Mémoire de Magister en Biologie - theses.univ-oran1.dztheses.univ-oran1.dz/document/TH3337.pdf · L’extraction des phénols totaux est faite par macération et l’évaluation

Mémoire de Magister en Biologie

Option : Microbiologie

Présenté par :

CHEKROUN Chahinez

Jury

Président : M. BELKHODJA Moulay : Professeur Université d’Oran.

Examinateurs : Mme IGHILHARIZ Zohra : Maitre de conférences Université d’Oran.

Mme BENNECEUR Malika : Maitre de conférences Université d’Oran.

Encadreur : Melle BOUABDALLAH Louiza : Maitre de conférences Université d’Oran.

Année universitaire 2010-2011

Etude des effets des filtrats de culture d’Ascochyta rabiei (Pass.) Lab.,

agent de l’anthracnose sur des cals de Cicer arietinum

Remerciements

Mes remerciements sont d’abord au Dieu tout puissant de m’avoir donné la force et la

patience pour terminer ce travail.

Je tiens à remercier tout particulièrement Monsieur le Professeur BELKHODJA

Moulay qui me fait l’honneur d’accepter de présider le jury.

Je remercie Melle BOUABDALLAH Louiza qui ma fait l’honneur de diriger ce

travail. Ses connaissances et son expérience ont été une source constante de savoir.

Qu’elle trouve en ces quelques lignes ma profonde gratitude.

Je remercie vivement Mme IGHILHARIZ Zohra qui a bien voulu examiner ce travail

et de nous avoir aidé tout au long du Magister.

Je remercie Mme BENNECEUR Malika pour sa participation au jury en examinant

ce travail.

Je voudrais également remercier Messieurs ; BENSOLTANE A, BEKKI A et

MAROUF A pour le matériel qu’ils ont mis a notre disposition.

Mes sincères remerciements pour Monsieur KARKACHI N et Mme KARKACHI S

pour leur aide, encouragement et soutien.

Mes remerciements vont aussi vers mes parents pour leur soutien moral fournit tout au

long de la réalisation de ce travail.

Merci à tous

Résumé

Le pois chiche (Cicer arietinum L.) est une source de glucides et de protéines ravagée

par l’anthracnose due à Ascochyta rabiei. Elle attaque les parties aériennes de la plante. Les

moyens de lutte envisagés sont peu efficaces. La recherche d’une méthode de lutte plus

efficace nécessite l’étude des mécanismes déployés lors des interactions hôte pathogène. Le

but de notre mémoire se rapporte à la mise en évidence de phénols lors de la confrontation

des cals de C. arietinum et des filtrats d’A. rabiei. Les phytoalxines constitués de phénols

sont les composés produits en quantités importantes lors des mécanismes de défense chez

les variétés résistantes infectées par un pathogène.

Les cals de tiges et de folioles des génotypes INRAT 199, Twist et Flip 82-150C sont

initiés sur MS avec les combinaisons hormonales M1 (3mg/l 2,4-D, 3mg/l BAP), M2

(3mg/l 2,4-D, 0.1mg/l BAP), Ma (2mg/l 2,4-D, 4mg/l Kinetine) et M8 (2mg/l 2,4-D, 4mg/l

ANA et Kinétine 1mg/l). La callogenèse est obtenue au bout d’un mois. La confrontation

des cals de INRAT 199 résistant et Twist et Flip 82-150C tolérants s’est effectuée sur

milieu MS avec 50% de filtrat des isolats (H1 et E7). L’extraction des phénols totaux est

faite par macération et l’évaluation quantitative est réalisée par spectrophotométrie.

La callogenèse initiée chez C. arietinum est influencée par l’explant (organe et

génotype) et par la composition hormonale (nature et concentration). Une callogenèse

maximale de tiges est observée chez le génotype INRAT 199 sur les milieux M1 et M2 et

pour les génotypes Twist et Flip 82-150C sur les milieux Ma et M8 respectivement. Une

callogenèse importante de folioles du génotype INRAT 199 est signalée sur les milieux M2

et M8 et chez le génotype Twist sur les milieux M1, Ma et M8. Les folioles du génotype

Flip 82-150C ont donné une bonne initiation de cals sur un seul milieu M1.

Les résultats des interactions cals de C. arietinum-filtrat de culture d’A. rabiei

suggèrent l’existence de substance dans le filtrat de culture des isolats E7 et H1 d’A. rabiei

capables de provoquer la production de phénols par les cals de C. arietinum. Elle est

variable en fonction de l’origine des cals (génotype résistant ou tolérante) et de l’isolat.

Les quantités de phénols des cals confrontés au filtrat de culture d’A. rabiei (E7 et

H1) sont supérieures à celles du témoin en général. Les cals du génotype Twist tolérant

traités par les filtrats de culture d’A. rabiei synthétisent plus de phénols que les cals des

autres génotypes. Les cals du même génotype se comportent selon l’isolat. Le filtrat de

l’isolat E7 a entrainé une plus grande synthèse de phénols par les cals de folioles et de

tiges.

Mots clés : Cicer arietinum, Ascochyta rabiei, Callogenèse, hormones, phénols.

Abstract

Chickpea (Cicer arietinum L.) is a source of carbohydrates and protein devastated by

anthracnose caused by Ascochyta rabiei. It attacks the aerial parts of the plant. The control

methods are considered inefficient. The search for a more effective control method requires

the study of mechanisms deployed at the host pathogen interactions. The purpose of our

submission relates to the detection of phenols in the confrontation callus of C. arietinum and

filtrates of A.. rabiei. The phytoalxines consisting of phenols are compounds produced in

large quantities during defense mechanisms in resistant varieties infected by a pathogen.

Calli stems and leaflets of genotypes INRAT 199, Twist and Flip 82-150C were initiated

on MS with combination hormonal M1 (3mg / l 2,4-D, 3 mg / l BAP), M2 (3 mg / l 2, 4-D,

0.1mg / l BAP), Ma (2mg / l 2,4-D, 4 mg / l Kinetin) and M8 (2mg / l 2,4-D, 4 mg / l NAA

and Kinetin 1 mg / l). The callus was obtained after a month. The confrontation of resistant

calli INRAT 199 and Twist and Flip 82-150C tolerant took place on MS medium with 50% of

culture filtrate of the isolates (H1 and E7). The extraction of total phenols is made by

maceration and quantitative evaluation is performed by spectrophotometry.

Callus initiated in C. arietinum is influenced by the explant (genotype and body) and by

the hormonal composition (nature and concentration). A maximum stem callus was observed

in the genotype INRAT 199 on media M1 and M2 and for genotypes Twist and Flip 82-150C

on Ma and M8 respectively. A large callus of the genotype of leaflets INRAT 199 is reported

on the media M2 and M8 in the genotype Twist on media M1, Ma and M8. The leaflets of

genotype Flip 82-150C gave good callus initiation on a single medium M1.

The results of interactions callus of C. arietinum-culture filtrate of A. rabiei suggest the

existence of substance in the culture filtrate of isolates of A. rabiei (E7 and H1) able to induce

the production of phenols by the callus of C. arietinum. It varies depending on the origin of

callus (resistant or tolerant genotype) and the isolate.

The amounts of phenols callus face the culture filtrate of A. rabiei (E7 and H1) are higher

than those of the control in general. Calli tolerant genotype Twist treated culture filtrates of

A. rabiei synthesize more phenols than other genotypes calli. Calli of the same genotype

behave according to isolate. The filtrate of the isolate E7 resulted in a greater synthesis of

phenols by callus of leaflets and stems.

Keywords: Cicer arietinum, Ascochyta rabiei, Callogenesis, hormones, phenols.

Sommaire

Introduction………………………………………………..……………........ 1

Chapitre I : Etude bibliographique

1. Présentation de la plante hôte Cicer arietinum L. ………………………… 3

1.1. Description de la plante …………………………………………………. 3

1.2. Importance de la plante …………………………………………………. 6

1.3. Culture de tissu ………………………………………………………….. 10

1.3.1. Généralités ……………………………………………………………..

1.3.2. Callogenèse et variation somaclonale …………………………………

10

11

1.3.3. Culture de tissu du pois chiche………………………………………… 11

1.4. Les maladies du pois chiche ……………………………………………. 13

2. Anthracnose du pois chiche ……………………………………………….. 14

2.1. Présentation du pathogène Ascochyta rabiei ……………………………. 14

2.1.1. Description du pathogène ……………………………………………... 14

2.1.2. Processus infectieux…………………………………………………… 17

2.1.3. Cycle de la maladie …………………………………………………… 19

2.1.4. Symptômes ……………………………………………………………. 21

2.2. Mécanismes de résistance de la plante hôte C. arietinum……………….. 23

2.3. Moyens de lutte …………………………………………………………. 25

Chapitre II : Matériel et méthodes

1. Matériel biologique ……………………………………………………… 28

1.1. Matériel végétal …………………………………………………………. 28

1.2. Matériel fongique ………………………………………………………... 28

2. Méthodes ………………………………………………………………….. 28

2.1. Repiquage du champignon Ascochyta rabiei………………………………..

2.2. Préparation du filtrat de culture d’A. rabiei…………………………………..

28

29

2.3. Dosage du filtrat de culture d’A. rabiei…………………………………... 29

2.3.1. Dosage des protéines (Méthode de Bradford)……………………….. . 29

2.3.2. Dosage des sucres (Méthode de Dubois)……………………………... 30

2.4. Préparation du semis……………………………………………………... 31

2.5. Culture in vitro……………………………………………………….. …. 31

2.6. Interaction cals C. arietinum- filtrat d’A. rabiei ……… ………………… 32

2.7. Dosage des phénols………………………………………………………. 32

2.8. Analyse statistique………………………………………………………... 34

Chapitre III : Résultats et discussion

1. Partie culture in vitro du pois chiche………………………………………. 35

1. 1. Résultats……………………………………………………………….. . 35

1.1.1. Cas des explants d’entre nœuds……………………………………… . 35

1.1.2. Cas des explants de folioles…………………………………………… 41

1.2. Discussion………………………………………………………………. 52

2. Partie interaction cals C. arietinum- filtrat d’A. rabiei …………………… 54

2. 1. Résultats………………………………………………………………… 54

2.1.1. Etude du champignon A. rabiei ……………………. ………………… 54

2.1.2. Cas du dosage du filtrat de culture d’A. rabiei……………………………. 56

2.1.3. Effets du filtrat de culture d’A. rabiei sur les cals de C. arietinum…….. 57

2.1.4. Teneur des polyphénols totaux………………………………………… 57

2.2. Discussion……………………………………………………………….. 63

Conclusion et perspectives …………………………………………………... 67

Références bibliographiques…………………………………………………. 69

Annexe……………………………………………………………………….. 79

Liste des tableaux

Tableau 1: Principaux constituants biochimique du pois chiche (Cicer arietinum L.)……... 6

Tableau 2: Composition en acides aminés du pois chiche (Cicer arietinum L.)……………. 7

Tableau 3: Les éléments minéraux contenus dans le pois chiche (Cicer arietinum L.)…….. 8

Tableau 4: Gamme étalon pour le dosage des protéines……………………………………. 30

Tableau 5: Gamme étalon pour le dosage des sucres……………………………………….. 31

Tableau 6: Les différentes combinaisons hormonales additionnées au milieu MS………... 32

Tableau 7: Gamme étalon pour le dosage des polyphénols totaux…………………………. 34

Tableau 8 : Etude statistique (analyse de variance ANOVA) sur l’effet des trois facteurs

(explant-génotype-milieu) sur l’initiation de la callogenèse chez les entre nœuds de

Cicer arietinum L…………………………………………………………………………….

40

Tableau 9 : Etude statistique (analyse de variance ANOVA) sur l’effet des trois facteurs

(explant-génotype-milieu) sur l’initiation de la callogenèse chez les folioles de

Cicer arietinum L…………………………………………………………………………….

48

Tableau 10: Caractéristiques des cals issus des explants de folioles et d’entre nœuds de

trois génotypes (D1, D2 et D3) de Cicer arietinum L. sur les milieux (M1, M2, Ma et

M8)............................................................................................ ......................................

50

Tableau 11: Caractéristiques macroscopiques des deux isolats d’Ascochyta rabiei…………. 54

Tableau 12: Caractéristiques microscopiques des deux isolats d’Ascochyta rabiei…………. 54

Tableau 13: Teneur des polyphénols totaux des cals provenant des explants d’entre nœuds

et de folioles (mg EAG/ g de cal) confrontés au filtrat de culture des deux

isolats E7 et H1……………………………………………………………………………….

Tableau 14 : Pourcentage de cals des explants d’entre nœuds des trois génotypes de pois

chiche en présence de différentes combinaisons hormonales (2,4-D, ANA,

BAP et KIN)………………………………………………………………………………….

Tableau 15 : Pourcentage de cals des explants de folioles des trois génotypes de pois

chiche en présence de différentes combinaisons hormonales (2,4-D, ANA,

BAP et KIN)………………………………………………………………………………….

59

82

82

Liste des figures

Figure 1 : Description botanique du pois chiche (Cicer arietinum L.)…………………... 5

Figure 2 : Pourcentages de production du pois chiche dans différentes pays du monde… 9

Figure 3 : Production du pois chiche en Algérie (1999-2009)…………………………… 9

Figure 4 : Caractéristiques microscopiques et macroscopique d’Ascochyta rabiei………. 16

Figure 5 : Structure des Solanapyrones………………………………………………….. 18

Figure 6 : Cycle de l’anthracnose du pois chiche………………………………………... 20

Figure 7 : Symptômes de l’anthracnose du pois chiche (Cicer arietinum L.)…………… 22

Figure 8 : Structure des composés phénoliques sécrétés par Cicer arietinum L………… 23

Figure 9 : Structure des phytoalexines sécrétés par Cicer arietinum L………………….. 24

Figure 10 : Génotypes de pois chiche INRAT 199, Twist et Flip 82-150C…………….. 28

Figure 11 : Extracteur sous reflux et Evaporateur rotatif………………………………… 33

Figure 12 : Effet des différents milieux sur la formation des cals à partir des explants

d’entre nœuds du génotype D1 (INRAT 199)……………………………………………..

37


d’entre nœuds du génotype D2 (Twist)……………………………………………………

37


d’entre nœuds du génotype D3 (Flip 82-150C)…………………………………………...

37

Figure 15 : Initiation de la callogenèse des explants d’entre nœuds des trois génotypes

D1 (INRAT 199), D2 (Twist) et D3 (Flip 82-150C) sur les deux milieux M1 et M2…….

38

Figure 16 : Cals âgés d’un mois des explants d’entre nœuds des deux génotypes D1

(INRAT 199) et D2 (Twist) sur les deux milieux M1 et M2……………………………...

39

Figure 17 : Effet des différents milieux sur la formation des cals à partir des explants de

folioles du génotype D1 (INRAT 199)……………………………………………………

42


folioles du génotype D2 (Twist)…………………………………………………………..

42


folioles du génotype D3 (Flip 82-150C)…………………………………………………..

42

Figure 20 : Initiation de la callogenèse des explants de folioles du génotype D1

(INRAT 199) sur le milieu M8 et du génotype D3 (Flip 82-150C) sur le milieu M2…….

43

Figure 21 : Initiation de la callogenèse des explants de folioles du génotype D2 (Twist)

sur les deux milieux M1 et M2……………………………………………………………

44

Figure 22 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D1 (INRAT 199)

sur les milieux M1, M2 et M8……………………………………………………………..

45

Figure 23 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D2 (Twist)

cultivés sur les milieux M1, M2 et Ma……………………………………………………

46

Figure 24 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D2 (Twist)

cultivés sur le milieu M8 et du génotype D3 (Flip 82-150C) cultivés sur le milieu M2….

47


d’entre nœuds des trois génotypes (D1, D2 et D3)………………………………………..

49


folioles des trois génotypes (D1, D2 et D3)……………………………………………….

49

Figure 27 : Callogenèse après mise en culture des explants d’entre nœuds et de folioles

des deux génotypes Twist et Flip 82-150C sur le milieu MS à base de charbon………….

51

Figure 28 : Aspect macroscopique et microscopique des deux isolats H1 et E7………… 55

Figure 29 : Courbe étalon du dosage des protéines par la méthode de Bradford………… 56

Figure 30 : Courbe étalon du dosage des sucres par la méthode de Dubois……………... 56

Figure 31 : Courbe étalon du dosage des phénols………………………………………... 58

Figure 32 : Teneur des polyphénols totaux (mg EAG/g de cal) d’explants d’entre nœuds

confrontés au filtrat de culture de l’isolat H1……………………………………………...

60

Figure 33 : Teneur des polyphénols totaux (mg EAG/g de cal) d’explants de folioles

confrontés au filtrat de culture de l’isolat H1……………………………………………...

60

Figure 34 : Teneur des polyphénols totaux (mg EAG/g de cal) d’explants d’entre nœuds

confrontés au filtrat de culture de l’isolat E7……………………………………………...

61


confrontés au filtrat de culture de l’isolat E7……………………………………………...

61

Figure 36 : Effet du filtrat de culture brut d’Ascochyta rabiei sur les cals de

Cicer arietinum après 1 semaine de confrontation………………………………………...

62

Introduction

Introduction

1

Introduction

Le pois chiche (Cicer arietinum L.) est l’une des plus importantes légumineuses à

graines dans le monde. Il occupe une place importante dans l’alimentation humaine à cause

de sa valeur nutritive. Il fournit une source de glucides, de protéines, de lipides, de sels

minéraux et de vitamines. La consommation de cette plante est très demandée en Algérie

mais la production nationale de pois chiche ne recouvre pas les besoins. Cette culture est

limitée par l’action de plusieurs facteurs biotiques (insectes, champignons, bactéries et

virus) et abiotiques (la salinité, la sécheresse et le froid). Parmi les nombreux champignons

phytopathogènes attaquant le pois chiche, le principal est Ascochyta rabiei agent de

l’anthracnose. Il peut entrainer des pertes du rendement qui peut atteindre 100% pour les

variétés sensibles. De nombreux moyens de lutte ont été envisagés tels que :

Les techniques culturales

La lutte biologique

La lutte chimique

La lutte génétique par les méthodes traditionnelles

Les moyens de luttes citées n’ont pas permis de contrôler efficacement la maladie. Ils

présentent en plus certains inconvénients. L’utilisation des fongicides peut développer une

résistance chez le champignon et entrainer des risques de toxicité chimique pour l’homme

et l’environnement. Il n’existe pas jusqu’à présent d’agents biologiques permettant

d’éradiquer Ascochyta rabiei. Les variétés sélectionnées par les méthodes traditionnelles

sont obtenues après de nombreuses années de sélection et ne présentent pas une résistance

durable qui est liée à un degré élevé de variation génétique du champignon.

L’utilisation des outils de la biotechnologie permet l’obtention d’une variation

somaclonale qui fait intervenir les modifications génétiques. Les conditions de culture

(milieu, régulateurs de croissance, température,…) entrainent de nouveaux signaux qui

seront le résultat des changements génétiques. Les changements pouvant se manifester par

l’apparition d’une résistance nouvelle et différente à celle obtenue par les méthodes

classiques. Ce caractère nouveau de résistance sera difficile à contourner par le

champignon.

Introduction

2

Cette variation somaclonale peut être orientée par un agent de pression de sélection

qui peut être le champignon lui-même ; son mycelium et ses spores mais aussi les produits

de ses sécrétions telles que les toxines et les enzymes contenues dans son filtrat de culture.

Le criblage in vitro des cals par l’utilisation du filtrat de culture d’un champignon

phytopathogène est une méthode de sélection de nouveaux caractères engendrés par la

variation somaclonale.

La résistance aux micro-organismes phytopathogènes principalement aux

champignons y compris Ascochyta rabiei se manifeste par la production de composés

phénoliques qui sont les précurseurs des phytoalexines. La quantité produite de ces

composés est variable selon le degré de résistance de la plante ; chez une plante résistante,

ils sont produits en plus grande quantité.

Le but de notre travail est l’étude de la mise en évidence de la production des phénols

chez des cals de pois chiche confrontés au filtrat brut de culture d’Ascochyta rabiei. Ce

filtrat renfermant les produits (enzymes et toxines) de sécrétion du pathogène peut

constituer un agent de pression de sélection intéressant. Il peut entrainer une plus grande

production de phénols qui pourrait contribuer à l’amélioration de la résistance vis-à-vis

d’Ascochyta rabiei.

La réalisation de ce travail se déroule en deux étapes ;

La première est la recherche des conditions physiologiques et biologique telles que :

milieu de culture, type d’organe, température, photopériode pour l’initiation des cals de

Cicer arietinum.

La deuxième étape se rapporte à l’interaction du filtrat de culture brut d’Ascochyta

rabiei avec les cals de Cicer arietinum et la détection et l’évaluation quantitative de la

production des phénols chez les cals confrontés.

Chapitre I :

Etude bibliographique


3

1. Présentation de la plante hôte Cicer arietinum L.

1.1. Description de la plante

1.1.1. Position systématique

Règne : Végétal

Sous règne : Phanérogames

Embranchement : Spermatophytes

Sous-embranchement : Angiospermes

Classe : Dicotylédones

Ordre : Fabales

Famille : Fabacées

Sous-famille : Papilionacées

Genre : Cicer

Espèce : arietinum L.

Nom commun : hommos (Arabe), pois chiche (Français), chickpea (Anglais),

garbanzo (Espagnol).

1.1.2. Description botanique

Cicer arietinum L. est une plante herbacée annuelle (Fig. 1a), diploïde (2n= 16)

autofécondée constituée de ;

a. La racine : la racine primaire est de type pivotant profond atteignant jusqu’à 1 à 2

m, ramifiée, les racines latérales pour la plupart sont étalées à 15-30 cm de profondeur dans

le sol. Les racines présentent des renflements ou nodosités suite à une association

symbiotique avec une bactérie Rhizobium.

b. La tige : est velue, anguleuse atteignant 20 à 40 cm de hauteur.

c. Les feuilles : sont alternes et composées imparipennées, sessiles de forme ovale à

elliptique, de 5 à 20 mm / 2 à15 mm, à contours fortement dentées dans les deux tiers


4

supérieurs et sans vrilles. La présence de stipules ovales à triangulaires de 3 à 5 mm / 2 à 4

mm.

d. La fleur : est pentamère avec une formule florale de: 5S+ 5P+ (5+5) E+ 1C. La

corolle est de type papilionacé très zygomorphe, le pétale supérieur est très dominant et

constitue l’étendard qui recouvre les deux pétales latéraux recouvrant eux même ceux de la

carène. La corolle peut être de différentes couleurs blanches (Fig. 1b), bleues (Fig. 1c) ou

(Fig. 1d) roses. Le calice est composé de cinq dents égales. La fleur est bisexuée constituée

des organes reproducteurs males et femelles. L’androcée comporte dix étamines soudées.

Le gynécée est composé d’un style de forme variable, incurvé de 3 à 4 mm de long, et d’un

ovaire toujours libre et stipulé.

e. Le fruit : est une gousse définie par une double ouverture ventrale et dorsale

globuleuse ovoïde, renflée, jaunâtre de 15 à 30 mm à maturité, contenant une à deux

graines (Fig. 1e et 1f).

f. Les graines de pois chiche sont de surface lisse ou rugueuse présentent une

variation de forme et de longueur de 5 à 14 mm / 4 à 10 mm. La couleur et la forme varient

selon les variétés :

La variété Desi : à petites graines de couleurs sombres (Fig. 1g), lisses ou

ridées et recouvertes d’un tégument épais. Les fleurs sont de couleurs bleu violet. Ces

variétés sont cultivées surtout dans le subcontinent Indien, elles tolèrent la chaleur et

la salinité.

La variété Kabuli : à grosses graines de couleur crème (Fig. 1h) recouvertes

d’un tégument mince. Les fleurs sont blanches. Ces variétés sont cultivées dans les

régions méditerranéennes, elles tolèrent le froid.


5

Figure 1 : Description botanique du pois chiche (Cicer arietinum L.).

a : Port herbacé de Cicer arietinum L. ; b : Fleur blanche de Cicer arietinum L. ; c : Fleur bleue de

Cicer arietinum L. ; d : Fleurs rose de Cicer arietinum L. ; e : Jeunes gousses vertes de Cicer

arietinum L. ; f : Gousses jeunes vertes et gousses mûres jaunes de Cicer arietinum L. ; g : Graines

de Cicer arietinum L. type Desi ; h : Graines de Cicer arietinum L. type Kabuli.

d

a

b c

e

f

g h


6

1.2. Importance de la plante (Cicer aritinum L.)

1.2.1. Valeur alimentaire

Le pois chiche est une légumineuse extrêmement nutritive par ses teneurs en glucides

et en protéines qui constituent ensemble 80% du poids sec de la graine.

Le pois chiche est composé de 38 à 59% de glucides dont l’amidon est le principale

carbohydrate le contenu en amidon chez les variétés Desi est inférieur a celui présent chez

les variétés Kabuli (Williams et Singh, 1987).

La concentration des protéines est de 17 à 24% au niveau des cotylédons. Le pois

chiche est riche en Leucine et en Lysine (Tab. 2) qui sont des acides aminés essentiels.

L’acide glutamique et l’acide aspartique sont les majors acides aminés non essentiels

présents dans le pois chiche (Tab. 2).

Les lipides représentent 5,2%. Les triglycérides et les phospholipides sont les

composants prédominants des lipides.

Le pois chiche est riche en minéraux particulièrement en Potassium, phosphore et

calcium (Tab. 3). Le tégument est composé de 70% du calcium total de la graine (Williams

et Singh, 1987).

Tableau 1: Principaux constituants biochimique du pois chiche (Cicer arietinum L.).

Composants Valeurs (%)

Eau 7.3

Glucides 38 à 59

Protéines 24.0

Lipides 5.2


7

Tableau 2: Composition en acides aminés du pois chiche (Cicer arietinum L.) (% de

protéines) (Iqbal et al, 2006).

Composants Valeurs (%)

Arginine 8.3 0.21

Histidine 3.0 0.03

Isoleucine 4.8 0.03

Leucine 8.7 0.03

Lysine 7.2 0.03

Méthionine 1.1 0.04

Phénylalanine 5.5 0.04

Thréonine 3.1 0.04

Tryptophane 0.9 0.02

Valine 4.6 0.03

Alanine 4.97 0.03

Acide aspartique 11.0 0.04

Cystéine 0.6 0.06

Acide glutamique 17.3 0.08

Glycine 3.7 0.03

Proline 3.8 0.05

Serine 3.7 0.02

Tyrosine 2.8 0.06


8

Tableau 3: Les éléments minéraux contenus dans le pois chiche (Cicer arietinum L.) (Iqbal

et al, 2006).

Composants Valeurs (mg)

Sodium 101 3.51

Potassium 1155 5.00

Phosphore 251 6.11

Calcium 197 3.61

Fer 3.0 0.20

Cuivre 11.6 0.20

Zinc 6.8 0.26

Manganèse 1.9 0.10

Magnésium 4.6 0.04

1.2.2. Intérêt agronomique et écologique

Le pois chiche est une légumineuse qui présente des nodosités racinaires. Ces

dernières renferment des bactéries du sol telles que Rhizobium. Cette bactérie a la capacité

de fixer l’azote atmosphérique qui constitue un apport en azote pour le sol. Ceci va

augmenter sa fertilité et améliore ainsi le rendement de cette culture.

Cette symbiose qui contribue à un apport azoté va limiter l’utilisation des engrais

chimiques ce qui va entrainer une baisse des dépenses de production mais aussi une

protection de l’environnement présentant ainsi un intérêt écologique.


9

1.2.3. Superficie et production

Selon les statistiques de la FAO (2009), la production mondiale du pois chiche

avoisine 9.7 millions de tonnes dans une surface de 11 millions d’hectares. L’Inde produit

66.9% de la production mondiale suivie par le second producteur le Pakistan avec une

quantité largement inférieur de 7,5% (Fig. 2). En Algérie la production est très faible de

0.18%. Au cours des dix dernières années (Fig. 3) cette production a subi des diminutions

et des augmentations. La production du pois chiche en Algérie reste toujours insuffisante et

ne recouvre pas les besoins de la population ce qui impose l’importation de cette

légumineuse.

Figure 2 : Pourcentages de production du pois chiche dans différentes pays du monde

(FAO 2009).

Figure 3 : Production du pois chiche en Algérie (1999-2009) (FAO 2009).

0

10

20

30

40

50

60

7066,9

7,5 5,7 4,5 3,1 2,1 0,58 0,51 0,18 0,11 0,05

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

Production (tonne)

Surface cultivée (hectare)


10

1.3. Culture de tissu

1.3.1. Généralités

Le terme in vitro est toute exploitation ou expérimentation biologique qui se fait en

dehors de l’organisme. La culture in vitro des tissus végétaux est l’ensemble de techniques

qui se sont développées depuis les années 1950 permettant de régénérer des plantes

complètes à partir d’explants divers misent en culture en condition aseptiques dans un

environnement contrôlé (température, lumière, composition du milieu de culture,

phytohormones,…).

La culture in vitro est basée sur la propriété de totipotence des cellules végétales qui

signifie la capacité de ces cellules de se multiplier, s’organiser en tissus différents

permettant de donner naissance à des plantes entières

1.3.2. Avantages de la culture in vitro

La manipulation d’une grande quantité de plante dans un espace réduit.

La conservation des génotypes dans des conditions protectrices vis-à-vis des

microorganismes.

Le maintien des génotypes de l’explant (assainissement des plants virosés par

culture de méristème, multiplication de façon conforme par micropropagation).

Elle implique des modifications génétiques de la plante dans le cadre d’obtention

de nouvelles variétés améliorées (variation somaclonale).

1.3.3. Inconvénients de la culture in vitro

La culture de méristème permet l’obtention de plantes indemnes de virus mais qui

ne présentent pas une résistance totale.

Les techniques de culture in vitro peuvent présenter un danger d’instabilité

génétique impliquant des modifications chromosomiques et l’obtention de variants.

Ces techniques nécessitent trop de main-d’œuvre spécialisée ce qui rend le coût des

plantes élevé.


11

1.3.4. Culture de tissu du pois chiche

L’embryogenèse somatique de cals est obtenue par induction des cals

embryogénique en utilisant des régulateurs de croissance de type auxine (Sagare et al,

1993 ; Kumar et al, 1994). Elle est influencée par la source d’auxine et sa concentration, la

source d’explant (génotype) et ses interactions (Barna et Wakhlu 1993, Kiran et al, 2005),

le picloran est la meilleure auxine pour l’induction de l’embryogénèse somatique (Kiran et

al, 2005). Mais ce type de régénération peut mener à une variation somaclonale, l’étude

réalisée par Kiran et al, 2005 sur l’embryogenèse somatique directe sans phase de cal à

partir des explants d’epicotyle de Cicer arietinum rapporte que 80% des plantes régénérés

survies au sol avec production des graines viables et qui ne présentent aucune variation

morphologique. Naz et al, 2008b signalent que la combinaison hormonale 2,4-D/ BAP

stimule l’induction d’embryon somatique indirecte et que 89,14% des plantes régénérés

survies après huit semaines de leur plantation au sol.

L’organogenèse de cal est obtenue par induction des pousses en utilisant les

régulateurs de croissance de type cytokinine (Rao et Chopra, 1987a ; Rao et Chopra, 1989 ;

Sangvan et al, 1989). Barna et Wakhlu, 1994 ont pu régénérer des plantes de pois chiche

par organogenèse indirecte par passage de stade cal et qui produisent des graines viables.

Huda et al, 2003 ont signalés que 35% de plantes régénérées à partir des cals dérivés des

cotylédons survies après quatre semaines de leur plantation dans le sol. Arora et Chawla,

2005 signalent que l’embryon immature est la meilleure source d’explant pour

l’organogénèse indirecte. Mirakabad et al, 2010 ont établies un protocole efficace de

régénération de 20 génotypes de pois chiche par l’utilisation de différentes combinaisons

hormonales pour l’induction des cals, des pousses et des racines.

Brandt et Hess, 1994 ont pu régénérer par organogenèse directe des plantes de pois

chiche avec une fréquence de survie au sol faible ; 28% (variété Desi : cv. Annigeri) et

23% (variété Kabuli : ICCV6). Sarker et al, 2005 ont développés un protocole de

régénération par organogenèse directe de trois variétés de pois chiche à partir des explants

de cotylédons et d’embryon. Naz et al, 2007 signalent que l’utilisation du BAP comme

régulateur de croissance permet la régénération par organogenèse sans phase cal à partir

des explants de nœuds et des pousses. Sujatha et al, 2007 ont établis un protocole rapide,

simple et efficace pour la régénération du pois chiche par l’utilisation de BA (Benzyl


12

Adenine) et l’IBA (Indole Butyric Acid) comme régulateur de croissance, 76,3% des

plantes régénérées survivent au sol sans aucune variation phénotypique.

La régénération du pois chiche in vitro est hautement récalcitrante, Anwar et al, 2010

signalent que deux facteurs majores limitent cette régénération ; l’étape de l’enracinement

et la transplantation. L’utilisation d’un système d’enracinement efficace et de

transplantation des plantules cultivées in vitro permettent de régénérer des plantes de pois

chiche. La disposition d’un protocole efficace et reproductible de culture de tissu et la

régénération des plantes de pois chiche in vitro ouvrent la voie à de nombreuses

applications en génétique et en amélioration pour la production de plantes transgéniques.

1.3.5. Callogenèse et variation somaclonale

La mise en culture d’un explant végétal dans un milieu de culture contenant les

substances nutritives et les phytohormones conduit à la formation d’un tissu néoplasique

relativement homogène appelé « cal » qui correspond à une dédifférenciation accompagnée

d’une reprise des divisions cellulaires (mitoses) de l’explant initial (Margara, 1984).

La variation somaclonale est le résultat des changements génétiques préexistants

(révélés par la régénération) ou induits par la culture in vitro. Elle se manifeste dès le stade

cal par une différence au point de vue couleur, compacité et aspect superficiel et par des

différences morphologiques et physiologiques des plantes régénérées et leur descendance

(Bouharmont, 1991).

L’intérêt de la variation somaclonale est l’obtention de lignés résistants aux

maladies ou divers contraintes de l’environnement (la salinité, la chaleur,…).

L’incorporation d’un agent sélectif au milieu de culture permet la sélection in vitro de

nouveaux caractères engendrés par la variation somaclonale. Partant par ce principe, des

études ont été réalisés pour l’obtention de lignés de pois chiche résistant à Ascochyta rabiei

(Singh et al, 1999) ou tolérants à la salinité (Jaiswal et Singh, 2001).


13

1.4. Les maladies du pois chiche

La production du pois chiche est limitée par l’action de plusieurs facteurs ; les

facteurs biotiques comme les nématodes et les micro-organismes (virus, bactéries et

champignons), les facteurs abiotiques (la salinité, la sécheresse et le froid) et les méthodes

de contrôles faibles.

Les nématodes comme Pratylenchus thornei, Meloidogyne incognita et

Macroposthonia ornata causent des lésions au niveau des racines. Les maladies virales sont

causées par différents virus comme le virus de la mosaïque du concombre, virus de la

mosaïque de Alfalfa et virus de la mosaïque de l’Haricot,…etc. (Nene et Reddy, 1987). Les

bactéries comme Pseudomonas andropogonis et Xanthomonas campestris pv cassiae

infectent le pois chiche et causent eux aussi des maladies (Nene et al, 1996).

Plusieurs champignons attaquent le pois chiche infectant soit les parties souterraines

et les tiges basses comme ; Fusarium oxysporum (agent du flétrissement), Pythium ultimum

(responsable de la fonte de semis et de la pourriture des racines et du collet) ou les parties

aériennes de la plante comme ; Botrytis cinerea (agent de la pourriture grise des racines et

du collet) et Ascochyta rabiei (agent de l’anthracnose)…etc. (Nene et Reddy, 1987).

La maladie la plus néfaste pour la production de pois chiche dans le monde est

l’anthracnose provoquée par Ascochyta rabiei (Nene et Reddy, 1987). C’est une maladie

fongique très importante qui sur le plan économique représente le facteur limitant de la

production du pois chiche. La baisse du rendement est le résultat du développement, sous

des conditions favorables, du champignon. Ce dernier attaque toutes les parties aériennes

de la plante aux différents stades de son développement (Navas-Cortes et al, 1998 ; Chongo

et Gossen, 2001) et persiste dans les résidus de culture, dans les graines et dans la plante

causant ainsi des pertes très considérables.


14

2. Anthracnose du pois chiche

2.1. Présentation du pathogène

2.1.1. Description du pathogène

2.1.1.1. Position systématique

Division : Eumycètes

Subdivision : Deuteromycètes

Classe : Coelomycètes

Ordre : Sphaeropsidales

Genre : Ascochyta (Agrios, 1988)

La découverte du stade téléomorphe : Didymella rabiei (Mycosphaerella rabiei) a

permis de l’intégrer au sein de la taxonomie des Ascomycètes ce qui engendre une double

nomenclature pour cette espèce.

Division : Eumycètes

Subdivision : Ascomycètes

Classe : Loculoascomycètes

Ordre : Dothideales

Genre : Didymella (Agrios, 1988)

2.1.1.2. Les caractéristiques microscopiques

Ascochyta rabiei (Pass.) Labrousse (teleomorphe Didymella rabiei (Kovachevski) v.

Arx) est un champignon imparfait (Agrios, 1970) qui présente deux modalités de

reproductions ; la reproduction asexuée (stade anamorphe : Ascochyta rabiei) et la

reproduction sexuée (stade téléomorphe : Didymella rabiei).

La reproduction asexuée (stade anamorphe : Ascochyta rabiei) assure la dispersion

du champignon est caractérisée par la production de pycnides et des pycnidiospores.


15

a. Les pycnides : sont globuleux sous épidermiques pourvus d’un ostiole (Viennot et

Bourgin, 1949 ; Hoger, 1954 ; Barnett et al, 1972). A l’intérieur des pycnides se

forment les spores asexuées : les pycnidiospores ou conidies (Fig. 4a).

b. Les pycnidiospores : sont hyalines droites ou légèrement incurvés, arrondis à

leurs extrémités, la plus part sont monocellulaires avec la présence de

pycnidiospores bicellulaires dont le pourcentage est bas mesurant 8.2 à 10.0 * 4.2

à 4.5µ (Nene et Reddy, 1987 ; Porta Puglia, 1990 ; Champion, 1997) (Fig. 4b).

c. Le mycelium : est cloisonné (Fig. 4c).

La reproduction sexuée (stade téléomorphe : Didymella rabiei) qui assure la

conservation du champignon est hétérothallique (Armstrang et al, 2001 ; Chang et al, 2008)

issue de l’association de deux cellules compatibles (MAT1-1 et MAT1-2) contribue à une

hétérozygotie des descendants et une diversité génétique et pathologique avec le

développement de nouvelles races du pathogène de haute virulence (Kaiser , 1997 ; Akem,

1999 ; Armstrong et al, 2001 ; Chongo et al, 2004 ; Taleei et al, 2009). Les organes de

reproduction sexuées sont ;

a. Le pseudothèce : mesure 76-152 * 120-250µm (Nene et Reddy, 1987), il

renferme des asques (Fig. 4d).

b. Les asques : mesurent 48-50 * 10-12µm (Nene et Reddy, 1987), chaque asque

contient huit ascospores (Fig. 4e).

c. Les ascospores : mesurent 13.5-17.25 * 6-6.75µm (Nene et Reddy, 1987).

2.1.1.3. Les caractéristiques macroscopiques

Les souches d’Ascochyta rabiei présentent une variabilité morphologique, les

colonies apparaissent en premier temps blanches et deviennent par la suite marrons foncés

à noires suite au développement des conidies après 3 à 4 jours d’incubation (Khan et al,

1999). La croissance du champignon est très lente et présente après repiquage des stries

concentriques très caractéristiques (Champion, 1997) dues au photopériodisme (Fig. 4f).


16

Figure 4 : Caractéristiques microscopiques et macroscopique d’Ascochyta rabiei.

a : Pycnide ; b : Pycnidiospores monocellulaire et bicellulaire (flèche) ; c : Mycelium d’Ascochyta

rabiei ; d : Pseudothèce d’Ascochyta rabiei (Rhaïem et al, 2006) ; e : Asque d’Ascochyta rabiei

(Rhaïem et al, 2006) ; f : Aspect macroscopique d’Ascochyta rabiei

a

b c

f e d


17

2.1.1.4. Pouvoir pathogène

Le degré élevé de la variabilité pathologique observé à l’intérieur de la population

d’Ascochyta rabiei à l’égard des variétés de pois chiche peut être du à plusieurs facteurs.

Cette variabilité est due à la reproduction sexuée et la combinaison de la diversité

génétique (Chongo et al, 2004; Chang et al, 2008). Les mutations qui peuvent se produire

au niveau du génome fongique et le phénomène de migration du champignon à l’échelle de

continents contribuent aussi à cette diversité (Lepoivre, 2003). Les isolats d’Ascochyta

rabiei dans le subcontinent indien ont été trouvés plus virulents que celle en Algérie et au

Liban (Singh et al, 1984). Atinsky et al, 2005 suggèrent que la variabilité du pathogène

observée d’un pays à un autre peut être due à un phénomène d’adaptation de ce dernier aux

conditions environnementaux. On parle de pathotypes.

2.1.2. Processus infectieux

Les spores portés par le vent se fixent sur l’hôte, cette fixation est facilitée par la

sécrétion d’une substance mucilagineuse (Jayakumar et al, 2005) qui permet la protection

du champignon contre la dessiccation (Höhl et al, 1990). La germination des spores et le

développement du tube germinatif sont observés après 12 à 48h de l’inoculation avec une

ramification des hyphes et développement de l’apressorium à leurs extrémités (Höhl et al,

1990). Les spores produisent des toxines qui jouent un rôle très important (Höhl et al,

1991 ; Chen et Strange, 1991) causant la destruction des tissus de l’hôte (Tivoli et Banniza,

2007), plusieurs toxines peuvent être secrétées ; solanapyrone A, B et C (Höhl et al, 1991),

cytochalasin D (Latif et al, 1993), proteinaceous phytoxin (Chen et Strange, 1994).

Le champignon peut pénétrer directement à travers la cuticule de la tige (Jayakumar

et al, 2005) et diffuse à travers le phloème, ou indirectement à travers l’espace

intercellulaire entre les cellules épidermiques et les cellules du parenchyme palisadique des

feuilles sans invasion des cellules vers le pétiole jusqu’à la tige (Höhl et al, 1990 ;

Jayakumar et al, 2005).

Le temps d’incubation et de latence est la période entre la pénétration du pathogène

et l’apparition des premiers symptômes dans l’hôte, la longueur de cette phase est

influencée par la température et l’humidité (Tivoli et Banniza, 2007), elle varie en fonction

de la souche et la variété. Les symptômes apparaissent et se manifestent par l’expression

des lésions caractéristiques.


18

La sévérité de la maladie est influencée par la température et la durée de l’humidité

et leurs interactions (Trapero-Casas et Kaiser, 1992). L’humidité est le facteur le plus

important pour le développement des champignons phytopathogènes, la germination des

conidies et la pénétration du tube germinatif augmentent linéairement avec l’augmentation

de la durée d’humidité et la sévérité de la maladie atteint son maximale après 18h

d’humidité (Jhorar et al, 1998). La température optimale pour le développement de la

maladie est 20°C (Trapero-Casas et Kaiser, 1992), une température inférieure a 18°C ou

supérieur a 28°C inhibe de développement de la maladie (Höhl et al, 1990).

La concentration de l’inoculum influe aussi sur la sévérité de la maladie et son effet

dépend de la sensibilité de la plante, Trapero-Casas et Kaiser, 1992 ont remarqués que chez

les plantes sensibles la sévérité est plus de 50% pour toutes les concentrations testées alors

que chez les plantes résistantes présentent un maximum de 12.7% lorsque la concentration

de l’inoculum est maximale (107 conidies/ml).

Figure 5 : Structure des Solanapyrones (Bahti et Strange, 2004)

Solanapyrone A Solanapyrone B Solanapyrone C


19

2.1.3. Cycle de la maladie

Le stade anamorphe : Ascochyta rabiei

Les graines infectées sont la source principale de l’infection primaire du pois chiche

et transmettent la maladie aux tiges et folioles de la plante (Fig. 6) sur laquelle apparaissent

des symptômes qui se manifestent par des tâches concentriques caractéristiques.

A la surface des tâches se développent les pycnides qui libèrent à maturité des

pycnidiospores constituant l’inoculum pour l’infection secondaire et qui vont être dispersés

par le vent et la pluie.

Le stade anamorphe est influencé par l’humidité relative (Navas-Cortes et al, 1998)

qui déterminera la croissance du champignon dans les tissus de la plante et les débris.

Le stade téléomorphe : Didymella rabiei

Le stade téléomorphe : Didymella rabiei (synonyme : Mycosphaerella rabiei) croit

saprophtytement dans les débris de pois chiche infectés (Fig. 6). Il commence en automne

par la formation des pseudothèce (Navas Cortes et al, 1995) qui libèrent, après maturation,

au début du printemps les ascospores. Ce stade comporte une étape de plasmogamie (fusion

de protoplaste) de deux cellules sexuées compatibles : l’anthéridie (gamétange mâle) et

l’ascogone (gamétange femelle) suivis d’une caryogamie (fusion des noyaux) et d’une

méiose qui aboutit à la formation d’asques dans lesquels se forment huit ascospores viables.

Apres maturation, les ascospore seront aéroportées et constituent une source d’inoculation

primaire permettant ainsi la propagation de la maladie et la survie de l’agent pathogène. A

ce stade, la sévérité de la maladie est corrélée avec la maturation du pseudothèce et la

production et la libération des ascospores (Trapero-Casas et al, 1996).

La capacité de ce champignon à survivre est limitée au genre Cicer et elle dépend de

son mode de propagation et de sa conservation.

Le développement des deux stades dépend des conditions environnementales et/ou

nutritionnelles, le pseudothèce se développe dans un environnement pauvre en nutriment

alors que la formation des pycnides nécessite la disponibilité des nutriments (Tivoli et

Banniza, 2007).


20


21

2.1.4. Symptômes

Sous des conditions favorables au développement du champignon, les symptômes

sont susceptibles de se manifester sur toutes les parties aériennes de la plante (Viennot et

Bourgin, 1949).

a. Sur les tiges : les lésions sont allongées mesurant 3 à 4 cm de longueur qui

peuvent entrainer la cassure de l’organe (Fig. 7a).

b. Les folioles : Des altérations nécrotiques se manifestent par l’apparition sur les

feuilles de tâches arrondies ou ovales qui peuvent atteindre jusqu'à 8 à 10 mm de

diamètre (Fig. 7b).

c. Sur les gousses et les graines : Sur les gousses apparaissent également des cercles

concentriques de 0,5 cm de diamètre (Fig. 7c et 7d) et le champignon peut ainsi

pénétrer dans la gousse et infecter la graine sur lesquelles une décoloration et des

nécroses irréguliers sont observés.

Le champignon peut être localisé à l’extérieur ou à l’intérieur de la graine ainsi

qu’il peut pénétrer dans les cotylédons et infecter rarement l’embryon. Lorsque le

champignon est proche des cotylédons il provoque la diminution de la

germination et les plantes issues présentent un taux élevé de symptômes

(Mitsueda et al, 2001).


22

Figure 7 : Symptômes de l’anthracnose du pois chiche (Cicer arietinum L.).

a : Symptômes de l’anthracnose sur la tige ; b : Symptômes de l’anthracnose sur les folioles de pois

chiche ; c : Symptômes de l’anthracnose sur les gousses jeunes de pois chiche ; d : Symptômes de

l’anthracnose sur les gousses mûres de pois chiche

a b

c d


23

2.2. Mécanisme de résistance de l’hôte

Lors des interactions hôte-pathogène, la plante réagit par développement d’un

mécanisme de résistance en synthétisant les phytoalexines, les composés phénoliques et les

enzymes de défense.

Les composés phénoliques sécrétés par Cicer arietinum L. sont des isoflavones ;

Biochanin A et Formononetin (Weigand et al, 1986), leur synthèse est constitutive

(Kebmann et Barz, 1987), présents à l’intérieur des cellules avant l’infection.

L’accumulation des Biochanin A et Formononetin (Fig. 8) est observée chez la variété

résistante (ILC3279) comme chez la variété sensible (ILC1929) avec une somme identique

entre les deux variétés (Weigand et al, 1986 ; Kebmann et Barz, 1987). La quantité de

Biochanin A est plus importante que la somme de Formononetin produit (Kebmann et

Barz, 1987).

Figure 8 : Structure des composés phénoliques sécrétés par Cicer arietinum L.

(Chérif et al, 2007)

Les phytoalexines Medicarpin et Maackiain (Fig. 9) sont des composés phénoliques

extracellulaires, leur synthèse est induite suite à une élicitation (Kebmann et Barz, 1987 ;

Daniel et al, 1990). Ces composés inhibent l’extension du mycelium lors de sa pénétration

dans les cellules de la plante (Jayakumar et al, 2005 ; Kavousi et al, 2009), Ils forment un

complexe avec les protéines solubles et extracellulaires et les parois des cellules

Biochanin A Formononetin


24

microbiennes causant la perturbation de leurs membranes. La quantité des phytoalexines

sécrétée par la variété résistante (ILC3279) est plus importante que celle de la variété

sensible (ILC1929) (Weigand et al, 1986 ; Kebmann et Barz, 1987) et l’accumulation des

Maackiain est plus faible que les Medicarpin chez les deux variétés (Daniel et al, 1990).

Figure 9 : Structure des phytoalexines sécrétés par Cicer arietinum L. (Chérif et al, 2007)

Les enzymes de défense comportent la Chitinase, la Peroxidase et la B-1,3 glucanase.

Chez la variété sensible, une somme limitée d’enzymes (chitinase, B-1,3 glucanase) sont

sécrétées qui est insuffisante pour l’inhibition de la croissance du champignon. Chez la

variété résistante la quantité de ses enzymes est grande. L’accumulation des enzymes

extracellulaires à activité hydrolase va jouer un rôle très important dans le mécanisme de

défense et déterminera l’interaction incompatible (Vogelsang et Barz, 1990).

Chez les cultivars de pois chiche sensibles le stade de développement de la plante

n’affecte pas la progression de la maladie qui est néfaste aux différents stades (Chongo et

Gossen, 2001), alors que chez les cultivars résistants la résistance varie en fonction de

l’âge de la plante, elle diminue avec le développement de la plante. Cette réponse est

probablement liée à la diminution de l’expression des gènes de résistances (Basandrai et al,

2007).

Medicarpin Maackiain


25

2.3. Moyens de lutte

2.3.1. La lutte chimique

La lutte chimique consiste à utiliser des fongicides qui peuvent être appliqués sur les

graines ou au stade de floraison. Les graines présentent la source principale de l’infection,

leurs traitements avec des fongicides comme Benomyl et Thiabendazole réduisent le

développement du champignon (Gan et al, 2006). L’application au stade de floraison ou de

formation des gousses augmente la quantité et la qualité des graines et réduit la sévérité de

l’anthracnose (Shahid et al, 2008).

Le traitement par les fongicides présente des risques de toxicités chimiques pour

l’homme et l’environnement, ainsi le champignon peut développer une résistance (Chérif et

al, 2007) qui est un processus d’adaptation empêchant le fongicide d’atteindre son site

d’action. Afin de maintenir une bonne efficacité d’une lutte chimique, des stratégies anti

parasitaires sont utilisés comme la limitation des nombres d’applications et l’association

des produits antiparasitaires à modes d’action différents (Gan et al, 2006).

2.3.2. La lutte culturale

L’utilisation de graines saines de qualités supérieures est toujours recommandée pour

s’assurer de l’absence totale d’Ascochyta. La destruction des plantes malades et la

désinfection du matériel utilisé sont des pratiques très importantes dans le contrôle de la

maladie. L’application des barrières horizontales par l’utilisation des plantes non hôtes

pour limiter la dispersion horizontale du champignon (Gan et al, 2006).

Ce champignon peut survivre de trois à quatre ans dans les débris de pois chiche

infectés. La rotation de culture chaque 3 ans (Kaiser, 1997) avec des plantes non hôtes

entre les cultures de pois chiche arrête le cycle de la maladie et réduit les changements des

structures des populations du pathogène (Chang et al, 2008). La lutte culturale vise à

accroitre la production agricole plutôt que de lutter contre les maladies. Ce type de lutte

n’est pas suffisant lorsque la pression de la maladie est élevée.


26

2.3.3. La lutte biologique

La lutte biologique consiste à utiliser des organismes vivants antagonistes dont le but

de réduire la densité de l’inoculum de l’agent pathogène ou d’altérer son activité. La

résistance du pois chiche vis-à-vis des attaques pathogéniques par le contrôle biologique

fait appel a des bactéries (Genre : Bacillus, Pseudomonas et Rhizobium) et des

champignons (Genre : Fusarium non pathogène) antagonistes. Les agents de lutte

biologique vont permettre d’induire une résistance chez la plante à travers l’accumulation

des composés phénoliques et de phytoalexines et l’activation de ces mécanismes de défense

(Chérif et al, 2007).

2.3.4. Biotechnologie et amélioration des plantes

Les biotechnologies végétales reposent principalement sur les cultures in vitro qui

permettent la manipulation d’une grande quantité de plante dans un espace réduit ainsi la

conservation et le maintien des génotypes dans des conditions protectrices vis-à-vis des

microorganismes (Haïcour, 2002).

Le criblage in vitro est une méthode de sélection opérée à des explants végétaux

cultivés in vitro, en se basant sur des critères marqueurs. Trois critères de sélection des

individus résistants sont utilisés pour l’amélioration des plantes ; les critères phénotypiques

(observation des symptômes), les critères biochimiques (production des protéines et des

métabolites secondaires) et les critères moléculaires (information génétique de la plante).

Deux procédés de criblages sont appliqués dans la culture in vitro soit par co-culture

du pathogène et des tissus de l’hôte, soit par culture de l’hôte sur un milieu contenant des

toxines (Lepoivre, 2003), Ces méthodes permettent de rechercher une corrélation entre la

résistance in vitro des génotypes végétaux au stade cal et leurs résistances au champ, elles

nécessitent l’utilisation d’un agent sélective efficace et un système de régénération

permettant de régénérer des plantes résistantes (Vardi et al, 1986).

Les toxines purifiées ou le filtrat de culture contenant des métabolites toxiques

peuvent être utilisés comme agent de sélection. Behenke 1979 a pu régénérer des plantes de

pomme de terre résistants à partir des cals résistants au filtrat de culture de Phytophthora

infestans se qui indique la persistance de la résistance à travers la régénération.


27

Cette méthode de sélection permet d’améliorer la résistance de la plante par

l’amélioration de l’expression des protéines reliées à la pathogénicité de la plante. Ahmed

et al, 1996 signalent la possibilité de sélectionner des cals de blé résistants au filtrat de

culture de Fusarium et de régénérer des plantes fertiles avec une résistance améliorée.

Ganesan et Jayabalan, 2006 ont pu régénérer pour la première fois des plantes de Coton

résistantes à partir de culture de cals confrontés au filtrat de culture de Fusarium

oxysporum. Les plantes régénérées produisent une quantité plus importante de chitinase qui

leurs permettent de résister à Fusarium oxysporum et à Alternaria macrospora.

Gayatri et al, 2005 ont pu régénérer des plantes tolérantes de Curcuma longa L. après

trois cycles de sélection des cals tolérants au filtrat de culture de Pythium graminicolum ce

qui indique une stabilité génétique. Rao et Ramgoapl, 2010 ont pu régénérer des plantes de

Tournesol (Helianthus annuus L.) à partir des cals tolérants au filtrat de culture

d’Alternaria helianthi.

Chapitre II :

Matériel et Méthodes

Matériel et méthodes

28

1. Matériel biologique

1.1. Matériel végétal

Trois génotypes de pois chiche ont été utilisés INRAT 199, Twist et Flip 82-150C.

Figure 10 : Génotypes de pois chiche INRAT 199 (a), Twist (b) et Flip 82-150C (c).

1.2. Matériel fongique

Les isolats des champignons utilisés pour cette étude ont été fournis par le laboratoire

de microbiologie de l’université d’ORAN (ES-SENIA). Ces isolats proviennent de cultures

monospores et ont été conservés dans le glycérol à 4°C (Mme Khouadjia).

1. Méthodes

2.1. Repiquage du champignon Ascochyta rabiei

Des cercles de 1cm du champignon débarrassés de l’huile avec du papier filtre stérile

sont déposés sur milieu pois chiche solide coulé en boite. Les boites sont mises en

conditions favorables de croissance du champignon (22°C, 12h d’éclairage). Afin de

maintenir les isolats en culture pure, deux à trois repiquages successifs sur le même milieu

ont été effectués.

Observation microscopique

Des fragments de mycelium d’Ascochyta rabiei sont déposés sur une lame. Elles sont

recouvertes par une goutte de bleu de coton. L’ensemble est recouvert d’une lamelle.

L’observation microscopique est réalisée à un grossissement (GX10 et GX40).

a b c


29

2.2. Préparation du filtrat de culture d’A. rabiei

Le milieu utilisé pour la préparation du filtrat de culture est le milieu Czapek liquide

modifié. Sa préparation est la suivante :

200 g de graines de pois chiche sont cuits dans l’eau distillée. Le bouillon de cuisson

est récupéré et auquel sont ajoutés les composés du milieu Czapek (voir annexe). Le milieu

est réparti à raison de 100 ml dans des erlenmeyer de 250 ml. Après autoclavage, chaque

erlenmeyer est ensemencé avec 2 disques de mycelium de 1cm de diamètre des isolats âgés

de 15 jours. L’ensemble des erlenmeyer est expos aux conditions citées précédemment.

Après la période d’incubation, le mycelium est séparé du milieu par filtration

grossière en utilisant un papier Whatman N°1.

2.3. Dosage du filtrat de culture d’A. rabiei

2.3.1. Dosage des protéines (Méthode de Bradford, 1976)

Principe

La méthode de Bradford est une méthode de dosage des protéines. Elle est basée sur

une réaction colorimétrique entre les protéines et un réactif (bleu de Coomassie).

Le résultat se manifeste par une coloration due à une réaction entre les acides aminés

aromatiques (tryptophane, tyrosine et phenylalanine) et leurs résidus hydrophobes

présentent dans les protéines. La forme anionique (liée) du colorant est bleu alors que la

forme cationique (libre) est rouge et verte. Le changement d'absorbance est proportionnel à

la quantité de colorant lié, indiquant donc la concentration en protéines dans l'échantillon.

Mode opératoire

Préparation du réactif de Bradford : 100 mg du Bleu de Coomassie G25 sont dissous

dans 50 ml éthanol 95°, 100 ml d’acide phosphorique (H3PO4) 85% sont ajoutés.

Le mélange est dilué dans 1l d’eau distillée puis filtré (papier Whatman N°1).

Préparation de la gamme étalon : une gamme de 10 tubes contenant de 10 à 100 ug de

protéines par tube est réalisée à partir de la solution mère BSA (Bovine Serum Albumin)

1 mg/ml.


30

Tableau 4: Gamme étalon pour le dosage des protéines.

Dilution Témoin 1/2 1/4 1/6 1/8 1/10 1/12 1/14 1/16 1/18 1/20 essai

Concentration

des protéines

(µg/ml)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

?

Solution BSA

(µl)

/ 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0

Eau distillée

(µl)

1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910 900 900

Réactif de

Bradford

(ml)

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

Filtrat brute 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100

Le réactif est ajouté au même moment dans tous les tubes afin que la coloration se

développe dans les mêmes conditions pour la gamme étalon et l'échantillon à doser.

L'absorbance de tous les tubes est ensuite mesurée au spectrophotomètre à 595 nm.

2.3.2. Dosage des sucres (Méthode de Dubois et al, 1956)

Principe : La méthode de DUBOIS et al (1956) permet de doser les sucres en

utilisant le phénol et l'acide sulfurique concentré. En présence des deux réactifs, les oses

donnent une couleur jaune-orange dont l'intensité est proportionnelle à la concentration des

glucides. La densité optique est déterminée à 490nm.


31

Tableau 5: Gamme étalon pour le dosage des sucres.

Dilution Témoin 1/2 1/4 1/6 1/8 1/10 1/12 1/14 1/16 1/18 1/20 essai

Concentration

des sucres

(µg/ml)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

?

Solution de

glucose (µl)

/ 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0

Eau distillée

(µl)

1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910 900 900

Acide

sulfurique

concentré (ml)

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

Solution

phénolique à

5% (µl)

200

200

200

200

200

200

200

200

200

200

200

200

Filtrat brute 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100

2.4. Préparation du semis

Après une désinfection des graines par trempage dans l’hypochlorite de sodium 5%

pendant 1 min afin d’éliminer les saprophytes. Elles sont répartis dans des boites stériles

contenant du papier filtre imbibé par l’eau distillée stérile. Les boites sont incubées

à l’obscurité dans l’étuve à 22°C. Les graines germées sont repiquées en pot pour fournir

les plantules.

2.5. Culture in vitro

Après trois semaines de mise en culture, deux types d’explants sont prélevés à partir

des plantules (folioles et les entre nœuds de tiges) en évitant de prendre les zones

méristématiques. Ces derniers ont une taille de 0.5 cm de long.

Les explants de folioles et d’entre nœuds de tiges sont désinfectés avec de l’éthanol

70% pendant 30 secondes et ensuite avec une solution d’hypochlorite de sodium 5%

pendant 3 min.

Les explants sont transférés dans des boites de Petri contenant les différents milieux

de culture à raison de dix explants par boite. L’incubation est faite dans la chambre de

culture (photopériode 16h, température 22°C). Les milieux de culture M1, M2, Ma et M8


32

correspondent aux macroéléments et aux microéléments de Murashige

et Skoog additionnés de différentes recombinaisons hormonales de ;

2,4-D (Acide 2,4-Dichlorophenoxyacetique), ANA (Acide Naphthaleneacetique),

BAP (Benzylaminopurine) et KIN (Kinétine) (Tab. 6).

Tableau 6: Les différentes combinaisons hormonales additionnées au milieu MS.

Hormones

Milieux

Auxines (mg/l) Cytokinine (mg/l)

2,4-D ANA BAP KIN

M1 3 - 3 -

M2 3 - 0,1 -

Ma 2 - - 4

M8 2 4 - 1

2.6. Interaction cals C. arietinum- filtrat d’A. rabiei

Les cals de chaque génotype sont transférés sur le milieu MS contenant le filtrat de

culture de chaque isolat (H1 et E7) à la proportion de 50% (V/V). Le témoin est préparé en

remplaçant le filtrat de culture par l’eau distillée stérile. Les résultats sont mentionnés

après une semaine d’incubation dans les mêmes conditions et la sensibilité des cals est

estimée par évolution nécrotique.

2.7. Dosage des phénols

2.7.1. Extraction des polyphénols totaux (Naz, 1996 ; Naz et al, 2008a)

Après 96h de confrontation, Les cals sont bouillis dans le méthanol pendant

5 minutes (Fig. 11a), puis homogénéisés dans un mortier. Le mélange est filtré a travers un

papier filtre (Whatman N°1) et les débris sont lavés avec du Méthanol acidifié 80%

(HCl 0.1M). 2 ml d’eau distillée sont additionnés. L’extrait est concentré en volume

aqueux par évaporation par évaporateur rotatif sous pression à 40°C (Fig. 11b). L’extrait

aqueux est centrifugé à 6000 tours/min pour écarter la chlorophylle et les débris fins. Une

solution mère est préparée avec l’eau distillée pour obtenir une concentration final de


33

1g/ml (1g de cal/ 1ml d’eau distillée), cette solution est utilisée pour l’estimation

quantitative des composés phénoliques.

Figure 11 : Extracteur sous reflux (a) et Evaporateur rotatif (b).

2.7.2. Dosage des polyphénols totaux

Principe

Les composés phénoliques sont oxydés par les acides phosphotungstique et

phosphomolybdique et ceux-ci sont réduits en oxyde bleu de tungstate et de molybdène.

La coloration bleue développée présente un maximum d’absorbance à 760 nm.

Dosage

L’analyse quantitative des polyphénols totaux est réalisée par le dosage

spectrophotométrique selon la méthode de Folin Ciocalteu (Singleton et al, 1999 ;

Heilerova et al, 2003).

Dans des tubes à essai, on additionne à 100 µl d’extrait (dissous dans l’eau à une

concentration de 1g/ml) 500 µl de Folin Ciocalteu (Merck) (1/10 dissout dans l’eau

distillée). On agite et on laisse à l’obscurité pendant 5 min à température ambiante, ensuite

on ajoute 1.5 ml d’une solution de Na2CO3 saturée à l’ensemble (2%, dissout dans L’H2O).

On agite encore et on laisse à l’obscurité pendant 1 heure à température ambiante,

la couleur jaune du réactif vire au bleu. Les dosages subissent deux répétitions.

Les densités optiques sont lues au spectrophotomètre à 765 nm.

a b


34

La quantification des polyphénols a été évalué au moyen d’une courbe d’étalonnage

linéaire y= ax + b réalisée à l’aide de différentes concentrations d’acide gallique à partir

d’une solution mère d’acide gallique de 1mg/ml dissout dans l’eau distillée (Tab. 7).

Cette courbe est réalisée dans les mêmes conditions opératoires que les échantillons.

Les résultats sont exprimés en mg d’équivalent d’acide gallique par gramme

d’extrait, ils représentent la moyenne de 2 répétitions.

Le blanc est préparé en remplaçant la quantité de l’extrait par l’eau distillée dans les

mêmes conditions.

Tableau 7: Gamme étalon pour le dosage des polyphénols totaux.

Tubes 1 2 3 4 5 6 7 8

Concentration 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.04 0.05

Solution mère

d’acide gallique (µl)

5 10 15 20 25 30 40 50

Eau distillée (µl) 995 990 985 980 975 970 960 950

2.8. Analyse statistique

Les résultats de la culture in vitro sont exprimés en pourcentage, une étude statistique

par analyse de variance était réalisée.

Les résultats du dosage des polyphénols totaux sont exprimés sous forme de

moyenne calculée sur la moyenne de deux répétitions.

Les données expérimentales sont présentées sous forme d’histogramme et courbe

pour l’étalon.

Le coefficient de corrélation R2 entre les DO et les concentrations des étalons sont

calculés à l’aide du logiciel Microsoft Excel 2007.

Chapitre III :

Résultats et Discussion


35

1. Partie culture in vitro du pois chiche

1.1. Résultats

Les résultats obtenus montrent qu’une callogenèse a pu être obtenue chez

Cicer arietinum dans les conditions testées. Elle est influencée par le génotype, organe

(entre nœuds et folioles) et la balance hormonale (nature et concentration). Le traitement

statistique des résultats a confirmé les différences de pourcentages obtenus en fonction de

ces facteurs. La différence est significative entre les génotypes pour la production des cals

en présence de différentes combinaisons hormonales (Tab. 8 et 9).

Les concentrations des combinaisons hormonales auxine et cytokinine (2,4-D et

ANA/BAP et Kinétine) ont induit la formation des cals à partir des entre nœuds et de

folioles chez les trois génotypes de pois chiche (INRA 199, Twist et Flip 82-150C).

Le délai d’apparition des cals est variable selon l’organe. Ce sont les entre nœuds qui

ont subi leurs premières divisions cellulaires au bout de dix jours par contre les folioles

initient leurs mitoses quinze jours plus tard. C’est au bout d’un mois que des cals sont

obtenus chez les deux explants.

Cette callogenèse est influencée par un ensemble de facteurs. Elle est variable en

fonction du génotype, de l’organe (entre nœuds ou foliole) et des hormones (nature et

concentrations).

1.1.1. Cas des explants d’entre nœuds

Après un mois de mise en culture, les explants d’entre nœuds des trois génotypes ont

abouti à la formation des cals d’aspect dur de couleur verte (Fig. 16). L’importance et le

délai de cette callogenèse sont variables selon le génotype et les régulateurs de croissance.

D’une manière générale, les fragments d’entre nœuds ont réagi très favorablement aux

combinaisons hormonales employées (Tab. 14 annexe), Les taux varient de 80% à 100%

(Fig. 12, 13 et 14).

Une prolifération très importante et plus rapide est observée chez les explants du

génotype D2 cultivés sur le milieu M1 (Fig.16b et b1) contenant un rapport

Auxine/Cytokinine égal à 1 (3 mg/l 2,4-D, 3 mg/l BAP). Ce même milieu est très favorable


36

en induisant des taux de cals très élevés 98.3% de cals chez le génotype INRAT 199 (D1),

93.7% chez le génotype Twist (D2) et 90% chez le génotype Flip82-150C (D3).

Le milieu M2 comportant une grande quantité d’une auxine forte (3mg/l 2,4-D) et

une faible quantité de Cytokinine (0.1 mg/l BAP) s’est révélé aussi efficace. Les

pourcentages de cals sont respectivement de 98.3% chez le génotype D1 (INRAT 199),

93.7% chez le génotype D2 (Twist) et de 79.5% chez le génotype D3 (Flip82-150C).

Le milieu Ma constitué d’un rapport Auxine/Cytokinine égal à 1/2 (2mg/l 2,4-D et

4 mg/l Kinétine) s’est montré très intéressant en favorisant une callogenèse de 100% chez

le génotype D2. L’emploi de deux auxines fortes (2 mg/l 2,4-D et 4 mg/l ANA) combinées

à une Cytokinine (1 mg/l Kinétine) chez le milieu M8 a donné des résultats similaires aux

autres milieux.


37


d’entre nœuds du génotype D1 (INRAT 199).


d’entre nœuds du génotype D2 (Twist).


d’entre nœuds du génotype D3 (Flip 82-150C).


38

Figure 15 : Initiation de la callogenèse des explants d’entre nœuds des trois génotypes D1

(INRAT 199), D2 (Twist) et D3 (Flip 82-150C) sur les deux milieux M1 et M2.

a : Initiation de la callogenèse chez les explants d’entre nœuds du génotype D1 (INRAT 199) sur

le milieu M1 ; b : Initiation de la callogenèse chez les explants d’entre nœuds du génotype D2 (Twist) sur

le milieu M1 ; c : Initiation de la callogenèse chez les explants d’entre nœuds du génotype D2 (Twist) sur

le milieu M2 ; d : Initiation de la callogenèse chez les explants d’entre nœuds du génotype D3

(Flip 82-150C) sur le milieu M2.

b

c

a

d


39

Figure 16 : Cals âgés d’un mois des explants d’entre nœuds des deux génotypes D1

(INRAT 199) et D2 (Twist) sur les deux milieux M1 et M2.

a, a1 et a2 : Cals âgés d’un mois des explants d’entre nœuds du génotype D1 (INRAT 199) sur

le milieu M1 ; b et b1: Cals âgés d’un mois des explants d’entre nœuds du génotype D2 (Twist) sur

le milieu M1 ; c : Cals âgés d’un mois des explants d’entre nœuds du génotype D2 (Twist) sur le

milieu M2.

a

b1

c

b

a1

a2


40

Tableau 8 : Etude statistique (analyse de variance ANOVA) sur l’effet des trois

facteurs (explant-génotype-milieu) sur l’initiation de la callogenèse chez les entre

nœuds de Cicer arietinum L.

Entre nœuds D1 D2 D3

M1 59 30 36 n = 4

M2 58 30 39

Ma 51 24 47 k = 3

M8 53 79 26

Somme T1= 221 T2= 163 T3= 148 G= 532

Moyenne 55.25 40.75 37 Total= 133

X 12255 8617 5702 Total= 26574

Erreur 44.75 1974.75 226 Total= 2245.5

Signification S

SCE inter-groupe = 743.17

Variance inter-groupes = 371.58

SCE intra-groupe = 2245.5

Variance intra-groupes = 249.5

F calculé = 1.48

Valeur de F ayant 5% de chances d’être dépassés est 4.256 (F théorique).

F calculé < F théorique

La différence est significative entre les génotypes pour la production des cals en

présence de différentes combinaisons hormonales.


41

1.1.2. Cas des explants de folioles

Après un mois de mise en culture, Les explants de folioles des trois génotypes

forment des cals friables de couleur blanche à marron (Fig. 22, 23 et 24). Le

déclenchement des mitoses se manifestent au niveau la nervure principale (Fig. 20 b1),

l’extrémité du limbe (Fig. 21 a1) et la zone d’excision (Fig. 21 a2). Ces cals ont donc

plusieurs origines.

Les résultats consignés au tableau 15 (annexe) montrent que les pourcentages de cals

sont variables en fonction du génotype et de la combinaison hormonale. Ils varient de

100% à 22% d’une façon générale. Les taux les plus élevés vont de 100% à 89%.

Les pourcentages 100% de cals sont obtenus de manière variable avec des

régulateurs de croissance diversifiés en nature et en concentration. Ils sont signalés chez le

génotype D2 (Twist) sur trois milieux M1, Ma et M8 (Fig. 18). Le milieu M1 contient un

rapport auxine/cytokinine égal à 1 (3mg/l 2,4D et 3mg/l BAP). Le milieu Ma renfermant la

même auxine (2mg/l 2,4D) que le milieu M1 mais une autre cytokinine (4 mg/l Kinétine).

Le milieu M8 comporte deux auxines (2mg/l de 2,4D et 4mg/l de NAA) et la même

cytokinine que le milieu Ma (1mg/l de Kinétine). Le même pourcentage de 100% est

signalé chez un autre génotype D3 (Flip 82-150C) sur le milieu M1 (Fig. 19).

Les plus bas pourcentages de cals formés sont obtenus chez les folioles du génotype

D3 sur les deux milieux M8 (22%) et Ma (32%). Ces faibles taux sont probables liés à la

majorité des explants qui se nécrosent ce qui réduit l’effectif des folioles aptes à la

callogenèse.


42


folioles du génotype D1 (INRAT 199).


folioles du génotype D2 (Twist).


folioles du génotype D3 (Flip 82-150C).

D3


43

Figure 20 : Initiation de la callogenèse des explants de folioles du génotype D1

(INRAT 199) sur le milieu M8 et du génotype D3 (Flip 82-150C) sur le milieu M2.

a, a1 : Initiation de la callogenèse des explants de folioles du génotype D1 (INRAT 199) sur le

milieu M8 ; b, b1 : Initiation de la callogenèse des explants de folioles du génotype D3


a a1

b1 b


44

Figure 21 : Initiation de la callogenèse des explants de folioles du génotype D2 (Twist) sur

les deux milieux M1 et M2.

a, a1 et a2 : Initiation de la callogenèse des explants de folioles du génotype D2 (Twist) sur le

milieu M1 ; b et c : Initiation de la callogenèse des explants de folioles du génotype D2 (Twist) sur

le milieu M2.

a a2

a1

c b


45

Figure 22 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D1 (INRAT 199) sur

les milieux M1, M2 et M8.

a et a1 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D1 (INRAT 199) cultivés sur le

milieu M1 ; b, b1 et b2 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D1 (INRAT 199)

cultivés sur le milieu M2 ; c et c1 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D1

(INRAT 199) cultivés sur le milieu M8.

c

b a

a1

c1

b1

b2


46

Figure 23 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D2 (Twist) cultivés

sur les milieux M1, M2 et Ma.

a : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D2 (Twist) cultivés sur le milieu M1 ;

b et c : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D2 (Twist) cultivés sur le milieu

M2 ; d, d1, d2, d3 et d4 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D2 (Twist)

cultivés sur le milieu Ma.

a

b c

d

d1

d3

d2

d4


47

Figure 24 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D2 (Twist) cultivés

sur le milieu M8 et du génotype D3 (Flip 82-150C) cultivés sur le milieu M2.

a, a1, a2, a3, a4 et a5 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D2 (Twist) sur le

milieu M8 ; b, b1, b2, b3 et b4 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D3


b

a

a1

a2

a3 a4 a5

b1 b2

b3 b4


48

Tableau 9 : Etude statistique (analyse de variance ANOVA) sur l’effet des trois

facteurs (explant-génotype-milieu) sur l’initiation de la callogenèse chez les folioles

de Cicer arietinum L.

Folioles D1 D2 D3

M1 53 55 40 n = 4

M2 57 42 48

Ma 26 52 16 k = 3

M8 51 93 11

Somme T1= 187 T2= 242 T3= 115 G= 544

Moyenne 46.75 60.5 28.75 Total= 136

X 9335 16142 4281 Total= 29758

Erreur 592.75 1501 974.75 Total= 3068.5

Signification S

SCE inter-groupe = 2028.17

Variance inter-groupes = 1014.08

SCE intra-groupe = 3068.5

Variance intra-groupes = 340.94

F calculé = 2.97

Valeur de F ayant 5% de chances d’être dépassés est 4.256 (F théorique).

F calculé F théorique

La différence est significative entre les génotypes pour la production des cals en

présence de différentes combinaisons hormonales.


49

Un même milieu peut se révéler très favorable à un génotype mais il peut donner des

résultats médiocres chez un autre génotype. Les deux milieux Ma et M8 ont donné 100%

de cals chez le génotype D2 mais des taux de cals faibles (30% et 22%) chez le génotype.

D3.


d’entre nœuds des trois génotypes (D1, D2 et D3).


folioles des trois génotypes (D1, D2 et D3).


50

Une homogénéité de texture et de coloration des cals est observée entre les trois

génotypes (Tab. 10). Les caractéristiques des cals sont influencées par la nature de

l’explant et les hormones (nature et concentration)

Tableau 10: Caractéristiques des cals issus des explants de folioles et d’entre nœuds de

trois génotypes (D1, D2 et D3) de Cicer arietinum L. sur les milieux (M1, M2, Ma et M8).

Explants

Caractéristiques

D1 (INRAT 199)

D2 (Twist)

D3 (Flip 82-150C)

Entre nœuds

Folioles

Entre nœuds

Folioles

Entre nœuds

Folioles

Réactivité

Précoce

Tardif

Précoce

Tardif

Précoce

Tardif

Taux de prolifération

(1 mois)

++

+++

+++

+++

++

+++

Nature du cal

Dure

Friable

Dure

Friable

Dure

Friable

Aspect du cal

Compact

Noduleux

Compact

Noduleux

Compact

Noduleux

Couleur des cals

Vert

Vert claire

Vert

Blanchâtre

à vert claire

Vert

Blanchâtre

à vert claire


51

Après le deuxième repiquage, certains cals ont commencé à brunir. Ils ont été

repiqués sur le milieu MS dont les macroéléments ont été réduits de moitié et la teneur de

saccharose baissée à 1% (Fig. 27). Ce nouveau milieu MS est additionné de charbon actif

reconnu pour ses propriétés anti oxydantes et limitant la production de phénols

responsables du brunissement des cals.

Figure 27 : Callogenèse après mise en culture des explants d’entre nœuds et de

folioles des deux génotypes Twist et Flip 82-150C sur le milieu MS à base de

charbon.


52

1.2. Discussion

Les divisions cellulaires et la production des cals exigent la présence des auxines et

des cytokinines. Ces phytohormones sont des composés organiques qui à faible

concentration commande une réponse physiologique chez la plante. Le rôle des auxines

in vitro est de favoriser la croissance des cals, les divisions ainsi que l’allongement

cellulaires. Les cytokinines stimulent eux aussi les divisions cellulaires. Les effets des

cytokinines sont liés à ceux de l’auxine. La callogenèse est principalement sous un contrôle

hormonal. Il existe d’autres facteurs participent à son expression et à son importance, ces

derniers se rapportent au génotype (âge, organe, taille du fragment…). Les résultats de nos

travaux vont dans ce sens. Les hormones et les génotypes testés ont permis de produire des

cals mais de manière variable chez Cicer arietinum L.

Des deux organes testés, les explants d’entre nœuds des trois génotypes ont donné les

meilleurs taux de cals avec toutes les combinaisons hormonales. L’influence de l’organe

sur la callogenèse a été étudiée par Rao et Chopra, 1987b qui rapportent que les cotylédons,

les epicotyle, les hypocotyles, les folioles, le méristème et les racines donnent des résultats

variables avec l’ANA et le BAP. Sangvan et al, 1989 signalent des réactions différentes

selon la nature de l’explant (cotylédons, hypocotyle, racine et les nœuds) de

Cicer arietinum L.

La provenance des organes semble affecter la formation des cals. Les génotypes Desi

et Kabuli présentent une différence de réponse à l’aptitude callogène (Rao et Chopra,

1987b). Les mêmes résultats sont observés dans notre cas avec le génotype Desi (génotype

D1) et les deux génotypes Kabuli (génotypes D2 et D3) qui ont donné les plus importants

taux de cals.

Ce comportement variable des différents génotypes de Cicer arietinum L. est signalé

par Sangvan et al, 1989. Les génotypes de Cicer arietinum L. testés par ces auteurs (C 235,

H 75-35 et Gora Hisari) présentent un pouvoir callogène différents selon la combinaison

hormonale (ANA, BAP, 2,4-D, IAA et Kinétine). Les folioles du génotype D2 ont exprimé

une meilleure callogenèse sur les mêmes milieux que les folioles des autres génotypes D1

(INRAT 199) et D3 (Flip 82-150C). La différence génétique entre les génotypes décrit la

différence de réponse aux régulateurs de croissance (El Far et Taie, 2009).


53

Les résultats de nos travaux montrent l’importance majeure des hormones. Elles

déclenchent les divisions cellulaires au sein de l’explant et leurs poursuites pour produire

des cals et elles assurent la croissance de ces cals. D’après les résultats obtenus les facteurs

de croissance employés semblent influencer cette callogenèse par leur nature et leur

concentration.

Les résultats de l’étude réalisée par Huda et al, 2003 sur Cicer arietinum, ont révélé

que les maximum de cals de cotylédones sont observés dans le milieu MS additionné de 3

mg/l 2-4D et 3 mg/l BAP. Ce rapport auxine/cytokinine égal à 1 qui semble stimuler une

bonne callogenèse avec une vitesse de croissance importante des explants d’entre nœuds du

génotype D2 (Twist).

Naz et al, 2008b remarquent une meilleure formation de cals nodulaires chez les

cotylédons et les folioles de Cicer arietinum L. sur le milieu MS (3 mg/l 2,4-D et

0,1 mg/l BAP). Les mêmes résultats sont signalés par nos travaux en utilisant cette

combinaison hormonale avec des folioles mais aussi des entre nœuds. Javed et al, 1987

observent un meilleur développement de cals friables de nœuds du génotype var. 6163 en

présence d’une grande quantité d’une autre auxine (3mg/l ANA) et maintien de la

cytokinine (0.6 mg/l BAP).

Rao et Chopra, 1987a ont remarqué que le 2,4-D associé avec kinétine produisent des

cals abondants d’épicotyle du génotype GB 256 de Cicer arietinum L. L’association de

deux auxines (2,4-D et ANA) avec la kinétine en présence des entre nœuds de INRAT199,

Twist et Flip 82-150C et des folioles de INRAT 199 et Twist a produit des cals abondants.


54

2. Partie interaction cals C. arietinum- filtrat d’A. rabiei

2.1. Résultats

2.1.1. Etude du champignon A. rabiei

2.1.1.1. Caractères macroscopiques

L’observation macroscopique révèle des différences entre les deux isolats dans leurs

aspects, la couleur des colonies, l’abondance du mycelium, la couleur des pycnides et du

cirrhe et la vitesse de croissance (Tab. 11). Le mycelium des deux isolats ; H1 (Fig. 28a) et

E7 (Fig. 28b) se développe en ras et une zonation est observée qui résulte de l’alternance

de la lumière. La vitesse de croissance de l’isolat E7 est plus grande.

Tableau 11: Caractéristiques macroscopiques des deux isolats d’Ascochyta rabiei.

Caractère

Isolats

Couleur des

colonies

Aspect du

mycelium

Zonation Couleur de

cirrhe

Vitesse de croissance

Diamètre (cm)

H1

Vert foncé avec des

bords clairs

Ras

+

Marron

5.9

E7

Saumon

Ras

+

Saumon

6.5

2.1.1.2. Caractères microscopiques

L’observation microscopique révèle aussi des différences entre les deux isolats ;

H1 (Fig. 28c et e) et E7 (Fig. 28d et f) qui sont mentionnés dans le tableau 12.

Tableau 12: Caractéristiques microscopiques des deux isolats d’Ascochyta rabiei.

Caractère

Isolat

Couleur des

pycnides

Sporulation

H1 Foncé +++

E7 Clair ++


55

Figure 28 : Aspect macroscopique et microscopique des deux isolats H1 et E7.

a : Aspect macroscopique de l’isolat H1 ; b : Aspect macroscopique de l’isolat E7 ;

c : Pycnide de l’isolat H1 (GX 40) ; d : Pycnide de l’isolat E7 (GX 40) ; e : Spores de l’isolat

H1 (GX 100), spore bicellulaire (flèche) ; f : Spores de l’isolat E7 (GX 100), spore

bicellulaire (flèche).

a b

c d

f e


56

2.1.2. Cas du dosage du filtrat de culture d’A. rabiei

2.1.2.1. Dosage des protéines

La concentration des protéines dans le filtrat de culture des deux isolats H1 et E7

est de 42,5 µg/ml et 77,5 µg/ml respectivement. Le contenu protéique du filtrat de l’isolat

E7 est le double de celui du filtrat de l’isolat H1 (Fig. 29).

Figure 29 : Courbe étalon du dosage des protéines par la méthode de Bradford.

2.1.2.2. Dosage des sucres

La concentration des sucres dans le filtrat de culture des deux isolats H1 et E7 est

de 307,5 µg/ml et 337,5 µg/ml respectivement (Fig. 30).

Figure 30 : Courbe étalon du dosage des sucres par la méthode de Dubois.


57

2.1.3. Effets du filtrat de culture d’A. rabiei sur les cals de C. arietinum

Les résultats de cette confrontation se sont manifestés en général par :

Des nécroses apparaissant au bout de 24h sur la partie au contact avec le filtrat brut.

Elles se propagent progressivement vers les parties supérieures du cal. Le filtrat brut peut

renfermer des spores et des fragments de mycelium car il n’a pas subi aucun traitement

thermique.

La croissance mycélienne des deux isolats qui est apparue à la surface du milieu

après 24h de confrontation. Elle devient intense et envahit toute la surface du cal après

72h. La croissance de l’isolat E7 est plus rapide que celle de l’isolat H1.

Les nécroses des cals et la croissance mycelienne se sont manifestées de manière

variable en fonction de l’isolat et la provenance des cals.

Après une semaine, une variation de réaction des trois génotypes aux filtrats de

culture des deux isolats est observée (Fig. 36). Une croissance mycélienne peu importante

est observée au tour des cals de folioles et d’entre nœuds du génotype D1 confrontés au

filtrat de culture de E7 (Fig. 36a), alors que chez les deux génotypes D2 (Fig. 36c) et D3

(Fig. 36e) le mycelium de l’isolat E7 à envahi totalement les cals Aucune croissance

mycélienne n’est observée autour des cals confrontés au filtrat de culture de H1 chez les

trois génotypes INRAT 199 (Fig. 36b), Twist (Fig. 36d) et Flip 82-150 (Fig. 36f). Les cals

dérivés des explants d’entre nœuds et de folioles du même génotype répondent de la même

façon en présence du filtrat de culture des deux souches.

Après deux semaines de confrontation une inhibition totale de la croissance des cals

et des brunissements généralisés sont observés.

2.1.4. Teneur des polyphénols totaux

La teneur des polyphénols a été obtenue à partir d’une courbe d’étalonnage établie

avec des concentrations croissantes en acide gallique (Fig. 31). Elle est exprimée en

mg d’acide gallique par gramme de cal.


58

La courbe de tendance obtenue dans ce cas (Excel 2007) est Y= 30.32X + 0.060

(R2= 0.924).

Figure 31 : Courbe étalon du dosage des phénols.

Selon les résultats consignés au (Tab. 13) les quantités de polyphénols produites

chez les cals de folioles du génotype D1 (INRAT 199) en présence du filtrat de culture des

deux isolats E7 et H1 sont proche (0,819 mg EAG/g de cal et 0,738 mg EAG/g de cal).

Même résultat est obtenu chez les cals du génotype D3 (Flip 82-150C) mais avec des

concentrations supérieur (1,092 mg EAG/g de cal et 1,008 mg EAG/g de cal) se qui

démontre une influence du génotype. Alors que la quantité des polyphénols chez les cals

de folioles du génotype D2 (Twist) sont différentes (Tab. 13) en fonction de l’isolat ;

1.995 mg EAG/g de cal en présence du filtrat de culture de l’isolat E7 et presque de moitié

(1.320 mg EAG/g de cal) en présence du filtrat de H1.

Les réactions des cals d’entre nœuds du génotype D2 sont différentes en fonction

de l’isolat. Les cals confrontés au filtrat de culture de l’isolat E7 produisent deux fois la

quantité (0.861 mg EAG/g de cal) de phénols que ceux confrontés au filtrat de l’isolat H1

(0.567 mg EAG/g de cal). Les mêmes résultats sont obtenus avec les cals du génotype D3.

Une quantité de 0.840 mg EAG/g de cal est produite en présence du filtrat de l’isolat E7

alors que cette quantité est de moitié (0.483 mg EAG/g de cal) chez les cals confrontés au

filtrat de l’isolat H1. Cette différence de production à coïncidé avec la présence d’une


59

quantité plus importante de protéines et de sucres dans le filtrat de culture de l’isolat E7

que celui de l’isolat H1.

La quantité de polyphénols totaux chez les deux génotypes D2 et D3 est plus

importante dans les cals provenant des explants de folioles que celles qui proviennent des

entre nœuds (Tab. 13).

Tableau 13: Teneur des polyphénols totaux des cals provenant des explants d’entre nœuds

et de folioles (mg EAG/ g de cal) confrontés au filtrat de culture des deux isolats E7 et H1.

Cals

Génotypes

Teneur des polyphénols (mg EAG/ g de cal)

Entre nœuds

Folioles

Témoin

Confronté

au filtrat

(E7)

Confronté

au filtrat

(H1)

Témoin

Confronté

au filtrat

(E7)

Confronté

au filtrat

(H1)

Génotype D1

(INRAT 199)

-

-

-

0.621

(0.056)

0.819

(0.013)

0.738

(0.048)

Génotype D2

(Twist)

0.508

(0.053)

0.861

(0.038)

0.567

(0.027)

0.980

(0.076)

1.995

(0.042)

1.320

(0.089)

Génotype D3

(Flip 82-150C)

0.440

(0.091)

0.840

(0.02)

0.483

(0.018)

0.847

(0.015)

1.092

(0.026)

1.008

(0.065)

EAG : Equivalent d’acide gallique


60

Figure 32 : Teneur des polyphénols totaux (mg EAG/g de cal) d’explants d’entre

nœuds confrontés au filtrat de culture de l’isolat H1.


confrontés au filtrat de culture de l’isolat H1.


61

Figure 34 : Teneur des polyphénols totaux (mg EAG/g de cal) d’explants d’entre

nœuds confrontés au filtrat de culture de l’isolat E7.


confrontés au filtrat de culture de l’isolat E7.


62

Figure 36 : Effet du filtrat de culture brut d’Ascochyta rabiei sur les cals de

Cicer arietinum après 1 semaine de confrontation.

a : effet du filtrat de culture de l’isolat E7 sur les cals du génotype D1 (INRAT 199) ; b : effet

du filtrat de culture de l’isolat H1 sur les cals du génotype D1 (INRAT 199) ; c : effet du

filtrat de culture de l’isolat E7 sur les cals du génotype D2 (Twist) ; d : effet du filtrat de

culture de l’isolat H1 sur les cals du génotype D2 (Twist) ; e : effet du filtrat de culture de

l’isolat E7 sur les cals du génotype D3 (Flip 82-150C) ; f : effet du filtrat de culture de l’isolat

H1 sur les cals du génotype D3 (Flip 82-150C).

f e

d c

b a


63

2.2. Discussion interaction

Les filtrats bruts d’Ascochyta rabiei n’ayant pas subi aucun traitement affectant leur

contenu contiennent le mycelium, les spores et les produits de sécrétion tels que les

enzymes et les toxines, Le contact de ce filtrat avec les cals de Cicer arietinum a entrainé

leur brunissement qui correspond à une production de phénols.

Le filtrat de culture d’un champignon phytopathogène peut être utilisé comme agent

sélectif à condition qu’il reproduise les mêmes symptômes observés in vivo. Le filtrat de

culture d’Ascochyta rabiei peut contenir des toxines qui sont impliqués dans le

développement de l’anthracnose et qui sont actives au niveau cellulaire (Shahid et al,

2004). Les symptômes nécrotiques correspondant à des composés phénoliques sont

généralement liés à des activités des toxines.

Höhl et al, 1991ont détectés dans le filtrat de culture d’Ascochyta rabiei trois types de

toxines ; Solanapyrones A, B et C. Les travaux de Latif et al, 1993 ont signalé l’existence

de Cytochalasin D. Chen et Strange, 1994 distinguent un autre type de phytotoxine ; toxine

de nature protéique dans le filtrat de culture d’Ascochyta rabiei.

L’application des toxines d’Ascochyta rabiei sur des suspensions cellulaires de deux

variétés une sensible et l’autre résistante entrainent la perte de viabilité et plasmolyse des

cellules (Höhl et al, 1991).

Khouaidjia, 2001 a détectée la présence d’une activité enzymatique dans le filtrat de

culture d’Ascochyta rabiei, Trois groupes d’enzymes ont été mis en évidence ; les enzymes

pectiques (pectine méthyl estérase et polygalacturonases), les cellulases et les amylases.

Le filtrat de culture d’Ascochyta rabiei s’est montré toxique sur les embryons, les

semences et les plantules de la variété sensible ILC 1929, alors que chez la variété

résistante ILC 3279 aucune anomalie n’est observée (Khouaidjia, 2001), cette variabilité

de réponse peut être due à l’inactivation des composés toxiques par l’hôte résistant ou à la

quantité insuffisante de ces composés pour induire les symptômes chez se dernier.

Latif, 2002 confirme la toxicité du filtrat de culture d’Ascochyta rabiei et son effet

inhibiteur sur les cellules et les folioles de pois chiche ainsi sur l’induction des cals et la

croissance des racines. Zerroug et al, 2007 rapportent que le filtrat de culture


64

d’Ascochyta rabiei inhibe la germination des graines de pois chiche et l’élongation de

l’hypocotyle et la radicelle des plantules.

La toxicité du filtrat de culture d’Ascochyta rabiei dépend de la concentration des

Solanapyrones qui varie d’une souche à une autre (Chen et Strange, 1991 ; Latif et al,

1993 ; Latif, 2002). Une phytotoxicité maximale est observée avec le filtrat de culture de

deux semaines (Khouaidjia, 2001), se qui indique que le champignon est en phase de

croissance exponentielle avec une production maximale des Solanapyrones A dans les

cultures de 14 jours (Bahti et Strange, 2004 ; Zerroug et al, 2007).

La croissance des cals chez les trois génotypes est totalement inhibée se qui indique

que les deux isolats produisent des composés toxiques dans le filtrat de culture capables

d’inhiber les cals de Cicer arietinum. Toyoda et al, 1984 signale que le brunissement des

cals est un indicateur de l’effet létal du filtrat de culture, Une coloration avec le FDA

(Diacetate fluorescent 0.01%) révèle que toutes les cellules sont mortes lorsque les cals

sont totalement brunis.

Les cals dérivés d’entre nœuds et de folioles du même génotype réagissent de la

même façon en présence du filtrat de culture des deux isolats. Les mêmes résultats sont

rapportés par Ahmed et al, 1996 avec les cals de Blé de différentes origines du même

génotype qui répond de la même façon en présence de 30% du filtrat de culture de

Fusarium.

Plusieurs études rapportent que le filtrat de culture des champignons

phytopathogènes affecte la croissance des cals et la viabilité de leurs cellules. Chen et

Swart, 2002 ont montré que le filtrat de culture de Fusariun oxysporum contient des

métabolites toxiques capables d’inhiber la croissance des cals d’Amaranthus hybridus.

L’estimation de la viabilité des cellules des cals par une coloration avec le FDA réveille

une réduction de la viabilité des cellules au cours du temps.

L’effet létal du filtrat de culture de Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici sur les cals

de la tomate dépend de sa dose (Toyoda et al, 1984). Pijut et al, 1990 ont observé une

diminution de la viabilité des cellules avec l’augmentation de la concentration du filtrat de

culture de Ceratocystis ulmi et que 50% des cals sont inhibés en présence de 50% du filtrat

de culture.


65

Saxena et al, 2008 signalent que l’inhibition de la croissance des cals de Géranium

(Pelargonium graveolens) est proportionnelle à la concentration du filtrat de culture

d’Alternaria alternata. L’addition de 20% du filtrat de culture inhibe totalement les cals

Des plantes ont pu être régénérées à partir des cals confrontés à 12% du filtrat de culture

elles présentent une résistance vis-à-vis du pathogène.

Le filtrat de culture de 14 jours de Fusarium oxysporum f.sp ciceri à la concentration

de 1% s’est révélé le plus toxique pour les cals de Cicer arietinum qui sont totalement

inhibés (Parkash et Chowdhury 1992a et b).

Les résultats de l’étude réalisée par Fernandez et al, 2000 sur l’effet du filtrat de

culture de deux isolats de Colletotrichum lindemuthianum sur les cals d’Haricot montre

que l’utilisation de 25% du filtrat de culture de l’isolat 7 inhibe totalement les cals alors

que les mêmes résultats sont obtenus qu’en présence de 12,5% du filtrat de culture de

l’isolat 38, se qui indique que les protéines dans le filtrat de culture de l’isolat 38 sont plus

actives ou en quantité plus importante que celles de l’isolat 7.

Singh et al, 1999 ont pus régénérer des plantes de pois chiche résistantes par le

système de sélection in vitro des cals résistants au filtrat de culture d’Ascochyta rabiei avec

l’utilisation de concentrations plus faible (1, 3 et 5%).

Plusieurs travaux ont signalés l’accumulation des composés phénoliques et des

phytoalexines dans les suspensions cellulaires de différents cultivars de pois chiche

(Weigand et al, 1986 ; Kebmann et Barz, 1987 ; Daniel et al, 1990).

Le filtrat de culture d’Ascochyta rabiei à induit une augmentation quantitative des

composés phénoliques. Une quantité plus importante des composés phénolique est détectée

chez les cals confrontés au filtrat de culture d’Ascochyta rabiei comparés aux cals témoins.

Les mêmes résultats ont été obtenus par Hrubcova et al, 1992 avec les cals de Alfalfa

(Medicago sativa L.) en présence du filtrat de culture de Fusarium spp.

Singh et al, 2003 signale que la quantité de polyphénols, de peroxidase et de B1-3

glucanase produites par les cals de trois génotypes de pois chiche (WR315, C235 et JG62)

confrontés au filtrat de culture filtré de Fusarium oxysporum f. sp. ciceri augmente avec

l’augmentation de la concentration du filtrat de culture et la durée de confrontation, la

quantité est plus importante chez les cals de la variété résistante (WR315).


66

L’augmentation quantitative des composés phénoliques et de l’activité enzymatiques

(phenylalanine ammonia-lyase, peroxidase) chez les cals contribue au développement de

certain degré de résistance (Hrubcova et al, 1992).

Le système de sélection in vitro des cals permet de distinguer les cultivars sensibles

et tolérants (Koike et al, 1993). Botta et al, 1994 rapportent que la réponse des cals de

Pomme de terre au filtrat de culture de Fusarium eumarii est lié à la réponse du cultivar au

pathogène. De Melo et piccinin, 1999 ont trouvé une corrélation entre la résistance des

plantes de Concombre au filtrat de culture de Fusarium oxysporum et la résistance des

cellules des cals.

Te-chato et al, 1995 ont remarqué que les cals résistants de Caoutchouc confrontés

au filtrat de culture de Phytophthora spp produisent la peroxydase et l’acide phosphatase,

ces deux enzymes sont impliqués dans le mécanisme de résistance de la plante.

Les travaux de Hidalgo et al, 1998 rapportent que les cals de l’Ananas du génotype

résistante (Perolera) poursuit leur croissance en présence d’une forte concentration en

filtrat de culture de Fusarium subglutinans alors que les cals du génotype sensible (Smooth

Cayenne) sont inhibés se qui indique que la plante dispose une résistance cellulaire au

filtrat de culture.

Conclusion et

Perspectives

Conclusion et perspectives

67


La callogenèse a pu être induite chez Cicer arietinum L. avec une variation de

réponse. Elle est influencée par l’explant (organe et génotype) et la composition hormonale

(nature et concentration).

Les réactions des tiges sont différentes selon le génotype et la composition

hormonale. Une callogenèse maximale d’entre nœuds de tiges est observée chez le

génotype INRAT 199 sur les deux milieux M1 (3 mg/l 2,4-D, 3 mg/l BAP) et M2

(3mg/l 2,4-D, 0.1 mg/l BAP) et pour le génotype Twist et Flip 82-150C sur les milieux Ma

(2 mg/l 2,4-D, 4 mg/l Kinétine) et M8 (2 mg/l 2,4-D et 4 mg/l ANA) respectivement.

Les folioles ont donné une callogenèse importante chez le génotype INRAT 199 sur

deux milieux M2 et M8 et chez le génotype Twist sur les milieux M1, Ma et M8. Les

folioles du génotype Flip 82-150 ont donné une bonne initiation de cals sur un seul milieu

M1.

Les entre nœuds de tiges forment des cals durs de couleur verte suite à des divisions

internes. Les explants de folioles forment des cals noduleux et friables dont l’origine est la

nervure principale, l’extrémité du limbe et la zone d’excision.

Lors de l’étude des interactions cals-filtrat de culture d’Ascochyta rabiei, les résultats

suggèrent l’existence de substance dans le filtrat de culture des deux isolats E1 et H7

d’Ascochyta rabiei capables de provoquer la production de phénols par les cals de

Cicer arietinum. Elle est variable en fonction de l’origine des cals (génotype résistant ou

sensible) et de l’isolat.

Les quantités de polyphénols produites par les cals confrontés au filtrat de culture

d’Ascochyta rabiei (E7 et H1) sont supérieures à celles du témoin en général. Les cals

provenant de génotype Twist tolérant traités par les filtrats de culture d’Ascochyta rabiei

synthétisent plus de phénols que les cals des autres génotypes. Les cals issus du même

génotype (résistant ou tolérant) confrontés se comportent différemment selon l’isolat. Le

filtrat de l’isolat E7 a entrainé une plus grande production de phénols chez les cals de

folioles et de tiges.


68

Il serait intéressant de :

Voir l’effet du filtrat de culture d’Ascochyta rabiei au niveau cellulaire (suspension

cellulaire) et suivre le taux de mortalité des cellules des cals en fonction du temps.

Isoler et purifier les toxines produites par Ascochyta rabiei et voir leurs actions sur

les cals de Cicer arietinum L.

Identifier les composés phénoliques secrétés pas les cals de Cicer arietinum.

Références Bibliographiques

69

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Références

bibliographiques

Annexe

Annexes

79

Composition du milieu pois chiche solide:

Farine de pois chiche : 50 g

Glucose : 20 g

Eau distillée : 1000 ml

PH : 5,8

Agar : 12 g

Composition du milieu Murashige et Skoog :

Macroéléments :

NH4NO3 : 1650 mg/l

KNO3 : 1900 mg/l

CaCl2, 2H2O : 440 mg/l

MgSO4, 7H2O : 370 mg/l

KH2PO4 :170 mg/l

Microéléments :

H3BO3 : 6.2 mg/l

MnSO4, H2O : 22.3 mg/l

ZnSO4, 7H2O : 8.6 mg/l

KI : 0.83 mg/l

Na2MoO4 : 0.25 mg/l

Annexes

80

CuSO4, 5H2O : 0.025 mg/l

CoCl2, 6H2O : 0.025 mg/l

Vitamines :

Thiamine HCl (vitamine B1) : 0.1 mg/l

Acide nicotinique : 0.5 mg/l

Pyridoxine HCl (vitamine B6) : 0.5 mg/l

Glycine : 2 mg/l

Sucre :

Myo-inositol : 100 mg/l

Saccharose : 30 g/l

Solution ferrique : Fer EDTA

Na2EDTA : 37.3 mg/l

FeSO4, 7H2O : 27.8 mg/l

Les hormones :

Hormones

Milieux

Auxines (mg/l) Cytokinine (mg/l)

2,4-D ANA BAP KIN

M1 3 - 3 -

M2 3 - 0,1 -

Ma 2 - - 4

M8 2 4 - 1

PH : 5,8

Agar : 12 g

Annexes

81

Milieu Czapek :

NaNO3 : 3g

K2HPO4 : 1g

KCl : 0,5g

MgSO4, 7H2O : 0,5g

FeSO4, 7H2O : 0,01g

Saccharose : 30g

Eau distillée : 1000 ml

PH : 5,6

Les milieux préparés sont stérilisés par autoclavage (120°C pendant 20 min).

Annexes

82

Tableau 14 : Pourcentage de cals des explants d’entre nœuds des trois génotypes de pois

chiche en présence de différentes combinaisons hormonales (2,4-D, ANA, BAP et KIN).

Explants

Entre

nœuds

Composition hormonale (mg/l)

Pourcentages (%)

2,4-D ANA BAP KIN D1

(INRAT 199)

D2

(Twist)

D3

(Flip 82-150C)

M1 3 - 3 - 98.3 93.7 90

M2 3 - 0.1 - 98.3 93.7 79.5

Ma 2 - - 4 89.4 100 94

M8 2 4 - 1 94.6 96.3 100

Tableau 15 : Pourcentage de cals des explants de folioles des trois génotypes de pois

chiche en présence de différentes combinaisons hormonales (2,4-D, ANA, BAP et KIN).

Explants

Folioles

Composition hormonale (mg/l)

Pourcentages (%)

2,4-D ANA BAP KIN D1

(INRAT 199) D2

(Twist) D3

(Flip 82-150C)

M1 3 - 3 - 94.6 100 100

M2 3 - 0.1 - 98.2 97.6 96

Ma 2 - - 4 89.6 100 32

M8 2 4 - 1 98 100 22

Annexes

83

Analyse de variance (ANOVA)

T= Xi

G= Ti

La moyenne= Ti /n

Somme des carrés des écarts (SCE) expérimentales (inter-groupe) = n – G2/kn

Variance inter-groupes = SCE (inter-groupe)/ddl ; ddl = k-1

Somme des carrés des écarts (SCE) entre les traitements (intra-groupe) = Xi2 - Ti

2/n

Variance intra-groupe = SCE (intra-groupe)/ddl ; ddl = kn-k

F= Variance inter-groupes/ Variance intra-groupe

Expression des résultats des polyphénols totaux

On prend l’exemple de cal d’entre nœuds du génotype D2 (Twist) qui présente une DO de

0.897

D’après la courbe d’étalonnage, on a l’équation suivante :

Y= 30.32X + 0.060 avec Y=DO

X= (0.897- 0.06)/ 30.32

X= 0.027 mg/ml

On multiplie cette valeur par 21 qui correspond au facteur de dilution de notre échantillon

[µl (volume déposé de l’échantillon/ 2100 µl (volume réactionnel) = 1/21]

Donc : X’ = X. 21 = 0.027. 21

X’ = 0.567 mg/ml

La solution mère est de 1g/ml

On a X’ : 0.567 1000 mg/ml

X’’ 1000 mg

X’’ = 0.567 mg

Donc le cal d’entre nœuds du génotype D2 contient 0.567 mg de polyphénols totaux

(EAG) par gramme de cal.

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Mémoire de Magister en Biologie - theses.univ-oran1.dztheses.univ-oran1.dz/document/TH3337.pdf · L’extraction des phénols totaux est faite par macération et l’évaluation