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TOXICOLOGIE
Méthodes de détection des contaminants chimiques dans les aliments
Introduction
1. Les mycotoxines
2. Les substances antimicrobiennes
3. Les pesticides
4. Les composés N-nitrosés
5. Les métaux lourds
Méthodes de détection des contaminants
chimiques dans les aliments
Introduction
• L’insécurité alimentaire : risques microbiologique / chimique
• Nature et origine des contaminants chimiques :
- Synthétisés par l’organisme vivant consommé
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- Synthétisés par des micro-organismes contaminants
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- Apportés volontairement :
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- Contaminants environnementaux
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Méthodes de détection des contaminants
chimiques dans les aliments
Introduction : paramètres des études toxicologiques
Méthodes de détection des contaminants
chimiques dans les aliments
Introduction : établissement des normesLa Commission du Codex Alimentarius, créée en 1963 par la FAO et l'OMS,met au point des normes alimentaires, des lignes directrices et des codesd’usages internationaux et harmonisés visant à protéger la santé desconsommateurs et à assurer des pratiques loyales dans le commerce desaliments. Elle encourage aussi la coordination de tous les travaux relatifs auxnormes alimentaires entrepris par des organisations gouvernementales etnon gouvernementales.
http://www.codexalimentarius.org/
Méthodes de détection des contaminants
chimiques dans les aliments
Introduction : les LMR• Les limites maximales de résidus (LMR) sont les niveaux supérieurs de concentration de
résidus de pesticides autorisés légalement dans ou sur les denrées alimentaires et lesaliments pour animaux. Elles sont fondées sur les bonnes pratiques agricoles et visent àgarantir le niveau d’exposition le plus faible possible pour les consommateurs.
• Le règlement (CE) n° 396/2005 établit les LMR des pesticides autorisés dans les produitsd’origine végétale ou animale destinés à l’alimentation humaine ou animale. Les limitesmaximales de résidus, qui représentent des seuils toxicologiques critiques, sont établis à lasuite d’une évaluation complète.
• L’unité PRAPeR de l’EFSA est chargée d’évaluer les risques associés aux LMR, conformément àla législation. En 2007, l’unité PRAPeR a aidé la Commission européenne à établir des LMReuropéennes temporaires, marquant un premier pas vers l’harmonisation des LMRnationales.
• Les États membres sont tenus d’effectuer des contrôles officiels sur les résidus de pesticidesafin de respecter la réglementation relative aux limites maximales de résidus.
http://www.efsa.europa.eu/fr
Méthodes de détection des contaminants
chimiques dans les aliments
Introduction : exemples de méthodes d’analyse
1. Les mycotoxines
1.1. Généralités• Les mycotoxines sont des métabolites secondaires sécrétés par des moisissures appartenant
principalement aux genres
• Elles sont produites sur une large variété de denrées alimentaires avant, pendant et aprèsrécolte.
1. Les mycotoxines
1.1. Généralités
• Le risque mycotoxicologique a existé dès la mise en place de productions agricolesorganisées. L’ergotisme est cité dans l’Ancien Testament de la Bible.
• Certains tombeaux égyptiens ont également été suspectés de contenir de l’ochratoxine A,responsable de la mort mystérieuse d’archéologues.
• C’est seulement en 1960 que les premières mycotoxicoses ont pu être mises en évidence enGrande-Bretagne où plus de 100 000 dindes sont mortes de nécroses importantes du foieprovoquées par une famille de molécules appelées aflatoxines. Depuis, de nombreusesmycotoxines ont été découvertes, le dernier grand groupe étant, en 1988, les fumonisines.
• En France, les pâturages peuvent être colonisés par les champignons du genre Claviceps
responsable de l’ergotisme, du genre Pythomyces produisant de la sporidesmine à l'originede l’eczéma facial, du genre Neotyphodium entraînant la formation de gangrène sèche et/oude troubles nerveux, ou du genre Rhizoctonia capable de synthétiser de la slaframine àl'origine de sialorrhée chez les ruminants.
1. Les mycotoxines
1.1. Généralités• Les mycotoxines sont élaborées par des champignons lors de quatre
processus différents :
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• En raison de la diversité de leurs effets toxiques et de leurs propriétéssynergiques, les mycotoxines présentent un risque pour le consommateurd’aliments contaminés.
• Le métabolisme des mycotoxines est complexe et comprend plusieursvoies de bioactivation et de détoxication régies par des mécanismes debiotransformation résultant de l’action d’enzymes de l’hôte et de la floremicrobienne présente dans le tube digestif. Une partie des toxines ou deleurs métabolites peut se fixer dans les tissus biologiques ; la majorité estéliminée par voie
1. Les mycotoxines
1.1. Généralités• Des moisissures peuvent se développer sur les plantes :
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et produire des toxines qui pourront avoir des conséquences néfastes sur leconsommateur de produits végétaux contaminés.
• A ce risque s'ajoute celui d'une présence éventuelle de résidus toxiques
dans les produits animaux destinés à la consommation humaine, lait ouviande, lorsque les animaux reçoivent des aliments contaminés.
• La réduction des risques passe par :
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1. Les mycotoxines
1.2. Biosynthèse des mycotoxines• Le métabolisme secondaire diffère du primaire par la nature aléatoire de
son activation et par la diversité des composés formés et la spécificité dessouches impliquées. Il n'est pas lié à la croissance cellulaire mais répondgénéralement à des signaux issus de l'environnement du champignon.
• Métabolisme primaire :
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• Métabolisme secondaire :
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• La contamination fongique des plantes et la synthèse de toxinesdépendent de conditions environnementales :
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1. Les mycotoxines1.2. Biosynthèse des mycotoxines• Les fourrages et les céréales sont naturellement en contact avec des
spores fongiques avant, pendant et après la récolte, durant le transport etle stockage. Les rongeurs, oiseaux, insectes interviennent dans leprocessus de contamination en provoquant des lésions physiques dans lestissus végétaux qui favorisent la pénétration des spores.
• La croissance fongique est régie par de nombreux paramètres physico-chimiques :
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• La principale moisissure rencontrée au champ appartient au genreFusarium. Bien qu'elle soit surtout présente dans les céréales, on peut larencontrer également dans les fourrages sur pied ou récoltés.
• Selon les espèces et l’environnement, Fusarium spp peut produire :�
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1. Les mycotoxines
1.3. Structure et classification des mycotoxinesSix groupes de mycotoxines sont produits par Aspergillus, Penicillium etFusarium. La structure chimique des mycotoxines est très diversifiée, ce quiexplique leurs effets biologiques différents :
1. Les mycotoxines
1.4. Bioconversion des mycotoxines• En fonction de l’efficacité de l’absorption gastro-intestinale et du
métabolisme hépatique, les mycotoxines et leurs métabolites sontpréférentiellement excrétés par les voies urinaire (mycotoxines hautementabsorbées et métabolisées comme l’AFB1) et fécale (toxines peuabsorbées ou éliminées par voie biliaire).
• Les ruminants sont globalement plus résistants à la plupart desmycotoxines grâce au rôle détoxifiant de la population microbienne durumen. Les principales toxines ingérées par les ruminants sont doncmodifiées dans le tube digestif des ruminants avant d'être excrétées par lavoie biliaire. Le ruminant est donc naturellement protégé, mais laprésence de résidus toxiques dans les produits animaux que sont le lait etla viande, constitue un risque pour le consommateur.
• L’épithélium intestinal, le foie et les reins sont le siège debiotransformations d’un grand nombre de composés. Il s'agit de réactionsde réduction, d’oxydation, d’hydrolyse et de conjugaison. Ces réactionsdiminuent la toxicité et augmentent la solubilité dans l’eau desmycotoxines, ce qui facilite leur excrétion dans l'urine (et dans le lait).
• Métabolisme del’aflatoxine B1 dansle foie (adapté deSwick 1984 et Neal1998).
1. Les mycotoxines
1.5. Effets des mycotoxines• Chez l’animal, l’effet cancérogène de cinq mycotoxines, aflatoxines (AFB1 et AFM1),
ochratoxine A (OTA), moniliformine, sterigmatocystine a été prouvé. Chez l’Homme, lesaflatoxines et l’OTA ont été classées comme cancérogènes avérées par le Centre Internationalde Recherche contre le Cancer. La fumonisine B1 (FB1) est actuellement classée dans lacatégorie des cancérogènes probables et pourrait entrer prochainement dans la classe descancérogènes. Des données toxicologiques récentes sur la patuline classent cette dernièreparmi les toxines à risque.
1. Les mycotoxines
1.5. Effets des mycotoxines• Les aliments sont fréquemment contaminés par plusieurs moisissures capables de produire
chacune plusieurs toxines. Or, des effets de synergie peuvent exister entre toxines. Ainsi,l’acide fusarique accroît la toxicité des fumonisines (D’Mello et Mc Donald 1997), et celle duDAS et du DON (Smith et al 1997). L'association de la ZEN et de l’acide fusarique augmente
de 2 à 5 fois leur passage mutuel dans le lait chez le rat (Porter et al 1998). Une interactionentre la FB1 et le DON induit un accroissement de la quantité de protéines dans le sang,alors que celle impliquant la FB1 et la T-2 conduit à une augmentation du taux de calcium
(Kubena et al 1997a) ou du taux d’hémoglobine et de l’hématocrite (Kubena et al 1995).
1. Les mycotoxines1.5. Effets des mycotoxines• Une contamination aiguë par les aflatoxines provoque des signes importants de lésions du foie (Pier
1992). L’aflatoxicose entraîne une accumulation d’acides gras dans le foie, les reins et le coeur, et peutêtre à l'origine d'encéphalopathies et d'oedèmes (Pfhol-Leszkowicz 2000). Les aflatoxines agissentcomme des intercalants ADN en créant des liaisons avec les bases guanines ce qui entraîne la mort de lacellule ou sa transformation en tumeur maligne (Riley 1998).
• Des ochratoxicoses ont été décelées chez l’Homme et chez le porc. Elles ont rarement été observéeschez les ruminants du fait de la capacité des microorganismes du rumen à hydrolyser l’OTA. Les toxicosesaiguës se caractérisent selon Chu (1974) par des dommages rénaux, une anorexie accompagnée d'uneperte de poids, des vomissements, une température rectale élevée, l’apparition de conjonctivites, unedéshydratation, un affaiblissement général et la mort de l'animal deux semaines après l’administrationde la toxine (Marquardt et Frohlich 1992). L’OTA peut inhiber le métabolisme du glucose et de l’insuline,ce qui entraîne l’accumulation de glycogène dans le foie. L'OTA a des propriétés immunotoxiques etcarcinogènes en diminuant le nombre de cellules 'Natural Killer' responsables de la destruction descellules tumorales, ce qui contribue à augmenter sa capacité à induire des carcinomes rénaux ethépatiques (Luster et al 1987). Elle a également un effet inhibiteur sur les lymphocytes B et T.
• Les effets de la ZEN sont dominés par des troubles de la reproduction et des modifications physiques desorganes génitaux identiques à ceux de l’oestradiol : oedèmes et hypertrophie des organes génitaux,diminution du taux de survie de l’embryon chez les femelles en gestation, diminution des quantités deLH et de progestérone produites affectant la morphologie des tissus utérins, diminution de la productionde lait, féminisation des jeunes mâles par diminution de la production de testostérone et infertilité.
• Les fumonisines provoquent des lésions profondes du foie, du tractus gastro-intestinal, du systèmenerveux et des poumons (Riley 1998).
• La patuline est potentiellement carcinogène et mutagène. La patuline altère la perméabilité ioniqueet/ou la communication intracellulaire, engendrant un stress oxydatif et la mort cellulaire (Riley 1998).
• Les trichothécènes provoquent une perte de poids, des vomissements, des dermatoses sévères et deshémorragies pouvant aller jusqu'à la mort de l'animal. Tout comme les aflatoxines, ils possèdent despropriétés immunosuppressives intervenant à la fois sur le système immunitaire des cellules et sur lenombre de macrophages, de lymphocytes et d'érythrocytes (Riley 1998).
• La T-2 et la DON inhibent la synthèse protéique et entraînent la mort des cellules de différents organes.
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments• Les mycotoxines sont, en général, présentes à l’état de traces dans les
aliments (c’est-à-dire en quantité inférieure au ppb, soit inférieure au µg/kg).
• Il existe toute une panoplie de méthodes fondées essentiellement sur leprincipe de la séparation chromatographique des molécules puis de leurdétection par spectrophotométrie ou par fluorimétrie. Les méthodes physico-chimiques comme la chromatographie sur couche mince (CCM), lachromatographie gazeuse (CPG) ou la chromatographie liquide hauteperformance (CLHP) permettent la quantification des mycotoxines.
• Les techniques immuno-chimiques de type ELISA permettent soit unedétection de type présence ou absence (résultat qualitatif), soit une détectionsemi-quantitative ou quantitative de la mycotoxine. Les techniquesimmunochimiques sont souvent qualifiées de rapides car de nombreuxéchantillons peuvent être analysés à la fois en 3 à 4 heures.
• Combinées à une étape préalable de purification par chromatographied’immunoaffinité, ces techniques ont pu être validées au niveauinternational. Ces principes d’analyse sont actuellement retenues dans laplupart des méthodes officielles et font l’objet de normes françaises (normesAFNOR), européennes (normes EN) ou internationales (normes ISO).
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments• Les aliments représentent une matrice complexe : des étapes de
préparation des échantillons sont nécessaires :
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• Souvent longues et manuelles, ces étapes doivent être optimisées pourchaque type de matrice.
• L’analyse des mycotoxines étant une analyse de traces, on procède à uneétape de purification puis de concentration de l’extrait, par exemple parpassage sur cartouches de silice greffée ou non (cas des aflatoxines, de lapatuline), ou sur résines échangeuses d’ions (cas des fumonisines).
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments• Le développement de l’immunopurification sur colonnes d’immunoaffinité a
considérablement amélioré la spécificité et les seuils de détection et dequantification des méthodes d’analyse des mycotoxines. Le principe de cettetechnique d’immunopurification repose sur l’utilisation de l’anticorps commeréactif d’affinité. L’anticorps antimycotoxine est tout d’abord immobilisé sur unsupport qui a souvent l’apparence d’un gel remplissant une microcolonne,conditionné à l’aide d’un tampon.
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments• Colonnes d’immunoaffinité :http://fr.aeschemunex.com/tests-automates-microbiologie,18/101,colonnes-immunoaffinite.html
http://www.romerlabs.com/fr/products/mycotoxins/immunoaffinity-columns/
http://www.libios.fr/mycotoxines.html
http://www.jle.com/e-docs/00/03/FE/08/article.phtml
http://www.neogeneurope.fr/FoodSafety/FS_NT_Index.html
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments
• La CCM : première technique employée� Inconvénients :
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� Avantages :
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1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments
• Principe de la chromatographie :
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La séparation est fondée sur la distribution dessolutés entre les deux phases non miscibles(stationnaire/mobile). Alors que la phasemobile tend à entraîner les espèces à séparerdans son mouvement, la phase stationnairetend à les retarder. Il en résulte que lesanalytes ont, pour la plupart, des vitesses dedéplacement différentes et inférieures à cellede la phase mobile, d’où la notion de rétentionet la possibilité de séparation.
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments
• Principe de la chromatographie sur couche mince
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On dépose sur la phase fixe une petite quantité du mélange à séparer et on met cettephase au contact de la phase mobile. La phase mobile migre de bas en haut, par capillarité,le long de la phase fixe en entraînant les constituants du mélange. C’est le phénomèned’élution, qui permet la séparation des constituants du mélange à analyser. Chaqueconstituant migre d’une certaine hauteur, caractéristique de la substance, que l’on appellerapport frontal ou rétention frontale (Rf) :
Rf =
Chaque tache correspond à un constituant et on l’identifie par comparaison du Rf avec untémoin (une même substance migre à la même hauteur dans des conditions opératoiresidentiques).
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments
• Chromatographie sur couche minceLa phase mobile se déplace par capillarité
(chromatographie planaire). L’analyste exploite les distances parcourues par chaque espèce à temps de développement donné : quand le « front » de solvant a parcouru une distance fixée, on repère la position de chaque soluté, par révélation par un système adéquat et on détermine le rapport des vitesses de déplacement que l’on identifie comme étant identique à celui des distances parcourues ; on étudie la distribution
isochrone (c’est-à-dire à temps de développement constant).
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les alimentsExemple de CCM :Corn samples are ground and extracted. The extractsare then spotted onto a TLC plate. One TLC plate canbe spotted with extracts from several corn samples.The TLC plate is developed, dipped into an aluminumchloride solution and heated. The mycotoxins arethen visualized by viewing the plate under long-waveultraviolet irradiation (black light). Mycotoxinstandards are also available making it possible tovisually estimate the quantity of the mycotoxinspresent. The corn sample illustrated below containsaflatoxin at approximately three times the standard.
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments• La phase stationnaire peut être disposée dans une colonne et la phase mobile
percole celle-ci à débit (ou pression) constant : c’est la chromatographie surcolonne. L’analyste exploite les différences de vitesses de déplacement desdifférentes espèces en déterminant le temps mis par chacune pour parcourir unelongueur égale à celle de la colonne (les solutés sont injectés en mélange à uneextrémité de la colonne et détectés à l’autre) : on étudie la distribution isoplanedes espèces (c’est-à-dire à distance parcourue fixée).
• Dans la chromatographie en phase liquide (CPL) : la phase mobile est constituéed’un solvant pur ou le plus souvent d’un mélange plus ou moins complexe desolvants de grande pureté ; elle est introduite sur la colonne à débit constant parun système de pompage.
• La technique CLHP est la plus utilisée depuis une vingtaine d’années. C’est laméthode de choix pour l’analyse des mycotoxines. Les méthodes par CLHP sontquantitatives et grâce à leur couplage à la détection par fluorescence, ellespeuvent atteindre des limites de détection aussi basses que la dizaine de ng/kg.
• La LC-MS est de plus en plus utilisée pour effectuer des confirmations et desidentifications de mycotoxines par identification des ions-fils et comparaison à desbanques de données spectrales. Cette technique est très coûteuse par l’achat del’appareil, sa maintenance et la nécessité d’un personnel hautement spécialisé.
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments• CLHP
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments• CLHP
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments• CLHP : HPLC Analysis of Fusarium Mycotoxins
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments• CLHP : Chromatogram of a standard mixture showing the separation of 10
mycotoxins : aflatoxins B1, B2, G1 and G2, citrinin, cyclopiazonic acid,mycophenolic acid, ochratoxin A, penicillic acid, penitrem A
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments• CPG
La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est réservée à l’étude des mycotoxinesqui peuvent être volatilisées. Elle convient plutôt à la classe des trichothécènes maiselles sont difficiles à calibrer et à valider.
La phase mobile est un gaz, dit gaz vecteur, et les solutés sont introduits sur lacolonne directement s’il s’agit d’un échantillon gazeux ou après volatilisation dans la
chambre d’injection chauffée s’il s’agit d’un échantillon liquide (éventuellementaprès dilution ou dissolution dans un solvant adéquat).
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments• CPG
GC–MS/MS chromatogram of a naturally contaminated wheat semolina at 55.4 μg kg−1 of DON showed in full scan mode (A), the mass spectrum of DON (B) and the characteristic transitions viewed in MRM mode (C)
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments• Méthodes immunochimiques
� utilisation d’un anticorps spécifique dirigé contre la mycotoxine recherchée.
� fixé sur un support inerte (tubes ou puits de plaque de micro-titration en polystyrène, billesde verre, membrane)
� capture des molécules de mycotoxine éventuellement présentes dans le milieu réactionnel
� réaction de type antigène-anticorps
� ajout d’un système enzymatique, en général couplé à un second anticorps (conjugué)
� transformation d’un substrat chromogène en produit coloré
� densité de la coloration mesurée par photométrie proportionnelle ou inversementproportionnelle (suivant la configuration du test) à la quantité de mycotoxines contenuesdans l’échantillon.
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments• Méthodes immunochimiques
Les trousses de dosage permettent une détermination quantitative de la teneur en mycotoxinepar test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). En général, elles se composent d’uneplaque de microtitration en polystyrène de 96 puits au fond desquels sont fixés de façoncovalente les anticorps. Ces trousses de dosage permettent l’établissement d’une gamme étalon.Malgré la nécessité d’effectuer une extraction et une purification de la mycotoxine à partir deséchantillons, ces tests se réalisent en 3-4 h avec une limite de dosage en général inférieure auppb. Il existe de telles trousses de dosage pour l’aflatoxine B1, l’ochratoxine A, la zéaralénone, latoxine T-2, la déoxynivalénol et les fumonisines.
Les techniques immunochimiques de dosage ou de dépistage sont en général commercialiséessous forme de kits ou trousses de dosage et s’utilisent selon des protocoles d’analyse d’exécutionsimple sur un grand nombre d’échantillons à la fois. Cependant, dans le cadre de l’analyse desaliments, il convient de rester prudent devant l’apparente facilité d’utilisation de ces techniquescar l’interprétation des résultats n’en est pas moins délicate. Les risques de réactions croiséessont inhérents à l’utilisation d’anticorps comme outil de détection : la reconnaissance d’autresmolécules de structure chimique proche, en particulier des métabolites de la molécule à doser,éventuellement présents dans le milieu réactionnel, provoque l’apparition de faux positifs quientraînent une surestimation des résultats. En outre, l’extraction des mycotoxines nécessite dessolvants (méthanol, acétonitrile, chloroforme...) et des traces de solvant dans l’extrait analysé partest ELISA peuvent aussi être une cause de production de faux positifs.
1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments• Décontamination des effluents
Après analyse au laboratoire, il est nécessaire de décontaminer les extraits d’échantillonscontaminés et les restes de solutions étalons avant élimination, ainsi que la verrerie avantréutilisation. Pour cela, différentes méthodes de décontamination ou de dégradation desmycotoxines (en particulier aflatoxines) dans les rejets de laboratoires ont été étudiées par leCentre international de recherche sur le cancer.
L’une de ces méthodes utilise l’hypochlorite de sodium en présence d’acétone. Son champd’application comprend les solutions stocks d’aflatoxines ou les solutions diluées en solvantorganique ou en milieu aqueux, les échantillons biologiques, la verrerie, les piluliers, les plaquesde CCM, les vêtements de laboratoire de protection. Il existe cependant une suspicion de toxicitédes produits de dégradation qui a conduit à rechercher d’autres procédés de décontamination.
Ainsi, une méthode au permanganate de potassium en conditions alcalines qui convient à tout unensemble de mycotoxines comme la patuline, l’ochratoxine, la citrinine, la stérigmatocystine maisaussi pour les aflatoxines B et G ne produit pas de dérivés mutagènes. Ce procédé décontamine àplus de 99,9 % les solutions aqueuses ou organiques ou bien la forme solide des mycotoxinescitées. Ce procédé a été validé pour la décontamination d’une solution de patuline par uneanalyse collaborative.
La dégradation des aflatoxines par le permanganate de potassium en milieu acide a égalementété mise au point mais son utilisation est maintenant déconseillée car ce réactif produit en milieuacide des ions Mn2+ potentiellement mutagéniques.
1. Les mycotoxines
1.7. Réglementation
