Etude des protéines inconnues du phage p2 par édition génétique avec CRISPR-Cas9

Edouard Saucier, Alice P. Jolicoeur & Sylvain Moineau

Système CRISPR-Cas9 Gabarit de recombinaison

Matériel & Méthode

Résultats Conclusions & perspectives

•Plasmide utilisé pour fabriquer notre pL2Cas9, pTRKL2 est compatible et s’exprime de manière stable dans d’autres lactocoques d’intérêt pour l’industrie laitière.(2)

Contexte

(1) Lemay, M.L., Tremblay, D., Moineau, S. (2017) Genome Engineering of Virulent Lactococcal Phages Using CRISPR-Cas9. ACS Synthetic Biology 6. 1351-1358. (2) O’Sullivan, D. J., and Klaenhammer, T. R. (1993) High-and low-copy-number Lactococcus shuttle cloning vectors with features for clone screening. Gene 137. 227−231.

Département de biochimie, de microbiologie et de bio-informatique, Faculté des sciences et de génie, Québec City, QC, CanadaGroupe de recherche en écologie buccale, Faculté de médecine dentaire, Université Laval, Québec City, QC, Canada

Infection des souches par le phage : génération de phage mutants pour la protéine étudiée.

‣Code gène de résistance à l’érythromycine : sélection des clones l’ayant intégré.

Vue en cyromicroscopie électronique de L. lactis subsp. cremoris MG1363

Par Kathryn Cross, IFR.

‣Plasmide pL2Cas9 code tous les éléments du système CRISPR-Cas9 de type II-A de Streptococcus pyogenes.

‣On le dirige en clonant un espaceur de notre choix qui dicte la spécificité de cible.

‣Oriente l’activité de l’endonucléase Cas9 qui clive le gène ciblé du phage p2.

‣Coupure double-brin de l’ADN favorise un événement de recombinaison homologue du phage pour réparer son génome.

‣Intégration par électroporation dans cellules MG1363 compétentes.

Conception bioinformatique d’amorces pour obtenir une version tronquée de la protéine 37/38 étudiée ici.

Version tronquée du gène est flanquée de bras d’homologie (300 pbs) avec le génome

du phage p2 pour diriger le gabarit de recombinaison : intégration de cette version dans le génome du phage lors de l’infection

virale.

Transformation du second plasmide par électroporation.

Culture de L. lactis sur milieu double antibiotiques : sélection des clones ayant

intégré les deux plasmides.

Assemblage Gibson dans plasmide pNZ123 qui code un gène de résistance au chloramphénicol.

Bactériophage p2• Groupe de

lactophage le plus prévalent, Skunavirus.

• Modèle de laboratoire.

• Menace constante envers l’industrie laitière.

•Construction de la souche L. lactis cremoris MG1363::pL2O37+pNZ37 qui exprime un système fonctionnel pour déléter le gène codant la protéine 37 du phage p2.

Courtesy of Pr. Cambillau

•Construction de la souche L. lactis cremoris pour éditer le gène 38 en cours.

•Infection par le phage p2 en cours : l’obtention de phages mutants pour le gène 37/38 servira à statuer sur leur nature essentielle ou non.

•Si ce phage mutant peut se répliquer, son phénotype aidera alors in fine à caractériser la fonction de la protéine 37/38 et mieux comprendre la biologie de ce phage.

•Outil d’édition génétique permettant l’étude simple et reproductible de potentiellement n’importe quel gène du phage p2.

•Outil générant des mutations Knock-Out : bon moyen d’approcher in vivo le caractère essentiel ou non d’une protéine.

•Méthodes complémentaires nécessaires pour étudier des protéines essentielles (fusion tag-histidine en N-ter).

•Perspective d’annoter fonctionnellement l’intégralité du génome du phage p2 : mieux caractériser l’interaction hôte-parasite entre les lactophages et les bactéries à haute valeur industrielle comme Lactococcus lactis subsp. cremoris. A terme proposer des souches bactériennes résistantes aux phages pour assurer la pérennité du processus de fermentation.

Gènes codant des protéines de fonctions inconnues

5kb

Expression précoce MédianExpression tardive

Génome de p2

1 2

3Adaptée de Lemay et al., bio-protocol, 2018

Lactococcus lactis

ADN bactérien•Destruction de souche de Lactococcus lactis subsp. cremoris après complétion du cycle lytique.

•Souche à haute valeur industrielle responsable des excellentes qualités organoleptiques du cheddar canadien.

Infection par phage p2

Ce projet utilise une approche d’édition génétique développée dans notre laboratoire (1) qui vise à exprimer un système CRISPR-Cas9 dans la souche modèle L. lactis subsp. cremoris MG1363 afin de modifier le gène 37 et 38 du phage p2 pour in fine caractériser fonctionnellement ces deux gènes.

Réplication & maturation