES COUPURES À BOUTS FRANCSEnzyme Hae IIIEnzyme Hae III : :
5'5' -- G G G G C C C C - - 3'3'
3'3' -- C C C C G G G G - - 5‘5‘
5’ – GG – 3’OH 5’P 5’ – GG – 3’OH 5’P – – CCCC – – 3’3’
3’ 3’ –– CC CC – – 5’P 3’OH – GG – 3’5’P 3’OH – GG – 3’
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
MÉTHYLATION DES CYTOSINES MÉTHYLATION DES CYTOSINES Enzyme Msp IEnzyme Msp I : : CoupureCoupure
5'5' -- C C C* G G - C* G G - 3'3'
3'3' -- G G C* G G C* C C - - 5'5'
Enzyme Hpa IIEnzyme Hpa II : : Pas de coupurePas de coupure
5'5' -- C C* G G - C C* G G - 3'3'
3'3' -- G G C* CG G C* C - - 5'5'
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
MÉTHYLATION DES SITES DE RESTRICTIONMÉTHYLATION DES SITES DE RESTRICTION
Enzyme Hind IIIEnzyme Hind III : coupure par l'enzyme : coupure par l'enzyme..5'5' -- AAA G C T TA G C T T - - 3'3'
3'3' -- T T C G AT T C G A A A - - 5‘5‘
Enzyme Hind III (avec hémi-méthylation sur Enzyme Hind III (avec hémi-méthylation sur
l'adénine en N6)l'adénine en N6) : Absence de coupure par Hind III. : Absence de coupure par Hind III.
5'5' -- A*A*A G C T TA G C T T - - 3'3'
3'3' -- T T C G A AT T C G A A - - 5'5'
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
LA DNase ILA DNase I
5' 3'
3'3' 5'5'
C'est une endonucléaseC'est une endonucléase
Ses coupures se font au hasardSes coupures se font au hasard
Elle coupe l'ADN (simple ou double brin)Elle coupe l'ADN (simple ou double brin)
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
La DNase 1 est une endonucléase qui dégradel’ADN double brin ou simple brin.
Les coupures (« nicks ») sont complètementaléatoires sans spécificité de site.
Les produits de la réaction sont des oligonucléotidesqui possèdent un groupement phosphate en 5’.
L’activité dépend des ions bivalents (Mg2+ et Mn2+)
La DNaseLa DNase
P P P PP
P P P PP
3’
5’OH
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
La Nucléase S1La Nucléase S1
La nucléase S1 dégrade l’ADN simple brin.
Nettoie les extrémités simples brins.Coupe un misappariement
Sans activité sur le double brin « parfait »Sans activité sur les hybrides ADN/ARN
S1
5’
5’3’
3’
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Enzymes des phosphates
Les phosphatases
Les kinases
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Phosphatases et KinasesPhosphatases et Kinases
Les phosphatases sont des enzymes qui enlèventles groupements phosphates situés en 5’ d’une chaîne d’ADN.Phosphatase alcaline est active à pH basique.
Les kinases, à l’inverse des phosphatases, sont desenzymes qui ajoutent un groupement phosphate àl’extrèmité 5’ d’un ADN , en présence d’ATP.
C’est le phosphate en γ de l’ATP qui est transféré.
αβγ A
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Enzymes recopiant les acides nucléiquesEnzymes recopiant les acides nucléiques
Enzymes recopiant l’ADN ou l’ARN
DNA polymérase DNA dépendanteDNA polymérase RNA dépendanteRNA polymérase DNA dépendanteRNA polymérase RNA dépendante
Ces enzymes synthétisent le nouveau brin dans le sens 5’ -> 3’
La synthèse se fait de manière complémentaire et antiparallèle.
L’enzyme fonctionne en présence de nucléosides triphosphates(XTP) ou de désoxynucléosides (dXTP)
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Les DNA polymérases
Propriétés
DNA polymérase DNA dépendante
DNA polymérase I : Activités exonucléasiques
Fragment de Klenow
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
LES ADN POLYMÉRASESLES ADN POLYMÉRASES - Un brin d'ADN matrice- Un brin d'ADN matrice
- Une amorce oligonucléotidique- Une amorce oligonucléotidique
- Une synthèse du brin nouveau 5'- Une synthèse du brin nouveau 5' 3' 3'
3'(OH)3'(OH) 5'5'
5'5' 3'3'
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
DNA polymérase DNA dépendanteDNA polymérase DNA dépendante
Ces enzymes recopient l’ADN en ADN.Elles nécessitent une amorce d’acide nucléique.La réaction catalysée est:(dXMP)n + dXTP (dNMP)n+1 + PPi
Amorce avec une extrémité 3’-OH libre
La nouvelle chaîne est synthétisée dansle sens 5’ 3’
Règle de complémentarité et de polarité inverse
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
La DNA polymérase 1La DNA polymérase 1
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
Fragment de KLENOWFragment de KLENOW
Le fragment de Klenow est préparé à partir de la DNA polymérse 1 d’E.coli.
Ce fragment ne possède plus d’activité exonucléasique 5’ 3’ mais garde l’activité polymérasique et l’activité exonucléasique 3’ 5’.
Cette enzyme est utilisée au laboratoire car elle permet de contrôler si la base qui vient d’être ajoutée obéit à la règle de complémentarité.(fonction d’édition)
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
LES ARN POLYMÉRASESLES ARN POLYMÉRASES
- Synthèse d'ARN sans amorce préalable.- Synthèse d'ARN sans amorce préalable.
- Présence de nucléotides : NTPs et d'ions - Présence de nucléotides : NTPs et d'ions
magnésium (Mgmagnésium (Mg2+2+).).
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01
- Une synthèse du brin nouveau dans le - Une synthèse du brin nouveau dans le
sens 5'sens 5' 3'. 3'.
- Absence de fonction d'édition.- Absence de fonction d'édition.
- Nécessité de reconnaître le promoteur - Nécessité de reconnaître le promoteur
spécifique correspondant.spécifique correspondant.
Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01