LES MÉTHODES DE TRAÇAGE DES VOIES NERVEUSES

Master 1 neuroscience

Eléonore SERANORomain TERROCHAIRE

Introduction:• La coloration des neurones morts est utilisée depuis plus de 100 ans, avec l'invention de la coloration de Golgi qui a permis la première description de réseaux de neurones (rendus visibles par du chromate d'argent sur tissus morts)

• Transport antérograde identification des efférences

• Transport rétrograde identification des cellules cibles d’une ou plusieurs cellules du SNC.

• Marqueurs fluorescents les plus utilisés: - PI - NY - RITC - FB

• En 1986, introduction des marqueurs de carbocyanine: DiO, DiI (marqueur post-mortem)

I. Méthodes et Généralités

• Injection sous pression. - FB, DY, dextrans aminés sont solubles - carbocyanines nécessitent un solvant organique

• Injection iontophorétique.

• Cristaux de colorants (dye crystals)

A. Injection:

I. Méthodes et Généralités

• Absorption active. - dextrans aminés pour des axones lésées - PI, FB pour des terminaisons intactes

• Absorption passive

• Injection intracellulaire

• Transport et séquestration dans la cellule: - Transport actif vésiculaire - Diffusion latéral dans la membrane

B. Absorption

I. Méthodes et Généralités

• Pour des marqueurs fluorescents: - Directement visibles

- Possibilité d’utiliser plusieurs marqueurs en même temps

- Pas préservés sur coupe au cryostat ou paraffine

- Une trop forte fluorescence peut masquer de plus petits processus

• Pour des marqueurs non fluorescents: - anticorps spécifiques

C. Détection

II. Les traceurs monosynaptiques Les traceurs rétrogrades :

Transport antérograde

Transport rétrograde

Le marqueur va être absorbé aux niveau des terminaisons nerveuses et transféré vers le soma du neurone

Utilisé lors de l’étude de la dégénération des axones

projetant vers la région du cerveau qui a été détruite

Les traceurs antérogrades :

Le marqueur est injecté au niveau du soma et sera transporté jusq’aux terminaisons nerveuses

Cela permet le traçage de cibles anatomiques d’une population particulière de projection de

neurones

II. Les traceurs monosynaptiquesLes traceurs exclusivement antérogrades

Les acides aminés radiomarqués : acides aminés tritiés, précurseur métabolique, neuro-transmetteur ou intermédiaire autoradiographie

Facilement transporté par des peptides nouvellement synthétisés

Faible poids moléculaire

Propriétés hydrophiles qui limitent la diffusion à l’intérieur de la matrice extracellulaire

Sélectivité restreinte pour certaines cellules ou projections

II. Les traceurs monosynaptiquesLes traceurs exclusivement antérogrades

Les dextrans aminés:

Facilement utilisable, injection par pression ou par iontophorèse

Grandes variétés de méthodes de détections ont été développées pour eux

Peuvent se conjuguer avec de nombreux colorants fluorescents

Visibilité immédiate et production de préparation permanente

Ex : Fluoro-Ruby, Fluoro-Emerald, Biotinylated dextran amines

II. Les traceurs monosynaptiquesLes traceurs exclusivement rétrogrades

HRP (Horse radish peroxydase ou péroxydase de raifort) : révélé par la DAB (diaminobenzidine)

L’utilisation de trop grandes quantités de traceur peut compromettre la précision de la visualisation

1er traceur neuroanatomique rétrograde utilisé 

La coloration est incomplète et reste limitée au soma et aux dendrites primaires

Analyse de l’ultrastructure

Détection profite des propriétés enzymatique du traceur (DAB et TMB)

L’absorption par les terminaisons nerveuses se fait par des vésicules qui contiennent l’enzyme

II. Les traceurs monosynaptiquesLes traceurs exclusivement rétrogrades

Fluoro-gold, E. Coli enterotoxin subunit B, billes microsphériques fluorescentes en

latex• Marquage sur du long terme• Temps de survie 24h à 48h• Étiquetage pendant plusieurs mois

II. Les traceurs monosynaptiques

Les traceurs antérogrades et rétrogrades

Les colorants de carbocyanides (DiI, DiO, DiAsp, DiA)

Les toxines bactériennes (sous-unités b de la toxine du choléra)

• Utilisation in vivo ou in vitro• Fluorescence intense des voies de signalisation• Fort pouvoir lipophile• Diffusion axonale lente

Se lie aux gangliosides présent sur la surface neuronale Marque de grands réseaux neuronaux

Les lectines (WGA, PHA-L)

Forte affinité pour de nombreux sucres transport spécifique efficace

II. Les traceurs monosynaptiques Les marqueurs fluorescents (TRITC, FITC, FB, TB, rhodamine …)

La biocytine et neurobiotine

• Simple à utiliser• Forte sensibilité pour le traçage• Combinaison possible avec d’autres méthodes de traçage• Non dégradé avec le temps

• Marquage très fin des arborisations axonales• Faible poids moléculaire• Forte affinité pour l’avidine (détection)

III. Les traceurs transsynaptiques

Traceurs permettant la visualisation d’un réseau neuronal

traceurs pouvant passer les barrières synaptiques présentes entre les neurones

Virus neurotropes modifiés

(Herpès, rhabdovirus)

WGA-HRPFragment C de la toxine tétanique

Lectines, fucose

radioactif, …

Les plus utilisésDépend des conditions

expérimentales

Transport transneuronal de la

périphérie

Diminution du signal dans le neurone de 2nd

ordre, …

III. Les traceurs transsynaptiques

Les virus neurotropes :

Réplication dans les cellules hôtes après le transport neuronal

Transport de la périphérie jusqu’au système nerveux central

Amplification du signal

Détection des antigènes viraux dans le corps des cellules

neuronales avec immunocytochimie

Conclusion

• De nos jours nous possédons une palette de marqueurs

• Ils sont soit antérogrades, soit rétrogrades ou les deux

• Ils ont donc des applications différentes

• La recherche de marqueur se poursuit ex: WGA-HRP transgène

Merci de votre attention !