INTERFACES• Interfaces fluides

– Membranes• Oléosomes (T. Chardot)• Construction d’une interface de phospholipides (M. Axelos)• Composition / Structure et dynamique membranaire (C. Tribet)

– Projets

• Interfaces ‘solides’– Parois II (Aguié)

• Monocouches orientées de cellulose + macromolécules pariétales Propriétés de surface: adhésion relation avec la structure

– Projets

Oléosomes OléosinesEnjeux

CognitifsCompréhension de la structure, et de l’assemblage des corps lipidiquesvégétaux oléagineux des zones tempéréesÉchelle intermédiaire molécule cellule

FinalisésProtéines amphiphiles (empaquetage de molécules hydrophobes)Lipochimie lipides à façon et dérivés pour la chimie des polymères

Le projet-Identifier décrire les différents composés du corps lipidique chez deuxorganismes modèles: A. thaliana et lalevure Y. lipolytica, comprendre leur assemblage -Etudier la dynamique de formation du corps lipidique(modèle levure) et la mobilisation ultérieure des lipides (modèle plante)

Biosynthèse stockage des lipides

Germination Lipolyse

ß-oxydation

Oléosomes

Expression, purification et propriétés d’oléosines àdifférentes interfaces

OléosomePurification des oléosomes

Les protéines de l’oléosomeInterfacialesIdentité

Les oléosinesExpression, purification, solubilitéInsertion à différentes interfaces

Perspectives

Oléosomes

Corps lipidiques purifiésMicroscopie électronique Versailles

Corps lipidiques purifiésMicroscopie de fluorescence Grignon

Visible Fluorescence

Y lipoyticaMicroscopie électroniqueVersailles

EB 1a 1b 2a 2b 3a 3b M

55.4 kDa

36.5 kDa31kDa

21 kDa

14.4 kDa

6 kDa

66.3 kDa

6

5

4321

97.4 kDa 116.3 kDa 200 kDa

8

7

Protéines des oléosomes

. Identified proteins in oil bodies purified from Arabidopsis thaliana seeds.

Band Identified protein Mol. Mass Sequence Accession Gene pI Ref Rename Coverage number

1 oleosin 18.5 kDa 18.569 24.9 % CAA44225 At4g25140 9.43 [41] S32 putative oleosin 19.755 23.5 % AAF01542 At3g01570 7.11 S13 oleosin 20.3 kDa 20.313 7.9 % CAA63011 At3g27670 6. 91 [18] S24 oleosin 21.2 kDa 21.279 34.2 % BAB11599 At5g40420 9.36 [43] S4

5 ATS1 28.012 8.6 % AAL36241 At4g26740 5.90 [28, 30] ATS Clo1 6 11-β-hydroxysteroid dHase 39.087 22.1 % BAB09145 At5g50600 5.92 [22] Arab-1

7 probable aquaporin TIP3.2 28.182 10.5 % O22588 At1g17810 6.54 [33]8 GPI-anchored protein 21.569 22.5 % AAO50480 At1g54860 6.09 [5]

Jolivet 2004, PPB in press

Kyte & Doolittle Scale Mean Hydrophobicity ProfileScan-window size = 13

Position2402302202102001901801701601501401301201101009080706050403020100

Mea

n H

ydro

phob

icity

2,8

2,1

1,4

0,7

0

-0,7

-1,4

-2,1

-2,8

Kyte & Doolittle Scale Mean Hydrophobicity ProfileScan-window size = 13

Position350300250200150100500

Mea

n H

ydro

phob

icity

2,5

2

1,5

1

0,5

0

-0,5

-1

-1,5

-2

Position2001901801701601501401301201101009080706050403020100

3,2

2,4

1,6

0,8

0

-0,8

-1,6

-2,4

-3,2

Hyd

roph

obie

moy

enne Oléosine S4 Arabidopsis

Oléosine S3Oléosine d’amande

Les protéines majeures des corps lipidiques d’arabette possèdent desrégions hydrophobes importantes.

Protéines des oléosomes

10 20 30 40 50 60 70. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

S1 AAF015 MADVRT------HSHQLQVHPQRQHEG--GIK--------------VLYPQSGPSSTQVLAVFVGVPIGG 48S2 BAB026 MANVDRDRRVHVDRTDKRVH-QPNYEDDVGFGGYGG---YGAG---SDYKSRGPSTNQILALIAGVPIGG 63S3 CAB367 MADTARG-----THHDIIGRDQYPMMG-RDRDQYQM----------SGRGSDYSKSRQIAKAATAVTAGG 54S4 BAB115 MADTHR-----VDRTDRHFQFQSPYEGGRGQGQYEGDRGYGGGGYKSMMPESGPSSTQVLSLLIGVPVVG 65S5 CAA908 MADQTR------THHEMISRD--------------------------STQEAHPKARQMVKAATAVTAGG 38Clustal C **: : : . ..: *: .*. * 10

80 90 100 110 120 130 140. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

S1 AAF015 TLLTIAGLTLAGSVIGLMLAFPLFLIFSPVIVPAAFVIGLAMTGFLASGAIGLTGLSSMSWVLNYIRRAG 118S2 BAB026 TLLTLAGLTLAGSVIGLLVSIPLFLLFSPVIVPAALTIGLAVTGILASGLFGLTGLSSVSWVLNYLRGTS 133S3 CAB367 SLLVLSSLTLVGTVIALTVATPLLVIFSPILVPALITVALLITGFLSSGGFGIAAITVFSWIYKYATGEH 124S4 BAB115 SLLALAGLLLAGSVIGLMVALPLFLLFSPVIVPAALTIGLAMTGFLASGMFGLTGLSSISWVMNYLRGTR 135S5 CAA908 SLLVLSGLTLAGTVIALTVATPLLVIFSPVLVPAVVTVALIITGFLASGGFGIAAITAFSWLYRHMTGS- 107Clustal C :**.::.* *.*:**.* :: **:::***::*** ..:.* :**:*:** :*::.:: .**: .: 57

150 160 170 180 190 200. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | .

S1 AAF015 QHIPEELEEAKHRLADMAEYVGQRTKDAGQTIEDKAHDVREAKTFDVRDRDTTKGTHNVRDTKTT- 183S2 BAB026 DTVPEQLDYAKRRMADAVGYAGMKGKEMGQYVQDKAHEARETEFMT----ETHEPGKARRGS---- 191S3 CAB367 PQGSDKLDSARMKLGSKAQDLKDRAQYYGQQHTGGEHDR-----------DRTRGGQHTT------ 173S4 BAB115 RTVPEQLEYAKRRMADAVGYAGQKGKEMGQHVQNKAQDVKQYDISKPH--DTTTKGHETQGRTTAA 199S5 CAA908 --GSDKIENARMKVGSRVQDTK-----YGQHNIGVQH-------------------QQVS------ 141Clustal C .:::: *: ::.. . ** . : :

La structure primaire des oléosines est très conservée.

Les oléosines

Évaluation de l’hydrophobie d’une molécule :

- Pour un émulsifiant de BPM :

HLB = 20 x Mhydrophile / Mtotal

si 3 ≤ HLB ≤ 6, bon émulsifiant eau dans huile

si 7 ≤ HLB ≤ 9, bon agent mouillant

si 10 ≤ HLB ≤ 18, bon émulsifiant huile dans eau

- Pour une protéine:

- Méthode de Kyte et Doolittle (1982) : calcul par fenêtre de x acides

aminés de l’hydropathie moyenne représentation graphique et

indice « GRAVY »

- Méthode de Nakai (1983) : hydrophobie = % d’acides aminés

hydrophobes contenus dans la protéine

- Hypothèse de Beisson (2001) sur les oléosines

% d’acides aminés hydrophobes (Nakai)

% (taille segment central / longueur totale de la protéine)(Baudoin)

Comment quantifier l’hydrophobie d’une oléosine ?

R2 = 0,9174

R2 = 0,1173

30,0040,0050,00

60,0070,0080,00

140 160 180 200 220taille de l'oléosine

hydr

opho

bie

(%)

Oléosines de faible masse moléculaire:solubles dans des solvants organiques

(Beisson)

Domaines d’application des oléosines ?

hydro

phile

hydro

phob

e

Antimou

ssan

ts

émuls

ions e

au / h

uile

mouss

ants,

agen

ts de

mou

illage

émuls

ions h

uile /

eau

déter

gents

solub

ilisan

ts de

prod

uits o

rganiq

ues

Applications des surfactants (de Gennes et al., 2002)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8molarité en urée (M)

% d

e pr

otéine

s so

lubilis

ées

S1S2S3S4S5SM2SM3

Solubilité des oléosines.

Milieu aqueux à froid

20°C 4°CC S

C S

rS3

rS5

Milieu organique à chaud

Culots Surnageants

rS4

TFE 25% 50% 25% 50%

200 kDa 116.3 kDa97.4 kDa66.3 kDa55.4 kDa

36.5 kDa31 kDa

21.5kDa

14.4kDa

6kDa

Solubilité des oléosines.

T CHCl3 Hexane

200 kDa 116.3 kDa97.4 kDa66.3 kDa55.4 kDa

36.5 kD31 kDa

21.5kDa

14.4kDa

6kDa

Caléosine

TFA 50 %

S4S3

116.3

21.5

14.4

3136.5

55.466.397.4

200kDa 1 2 3

S4 S3

4 5

Les oléosine peuvent s’auto associer, via des motifs GxxxG ?

S1 S2 S3 S4 SM1 SM2 SM3GRGQG

GGYGG GQYEGGYGAG GYGGC

Leu Zipp1 ? GQLFGGVPIG GVPIGGSVIG GSVIG Leu Zipp2 ? GSVIG GTVIG

GTLIGGFLVG

GKEMC GKEMC GYFHG GYFHG

Statistical analysis of amino acid patterns in transmembrane helices: the GxxxG motif occurs frequently and in association with beta-branched residues at neighboring positions Alessandro Senes, Mark Gerstein and Donald M. Engelman J Mol.Biol (2000), 296(3), 921-936

urée

Lysozyme rS4caséine ß

rS3

[protéine] = 0,05 g.L-1

Protéine

Huile

Etudes des propriétés des oléosines aux interfaces

0 20 40 60 80 100 120

Time (min)

10

15

20

25

30

γ (m

N /

m)

0.01 0.1 15

10

15

20

γ (m

N /

m)

[protéine] g. L-1

Eau / Huile.

Etudes des propriétés des oléosines aux interfaces

0

10

20

30

40

50

250 350 450 550 650

aire, cm2

PiA

, mN

.m-1

PCPC 0 mN.m-1 + rS3PC 5 mN.m-1 + rS3PC 20 mN.m-1 + rS3PC 5 mN.m-1 + 2 x rS3

« gaz »« liquide »

« solide »

Insertion d’oléosines dans une monocouche de PLs

collapse

Phospholipides / air.

Roux, 2004 JAFC in press

Dépôt d’oléosines sur un film de PC plus ou moins comprimée

Dépôt d’oléosines rS3 sur un film

de PC à 0 mN.m-1 (« gaz »)

Dépôt d’oléosines rS3 sur un

film de PC à 5 ou 20 mN.m-1

(« liquide » ou « solide »)

4 m

m

5 mm

eau

PC

rS3

Pi ouPS

air

TGs

N- -C

? ?

200 kDa116.3 kDa97.4 kDa

66.3 kDa55.4 kDa

36.5 kDa31.0 kDa

21.5 kDa14.4 kDa6 kDaUnresolvedinsulin

30354045505560657075

0 20 40 60 80 100 120 140Time [min]

IFT

[mN

/m]

Etudes des propriétés de la caleosine aux interfaces

Eau / air.

WS COL COL S2/2 S2/5 S2/8 S2/11

WS COL COL S1/11

S1

S2

S3

S4

COL WS WS S3/4 S3/6

WS COL COL S4/11

Génomique fonctionnelleBiolSem Versailles

Clo, Slo

C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 C20/20

10

20

30

40

AG

en

% d

u to

tal

O Neil Col S2 S4

Conclusions…

Purification d’oléosines recombinantes à l’homogénéité, en quantités.

Caractéristiques d’émulsifiants avec variation de l’hydrophobie en fonction de

l’isoforme étudiée émulsifiants à applications variées.

In vitro, stabilisation par des oléosines d’émulsions d’huile dans eau en synergie

avec des phospholipides. Capacité des oléosines à s’insérer à l’interface eau /

huile et à abaisser la tension de surface. Insertion dans une monocouche de

PLs à l’interface eau / air.

… et perspectivesDisponibilité en grandes quantités des oléosines études de structure en

solution dans des milieux modèles (protéines marquées, complexes ?), à

différentes des interfaces, reconstitution d’oléosomes, vectorisation.

Génétique végétale, Le Génétique végétale, Le MoulonMoulon

ISDISDInterfaces Systèmes dispersés, NantesInterfaces Systèmes dispersés, Nantes

Biologie des semences, VersaillesBiologie des semences, Versailles

M Zivy, L Negroni, M Davanture

M Axelos et M.H. Ropers

L Lepiniec, M Miquel

Chimie Biologique, GrignonChimie Biologique, Grignon E Roux, P Jolivet, S, D’Andrea, T Chardot

GDR AMVGDR AMV

Interactions phospholipides / polysaccharidesà l ’interface eau/air: construction d’un

modèle pour l’étude en réflectivité

M.H. Ropers

*Unité de Physico – Chimie des Macromolécules, INRA Nantes

D2O

Si

Matelas de polymèresPEI(PSS/PAH)6PSS

Bicouche de DMPC

Pectine (charge 100%)

PEI +PSS -PAH +PSS -DMPC +pectine -

6

500µM

Microscopie à l’angle de BrewsterSur film de Langmuir

0 1 2 3 4 5 60

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Film

pre

ssur

e, m

N/m

Time, hours

DMPC + P100 0.1g/l

40 60 80 100 120 140 1600

10

20

30

40

50

60

Film

pre

ssur

e, m

N/m

Area, Å2/mlc

DMPC DMPC + P100 0.1g/l

0,01 0,11E-5

1E-4

1E-3

0,01

0,1

1

10

100

1000

Si/polymers/D2 O

Si/polymers/DMPC/D2 O

Si/polymers/DMPC/P100/D2 O

RF/R

0

QZ

Réflectivité

Composition / Structure et dynamique membranaire

C. Tribet

Projet: « Oléosome » en cours d’élargissement

Approche in vitro: reconstitution des oléosomesStabilisation de gouttelettes par les # protéinesStructure locale des phospho autour des protéines (RMN)

Approche in vitro: sur interface modèle:Ségrégation entre les différents phospho, les différentes protéines, rôle des stérols ?Structure d’insertion des oléosines dans la couche de phosphoInteractions protéines/phospho: comparaison triblock

Méthodes: Corrélation de fluorescence, BAM, rhéologie interfaciale, réflectivité, Biacore

Approche in silico : modélisation (1post-doc)

INRA (UMR-CB Grignon, Nantes), ESPCI, + ?

Approche in planta: génétique: modulation du stockage des lipides de réservesmutants oléosomes de composition déterminée

Autres projets ?:

Interactions phospholipides/microfibrilles de cellulose ?

Interactions phospholipides/ protéines de réserve: CRPP – INRA Nantes

Interfaces Solides:

Véronique Aguié

Interfaces dans les parois II?

Signification?

Intérêts des modèles?

Schéma classique de la paroi IId’une fibre

Roland et al.(1995)

40 – 50% cellulose (80% cristalline, 20% amorphe)20 – 30% hémicelluloses10 – 30% lignines

selon le végétal

Parois d ’une tige (transversale)

Parois II de fibres différenciéesde lin

X 19000

Coupes transversales de 2 fibres contigues. S1 et S3 : µfibrilles avec une orientation oblique

S2: µfibrilles coupées transversalementPoints de rebroussement des µfibrilles aux interfaces S1-S2 et S2-S3

X 32000

Signification des propriétés de surfacedans ces systèmes pariétaux?

⇒ Rôle des structures « 2D » parallèles/non parallèles sur:

- les propriétés de cohésion dans le plan et entre lesplans- la structure des autres polymères pariétaux- la réactivité (chimique, enzymatique)- la compréhension des interactions mises en jeu dansles zones interfaciales- sur les propriétés (3D) des tissus (mécaniques)

Réaliser des surfaces modèles planes de cellulose (/hémicelluloses, lignines)

orientée/non orientée

Intérêts des systèmes modèles « 2D » de composition connue

1) Mono-couches à partir de très peu de matière2) Interactions des macromolécules dans un espace confiné3) Rôle de l’orientation sur les propriétés dans le plan et

perpendiculairement au plan4) Adhésion entre couches5) Etalonnage (composition, géométrie) des propriétés de surface des

parois et fibres (adhésion, mouillage,…)

Conclusions

Construction de cette action transversale avance …

Interfaces de type ‘membrane’: deux projets bien identifiésUn autre à construire

Parois secondaires:Idées intéressantes à creuser

compétences en adhésion et mouillage ?