Bachar Cheaib Laboratoire Derome Le 07 Avril 2015 

Lire un métagénome c’est retrouver son chemin dans une forêt ? 

Du ciel confortable (bio) à la forêt inconfortable (bioinfo)  

NGS 

Rendre la complexité simple et lisible 

La métagénomique une méthode d’accès aux  ressources généMques 

culture cellulaire  

ÉchanMllonnage 

ÉchanMllonnage 

Microfiltrage 

adapté  

Extrac3on de 

L’ADN total  

La métagénomique une méthode d’accès aux  ressources généMques 

ÉchanMllonnage 

Coupure 

La métagénomique une méthode d’accès aux  ressources généMques 

Microfiltrage 

adapté  

Extrac3on de 

L’ADN total  Prépara3on 

des librairies 

amplifica3on 

ÉchanMllonnage 

Coupure Prépara3on 

des librairies 

amplifica3on 

Séquençage 

massif  

fragments 

courts 

La métagénomique une méthode d’accès aux  ressources généMques 

Microfiltrage 

adapté  

Extrac3on de 

L’ADN total  

Du séquençage à la bioinformaMque 

Metagenomes Reads

Preprocessing

(Trimming, Quality Control,

Decontamination)

Metagenomes Reads

Preprocessing

(Trimming, Quality Control,

Decontamination)

Assembly

Annotation

Metagenomes Reads

Preprocessing

(Trimming, Quality Control,

Decontamination)

Assembly

Annotation Function

abundance

Metagenomes Reads

Preprocessing

(Trimming, Quality Control,

Decontamination)

Assembly

Annotation Taxonomic

abundance

Function abundance

Metagenomes Reads

Preprocessing

(Trimming, Quality Control,

Decontamination)

Assembly

Annotation Taxonomic

abundance

Function abundance

Polymorphism

Metagenomes Reads

Preprocessing

(Trimming, Quality Control,

Decontamination)

Assembly

Annotation Taxonomic

abundance

Function abundance

Polymorphism

Metabolic abundance

Metagenomes Reads features

Data exploraMon ( i.e SGA Preqc)  

Per‐base error rates 

Sequence coverage  

Repeat‐content 

Metagenome size, 

Before filtering…   

Metagenomes Reads features

Before filtering…   

Metagenomes Reads features

Before filtering…   

Metagenomes Reads

Preprocessing

(Trimming, Quality Control,

Decontamination)

Metagenomes Reads

Preprocessing

(Trimming, Quality Control,

Decontamination)

NGS technologies

Fastx-toolkit,

Trimmomatic,

Sickle,

ERNE-filter,

Deconseq

Metagenomes Reads

Preprocessing

(Trimming, Quality Control,

Decontamination)

NGS technologies

‐  Fastx‐toolkit for Short‐Reads FASTA/FASTQ (Hannon Lab ) ‐  TrimmomaMc (Bolger et al 2014, Bioinforma3cs) 

‐  Sickle (Joshi NA and Fass JN. , 2011) ‐  ERNE (Extended Randomized Numerical alignEr) (Fabbro et al, 2013) ‐  Deconseq (DECONtamina3on of SEQuence data) (Schmeider and Edwards, 2011) 

Fastx-toolkit,

Trimmomatic,

Sickle,

ERNE-filter,

Deconseq

Metagenomes Reads

Preprocessing

(Trimming, Quality Control,

Decontamination)

NGS technologies

Assembly

RAY META

SOAP, SGA

Fermi, MetaVelvet,

Newbler

Fastx-toolkit,

Trimmomatic,

Sickle,

ERNE-filter,

Deconseq

Metagenomes Reads

Preprocessing

(Trimming, Quality Control,

Decontamination)

Assembly

Annotation

Inconnu 

Connu 

Retrouver le connu et prédire l’inconnu 

Inconnu 

Connu 

Retrouver le connu et prédire l’inconnu 

Generalist  Specialist 

Curated/

verified 

 

Not 

verified/

curated 

GeneBank 

EMBL 

… 

SwissProt 

… 

Curated/

verified 

 

Not 

verified/

curated 

SEED 

Model organisms 

Databases (FlyBase) 

 

Local databases 

… 

Pfam 

ProDom 

… 

Sequence/funcMon/structure  Sequence/funcMon/structure 

FuncMonal classificaMon  

•  The gene/protein family approach or the Clusters of Orthologous Groups(COG)s, (clustering algorithms based similarity) 

•  The Subsystem approach to genome annotaMon (Overbeek et al 2005) 

•  Bio‐ontology (rarely used in metagenomics) 

h^p://portal.nersc.gov/project/m1317/FOAM/ 

Bio‐onthologies 

Inconnu 

Connu 

Retrouver le connu et prédire l’inconnu 

métagenome 

Inconnu 

Connu 

Retrouver le connu et prédire l’inconnu 

métagenome 

•  Importance de 

l’algorithmique de 

graphes 

•  Assemblage des 

nouveaux génomes 

•  Découverte des 

nouvelles organismes  

Metagenomes Reads

Preprocessing

(Trimming, Quality Control,

Decontamination)

Assembly

Annotation Function

abundance

FindORFS 

•  Ab ini3o/De novo  

(based gene content) 

•  Similarity methods 

•  Combined  

•  Compara3ve  

Annota3on against 

databases 

•  Local and global

similarity search

•  Exact matching

etc

Func3onal 

annota3on and 

classifica3on 

….. 

GLIMMER 

METAGENE‐ANNOTATOR 

GeneMark 

FragGeneScan 

….. 

 

Func3onal annota3on 

and classifica3on 

ORFS (FragGenScan)  BLAT 

The SEED 

database 

(Overbeek et al 2014) 

(Oberbeek et al 2005) 

Func3onal annota3on 

and classifica3on 

ORFS (FragGenScan)  BLAT/BLAST 

The SEED 

database 

4 hierarchical levels 

Level 1  

(27 categories) 

(Overbeek et al 2014) 

(Oberbeek et al 2005) 

RAST, Rapid Annota3ons 

 using Subsystems Technology 

Metagenomes Reads

Preprocessing

(Trimming, Quality Control,

Decontamination)

Assembly

Annotation Taxonomic

abundance

Function abundance

Taxonomic assignment 

(binning) 

Amplicons of markers  from metagenomes  

Whole MG content  

Gene Markers 

All genes 

16S 

House‐keeping 

Specific biomarkers 

Taxonomic assignment 

(binning) 

Whole MG content  

All genes 

LCA (Lowest Common 

Ancestor) 

Best hit  

Representa3ve hit 

Assignement des taxons 

Bazinet and Cummings BMC Bioinforma3cs 2012 

Similarity based PhylogeneMc‐based ComposiMon‐based 

Bazinet and Cummings, 2012 

Taxonomic assignment 

(binning) 

OTUs Profiling based  

16S gene markers 

Alpha‐Diversity es3ma3on 

Mothur  (Uclust) 

Qiime (Usearch)  

OTU (Opera3onal Taxonomic 

Unit) Clustering 

For Amplicons only, not metagenomes  

16S 

Gene Markers 

Taxonomic assignment 

(binning) 

Amplicons of markers  from metagenomes  

OTUs based Gene Markers 

16S 

House‐keeping 

Biodiversity sampling ? RarefacMon curves 

Specific biomarkers 

Taxonomic assignment 

(binning) 

OTUs Profiling based  

16S gene markers 

Alpha‐Diversity es3ma3on 

Mothur  (Uclust) 

Qiime (Usearch)  

OTU (Opera3onal Taxonomic 

Unit) Clustering 

For Amplicons only, not metagenomes  

16S 

Gene Markers  House‐

keeping 

OTUs profiling based

housekeeping genes

Metaphlan

Mapping/similarity

research

BOWTIE/BLAST 

(Segata et al, 2012) 

Metagenomes Reads

Preprocessing

(Trimming, Quality Control,

Decontamination)

Assembly

Annotation Taxonomic

abundance

Function abundance

Polymorphism

Environmental biomarkers annotated from contigs

Calling Variants (SNP)s

Mappings Reads/Contigs

Calling Variants (SNP)s

SamTools, VCFTools

FreeBayes, picard

GATK, Platypus

1 ? 

Next club discussion ?  

Tools based mapping 

Environmental biomarkers annotated from contigs

Mappings Reads/Contigs

Tools EvaluaMon 

Rufallo et al, 2011 

SEAL evaluator : Seal is available as open source at h^p://compbio.case .edu/seal/ 

Rufallo et al, 2011 

Indexing run3me versus Alignment Run3me 

Metagenomes Reads

Preprocessing

(Trimming, Quality Control,

Decontamination)

Assembly

Annotation Taxonomic

abundance

Function abundance

Polymorphism

Metabolic abundance

Functional metagenome

annotations

Mapping metabolic pathways

KEGG MAP TOOL 

Abundance of pathways

enzymes

Pipeline d’analyse de “reads” aux métabolites 

Prétraitement 

Pipeline d’analyse de “reads” aux métabolites 

LCA 

MGRAST 

Assignement des taxons 

Prétraitement 

Taxonomie 

Pipeline d’analyse de “reads” aux métabolites 

LCA 

MGRAST 

Assignement des taxons 

Prétraitement 

Taxonomie 

FoncMon 

Pipeline d’analyse de “reads” aux métabolites 

LCA 

MGRAST 

Assignement des taxons 

Prétraitement  Polymorphisme 

Taxonomie 

FoncMon 

Metabolic abundance

Metagenome webservers and soeware 

•  MG‐RAST 

•  METAGENassist 

•  AMPHORA2 

•  QIIME (amplicons) 

•  MOTHUR (amplicons) 

•  MEGAN 

 

etc 

 

Quelques astuces … 

•  Chercher des études compara3ves ou des logiciels d’évalua3on 

•  Chercher des références pour l’op3misa3on des paramètres  

•  Choisir les bonnes ressources d’annota3on 

•  Faire des expériences supplémentaires pour évaluer la per3nence 

et la fiabilité des méthodes 

•  Ouvrir la boite noire des ou3ls, logiciels, web serveurs etc.  

“Whether you want  to uncover  the  secrets of 

the  universe,  or  you  just  want  to  pursue  a 

career  in  the  21st  century,  basic  computer 

programming is an essen0al skill to learn.”  

 

Stephen Hawking 

Club of “Biocoders” idea ?  

R,  Python, PERL, AWK … 

“Scripts developed over 0me and (some0mes) s0ll usefull” 

References 

•  Sharon et Banfield, Science, 2013 

•  Albertsen et al, Nature biotechnology, 2013 

•  Iverson et al, Science, 2012 

•  Yilmaz et al, Nature biotechnology, 2011 

•  Luo et al., Methods in enzymology, 2013 

•  Sharpton et al., Fron3ers in PLANT science, 2014 

•  Caporaso et al, Nature Methods, 2010 

•  Huson et al, Genome Research, 2011 

 

QuesMons ? 

Mande et al, 2012 

Mande et al, 2012 

U=Unknown  

K=known