L’interférence ARNune nouvelle approche pour inhiber

l'expression des gènes. Perspectives en cancérologie

Odile.Filhol.Cochet@cea.frINSERM EMI 104CEA Grenoble

Comparaison entre différentes méthodes d’inhibition de gènes.----------------------------------------------------------------------

Méthodes Avantages Inconvénients

----------------------------------------------------------------------Knock-out animal Inhibition Complète du gène Laborieux, cher, Des

mutants létaux peuvent empêcher le

développement embryonnaire

Petites molécules introduction facile Spécificité variable inhibitrices Travail de développement

intensif

Anti-sense DNA Facile Efficacité variable peu onéreux Spécificité variable

Nécessite une transfection

RNA interference Spécifique Knock-down (pas knock-out)

Relativement facile Nécessite une transfection

Antisens (ssDNA): un autre mécanisme pour le blocage de l’expression des

gènes

3 modes d’intervention des antisens dans la cellule:

• dégradation par la RNaseH• arrêt de transcription• régulation de la maturation des ARN(de: http://www.isispharm.com + Scherer et Nature 2003 21, p1457)

Hybridation AS+ARN puis degradation:

La RNAissance

• 1998, RNA interférence : inhibition post-transcriptionnelle de l’expression de gènes après introduction d’ARNdb (nématode) Fire et al.

• 2001: siRNA dans des cellules de mammifères Elbashir et al.

• En 2002, Science magazine élit les RNAi comme la plus grande avancée technologique de l’année 2003.

• 2004, association de la génomique fonctionnelle et du RNAi en oncologie (Oncogene)

L’ARNi: une nouvelle star biotechnologique

Principe de l’interférence ARN:

Spécificité de la dégradation

RISC (RNA-induiced sillencing complex)

• siRNA (synthèse chimique)

• RNAi (viral)

• shRNA (small hairpin)

Produit à partir de plasmides

• miRNA (micro : in vivo)

Prêt à agir après phosphorylation

Origines de siRNA

Découpés par DICER en siRNA

Mode d’action de l’interférence

Design de siRNA

Critères d’efficacité: >90% de réduction du niveau de la protéine.[siRNA] de 1 à 20 nMÉviter les régions 3’ et 5’ non codantes du gène.

Choix d’une séquence siRNA

• Copier une séquence de 21 nt ayant les bons critères

• S’assurer que cette séquence est spécifique du gène à cibler (BLAST)

• Commander la séquence et son contrôle sous forme:

- ARN synthétique- ADN

NB:Il faut choisir au moins 3 siRNA pour cibler un gène.

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Méthodes de production des siRNA.-------------------------------------------------------------------------

Méthodes AvantagesInconvénients

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Synthèse Rapide RNAi TransitoireChimique Nécessite une transfection

Chimique: grande purité Chimique: cher

DNA (vecteur ou casette) moins cher Très laborieux RNAi stable possible Nécessite une

transfection

Vecteur viral RNAi stable Très laborieux Utilisable pour des cellules Potentiellement

dangereux résistantes aux transfections par dsRNA/plasmides

Comment introduire le siRNA dans une cellule de

mammifère?• Par transfection de l’ARN ou de l’ADN

(différents agents lipophiles)• Par électroporation • Par infection virale (adenoV*; retroV; lentiV)

Comment introduire le siRNA dans un animal?

• Par électroporation • par injection intra péritonéale• Par injection intraveineuse (apolipoprotéine B)

shRNA transgénique

• génération of knockdown pour des lignées ES• ‘Transgenic RNA interference in ES cell-derived

embryos recapitulates a genetic null phenotype’ (May 2003, 21, 5 pp 559 - 561), Nature: Kunath et al.

• Exemple: production stable de shRNA du gène p120-Ras GTPase-activating protein (RasGAP)

• Il est possible de concentrer sur un seul allèle: grand intérêt en génétique (dirigé contre une mutation dominante, exemple le gène Tau dans les troubles neurologiques)

Comment quantifier l’effet RNAi?

• Au niveau de l’ARNm– Par Northern blot– Par RT-PCR

Au niveau de la protéine– Par Western Blot– Par immunofluorescence– Par cytométrie en flux– Par des tests phénotypiques ou fonctionnels

Applications

• Génétique inverse (découvrir la fonction inconnue d’un gène connu).

• Combinaison de l’interférence ARN et de la génomique (découvrir des gènes inconnus à partir d’un phénotype connu).

Inhibition par RNAi de l’infection par HIV-1 delymphocytes T humains

Approche combinatoire

Applications

• Génétique inverse (découvrir la fonction inconnue d’un gène connu).

• Combinaison de l’interférence ARN et de la génomique (découvrir des gènes inconnus à partir d’un phénotype connu).

Banques de siRNA.

Préparation d’une banque de siRNA

Le premier criblage RNAi

• Stanford's Pat Brown looking at RNAi in genomewide expression profiling PNAS's May 27 (2003) p1073.

Depuis,quelques publications…

La difficulté de créer de bonnes banques de siRNA, puis d’avoir un phénotype facile à mesurer sur des cellules cultivées et tranfectées au format de criblage à haut débit, explique la faible abondance de publications dans le domaine.

Perspectives de thérapie anticancéreuse par ARN

interférence• Ciblage de molécules impliquées en

carcinogenèse* voies d’oncogenèse (PTK, APC, PI3K

HIF-1…)* Régulateurs du cycle cellulaire (RB,

P53, cyclines…)* Apoptose (BCL2…)* sénescence (télomérase)* Stabilité et dégradation des protéines

(cathépsine L)

Perspectives de thérapie anticancéreuse par ARN

interférence• Ciblage de gènes impliqués dans les

interactions hôte-tumeur• Gènes importants pour l’angiogenèse (VEGF,

angiogènine…• Gènes importants pour la dégradation de la

matrice extracellulaire (u-PA• Gènes importants pour l’invasion et les

métastases• Gènes de l’adhésion cellulaire

Perspectives de thérapie anticancéreuse par ARN

interférence• Ciblage de gènes important pour la

résistance tumorale à la chimio et/ou radiothérapie

• Gènes MDR• Molécules liées aux mécanismes de réparation de

l’ADN ERCC1…

Biblio

• RNA interference collection Nature reviews Mai 2005 www.nature.com/reviews/focus/rnai

• Prospects of RNA interference therapy for cancer gene therapy 2006 0 1-13 www.nature.com/gt