Eprouvette  UNIL Journées Xfragile

Les techniques de diagnosticde diagnostic des maladies génétiques

Dr Danielle MartinetSpéc. FAMH en analyses de génétique médicaleService de génétique médicale

Présentation

Service de génétique médicaleProf. J.Beckmann

Réseaux

Équipe génétique cytogénétique cytogénétique

Hôpitaux de zone

q pmédicale

g qmoléculaire

y g qconstitutionnelle

gynécologie

y g qdu cancer

gynécologieobstétrique

Laboratoire NeurologieLaboratoireprivé

Pédiatrie

NeurologieAutres ServicesCHUV

Associations

Médecinsinstallés

Hôpital de l’enfance

CHUVRechercheDGM /Ped.mol./ UNIL / EPFL…

Hôpitalophtalmique

•GENERALITES

•TECHNIQUES DE DIAGNOSTICTECHNIQUES DE DIAGNOSTIC 

ANALYSES DIAGNOSTIQUES AU QUOTIDIEN

DU DIAGNOSTIC A LA RECHERCHE

Catégories de maladies génétiquesCatégories de maladies génétiquesGénéralités

* Chromosomiques

* Monogéniques / mendéliennes

‐ dominantes‐ récessives‐ liées à l’X

* Mitochondriales 

* Empreinte parentale

* Multifactorielles / polygéniques / complexes

‐malformations congénitales isoléesl di‐ « maladies communes »

Exemples de Exemples de maladies génétiquesmaladies génétiquesGénéralités

S d X F ilSyndrome X‐FragileMucoviscidose Chorée de HuntingtonChorée de HuntingtonAchondroplasieDrépanocytosePrédisposition familiale aux cancers du sein et de l’ovaire (BRCA1 et BRCA2)S d d P d WillSyndrome de Prader‐WillyTrisomie 21Syndrome de TurnerSyndrome de Turner

6000 7000 l di (1/2000)6000‐7000 maladies rares (1/2000)

Analyses diagnostiques

Loi sur l’analyse génétique (LAGH) Ordonnance sur l’analyse génétique (OAGH)

CaryotypeFISHPuces à ADN

Choix ,T h i

OBJECTIFS DIAGNOSTICS

MLPAPCR, Southern Blot, Séquençage

Techniques,Approche la plus 

adaptéeq ç g

……

SpécificitéQualité

Haute résolution SensibilitéContrôles de qualité

FiabilitéExpertise/ExpériencesRé

Interprétation

Diagnostic /

Réseaux  

Délai /Recherche

Délai

LIMITES  

TECHNIQUES DIAGNOSTIQUES

Ce qui est recherché est  trouvé

Mais…. n’est retrouvé (souvent) que ce qui est recherché( ) q q

OBJECTIFS DE DEVELOPPEMENT  

Chercher « partout », voir mieux, rapidement et.. pas cher

A optimiser: choix de l’approche, sensibilité, spécificité,Et l’interprétationEt  l interprétation 

TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC

R h h d t ti

SEQUENCES d’ADN

Recherche de mutations

SEQUENCES d’ADN

CHROMOSOMES

PRELEVEMENTSTECHNIQUES DE DIAGNOSTIC

…..

Sang,           peau,                 frottis buccal     etc..        liquide     amniotiqueamniotique

ANALYSES GENETIQUES

Caryotype émoléculaire

Ex: infertilité Ex: S. Williams Ex: S. X fragileEx: 16p11.2

11

TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC    ‐ ANALYSES DIAGNOSTIQUES CLASSIQUES

Caryotype

Culture cellulaire Stade métaphase Stade interphase

PRATIQUE        PREPARATION DES LAMES POUR L’ANALYSE

Culture cellulaire 

2

2

pStade interphase

Division cellulaire7

7

Analyse desChromosomes

Caryotype  FISH

Interprétation Résultat anormal: 46,XY,del(5)(p13p15.1) délétion hétérozygote sur un des chromosomes 5  impliquant  la région  du bras court…….

Li id i iCulture cellulaire 

PRATIQUE        PREPARATION DES LAMES POUR L’ANALYSE

Liquide amniotique

Division cellulaire

Mise en cultureAnalyse desChromosomes

Changement demilieu

InterprétationInterprétation

Culture cellulaire

PRATIQUE        PREPARATION DES LAMES POUR L’ANALYSE

Division cellulaire(Etuve à CO2)

Culture cellulaire 

Division cellulaire

Analyse desChromosomes

Formation d’un clone

Clones cellulairesLiquide amniotique

observationInterprétation

Culture cellulaire

PRATIQUE        PREPARATION DES LAMES POUR L’ANALYSE

é h d é

Culture cellulaire 

Température, humidité,Vent ‐ bise….  métro

ColorationsDivision cellulaire

l hMicroscope Analyse sur photo

Système d’analyseordinateur

Analyse desChromosomes

I t ét ti

Dossiers en attented’interprétation

Interprétation Résultat anormal :     présence d’une translocation entre les chromosomes….Interprétation

mutations de grandes tailles

Caryotype

LES ANOMALIES CHROMOSOMIQUES

Ca yotype

métaphase

caryotype

Résultat: 46,XY    masculin normal

Exemple de caryotype anormal: li d b

LES ANOMALIES CHROMOSOMIQUES

anomalie de nombre

« Le Huitième jour, Georges et Harry »Pascal Duquenne et Daniel Auteuil.

Risque T21: /1/2000 naissances vers 20 ans

‐ 1/400 vers 38 ans‐ 1/100 vers 40 ans

‐ 50 000 personnes trisomiques en France400 000 E‐ 400 000 en Europe,

‐ 8 millions dans le monde. 

Choix de la stratégie diagnostique

MUTATION GENIQUE‐ RECHERCHE DE MUTATIONS DE PETITE TAILLE

‐Maladie (homogénéité /hétérogénéité génétique)

‐Mutation récurrente ou hétérogénéité allèlique

Différents types de mutations

E t ti d’ADN

‐ Différents types de mutations

Extraction d’ADN

PCR

Séquençage

Situations 

1) Mutations prédéfinies: screening  (criblage)

2) Mutations inconnues: scanning  (balayage)) g ( y g )

1) Mutations prédéfinies: screening  (criblage)

MUTATION GENIQUE‐ RECHERCHE DE MUTATIONS DE PETITE TAILLE

Exemple de la mucoviscidoseMaladie autosomique récessiveGène impliqué: CFTR

Analyse: détection de certaines mutations par hybridation inverse sur bandelettes

‐ Extraction d’ADN‐ PCR (exon spécifique)‐ Hybridation‐ Hybridation du produit d’amplification‐ Révélation (biotine‐streptavidine)

2)     Mutations inconnue: scanning  (balayage)

MUTATION GENIQUE‐ RECHERCHE DE MUTATIONS DE PETITE TAILLE

exon1 ex2 ex3 ex4 ex5

ATG

) g ( y g )

Amplification régions codantes

Séquençage

amorce amorce

q ç g

Séquence de référence(bases de données)

Séquence du patient

Comparaison desSéquence

Substitution d’un nucléotide hétérozygote

.. CCC  CTG  CTA  TGC  CCT  …CYS

.. CCC  CTG  CTA  TGA  CCT  …STOP

Exemple d’une mutationMUTATION GENIQUE‐ RECHERCHE DE MUTATIONS DE PETITE TAILLE

Interprétation:  Mutation ou polymorphisme?

délétère sans conséquence pathologique

Substitution trouvée chez d’autres patients?

Substitution absente dans une population contrôle?

Changement biochimique important au niveau de l’acide aminé

Séquence conservée au cours de l’évolution

Ségrégation avec la maladie ?Néomutation chez un enfant dont les parents ne sont pas malades

Altération de la fonction téi ? M déli ti ?

parents ne sont pas maladesEtude fonctionnelle de la protéine in vitro/in vivo

protéique? Modélisation?

TECHNIQUES DIAGNOSTIQUES

‐ Recherche translationnelle

DEVELOP‐PEMENT

translationnelle

PEMENT

DIAGNOSTICDIAGNOSTIC‐Diagnostic ‐pré et postnatalNOUVELLES

TECHNOLOGIES

Analyses génétiques

E E

Caryotype é

Ex: infertilité Ex: Syndrome Williams

Ex: Xfragile

moléculaire

24

Caryotype

VOIR 1000 x plus

y yp

X 1000Puces à ADN

X 1000

Définition du nombre de copies génomiques

NOUVELLES TECHNIQUES DIAGNOSTIQUES  ‐ Analyse

Analyse des profils

p g q

Résultat normalAnalyse des profils progamme CGH Analytics

Résultat anormal Résultat anormal

perte gain

Résultat anormal Résultat anormal

p g

Informations ‐ réflexions

1000 x

Puce à ADNoeil microscope

1000xPuce à ADNoeil               microscope                  

informations +++informations +++

Database of genomic variants http://projects.tcag.ca/variation/cgi‐bin/gbrowse/hg18

NOUVELLES TECHNIQUES DIAGNOSTIQUES  ‐ INTERPRETATIONS

ENSEMBL  http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html

NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?taxid=9606&chr=11

DECIPHER htpps://www.Decipher.com

OMIM  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=608548

Expérience puces à ADN au CHUV

NOUVELLES TECHNIQUES DIAGNOSTIQUES  ‐ INFORMATIONS

p p

Du génotype au phénotype: D i i d dDescription de nouveaux syndromes

TECHNIQUES DIAGNOSTIQUES  

RECHERCHETRANSLATIONNELLE

DIAGNOSTIC

Nouvellestechnologies

Diagnostic 

DU DIAGNOSTIC A LA RECHERCHE

Exemple 2

Caryotype conventionnel 

46, XY masculin normal

Caryotype moléculaire (puce à ADN): 

Délétion 16p11.2

Caryotype conventionnel Caryotype moléculaire

16p11 216p11.2

16p11.2 Deletion

Deletion

del(16)(p11.2p11.2) taille 600kb-980kb

I t ét ti litté t

DU DIAGNOSTIC A LA RECHERCHE

Exemple 2

Interprétation ≠ littérature

XXdel16p11.2

16p11.2 ?

Troubles du comportementTroubles du comportement

alimentaire ? 

DU DIAGNOSTIC A LA RECHERCHE

Cas avec déficits cognitifs avec ou sans obésité 

Analyse pour déficits cognitifs, malformations

Diagnostic cytogénétique 22/3947 0 6%

Del/total

Diagnostic cytogénétiqueGroupes Suisse, français

22/3947       0.6%

Analyse pour déficits cognitifs, malformations et

obésitéobésité

Lille / Strasbourg/Londres9/312         2.9%

Walter, et al., Nature 2010

DU DIAGNOSTIC A LA RECHERCHE

Variation rare étiologie maladie communeVariation rare                    étiologie maladie commune

DU DIAGNOSTIC A LA RECHERCHE

Robin G Walters1,2*, Sébastien Jacquemont 3*, Armand Valsesia4‐6, Adam J de Smith1, Danielle Martinet3, JohannaAndersson1, Mario Falchi1, Fei Chen7, Joris Andrieux8, Stephane Lobbens9, Bruno Delobel10, Fanny Stutzmann9, Julia S El‐Sayed Moustafa1, Jean‐Claude Chèvre9, Cecile Lecoeur9 Vincent Vatin9, Sonia Bouquillon8, Odile Boute11, Jean‐MarieCuisset12, Anne‐Emmanuelle Ambresin13, Andréa Brioshi3, Gaillard Muriel3, Vittorio Giusti14, Florence Fellmann3, AlessandraFerrarini3 Nouchine Hadjkhani7,15 Dominique Campion16 Alice Goldenberg17 Nadège Calmels18 Jean‐Louis Mandel18Ferrarini , Nouchine Hadjkhani , Dominique Campion , Alice Goldenberg , Nadège Calmels , Jean Louis Mandel ,Cedric Le Caignec19,20, Albert David19, Bertrand Isidor19, Marie‐Pierre Cordier21, Sophie Dupuis‐Girod21, Audrey Labalme21,Damien Sanlaville21,22, Mylène Béri‐Deixheimer23, Philippe Jonveaux23, Bruno Leheup23,24, Katrin Õunap25, Richard Ellis26, KayD. MacDermot26, Catherine Vincent‐Delorme27, Ghislaine Plessis28, Renaud Touraine29, Anne Philippe30, Valerie Malin30,Bettina Blaumeiser31, R. Frank Kooy31, Robert Caiazzo32,33, Marie Pigeyre33, Beverley Balkau34, Rob Sladek35,36, SvenB 4 6 Vi t M 37 D W t th37 Al d R d38 P t V ll id 39 Gé d W b 39 A tBergmann4,6, Vincent Mooser37, Dawn Waterworth37, Alexandre Reymond38, Peter Vollenweider39, Gérard Waeber39, AntsKurg40, Priit Palta40, Tõnu Esko41,42, Andres Metspalu41,42, Mari Nelis41,42, Paul Elliott2, Anna‐Liisa Hartikainen43, Mark I.McCarthy44,45, Leena Peltonen46‐48, Lena Carlsson49, Peter Jacobson49, Lars Sjöström49, Katrin Männik40, Marjo‐RiittaJarvelin2,50,51, François Pattou32,33, David Meyre9, Andrew J Walley1, Lachlan JM Coin2, Alexandra IF Blakemore1, PhilippeFroguel1,9†, Jacques S. Beckmann3,4

Jacquemont et al., Nature, August 2011Walter RG et al.,Nature,.2010 Feb 4;463(7281):671‐5.

TECHNIQUES DIAGNOSTIQUES – CONCLUSION (1)

PATIENT AssociationsRéseaux

chercheurDermatologie

PATIENT

Généticiens

scientifiques

pathologie……

bio informaticien

Dermatologie

Ethicien

Généticiensspécialistes

Cardiologie

bio informaticien

pathologie

neurologiepsychiatriePédiatrieophtalmologie

p y

Les techniques de diagnostic des maladies génétiques

MERCIDE VOTRE ATTENTIONDE VOTRE ATTENTION

Danielle MartinetDanielle Martinet079 556 2282