MEMOIRE D’HABILITATION A DIRIGER DES RECHERCHES DE L

1

MEMOIRE D’HABILITATION A DIRIGER DES RECHERCHES

DE L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE

Spécialité : Ecologie Microbienne

Présenté par

Jean-François GHIGLIONE

BIODIVERSITE BACTERIENNE EN MILIEU PELAGIQUE Influence des facteurs environnementaux et rôle dans le cycle du carbone

Soutenue le 5 Juin 2012

Devant le jury composé de :

Duran Robert, Professeur, Université de Pau Rapporteur

Godon Jean-Jacques, Directeur de Recherches, INRA Narbonne Rapporteur

Sime-Ngando Télesphore, Directeur de Recherches, Clermont-Ferrand Rapporteur

Blain Stéphane, Professeur, Université Paris 6 Examinateur

Grémare Antoine, Professeur, Université Bordeaux 1 Examinateur

Sempere Richard, Directeur de recherches, Université de Marseille Examinateur

2

3

PLAN DU MANUSCRIT

-Soutien à la recherche et remerciements

-Introduction générale

-Chapitre 1- Facteurs environnementaux qui structurent la distribution spatiale et temporelle de la

diversité bactérienne des fractions totales et métaboliquement actives en milieu pélagique.

1.1. Variations spatiales et temporelles de la diversité bactérienne en milieu pélagique

1.1.1. Exemples en Mer Méditerranée Nord Occidentale

1.1.2. Exemples en zones polaires Arctique et Antarctique

1.1.3. Prise en compte de la diversité des bactéries métaboliquement actives

1.2. Influence relative des paramètres environnementaux sur la structuration des communautés

bactériennes dans différents conditions environnementales

1.2.1. Changements saisonniers en milieu côtier

1.2.2. Stratification estivale en milieu hauturier

-Chapitre 2- Rôle de la diversité des bactéries libres et attachées aux particules dans le cycle

biogéochimique du carbone en milieu pélagique

2.1. Changements rapides de diversité bactérienne en condition de bloom printanier et

influence sur la reminéralisation de la matière organique dissoute et particulaire en milieu

hauturier

2.2. Contribution des bactéries métaboliquement actives à la diversité des bactéries attachées

aux particules en milieu hauturier

2.3. Rôle de la diversité des bactéries attachées aux particules dans la transformation de la

matière organique en milieu estuarien

2.4. Influence des paramètres environnementaux sur la distribution de la diversité des

bactéries attachées aux particules en milieu lagunaire

-Chapitre 3- Rôle de la diversité bactérienne dans la régulation des processus de biodégradation

des hydrocarbures pétroliers en milieu marin pélagique

3.1. Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes pélagiques côtières

marines en condition naturelle

3.1.1. Evaluation in situ de l’influence relative des HAP comparée à d’autres paramètres

physicochimiques sur la structure des communautés bactériennes en milieu côtier

3.1.2. Impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à l’apport de

pétrole et à la biostimulation.

3.2. Contrôle de la diversité des bactéries hydrocarbonoclastes par les ressources (bottom-up)

et par la prédation (top-down)

3.3. Exemple d’identification de la diversité associée à une fonction par l’utilisation de

marquage par des isotopes stables : cas des bactéries dégradant les HAP

4

-Projets de recherches :

-Projet 1 : Rôle de la diversité microbienne dans la régulation de la transformation de la

matière organique dissoute et particulaire lors d’épisodes de convection et de cascades d’eaux

denses en Mer Méditerranée

-Projet 2 : Etudes écotoxicologiques des eaux littorales

-Références bibliographiques

-Annexes:

-Annexe 1 : Curriculum Vitae

-Annexe 2 : Diffusion du travail

-Annexe 3 : Trois publications significatives

5

Soutien à la recherche et remerciements

Les recherches qui vont vous être présentées dans ce manuscrit n’auraient pu voir le jour sans

mon implication active dans de nombreux programmes scientifiques nationaux et

internationaux. Ces programmes m’ont apporté le soutien financier pour les importants moyens

nécessaires à une recherche pluridisciplinaire utilisant des technologies dites « de nouvelles

générations ». Ils ont été également un moyen de partager des connaissances avec de nombreux

collègues permanents et non-permanents de la recherche institutionnelle et privée. Ils m’ont

permis enfin d’acquérir une expérience de terrain en participant à 11 campagnes

océanographiques (235 jours de mission en mer) avec des moyens à la mer exceptionnels.

Je tiens également à remercier les différents directeurs d’unité de l’UMR 7621 qui se sont

succédés durant ces dix dernières années : Antoine Grémare, Jean-Marc Guarini, Stéphane

Blain ainsi que tous les membres de cette unité.

6

Mes collaborateurs principaux durant ces dix années de recherche au CNRS ont été Alison

Murray (Université de Réno, EU), Madeleine Goutx et France van Wambecke (MIO-

Marseille), Régis Grimaud (IPREM-Univ. Pau), Hervé Gueuné (Sté CORRODYS), Daniel

Delille, Fabien Joux, Pascal Conan et Mireille Pujo-Pay (LOMIC).

Ces travaux ont également été l’occasion d’assurer l’encadrement de plusieurs étudiants ainsi

qu’une étroite collaboration avec plusieurs post-doctorants, que je profite pour remercier ici:

Mes remerciements vont également à ma famille et à mes amis. Une pensée particulière pour

mes parents, ma sœur et mon frère qui ont cru en moi, qui m’ont toujours soutenu et me

soutiennent encore. Merci aussi à la formation de Master Océano qui m’a permis de

rencontrer ma femme Mylène « pour le meilleur et pour le meilleur » et merci à ma fille Péma

qui découvre avec bonheur les joies de la Mer.

7

Introduction générale

8

L’Ecologie

microbienne

marine : une

science

relativement

récente…

… dont

l’évolution

conceptuelle est

dépendante de la

levée de verrous

méthodologiques.

Les révolutions

successives de

l’étude de la

diversité

microbienne

Mon recrutement en Sept. 2001 s’est effectué sur un poste thématique Science

de la Vie/ Science de l’Univers (SDV/SDU) intitulé «Influence de la

biodiversité dans la régulation des cycles biogéochimiques». Cette

problématique reste encore d’actualité dans le domaine de l’Ecologie

microbienne marine, qui est une science relativement récente. C’est en effet au

milieu des années 1970 que Lawrence Pomeroy (1974) a suggéré pour la

première fois le rôle central joué par une chaîne alimentaire planctonique dans

les cycles biogéochimiques océaniques, incluant le petit phytoplancton, les

bactéries et les protistes. Le concept de « boucle microbienne », séparant le

compartiment microbiologique de la chaîne alimentaire linéaire pélagique, n’est

apparu qu’en 1983 (Azam et al. 1983, Ducklow et al. 1983). Du fait de leur

petite taille invisible à l’œil, l’étude des microorganismes a toujours été

dépendante de la levée de verrous méthodologiques. Il fallut attendre 1985 pour

qu’une nouvelle révolution soit annoncée par « the great plate count anomaly ».

En utilisant le comptage direct en microscopie par épifluorescence, Staley et

Konopka (1985) montraient qu’au lieu de centaines ou milliers de bactéries par

millilitre d’eau de mer obtenues par comptage sur milieu de culture solide, il

s’agissait plutôt de millions de bactéries par millilitre d’eau de mer, ce qui

élevait les bactéries au rang des organismes les plus abondant des Océans (après

les virus). C’est également en 1985 que Dave Kirchman développa une mesure

d’activité bactérienne encore classiquement utilisée de nos jours. Cette méthode

fondée sur l’incorporation de leucine radioactive permet de mesurer le taux de

production de protéine par les bactéries marines. Elle permit d’estimer que 20 à

50% de la production primaire transitait par le compartiment bactérien,

confirmant le rôle essentiel joué par les bactéries dans la reminéralisation la

matière organique en milieu pélagique (Cho & Azam 1990).

Jusque dans les années 1990, la diversité des espèces bactériennes était

considérée comme une « boîte noire » par les écologistes microbiens. La « plate

count anomaly» suggérait que moins de 0.1% des bactéries était cultivable. Mes

premiers travaux de recherche en DEA (master 2) s’intéressaient à la diversité

des bactéries cultivables, et ils faisaient partie des multiples preuves mettant en

évidence que le morphotype des colonies, généralement utilisé comme critère

préliminaire pour distinguer différentes espèces sur milieu de culture solide,

9

Du cultivable à

l’ARNr 16S…

n’était pas un critère discriminant pour la majorité des morphotypes rencontrés

en milieu marin (Lebaron et al. 1998). Même si de nouvelles méthodes de

culture dites par « dilution-extinction » augmentent la représentativité des

bactéries cultivables (Connon & Giovannoni 2002), les méthodes de culture

restent très laborieuses et inadaptées à l’étude de la biodiversité bactérienne

marine.

Une révolution de la vision de la diversité bactérienne et du monde vivant en

général est apparue avec les travaux de Woese (1987) qui, par une analyse

comparative des séquences des gènes ARNr 16S et 18S, décrivit 3 domaines du

vivant: Bacteria, Eucarya et Archaea. Le domaine bactérien y était divisé en 12

phyla (ou « divisions », ou « règnes ») sur une base phylogénétique où un

phylum consiste en deux ou plusieurs séquences ARNr 16S monophylétiques et

non affiliées à tout autre groupe d’un autre phylum. Ces travaux ont été le point

de départ d’une description exponentielle de nouvelles espèces bactériennes à

partir de méthodes moléculaires utilisant les propriétés de l’ARNr 16S,

outrepassant du même coup le problème de la faible représentativité des

bactéries cultivables. De manière empirique, la définition de l’espèce

bactérienne a été fixée à une homologie de 97% de l’ARNr 16S entre deux

individus de la même espèce, correspondant à une hybridation de 70% de leur

ADN génomique (Stackebrandt and Göbel 1994). La première description de la

diversité bactérienne en milieu marin pélagique utilisant les propriétés de

l’ARNr 16S montra un nombre très important de séquences non reliées aux

séquences d’organismes cultivés (Giovannoni et al. 1990). Un nouveau clade,

SAR11, découvert dans le cadre de cette étude sera postérieurement identifié

comme le groupe le plus abondant dans tous les Océans du Monde (Giovannoni

et Rappé. 2000).

Durant les 20 dernières années, le développement de nouveaux outils de la

biologie moléculaire a permis de nettes avancées dans l’étude de la diversité

bactérienne en milieu marin. Il existe à ce jour une large palette de

méthodologies à l’usage des Ecologistes microbiens, utilisables selon le champ

d’investigation envisagé a priori, chaque méthode ne répondant pas à toutes les

questions. En milieu marin, les techniques les plus couramment utilisées sont

les méthodes non-destructives reposant sur des observations microscopiques

10

Une grande

palette de

techniques

d’analyses de

l’ARNr 16S

(Fluorescent In Situ Hybridization - FISH) et des méthodes destructives

reposant sur l’extraction des acides nucléiques et l’amplification du gène

ARNr16S par PCR (polymerase chain reaction). Les produits PCR sont alors

directement séparés par des méthodes d’empreintes moléculaires (DGGE, CE-

SSCP, T-RFLP, ARISA, LH-PCR) ou en construisant des banques de clones qui

sont séquencés selon la technique de Sanger (1977). La description de ces

techniques a fait l’objet de plusieurs revues, soulignant leurs avantages et

inconvénients (Ranjard et al. 2000, Dorigo et al. 2005, Smalla et al. 2007). Mon

recrutement en 2001 se situait dans cette nouvelle vague utilisant les

« développements récents de la biologie moléculaire » qui devaient permettre

d’évaluer le rôle de la biodiversité microbienne dans le « fonctionnement des

écosystèmes ».

Figure 1 : Arbre phylogénétique basé sur le maximum de vraisemblance du domaine des bactéries. Les

phyla sont distingués par la couleur de leur branche et les noms d’espèces indiquées en rouge sont

référencés à la GEBA (Genomic Encyclopedia of Bacteria and Archaea) (Wu et al. 2009) .

11

La récente

révolution de

l’analyse de la

diversité

bactérienne par

pyroséquençage.

L’étude de la

biodiversité

bactérienne : un

prérequis pour

de nombreuses

questions

d’Ecologie

microbienne

La limitation du nombre de clones analysés par la technique de Sanger a été

récemment résolue par les méthodes d’extension cyclique dont le

pyroséquençage fait partie. Avec la levée de cette limitation, nous sommes en

train d’assister à une révolution de notre façon d’analyser la diversité

bactérienne, qui devrait propulser le pyroséquençage comme méthode de choix

dans un avenir proche. Le pyroséquençage 454 est une technique peu onéreuse

comparée au coût par base séquencée par la méthode de Sanger et cette

technique a d’ores et déjà changé le potentiel d’investigation de la génomique

en général (Margulies 2005). Le pyroséquençage utilise les acides nucléiques

extraits et ne nécessite pas d’étape de clonage. Il consiste à détecter en temps

réel le pyrophosphate (PPi) produit lors de l’incorporation de nucléotides durant

la synthèse de l’ADN [(DNA)n + dNTP -> (DNA)n+1 + PPi ]. Sogin et al. (2006)

ont été les premiers auteurs à adapter le pyroséquençage à l’analyse de la

diversité bactérienne et à faire le premier pas dans ce qu’ils ont nommé la « rare

biosphere » (les espèces rares). Dans cette étude, plus de 118 000 séquences a

été générées à partir d’un seul passage en pyroséquençage, plus qu’aucune étude

jamais réalisée jusqu’alors avec la technique de séquençage de Sanger. Le

Chapitre 1 de ce manuscrit montrera comment mes travaux contribuent

actuellement à redéfinir certaines notions de biogéographie des communautés

bactériennes marines grâce à l’utilisation de cette méthode dite « de nouvelle

génération ».

Au-delà de la description de nouvelles espèces ayant des propriétés

remarquables, notre habilité à mesurer la diversité bactérienne est un prérequis

pour l’étude systématique de la biogéographie, du suivi de l'évolution spatio-

temporelle des populations d'une communauté, pour comparer les structures de

plusieurs communautés, ou encore relier des modifications de la structure d'une

communauté avec différents descripteurs du milieu, comme la productivité ou la

quantité d'un polluant. Le compartiment microbien joue un rôle clé dans la

régulation des contraintes que subit l'écosystème marin face à l'action directe ou

indirecte des activités humaines ou des phénomènes climatiques naturels. Il

constitue aujourd’hui un compartiment biologique incontournable dans la

compréhension du milieu marin et de sa réaction aux perturbations

anthropiques.

12

Comment relier

la biodiversité

bactérienne à la

régulation des

cycles

biogéochimiques?

Comme je l’ai souligné plus haut, mon recrutement posait la question de

l’«Influence de la biodiversité dans la régulation des cycles biogéochimiques».

Les récentes avancées de la biologie moléculaire nous permettent aujourd’hui

d’accéder à une vision de plus en plus précise de la très grande biodiversité

bactérienne, qui n’était considérée que comme une « boîte noire » dans les

années 1990. En Janvier 2012, on dénombrait 2.110.258 séquences ADNr 16S

différentes alignées et annotées appartenant aux domaines des Bacteria (95%

des séquences) et Archaea (5% des séquences) sur le site du ribosomal database

project (http://rdp.cme.msu.edu/). Néanmoins, moins de 15% des séquences

disponible dans les bases de données appartiennent à des bactéries cultivées, ce

qui pose le problème de la connexion entre la structure des communautés

bactériennes et leur fonction écologique. La relation entre la biodiversité

bactérienne et son rôle dans la régulation des cycles biogéochimiques n’est pas

triviale. Nous verrons tout au long de ce manuscrit les différentes directions que

j’ai choisi de prendre pour apporter des éléments de réponse à cette question.

La question de l’«influence de la biodiversité dans la régulation des cycles

biogéochimiques » a en effet constitué la ligne directrice des recherches que j’ai

menées depuis un peu plus de dix ans de carrière au CNRS. J’ai organisé ce

manuscrit autour de trois questions :

CHAPITRE 1 - Comment les facteurs environnementaux contribuent-ils à

structurer la distribution spatiale et temporelle de la diversité bactérienne des

fractions totales et métaboliquement actives en milieu pélagique ?

Ce chapitre abordera des notions de biogéographie de la diversité des bactéries

marines et décrira comment les paramètres environnementaux peuvent

expliquer les tendances de la répartition spatiale et temporelle des communautés

bactériennes que j’ai observées en milieu marin pélagique côtier et hauturier,

mais aussi en milieu lagunaire et lacustre.

CHAPITRE 2 - Quel est le rôle de la diversité des bactéries libres et attachées

aux particules dans le cycle biogéochimique du carbone en milieu pélagique ?

Ce chapitre propose différents exemples reliant les nouvelles connaissances de

la diversité bactérienne aux variations du taux de reminéralisation de la matière

organique dissoute et particulaire en milieu pélagique côtier et hauturier.

13

CHAPITRE 3 - Quel est le rôle de la diversité bactérienne dans les processus de

bioremédiation des hydrocarbures pétroliers en milieu pélagique ?

Ce dernier chapitre s’intéresse à la fois à l’impact des contraintes

environnementales de plus en plus fortes auxquelles ont à faire face les

communautés bactériennes en milieu littoral, mais aussi au rôle de la diversité

des bactéries hydrocarbonoclastes dans le « service rendu par les

microorganismes » en stimulant leurs capacités de bioremédiation

d’écosystèmes pollués. Il propose enfin de nouvelles pistes d’investigation dans

ce domaine.

14

15

Chapitre 1

Facteurs environnementaux qui structurent la distribution spatiale

et temporelle de la diversité bactérienne des fractions totales et

métaboliquement actives en milieu pélagique

16

1.1. Variations spatiales et temporelles de la diversité bactérienne en milieu pélagique

1.1.1. Exemples en Mer Méditerranée Nord Occidentale.

Supports programmatiques relatifs à cette partie:

-PNEC ART5 (2002): Programme National Environnement Côtier

(PI : Ghiglione JF)

-IFB-OBSDIV (2005): Observatoire de la diversité microbiologique

(PI : Ghiglione JF & Lebaron P)

- Europe BASICS (2002-2005): Bacterial single-cell approaches to the relationship between diversity and

function in the Sea (PI : Gasol JM)

-PROOF PECHE (2003-2006): Production et Exportation du Carbone : contrôle

par les organismes HEtérotrophes à petite échelle de temps (PI Andersen V et Goutx M)

Diffusion du travail relative à cette partie :

Ghiglione et al. 2005 Aquatic Microbial Ecology (IF 2.38)

Ghiglione et al. 2008 Biogeosciences (IF 3.45)

Rodriguez-Blanco et al. 2009 FEMS Microbiology Ecology (IF 3.35)

Lami et al. 2009 Aquatic Microbial Ecology (IF 2.38)

Ducklow et al. 2011 Aquatic Microbial Ecology (IF 2.38)

L’émergence des

« Observatoires

Microbiologiques »

Les stations d’Observations sont des outils essentiels pour comprendre les

facteurs qui contrôlent les communautés biologiques et pour suivre et prédire

leur évolution lorsqu’ils sont soumis à des changements environnementaux. Il

existe à l’heure actuelle une émergence d’Observatoires Microbiologiques

dans la communauté internationale qui ont pour objectif (i) d’explorer la

biodiversité des microorganismes, d’appréhender les facteurs qui contrôlent

leurs changements et (ii) d’utiliser la veille microbiologique comme indicatrice

de perturbations environnementales à court ou long terme. En association avec

l’initiative SOMLIT (Service d’Observation en Milieu LITtoral –

http://somlit.epoc.u-bordeaux1.fr/fr/), la Station d’Observation du Laboratoire

Arago (SOLA) a été mise en place au début de l'année 1997 en Baie de

Banyuls sur Mer (plateau continental du Golfe du Lion) et fixée par 27 m de

profondeur. C’est à partir de mon recrutement en 2001 que ce site a été choisi

comme Observatoire Microbiologique et pérennisé à l’aide de différents

programmes que j’ai coordonné ou auxquels j’ai participé (programmes

nationaux financés par le PNEC et l’IFB et programme Européen BASICS).

Le caractère dynamique du milieu pélagique marin impose que toute étude

traduisant la structure des communautés bactériennes utilise une stratégie

d'échantillonnage adaptée à l'échelle de variation considérée, tant spatiale que

17

Stratégie

d’échantillonnage

de la diversité

bactérienne en

milieu marin :

nécessité d’outils

hautement

résolutifs et

hautement

reproductibles

temporelle. Cette question fondamentale pour l’analyse du compartiment

bactérien n’a été que très rarement explorée. Si plusieurs études ont été

publiées sur les variations spatio-temporelles des communautés bactériennes

dans différentes mers du globe, différents auteurs soulignent en effet que le

choix de la taille des échantillons et l’évaluation précise de leur

représentativité à différentes échelles spatiales et temporelles ne sont que

rarement mentionnées (Murray et al. 1998 ; Schauer et al. 2000).

Pour aborder cette question, il est essentiel de disposer d'outils d’observation

hautement résolutifs et hautement reproductibles. Les empreintes moléculaires

répondent à cette attente en donnant une image de la structure des

communautés bactériennes et en permettant de comparer rapidement un grand

nombre d’échantillons à moindre coût. La plupart des techniques d’empreintes

moléculaires utilisent la dissimilarité des séquences de l’ARNr 16S entre les

espèces bactériennes. Par exemple, la DGGE (denaturing gradient gel

electrophoresis) a longtemps été majoritairement utilisée pour l’analyse des

communautés bactériennes et pour l’identification de ribotypes d’intérêt par

excision des bandes du gel puis clonage et séquençage (Muyzer et al. 1993,

Muyzer et Smalla 1998). Néanmoins, cette technique présente l’inconvénient

d’une faible reproductibilité entre les gels, limitant la comparaison à un

nombre réduit d’échantillons (20 maximum). Des techniques reposant sur

l’électrophorèse capillaire ont émergés plus récemment pour permettre la

comparaison fiable d’un nombre théoriquement infini d’échantillons. C’est le

cas de la T-RFLP (Terminal - Restriction Fragment Length Polymorphism) qui

fut largement utilisée dans de nombreux environnements (Avaniss-Aghajani et

al. 1994, Liu et al. 1997, Osborn et al. 2000), mais qui montre un nombre de

pics (ribotypes) par échantillons souvent insuffisant en milieu marin. La

technique d’ARISA (Amplified Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) génère

beaucoup plus de pics puisqu’elle utilise les variations au niveau de la sous-

espèce de la région intergénique entre l’ARNr 16S et 23S (Intergenic Spacer,

ITS), mais pose le problème du niveau taxonomique étudié. Avec l’aide de

l’équipe d’Ecologie Microbienne du Laboratoire de Biotechnologie de

l'Environnement de l’INRA de Narbonne, j’ai transposé la technique de CE-

SSCP (capillary electrophoresis – single strand conformation polymorphism)

jusque-là mise au point pour le milieu tellurique et les boues activées (Lee et

18

La CE-SSCP: une

technique

d’empreinte

moléculaire de

choix pour

l’analyse de la

structure des

communautés

bactériennes en

milieu pélagique

al. 1996 ; Godon et al. 1997) à l’analyse de la structure des communautés

bactériennes marines. Cette approche s’est avérée très reproductible et

particulièrement bien adaptée pour l’analyse de la structure des communautés

du milieu pélagique marin (Ghiglione et al. 2005). Comme pour les autres

techniques d’empreintes moléculaires, nous avons pu vérifier que

l’identification taxonomique des pics de profils CE-SSCP est réalisable

(Rodriguez-Blanco et al. 2009, Lami et al. 2009) (Figure 2).

Figure 2 : Assignation des pics CE-SSCP

(en haut) par une banque de clones effectuée

sur le même échantillon (à gauche). Pour

chaque pic CE-SSCP, le ou les clones

présentant la même migration

électrophorétique sont indiqués, ainsi que le

pourcentage du clone le plus fréquemment

rencontré sous ce pic. ND : pic dont l’identité

n’a pas pu être déterminé.

19

Echelles de

variations spatiales

et temporelles des

communautés

bactériennes

Récemment, nous avons comparé cette technique avec la DGGE, la T-RFLP et

la LH-PCR (Length Heterogeneity PCR, qui utilise la variation naturelle de

taille de l’ADNr 16S) sur les mêmes échantillons. Ces travaux ont montré que

la CE-SSCP détectait plus de groupes phylogénétiques, présentait une

meilleure résolution en terme de pics détectés et était moins affectée par la co-

migration de plusieurs séquences sous un même pic ou par la production de

plusieurs pic par une même espèce (Ducklow et al. 2011). Des résultats

similaires ont été observés lors d’une comparaison entre la DGGE et la CE-

SSCP dans un écosystème minier (Hong et al. 2007), suggérant que la CE-

SSCP soit effectivement un outil d’observation hautement résolutif et

hautement reproductible de choix pour l’analyse d’un grand nombre

d’échantillons.

En milieu marin, nous avons montré que la taille optimale de l’échantillon

d’eau de mer à prélever pour obtenir une représentativité suffisante de la

diversité bactérienne était d’au moins 3.107 cellules (environ 50 mL) pour la

CE-SSCP.

L’échelle de variation spatiale des communautés bactériennes a été abordée à

la fois à partir d’un échantillonnage aléatoire de 200m autour de la station

d’Observation côtière SOLA, et à partir un transect de 33km de la station

SOLA vers le large. Nous avons observé que la structure des communautés

bactériennes ne variait pas dans un rayon de 3,7km autour de la station

d’Observation SOLA, avec des variations significatives observées seulement à

partir de 9.3 km au large de cette station.

L’étude des échelles de variation temporelle à la station d’Observation SOLA

durant l’année 2002-2003 a montré que la structure des communautés varie à

l’échelle du mois, alors qu’elle reste identique à l’échelle de la semaine, du

jour, ou de l’heure (Ghiglione et al. 2005). Quatre banques de clones ont été

réalisées à partir de l’analyse de 650 clones (en moyenne 160 clones analysés

par saison). Les -Proteobactéries, les -Proteobactéries, les Bacteroidetes et

les Cyanobactéries sont les groupes dominants retrouvés au long de l’année,

mais leur proportion relative montre une saisonnalité marquée. Par exemple,

les -Proteobactéries sont plus abondant à la saison chaude et les populations

majoritaires de ce groupe, SAR11 et Roseobacter, montrent une évolution

20

Les stations

d’Observations en

milieu hauturier

MOLA et

DYFAMED :

stratification

verticale des

communautés

bactériennes

opposée dans le temps (R=-0,93). Un résultat original de cette étude a été de

montrer qu’un tiers de la richesse bactérienne était associée à une

microdiversité des grands groupes phylogénétiques rencontrés, qui évoluent

très significativement entre les saisons.

Ces résultats ont été pionniers par la robustesse de leur échantillonnage et ils

ont permis d’envisager différentes échelles spatiales et temporelles selon la

question posée. Par exemple, nous avons proposé un échantillonnage mensuel

pour suivre les effets de changements environnementaux à long terme

(changements climatique), alors qu’un échantillonnage hebdomadaire serait

plus adéquat pour le suivi de l’effet d’événements à court terme (bloom

phytoplanctonique, crue, pollution localisée,…). Ces résultats ont été

confirmés par d’autres travaux postérieurs à cette étude menés sur d’autres

Observatoires Microbiens (Fuhrman et al. 2006, Alonso-Saez et al. 2007,

Gilbert et al. 2009).

Une autre station d’Observation a été créée au large de Banyuls sur mer à

l’initiative de Philippe Lebaron (Directeur du Laboratoire Arago). Cette station

hauturière (profondeur max. 1000m) nommée Microbial Observatory of the

Laboratoire Arago (MOLA) vient renforcer la mission d’Observation du

Laboratoire Arago initiée avec la station côtière SOLA (Figure 3). Nous avons

pu montrer que la structure des communautés bactériennes à la station

hauturière MOLA est très différente de celle de la station côtière SOLA dont

elle est distante de 33 km. Par contre, la structure des communautés varie très

peu le long d’un transect de 98 km au large de la station MOLA (Rodriguez-

Blanco et al. 2009). Ces travaux ont également permis de mettre en évidence

une stratification verticale de la structure des communautés très marquée au

large, alors qu’elle n’était peu ou pas visible sur le plateau continental. Ces

résultats sont en accord avec les observations menées dans d’autres milieux

hauturiers, tels que dans les Océans Atlantiques et Pacifiques (Lee & Fuhrman

1991), en mer Méditerranée (Acinas et al. 1997, Moeseneder et al. 2001) et

dans l’Océan Austral (Murray et al. 1998).

21

Figure 3 : Localisation des stations d’observations en Mer Méditerranée étudiées dans le cadre

des travaux présentés. Les stations SOLA (Station d’Observation du Laboratoire Arago) et

MOLA (Microbial Observatory of the Laboratoire Arago) sont situées à l’Ouest du Golfe du

Lion au large de Banyuls sur mer. La station DYFAMED (DYnamique des Flux

Atmosphériques en MEDiterranée) est située en Mer Ligure entre Nice et la Corse.

D’autres travaux nous ont également permis d’observer une stratification

verticale très marquée à la station d’Observation hauturière située en Mer

Ligure, entre Nice et la Corse : la station DYFAMED (DYnamique des Flux

Atmosphériques en MEDiterranée) (Figure 3). Un échantillonnage intensif

durant un mois (Sept.- Oct. 2004) en condition de stratification estivale a été

réalisé lors de la campagne océanographique DYNAPROC II dans le cadre du

programme PROOF-PECHE. Ce suivi haute fréquence a révélé une différence

très nette entre la structure des communautés de surface (0-40m), proche du

maximum de chlorophylle et en dessous (80-150) et dans le mésopélagique

(200-1000) (Figure 4) (Ghiglione et al. 2008).

MOLA

SOLA

DYFAMED

22

1.1.2. Variations spatiales et temporelles de la diversité bactérienne des milieux pélagiques en

zones polaires Arctique et Antarctique


-Année polaire internationale (2007-2008) Polar Observatories of Microbial Biodiversity in

Antarctic and Sub-Antarctic zones (PI JF Ghiglione)

-National Science Foundation-CAML (2007-2010): Census of Aquatic Marine Life

(PI AE Murray)

-IPEV-MICROBIOKER (2005-2007): Impact écologique des hydrocarbures sur la boucle

micobienne en Antarctique (PI Delille D)


Ghiglione & Murray 2012 Environmental Microbiology (IF 5.54)

Ghiglione et al. en préparation soumission PNAS (IF 9.77)

1.1.2.1. Etude des changements saisonniers de diversité bactérienne dans l’Océan

Austral par une approche de pyroséquençage 454.

Si le clonage/séquençage était considéré comme la technique de choix pour

analyser la diversité taxonomique et phylogénétique bactérienne d’un

échantillon marin jusqu’en 2005, sa représentativité reste néanmoins sujette à

Figure 4. A gauche: profils de la communauté bactérienne par

CE-SSCP à différentes profondeurs.

A droite: Analyse en MDS (MultiDimensional Scaling) de la

similarité (Bray Curtis) des profils CE-SSCP échantillonnés à

différents temps et profondeurs à la station d’Observation

DYFAMED. La répartition des profondeurs est organisée en 3

groupes: 0-40m (Δ) , 60-150m (Ο) et 200-1000m (■).

A-5

A-20

A-40

A-60

A-80 A-150

A-200

A-400

A-700

A-1000

B-5 B-20

B-40 B-60

B-80

B-150

B-400

B-500 B-700 B-1000

C-5

C-20

C-40

C-60 C-80 C-150 C-200

C-400

C-500

C-700

C-1000

D-5

D-20

D-40

D-60 D-80

D-150

D-200

D-400 D-500 D-700

Stress: 0.14

23

Le

pyroséquençage :

une nouvelle

révolution de

l’étude de la

diversité

bactérienne.

Une

collaboration

entre les bases

polaires française

(Kerguelen) et

américaine

(Palmer)

caution. En effet, cette technique reste lourde et même si le coût d’analyse a

largement diminué ces dernières années, la plupart des travaux utilisant cette

approche se sont limités à l’analyse de quelques centaines de clones par

échantillon. Si on considère que la diversité bactérienne contenue dans 1 litre

d’eau de mer atteint en moyenne plus de 2 000 espèces, on se rend compte que

200 clones ne donnent qu’une faible représentation de la diversité des espèces

présentes (moins de 1%). De nouvelles techniques de séquençage ont permis de

lever ce verrou méthodologique et d’offrir aux écologistes microbiens un outil

très puissant pour l’analyse de la diversité bactérienne dont ils ne disposaient pas

jusqu’alors. Depuis les 5 dernières années, le coût du séquençage de l’ADN a

diminué de manière dramatique avec l’avancée de la technologie de séquençage

de type MPS (Massively Parallel Sequencing) (Margulies et al., 2005; Rogers

and Venter, 2005). Le Pyroséquenceur 454 de la société Roche a été utilisé pour

la première fois en Ecologie microbienne par Huber et al. (2007) et depuis, des

équipes du monde entier utilisent cette technologie. Nous avons utilisé cette

technologie en collaborant avec une équipe américaine du Desert Research

Institute (Réno, NV, USA) dans le cadre de l’année polaire internationale. C’est

dans le cadre du programme NSF-CAML coordonné par A.L. Murray que nous

avons pu accéder à la plateforme de pyroséquençage du Marine Biological

Laboratory in Woods Hole (MA, USA). Le prélèvement mensuel des

échantillons durant l’année 2007 a été effectué dans le cadre du programme

IPEV-MICROBIOKER.

Nous avons analysé plus de 160 000 séquences d’ARNr 16S (chiffre à comparer

aux 200 séquences généralement analysées par clonage/séquençage) obtenues à

partir d’échantillons sélectionnés lors d’un suivi mensuel organisé durant une

année à deux stations d’Observation côtières en zones Antarctique (Palmer, US)

et Sub-Antarctique (Kerguelen, FR). Le traitement du nombre considérable de

séquences a été rendu possible grâce au récent développement de la plateforme

d’analyse “Visualization and Analysis of Microbial Population Structures”

(VAMPS) du Josephine Bay Paul Center. Cette collaboration franco-américaine

nous a permis d’observer que la diversité bactérienne des zones Antarctique et

Sub-Antarctique étaient très différentes, avec notamment une disparité

importante de la distribution des séquences majoritaires de

24

Différence

importante de la

diversité

bactérienne de

l’Océan

Antarctique entre

les saisons

estivales et

hivernales avec

une richesse plus

importante du

bacterioplancton

en hiver

Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria et Bacteriodetes. Couplé à des

méthodes d’empreintes moléculaires classiques (CE-SSCP et DGGE), nous

avons observé des changements de structure de communautés très important

entre les deux saisons présentes à ces latitudes, avec une richesse des espèces

bactériennes plus importante en hiver, surtout à la station Antarctique PALMER.

Aux deux stations, plusieurs groupes abondants tels que les Rhodobacteraceae,

Gammaproteobacteria et Bacteriodetes montrent des variations importantes dans

leur abondance et leur composition (Ghiglione et Murray, 2012).

Dans cette étude, nous avons également trouvé des tendances similaires lorsque

nous avons comparé les résultats obtenus par les techniques CE-SSCP, DGGE et

pyroséquençage 454, suggérant que les empreintes moléculaires, lorsqu’elles

prennent en compte la présence et l’intensité des pics ou bandes, reflètent bien la

structure de la communauté totale (contrairement à l’idée répandue de leur

limitation par le faible nombre de pics ou bandes détectées).

(A)

(B)

Figure 5. (A) Courbe d’accumulation des données de pyroséquençage montrant l’effort

d’échantillonnage de la diversité, estimée entre 58 et 68% de la diversité totale selon les

échantillons. La richesse en espèces bactériennes est plus importante en hiver dans ces zones

polaires.

(B) Comparaison des dendrogrammes UPGMA obtenus à partir des données de pyroséquençage

ou d’empreintes moléculaires (DGGE et CE-SSCP) montrant des organisations très similaires

entre les techniques.

25

1.1.2.2. Biogéographie des communautés bactériennes pélagiques du pôle nord au pôle

sud

Figure 6. Carte globale indiquant la localisation des échantillons prélevés en Antarctique (à gauche) et en

Arctique (à droite). Les coordonnées des échantillons est disponible sur le site

http://vamps.mbl.edu/mapper/index.php.

Les zones

polaires pour

étudier la

biogéographie

des bactéries

marines

Les régions polaires Arctiques et Antarctiques offrent une opportunité unique de

tester les facteurs qui influencent la biogéographie des communautés

microbiennes marines puisqu’elles représentent à la fois une situation extrême

de séparation géographique tout en partageant des pressions de sélection

similaires. A notre connaissance, ce travail présente la comparaison la plus

globale jamais réalisée de la diversité du bactérioplancton entre les Océans

polaires Arctique et Antarctique en utilisant une analyse standardisée de données

de pyroséquençage de la région V6 de l’ARNr 16S. Cet effort inclus également

des microbiomes échantillonnés à de plus basses latitudes pour proposer une

perspective globale, portant l’analyse à 837 844 séquences.

De manière surprenante, nous avons observé une différence claire entre les

microbiomes des Océans polaires Arctique et Antarctique : 78.0% des OTUs ont

été trouvées dans l’Océan Antarctique et pas dans l’Arctique, et inversement

70.4% des OTUs ont été trouvées en Arctique et pas dans l’Océan Antarctique.

26

Spéciation

sympatrique des

communautés de

la zone

euphotique et

spéciation

allopatrique des

communautés

méso- et

benthypélagiques

Pas d’évidence de

gradient

latitudinal de la

richesse

bactérienne

Même si les bactéries des Océans des deux pôles étaient plus proches entre elles

comparées à celles présentes à de plus faibles latitudes, les analyses comparant

des échantillons provenant de la côte ou du large, de différentes profondeurs et

de différentes saisons démontrent que les communautés bactériennes des Océans

polaires Arctique et Antarctique sont toujours différentes. Les communautés

bactériennes Arctique et Antarctique échantillonnées dans des zones côtières

étaient plus différentes entre elles que celles des zones hauturières. Inversement,

les communautés méso- et bathypélagiques étaient moins différentes entre les

pôles et avec les échantillons des océans profonds prélevés à de plus faibles

latitudes (Figure 7). Ces résultats nous amènent à proposer que le

bacterioplancton de surface est plus influencé par les conditions

environnementales contemporaines, telles que la lumière, la variabilité des

ressources et du climat (spéciation sympatrique), alors que les communautés

profondes sont structurées par la balance entre une isolation historiquement plus

longue et une connectivité via la circulation océanique (spéciation allopatrique).

Contrairement à d’autres études antérieures, nous n’avons pas pu mettre en

évidence de gradient latitudinal de la richesse du bactérioplancton. Ce résultat

soutient la thèse selon laquelle la taille des organismes influence le degré

d’importance du gradient latitudinal sur l’alpha-diversité (Fenchel & Finlay,

2004). En effet, les petits organismes ne sont pas soumis aux mêmes contraintes

que les organismes de plus grande taille dont la richesse diminue avec la

latitude, ce qui expliquerait la répartition cosmopolite des protozoaires (Fokin,

2000), des diatomées (Hillebrand and Azovsky 2001) et de la meiofaune (Giere

1993).

Ce travail a permis d’identifier les groupes bactériens majeurs présents en milieu

côtier et hauturier en surface et en milieu profond, et propose une base solide

pour la compréhension de la biogéographie du bactérioplancton pélagique.

27

Figure 7. Dendrogramme UPGMA basé sur la dissimilarité de Bray Curtis des séquences V6 du gène ARNr 16S

d’échantillons pélagiques prélevés en Arctique (bleu), en Antarctique (rouge) et en Mer Mediterranée, dans les

Océans Pacifique et Atlantique (gris). Le nom des échantillons est codé par région océanique_code de la base de

donnée VAMPS_côtier (C) ou hautuirer (O)_profondeur en mètres. Les régions océaniques de l’Océan

Antarctique (SO) sont Amundsen Sea (AS), Antarctic Peninsula (AP), Kerguelen Islands (KI), Ross Sea (RS),

Weddell Sea (WS) et celles de l’Océan Arctique (AO) sont Baffin Bay (BB), Beaufort Sea (BS), Chukchi Sea

(CS), East Siberian Sea (ES), Franklin Bay (FB).

Les groupes de dissimilarité ont été nommés Summer Antarctic coastal (A), Summer Arctic coastal (B), Winter

Antarctic coastal (C), Winter Arctic coastal (D), Kerguelen Islands coastal (E), Summer Antarctic open ocean

(F) , Summer Arctic open ocean (G), Summer Western Arctic deep (H), Summer Western Arctic Deep (I),

Summer Eastern Arctic and Antarctic Deep (J) and Mid-latitude large cluster (K).

28

1.1.3. Prise en compte des bactéries métaboliquement actives dans l’étude de la structure des

communautés bactériennes


-IFB-OBSDIV (2005): Observatoire de la diversité microbiologique

(PI : Ghiglione JF & Lebaron P)

- Europe BASICS (2002-2005): Bacterial single-cell approaches to the relationship between diversity and

function in the Sea (PI : Gasol JM)


Rodriguez-Blanco et al. 2009 FEMS Microbiology Ecology (IF 3.35)


L’ARNr 16S

comme marqueur

de l’activité

métabolique des

bactéries

Si l’émergence des techniques d’empreintes moléculaires a conduit à une

meilleure compréhension de la structuration des populations bactériennes dans

les écosystèmes côtiers et hauturiers, le lien entre la structure des communautés

bactériennes et l’activité des populations reste encore très peu documenté.

Différents auteurs ont souligné la possible utilisation de l’ARNr 16S comme

marqueur de l’activité des bactéries, puisqu’il intervient dans la structure des

ribosomes impliqués dans la machinerie cellulaire de synthèse des protéines

(Poulsen et al. 1993, Moeseneder et al. 2001, Trousselier et al. 2002).

L’optimisation de la technique CE-SSCP pour l’analyse simultanée des ADNr

16S et des ARNr 16S nous a alors permis d’accéder à l’analyse couplée de la

structure des communautés bactériennes totales et métaboliquement actives

(Figure 8).

Un nouveau suivi annuel (2003-2004) réalisé à la station côtière SOLA a montré

que les structures des communautés bactériennes totales vs. métaboliquement

actives étaient soumises aux mêmes variations saisonnières. Une analyse

détaillée des ribotypes présents dans les deux fractions montrent généralement

que le nombre de ribotypes présents au niveau de l’ADNr 16S est toujours plus

élevé que celui de l’ARNr 16S, suggérant que de nombreuses espèces

bactériennes sont présentes mais peu actives dans l’écosystème (Lami et al.

2009).

Les ribotypes présents au niveau ARNr16S sont majoritairement (97% )

représentés au niveau de l’ADNr16S. Il existe de rares cas (3%) de ribotypes

bactériens contenant des ARNr16S qui ne sont pas détectés en ADNr16S,

suggérant que certains ribotypes puissent être faiblement abondants mais

29

Comparaison des

communautés

totales vs.

métaboliquement

actives

suffisamment actifs pour apparaître parmi les ribotypes actifs dominants. Ces

résultats suggèrent que les membres d’une communauté bactérienne peuvent

avoir une activité plus ou moins élevée que leur abondance relative l’aurait

suggéré.

Figure 8. Profils CE-SSCP des ADNr16S et des ARNr 16S bactériens extraits d’un

échantillon naturel. Présence/absence des ribotypes et de leur activité.

En couplant l’analyse par empreinte moléculaire et celle de banques de clones, il

nous a été possible de faire l’assignation des pics CE-SSCP des fractions ADNr

et ARNr 16S (voir Figure 2) par les clones correspondant avec une efficacité de

86,7% de la surface totale du profil. Cette assignation nous a permis de montrer

que les différences observées entre présence et activité des populations de la

communauté étaient également très visibles pour les ribotypes dominants tels

que Roseobacter, Synechococcus, SAR 11 ou SAR116 et variaient tout au long

de l’année (Figure 9). Des études antérieures avaient effectivement montré qu’il

n’existe pas de relation linéaire entre l’abondance relative de certains taxa et leur

contribution à la production de biomasse (Cottrell & Kirchman 2004).

Les empreintes moléculaires utilisant l’ADNr 16S décrivent relativement bien la

dynamique de la structure des communautés bactériennes, alors que les

empreintes moléculaires utilisant l’ARNr 16S permettent la détection des

populations actives, a priori plus sensibles aux changements environnementaux.

La détection de variations significatives entres les empreintes moléculaires

utilisant l’ADNr 16S et l’ARNr 16S suggèrent que tous les membres de la

communauté ne participent pas de manière équivalente dans le flux de carbone

en milieu côtier. Ces résultats soulignent le besoin de réévaluer certaines

hypothèses utilisées dans les modèles des cycles biogéochimiques qui considère

Ribotype + Activité +

Profil ADNr 16S

Profil ARNr 16S

Ribotype - Activité +

Ribotype + Activité -

30

Assignation des

pics CE-SSCP

métaboliquement

actifs

Comparaison

ADN / ARN pour

une meilleure

compréhension

du rôle

fonctionnel de

certaines

populations

que tous les membres des communautés procaryotes contribuent de manière

égale au flux de matière et d’énergie (Alonso-Saez & Gasol, 2007) quelle que

soit la saison de l’année.

Figure 9. Dynamique des quatre phylotypes ADNr et ARNr 16S dominants sur les

profils CE-SSCP durant le suivi mensuel de l’année 2003-2004 à la station SOLA et

variation du ratio de la surface des pics pour ces phylotypes dominants, respectivement

Roseobacter, Synechococcus, SAR11 and SAR116.

A la station hauturière MOLA et à deux stations plus au large, les différences les

plus importantes entre la structure des communautés bactériennes présentes et

actives ont été observées aux profondeurs où la production bactérienne était la

plus importante, i.e. à la surface et au maximum de chlorophylle (Rodriguez-

Blanco et al. 2009). L’assignation des pics CE-SSCP à une banque de clones a

permis de montré que SAR11 était le groupe le plus abondant en surface alors

que les -Proteobacteria l’étaient au maximum de chlorophylle, sur la base de

leur ADNr16S. Par contre, leur activité métabolique s’est montrée relativement

plus faible que d’autres groupes à ces profondeurs. Le cas inverse a été observé

pour le groupe Prochloroccocus qui présentait une très forte activité en surface

et au maximum de chlorophylle (estimée par l’ARNr16S) que n’aurait laissé

prévoir son abondance relative (estimée par l’ADNr16S). Ces travaux soulignent

à nouveau l’importance de la combinaison des approches basées sur l’ADNr 16S

et l’ARNr 16S pour une meilleure compréhension du rôle fonctionnel de

certaines populations bactériennes in situ.

31

1.2. Détermination de l’influence relative des paramètres biotiques et abiotiques dans la

structuration des communautés bactériennes

Introduction aux

statistiques

multivariées

directes

Etudes

pionnières en

Ecologie

microbienne

marine

Les statistiques multivariées directes proposent un panel varié permettant de

décrire les facteurs environnementaux qui contrôlent les changements de

structure de communauté. Ces techniques sont très utilisées par les écologistes

des organismes supérieurs, mais très rarement par les écologistes microbiens.

Les jeux de données sont souvent explorés via des analyses multivariées

indirectes dites « exploratoires » en composante principale (ACP) ou

hiérarchiques par groupement (voir les dendrogrammes issus de ce type

d’analyse dans le chapitre 1.1). Les analyses dites « hypothético-déductives » de

type analyses des redondances (RDA) ou analyse canonique des

correspondances (CCA) proposent un pouvoir explicatif statistique des liens

entre les changements de diversité et les variables environnementales (Ter

Braak, 1986). Leur utilisation en Ecologie microbienne a certainement été

retardée par le faible pouvoir résolutif des anciennes approches de la diversité

bactériennes basées sur la culture des cellules (Staley & Konopka 1985) et par la

limitation des techniques moléculaires de clonage séquençage à faible débit qui

réduit le nombre d’échantillons analysés. Le développement récent de

techniques à haut débit, tels que la CE-SSCP, la T-RFLP, l’ARISA, permettant

l’analyse de la structure des communautés microbiennes d’un grand nombre

d’échantillons a ouvert la porte à l’utilisation des outils statistiques multivariés

directs. A l’heure actuelle, très peu de littérature existe sur l’emploi de tels

outils, et nous avons été pionniers de leur utilisation en milieu marin pour

l’analyse des facteurs environnementaux qui influencent la diversité du

bactérioplancton. Ce type d’analyse requiert un investissement de terrain et la

participation à des programmes scientifiques pluridisciplinaires permettant la

compilation d’un nombre suffisant de paramètres environnementaux mesurés

par différentes équipes scientifiques lors de mission en mer ou à des stations

d’Observation. Nous avons proposé ce type d’analyse dans des programmes

scientifiques menés en milieu côtier (Lami et al. 2009), hauturier (Ghiglione et

al. 2008), estuarien (Ghiglione et al. en préparation) et lacustre (Berjeb et al.

2011a et 2011b). Dans un souci de concision, j’ai choisi de ne présenter que les

résultats relatifs aux milieux côtiers et hauturiers dans ce manuscrit.

32

1.2.1. Quels sont les facteurs qui déterminent les changements saisonniers de la structure des

communautés bactériennes en milieu côtier ?


- Europe BASICS (2002-2005): Bacterial single-cell approaches to the relationship between diversity

and function in the Sea (PI : Gasol JM)

- UVECO (2003-2006) Induction of microbial community responses and dissolved organic matter

transformations by UltraViolet radiations in marine ECOsytems (PI F. Joux et R. Sempéré)



Abbouddi et al. 2008 Microbial Ecology (IF 2.89)

Joux et al. en préparation

Déterminants

environnementaux

des changements

saisonniers des

communautés en

milieu côtier

Modèles

statistiques de

l’influence des

paramètres

environnementaux

sur la diversité

bactérienne

Des travaux antérieurs (Ghiglione et al. 2005) ainsi que des travaux plus récents

de la littérature (Fuhrman et al. 2006, Gilbert et al. 2012) ont montré qu’un

caractère récurrent des changements de la structure des communautés

bactérienne en milieu côtier était les changements saisonniers. Dans ce travail,

nous avons vérifié ces premiers résultats en les complétant par une meilleure

prise en compte de la fraction métaboliquement active (comparaison ADN et

ARN) et par l’identification phylogénétique des ribotypes évoluant tout au long

de l’année par couplage de la CE-SSCP au clonage/séquençage (voir §1.1.3).

Ces travaux ont été effectués dans le cadre du programme européen BASICS et

par le concours du réseau SOMLIT. Plusieurs phylotypes de la fraction active

diffèrent de la fraction totale, suggérant qu’une partie des membres de la

communauté présente une forte activité sans pour autant être un acteur

abondant dans la communauté. Cette différence inclus des ribotypes dominants

tel que les groupes Roseobacter, Synechococcus, SAR11 and SAR116.

L’analyse multivariée montre qu’un réseau complexe de paramètres

environnementaux incluant la température, la salinité, les sels nutritifs et la

chlorophylle a concourent pour expliquer une part importante (environ 60%)

des changements de structure de communauté totale (ADN) et active (ARN)

(Figure 10) (Lami et al. 2009). Ces modèles statistiques montrent également

qu’une proportion non négligeable de la variation des structures de

communautés n’est pas expliquée par les paramètres environnementaux

mesurés. Des travaux ultérieurs devront prendre en compte la limitation par les

prédateurs (« top-down » control) tels que les virus, les flagellés et les ciliés.

33

Figure 10. Diagramme d’ordination de l’analyse canonique de correspondence (CCA) des

empreintes CE-SSCP sur la base de l’ADNr 16S (A) et de l’ARNr 16S (B). Les groupes

affichés en pointillé sont ceux correspondant aux groupes obtenus par l’analyse multivariée

indirecte et non contrainte réalisée en amont sur les mêmes échantillons, montrant une

répartition de la structure des communautés en fonction des 4 saisons. Les triangles indiquent la

position des phylotypes dominants sur les deux axes. Roseo: Roseobacter, Syn: Synechococcus.

D’autres résultats concernant l’effet des radiations UV sur la structuration des

communautés bactériennes en milieu côtier ont été menés dans le cadre du

programme PROOF-UVECO. Ils ont permis de montrer en condition contrôlée

que les radiations UV induisaient des changements de la structure associés à

des changements de l’activité des communautés bactériennes (Joux et al. en

préparation). Néanmoins, les conditions expérimentales ne nous ont pas permis

de dissocier l’importance relative de l’impact direct des UV sur les organismes

ou de l’impact indirect des UV via la photo-transformation de la matière

organique pour expliquer les changements observés. Pour évaluer l’importance

34

Effets directs et

indirects des

radiations UV sur

la structure des

communautés

bactériennes

de la photo-transformation de la matière organique par les radiations UV dans

la structuration des communautés microbiennes et leur activité, nous avons

conduit différentes expérience à la station d’Observation SOLA (Baie de

Banyuls sur mer) et dans deux étangs (Leucate et Canet). Ces écosystèmes se

distinguent par leur concentration en matière organique dissoute (DOM) et en

matière organique dissoute chromophore (CDOM) (valeurs plus faible pour la

station SOLA < Leucate < Canet). Après exposition à la lumière solaire ou sans

lumière (contrôle) pendant une journée, ces eaux débarrassées de leur contenu

biologique (filtration à 0.2 µm) ont été inoculées par leur communauté

bactérienne originelle. La phototransformation de la DOM a eu des effets

contrastés sur la production et la respiration bactérienne, résultant en une

augmentation de l’efficacité de croissance pour les eaux côtières oligotrophes

(120%) et en une diminution pour les eaux lagunaires (20 à 40%), par

comparaison à ce qui était observé dans les traitements maintenus au noir. Nous

avons également observé que la croissance bactérienne sur la DOM irradiée par

l’exposition à la lumière était associée à des changements important de la

structure de la communauté bactérienne totale et active pour les trois

environnements, et ceci par comparaison aux bactéries utilisant la DOM non-

irradiée (Fig. 11) (Abboudi et al. 2008).

Figure 11. A gauche : Localisation des sites d’échantillonnage en milieu marin côtier (SOLA)

et lagunaire (Canet et Leucate). A droite : Dendrogramme UPGMA relatif aux différences

entre les empreintes moléculaires CE-SSCP ADNr16s et ARNr 16S des échantillons contrôle

(C), sans lumière (DK), avec lumière PAR (PAR) et avec lumière solaire (FS) aux stations

SOLA, Canet et Leucate.

Nous avons pu déterminer que ces changements étaient essentiellement liés à

une photo-transformation de la DOM par les radiations UV dans le cas de

16S rDNA 16S rRNA

C

PAR

FS

DK

C

DK

PAR

FS

LEUCATE

SOLA

C

DK

PAR

FS

CANET

0.02 0.

04 0.06 0.

08 0.1 0.

12 0.14 0.

02 0.04 0.

06 0.08 0.

1

C

PAR

FS

DK

C

DK

PAR

FS

C

DK

PAR

FS Mediterranean

Sea

France

SOLA

Canet

Leucate

35

l’étang le plus eutrophique et pour la station oligotrophe côtière, et plutôt par

les radiations photosynthétiquement actifs (PAR) dans l’étang mésotrophe. Ces

résultats indiquent que la photo-transformation de la DOM altère

significativement à la fois la structure des communautés et le métabolisme des

bactéries pour une variété d’eaux de surface en condition estivale en Mer

Méditerranée Nord Occidentale (Figure 11) (Abbouddi et al. 2008). Afin de

pouvoir généraliser ces résultats à une échelle annuelle, des travaux similaires

sont actuellement en cours pour évaluer l’importance des changements

saisonniers de la structure des communautés discutés, mais aussi de l’intensité

de lumineuse et de la qualité et de la concentration du DOM.

1.2.2. Quels sont les facteurs qui déterminent la stratification verticale de la structure des

communautés bactériennes en milieu hauturier ?

Support programmatique relatifs à cette partie:

-PECHE (2003-2006): Production et Exportation du Carbone : contrôle par les organismes

HEtérotrophes à petite échelle de temps (PI Andersen V et Goutx M)

Diffusion du travail relative à cette partie : Ghiglione et al. 2008 (Biogeosciences IF 3.45)

Goutx et al. 2009 (Biogeosciences IF 3.45)

Bourguet et al. 2009 (Deep Sea Research II IF 1.03)

Van Wambecke et al. 2009 (Biogeosciences IF 3.45)

- Pulido-Villena et al. 2012 dans “Life in the Mediterranean Sea: a look at habitat changes”

Déterminants

environnementaux

de la structuration

verticale des

communautés en

milieu hauturier

Nos travaux antérieurs (Ghiglione et al. 2007) ainsi que d’autres travaux de la

littérature (Rieman et al. 1999, Moeseneder et al. 2001) ont montré que lorsque

la colonne d’eau n’est pas trop perturbée par des courant d’advection

horizontale la diversité bactérienne en milieu hauturier était structurée

verticalement de manière très caractéristique en relation avec le maximum

profond de chlorophylle (DCM). Au cours de la troisième campagne du

programme national PROOF-PECHE, un échantillonnage journalier a été

réalisé sur un mois (Sept.-Oct. 2004) à la station d’observation JGOFS-

DYFAMED (campagne DYNAPROC II). L’analyse de la structure des

communautés bactérienne a été suivie dans la colonne d’eau, de la surface

jusqu’à 1000 mètres de profondeur. L’analyse multivariée indirecte et non

36

Action synergique

de plusieurs

paramètres

physico-

chimiques, et rôle

particulier de la

qualité de la

matière organique

et de la diversité

phytoplanctonique

Etude en bioessais

pour préciser le

contrôle par les

ressources

(« bottom-up »

control) de la

structure des

communautés à

différentes

profondeurs

contrainte des données CE-SSCP lors de cette campagne ont confirmé la

répartition verticale de la structure des communautés bactériennes qui est resté

stable durant le mois d’échantillonnage en trois couches réparties en surface (0-

20m), dans ou juste sous le maximum profond de chlorophylle (60-150m) de

chlorophylle, et dans la zone mésopélagique (200-1000m) (Figure 4). L’analyse

multivariée directe et contrainte par les paramètres environnementaux a permis

de montrer que plusieurs paramètres agissaient en synergie pour expliquer la

répartition verticale de la structure de communauté dans la colonne d’eau. Les

paramètres physico-chimiques tels que le phosphate, le nitrate, la salinité et à

un moindre niveau la température, la lumière, l’oxygène et le carbone

organique dissous agissent en synergie pour expliquer plus de 45.8% des

changements dans la colonne d’eau (Figure 12). L’analyse des marqueurs

lipidiques de la qualité de la matière organiques expliquent à eux seuls 22.4%

de la variabilité (notamment les lipides d’origine chloroplastique). Dans la zone

euphotique, nous avons pu monter des relations avec la diversité du

phytoplancton, expliquant 44.5% de la répartition des communautés

bactériennes entre la surface et 150m (Ghiglione et al. 2008). Ces travaux ont

légitimé l’importance de la mesure de la fraction lipidique (proxy de la qualité

de la matière organique) comme variable explicative à prendre en compte dans

la structuration des communautés bactériennes capable dans la colonne d’eau.

En me rapprochant de l’analyse des données de la chimie analytique des lipides

en étroite collaboration avec le LMGEM de Marseille, nous avons pu montrer

également des corrélations fortes entre ce paramètre et les activités bactériennes

(Goutx et al. 2009, Bourguet et al. 2009).

L’effet du contrôle par les ressources (« bottom-up » control) a été précisé lors

de cette campagne par des tests de facteurs limitant l’activité bactérienne durant

la période d’échantillonnage (Sept-Oct 2004). Durant la campagne, la limitation

de l’activité bactérienne est passée d’une co-limitation en azote et phosphore à

une limitation en phosphore seule. Le résultat majeur de ce travail a été de

montrer que les différences de facteurs limitant en surface (5m : co-limitation

N-P puis P seul) et en profondeur (80m : limitation par le carbone labile) avait

une influence importante sur les changements de structure de communauté. Les

deux communautés (5m et 80m) réagissent rapidement (24h) aux changements

de concentration en nutriments par des changements drastiques des populations

37

totales (ADN) et métaboliquement actives (ARN), résultant en des

changements important d’activité bactérienne. Ces résultats viennent conforter

les hypothèses proposées par l’analyse multivariée (voir résultats présentés ci-

dessus) et illustrent l’effet du contrôle des communautés et de l’activité des

communautés bactériennes par les ressources en milieu épipélagique de la

Méditerranée Nord Occidentale (Van Wambecke et al. 2009).

Figure 12. Analyse canonique de correspondance (CCA) de la structure des communautés

bactériennes des échantillons de la colonne d’eau (0-1000m) en utilisant les paramètres

physico-chimiques (à gauche), des marqueurs lipidiques de la qualité de la matière organique

(au milieu) et la diversité pigmentaire phytoplanctonique (à droite). Les flèches indiquent la

direction de valeurs croissantes de la variable considérée. La longueur des flèches indique le

degré de corrélation avec les axes. La position relative de l’échantillon avec les flèches est

interprétée en projetant les points sur la flèche et indique à quel point la structure des

communautés d’un échantillon est influencée par le paramètre environnemental décrit par la

flèche. Les différents groupes d’échantillons révélés par l’analyse multivariée indirecte et non

contrainte (0-20m, 60-150m and 200-1000m) sont indiqués par des symboles différents.

38

39

Chapitre 2

Rôle de la diversité et de l’activité des bactéries libres et attachées

aux particules dans le cycle biogéochimique du carbone en milieu

marin côtier et hauturier

40

2.1. Rôle sous-estimé des bactéries attachées aux particules dans la transformation de la

matière organique en milieu hauturier en condition de bloom printanier


-PECHE (2003-2006): Production et Exportation du Carbone : contrôle



Ghiglione et al. 2007 (Microbial Ecology, IF 2.89)

Mével et al. 2009 (Biogeosciences IF 3.45)

Quel est le rôle

des bactéries

attachées dans la

transformation

de la matière

organique en

milieu hauturier?

L’étude des stocks et des flux de carbone ainsi que leur transfert au sein des

réseaux trophiques sont des questions fondamentales pour la compréhension du

fonctionnement des écosystèmes océaniques. Le programme national PROOF-

PECHE avait pour objectif de décrire les mécanismes de contrôles impliqués

dans la production et l’exportation du carbone au sein de la colonne d’eau en

Mer Méditerranée Nord Occidentale. Deux premières campagnes en mer ont été

effectuées en Mars et Juin 2003 (PROPECHE 1 et 2) à la station d’observation

hauturière JGOFS-DYFAMED (au large de Nice et de la Corse; 2350 m

profondeur maximale). Cette station est reconnue pour ne présenter que très peu

de phénomène d’advection horizontale, et constitue donc un modèle d’étude des

transferts verticaux au sein de la colonne d’eau. Ces deux campagnes nous ont

permis de distinguer le devenir de la matière organique et son transfert dans la

chaîne trophique dans deux conditions contrastées de bloom printanier

(condition mésotrophique) et de stratification estivale (condition

oligotrophique), caractérisés par une production primaire dix fois plus

importante et une biomasse zooplanctonique maximale au printemps par rapport

à l’été (Figure 13).

Une attention particulière a été portée sur le rôle du compartiment bactérien dans

le transfert de la matière organique dissoute et particulaire dans la colonne

d’eau. Si le rôle des bactéries dans la reminéralisation de la matière organique

dissoute est assez bien documenté, peu de travaux reflètent leur rôle dans la

transformation de la matière organique particulaire. Le but de ces travaux était à

la fois (i) de comparer les flux de carbone dissous et particulaire qui transitent

par le compartiment bactérien en conditions mésotrophes (printemps) et

41

En condition

mésotrophe, plus

de 80% de la

production

bactérienne totale

est assurée par

les bactéries

attachées aux

particules la nuit.

oligotrophes (été) et (ii) d’évaluer l’influence de la diversité des bactéries libres

et des bactéries attachées aux particules dans ces flux.

Les communautés bactériennes attachées aux particules sont apparues très

différentes de celles des bactéries libres à la fois en termes de structure des

communautés, d’abondance et d’activités.

Le résultat le plus important de ce travail a été de montrer des changements

nycthéméraux très prononcés de l’activité des bactéries attachées dans la couche

supérieure de la colonne d’eau, avec une activité beaucoup plus importante en

condition nocturne. En condition mésotrophe (printemps), la contribution des

bactéries attachées à l’activité bactérienne totale augmente de 10% le jour à plus

de 80% la nuit dans la couche supérieure (Figure 13). Ces changements rapides

ont pu être reliés à un apport massif de matière organique particulaire d’origine

zooplanctonique qui migre la nuit pour se nourrir du phytoplancton, très

abondant au printemps dans la couche supérieure (Ghiglione et al. 2007).

Figure 13:

(A gauche) Evolution verticale de la fluorescence durant les périodes de bloom

printannier (campagne PROPECHE 1) et de stratification estivale (campagne

PROPECHE 2).

(A droite) Variation nycthémérale de l’activité bactérienne totale et du pourcentage

d’activité des bactéries attachées durant les campagnes PROPECHE 1 (en haut) et

PROPECHE 2 (en bas).

Cette forte activité des bactéries attachées aux particules n’a pas été retrouvée

lors d’un suivi haute fréquence de 1 mois (Sept-Oct 2004) en condition de

42

stratification estivale lors de la campagne océanographique DYNAPROC II.

Néanmoins, des variations rapides de la contribution de la fraction attachée (de

18 à 63% en quelques jours) ont pu être observées en surface (Figure 14) (Mével

et al. 2009).

(A)

(B)

Figure 14.

(A) Variation de la contribution des bactéries attachées à la production bactérienne

totale entre 0 et 1000m entre le jour (□) et la nuit (■) durant la campagne. Les jours

juliens sont indiqués pour chaque profil: 18/09=JD 262; 19/09=JD 263; 26/09=JD 270;

04/10=JD 279; 05/10=JD 280; 12/10=JD 286.

(B) Abondance, production et activité spécifique des bactéries totales et attachées aux

particules à 5m de profondeur. TBA=total bacterial abundance, TBP=total bacterial

production, TSA=total specific activity, Att. BA=relative attached bacterial abundance

on the TBA, Att. BP=relative attached bacterial production on the TBP, Att.

SA=relative attached bacterial specific activity on the TSA.

43

La régulation de ces flux de carbone par la diversité bactérienne a été abordée

par la technique d’empreinte moléculaire (CE-SSCP pour Capillary

Electrophoresis-Single Strand Conformation Polymorphism). Cette technique

hautement reproductible nous a permis de comparer un grand nombre

d’échantillons et de suivre l’évolution de la structure de ces communautés à

petite échelle de temps (jour/nuit) et à l’échelle saisonnière (printemps/été). Si la

structure des communautés est différente entre les bactéries libres et attachées,

de nombreux ribotypes (environ 36%, n=32) sont communs aux deux fractions,

suggérant un échange rapide entre ces fractions (Figure 15). En condition

mésotrophe, nous avons pu montrer qu’un changement rapide de la structure des

communautés entre le jour et la nuit pouvait expliquer l’augmentation

spectaculaire de l’activité des bactéries attachées observée pendant la nuit dans

la couche de surface. Ces résultats renforcent le rôle de la diversité bactérienne

dans le recyclage du carbone organique particulaire des Océans et souligne

l’importance de la variabilité nycthémérale dans ces processus (Ghiglione et al.

2007).

Figure 15: Dendrogramme UPGMA représentant le pourcentage de similarité des profils CE-SSCP des

communautés bactériennes libres et attachées aux particules à différentes profondeurs (0-1000m), le

jour (D) et la nuit (N) entre le printemps et l’été. Le nombre pics par échantillons est indiqué entre

parenthèses.

44

2.2. Diversité des bactéries totales et actives en relation avec leur état libre et attaché aux

particules


-PECHE (2003-2006): Production et Exportation du Carbone : contrôle



Ghiglione et al. 2009 (FEMS Microbiology Letters, IF 2.04)

Quelle est

l’activité de

chacune des

espèces attachées

aux particules ?

Nos précédents résultats exposés ci-dessus ont montré que la diversité des

bactéries attachées aux particules était moins élevée que celle des bactéries

libres, ce qui résulte en une structure des communautés différente entre les deux

communautés. De manière originale, nous avons pu préciser qu’un grand

nombre de ribotypes attachés aux particules était néanmoins identique à celle

des bactéries libres. Contrairement à certaines suppositions de la littérature, ces

résultats suggèrent que s’il existe une compétition sur les particules (diminution

de la diversité sur les particules), les bactéries qui vivent sur les particules sont

plutôt « généralistes » (elles sont capables de vivre à la fois sur les particules et à

l’état libre) que « spécialistes » dans la colonisation des particules.

Les résultats précédents ont également montré que l’activité des bactéries

attachées aux particules était jusqu’alors sous-estimée, pouvant aller jusqu’à

83% de la reminéralisation totale de la matière organique par les bactéries. La

question de l’activité de chacune des espèces qui composent la communauté des

bactéries attachées restait ouverte. Pour répondre à cette question, nous avons

organisé une campagne d’échantillonnage à la station fixe MOLA (Microbial

Observatory of Laboratoire Arago), située à 35 km au large de Banyuls sur mer

(42°28’300 N, 03°15’500 E, profondeur 1000m) en Juillet 2005 dans le cadre du

programme PECHE. La structure des communautés totale et métaboliquement

active des bactéries libres et attachées aux particules a été abordée par

l’utilisation de la technique d’empreinte moléculaire CE-SSCP (capillary

electrophoresis single strand conformation polymorphism) des gènes ADNr 16S

et ARNr 16S.

Nos résultats ont tout d’abord confirmé que la diversité des bactéries libres et

45

attachées présente un haut degré de similarité dans la zone productive (entre 52

et 69% de des ribotypes ADNr 16S sont présent dans les deux fractions dans les

100 premiers mètres), confirmant un échange rapide entre ces communautés.

Néanmoins, les résultats basés sur l’ARNr 16S ont montré que seules certaines

de ces espèces sont adaptées pour exploiter cet habitat. En effet, un grand

pourcentage d’espèces étaient présentes au niveau ADNr 16S mais pas au niveau

de l’ARNr 16S, pour les deux fractions (Figure 16). Ces résultats suggèrent que

même si la colonisation et le détachement des bactéries aux particules est

ubiquiste, l’utilisation des sources de carbone présentes sur les particules

apparaît être faite par un petit nombre d’espèces bactériennes spécialisées dans

l’exploitation d’un tel microenvironnement (Ghiglione et al. 2009).

Figure 16. Pourcentage d’OTUs communs entre les fractions libres et attachées aux particules

(■), seulement sur la fraction libre ( ), ou seulement sur la fraction attachée (□) selon les

empreintes moléculaires CE-SSCP basés sur le gène ADNr16S (A) ou sur l’expression du gène

ADNr16S (B).

0 20 40 60 80 100

-10

-30

-50

-80

-100

-150

0 20 40 60 80 100

-10

-30

-50

-80

-100

-150

(A) (B)

46

2.3. Rôle des bactéries attachées aux particules dans la transformation de la matière

organique en milieu estuarien et influence des paramètres environnementaux sur leur

distribution


-PNEC-BIOPRHOFI (2004-2005): Biogeochemical processes in Rhone diluted mesoscale structure

(PI JJ Naudin)

-ANR-CHACCRA (2006-2009): Climate and Human-induced Alterations in Carbon Cycling at the

River-SeA connection (PI C. Rabouille)

-ANR-MALINA (2008-2011): Impact des changements climatiques sur la biodiversité microbienne et

les flux biogéochimiques dans l’Océan Arctique (PI. M. Babin)

Diffusion du travail relative à cette partie : -Ghiglione et al. (en préparation)

–Böttjer et al. (en préparation)

-Ortega et al. (en préparation)

Le rôle clé joué

par les apports

nutritifs des

fleuves dans le

cycle du carbone

en milieu marin

Le milieu estuarien situé à l’interface entre le continent et l’océan est un milieu

riche et diversifié dont les écosystèmes très productifs sont maintenus par les

apports nutritifs continentaux. Ces apports déterminent le rôle du milieu côtier

dans le cycle du carbone global. En effet, les apports de carbone particulaire ou

dissous qui peuvent être minéralisés représentent une source de CO2 vers

l’atmosphère alors que les organismes qui vont fixer du carbone qui sera enfoui

avec le carbone terrigène représentent un puits de CO2. L’équilibre entre ces

sources et puits de CO2 contraint la teneur en dioxyde de carbone

atmosphérique. Au niveau du plateau continental (la partie distale de la zone

côtière), on considère que la mer Méditerranée joue le rôle de puit de CO2

d’environ 0.4 PgC an-1

. En revanche, le comportement des zones littorales et

notamment de celles situées au débouché des fleuves est beaucoup moins bien

contraint au niveau global comme au niveau local. La complexité des

phénomènes mis en jeu (source et puits intrinsèquement liés) et les variations

temporelles des apports dissous et particulaires rendent les bilans très difficiles à

établir. Des premiers résultats semblent indiquer que la zone littorale jouerait un

rôle de source de CO2 aussi fort que le rôle de puit de CO2 du plateau

continental. Le rôle essentiel joué par les bactéries dans la reminéralisation de la

matière organique (jusqu’à 50% eq. de la production primaire) n’est plus à

démontrer, soulignant son rôle incontestable dans les bilans de carbone. La

question du rôle des acteurs de cette reminéralisation, c’est-à-dire la diversité

bactérienne, est encore très peu investie. Cette question a été abordée dans le

47

Rôle des

bactéries

attachées dans

la

transformation

de la matière

organique en

milieu estuarien

Suivi de lentilles

d’eaux dessalées

du Rhône

cadre du programme ANR-CHACCRA qui s’est intéressé aux bilans de carbone

dans l’estuaire du Rhône. Le Rhône est une des sources majeures d’eau douce et

de particules terrigènes en Méditerranée (flux de MO entre 2 et 20 Mt.an-1

; en

moyenne 5 Mt.an-1

, eq. à 80%de la charge particulaire du Golfe du Lion).

De manière générale, si le rôle des bactéries dans la transformation de la matière

organique dissoute (MOD) est relativement bien documenté, la reminéralisation

de la matière organique particulaire (MOP) peut être parfois sous-estimée

(Ghiglione et al. 2007, §2.1.). En général, la contribution des bactéries utilisant

le DOC (bactéries libres) à la production bactérienne totale est supérieure à celle

des bactéries utilisant le POC (bactéries attachées aux particules). En milieu

marin, les bactéries attachées contribuent généralement à moins de 30% de

l’activité bactérienne totale, alors que ce pourcentage peut être supérieur à 50%

en milieu estuarien (Simon et al. 2002). Le rôle de la diversité des bactéries dans

ces processus est encore très peu connu. En milieu estuarien, la diversité

microbienne est abondante, du fait de la rencontre d’espèces d’origines

fluviatiles et marines. La compréhension des facteurs qui influencent la diversité

bactérienne et leur activité est déterminante pour la compréhension de ce

système dynamique complexe.

A partir d’un échantillonnage lagrangien effectué dans le panache du Rhône,

nous avons montré que la structure des communautés bactériennes attachées aux

particules est très différente de la fraction libre dans tout le panache du Rhône

(Figure 17). Dans cette zone de mélange entre les eaux du Rhône et les eaux

côtières, seule une faible proportion de la diversité totale a été retrouvée comme

étant métaboliquement active. Ces populations sont contraintes par la salinité, la

concentration en Chla, la température, les sels nutritifs (N et P) et le carbone

organique particulaire. De manière très intéressante, nous avons pu montrer que

dans la zone proche de l’embouchure, les bactéries attachées aux particules

présentaient une très forte activité, et qu’elles étaient responsables de la plupart

de l’activité bactérienne totale (plus de 90% de l’activité totale dans cette zone –

Figure 17). Ces résultats apportent un regard nouveau sur le rôle sous-estimé

des bactéries attachées aux particules dans le cycle biogéochimique du carbone

en milieu estuarien.

48

Figure 17.

En haut : Analyse en groupement (UPGMA) de la structure des communautés bactériennes totale

(ADN) et active (ARN) libre (free) ou attachées (att) aux particules dans l’embouchure du Rhône.

A gauche: Diagramme d’ordination de l’analyse canonique de correspondance (CCA) des

empreintes moléculaires en association différentes variables environnementales (Salinité, Chl a,

Temperature, Phosphates et azote dissous totaux, Carbone organique particulaire).

A droite : Contribution (en %) de la fraction attachée aux particules dans l’activité bactérienne

totale observé aux stations proches de l’embouchure (symboles vides) ou dans une zone plus

distale de l’embouchure (symboles pleins).

49

Figure 18 : Stratégie d’échantillonnage des lentilles d’eaux dessalées en Mai 2006

(Campagne Bioprhofi)

Des travaux antérieurs menés par notre équipe ont montré que des structures

sous forme de lentilles d’eau dessalées issues de l'interaction entre le panache

du Rhône et les conditions météorologiques, pouvaient être transférées jusqu'au

large de Barcelone. Ces structures dessalées, détachées du panache proprement

dit, sont plus riches en particules et en éléments chimiques dissous que l'eau

marine environnante. Des travaux précédents ont montré qu’elles peuvent

constituer des masses d’eau de plus de 1000 km² (15x20 milles) et de près de

20m d'épaisseur dans sa partie centrale (isohaline 37), et constituer un volume

total équivalent à 4 jours du débit du Rhône, soit ~5.3 109 m

3.

Deux lentilles d’eaux dessalées ont été suivies lors d’une campagne organisée

en Mai 2006 (campagne Bioprhofi – Figure 18). Dans un premier temps, nous

avons pu démontrer qu’il existe une activité de reminéralisation de la MO

beaucoup plus importante dans la lentille d’eau que dans une eau marine (120

Référence marine

2ème

trajectoire 19 au 23 Mai 2006

(début(CTD88) , milieu(CTD130) et fin(CTD171))

1ère

trajectoire 16 au 18 Mai 2006

(début(CTD26) et fin(CTD68))

Rhone discharge

50

pmol leu l-1

h-1

dans la lentille contre 40 pmol leu l-1

h-1

dans l’eau sous-jacente

ou dans un échantillon d’eau de mer témoin). Nous avons également pu mettre

en évidence que la fraction attachée aux particules pouvait contribuer

jusqu'à 80% de la production bactérienne totale dans ces eaux. Cette

activité de reminéralisation de la MO par les bactéries attachées est plus

importante pour les eaux dessalées plus âgées, suggérant une cinétique plus

longue de réponse de ces communautés et/ou une évolution de la structure des

communautés associées. Des travaux complémentaires ont permis de montrer

que ces changements d’activités bactériennes attachées aux particules étaient

associés à des changements rapides de leur diversité (Figure 19). Ces résultats

renforcent le rôle de la diversité bactérienne dans le recyclage du carbone

organique particulaire des Océans.

Figure 19: Evolution de la structure des communautés bactériennes libre (F) et

attachées (A) aux particules entre le début et la fin de la lentille 1 (à gauche) et le

début, le milieu et la fin de la lentille 2 (à droite) échantillonné en Mai 2006.

51

Chapitre 3

Rôle du compartiment bactérien dans la régulation des

processus de biodégradation des hydrocarbures pétroliers

en milieu marin pélagique

52

Importance

des bactéries

dans la

dégradation

des

hydrocarbures

pétrolier :

« service

rendu par les

écosystèmes »

Expérience de

l’UMR7621

dans la

bioremédiation

des HCP

Si le rôle des bactéries est essentiel dans les cycles biogéochimiques en milieu

marin, elles jouent un rôle également très important dans la réaction des

écosystèmes aux impacts anthropiques. En terme quantitatif, le pétrole brut est un

des polluants organiques les plus répandus dans les environnements côtiers du fait

de la concentration importante des activités humaines dans ces zones (stockage,

transport, activités industrielles) (Head et Swannel, 1999). Les catastrophes

pétrolières, telles que l’accident récent de la plateforme pétrolière dans le Golfe du

Mexique (record historique de pollution pétrolière en mer avec plus de 700 000

tonnes de pétrole), marquent invariablement l’attention du public et incitent les

organismes décideurs à réfléchir sur le problème de détection et de lutte contre les

pollutions chroniques ou accidentelles par les hydrocarbures pétroliers (HCP). La

biodégradation par les microorganismes est indéniablement le processus le plus

abouti dans l’élimination des polluants d’origine pétrolière (Atlas 1981). Même s’il

est relativement lent, ce processus permet une dégradation quasi-complète

(transformation en CO2) des hydrocarbures. Les bactéries semblent qualitativement

et quantitativement les plus efficaces dans cette fonction (Figure 20) (Prince 2005).

Ce processus naturel a pour nom la bioremédiation.

Notre UMR a une expérience de plus de 20 ans sur le thème de la

bioremédiation des hydrocarbures pétroliers (voir publications de Daniel Delille

depuis 1990). Les travaux étaient essentiellement orientés sur les moyens de

résoudre des problèmes de pollution par les HCP en environnement Antarctique.

Des découvertes importantes ont permis notamment une amélioration de la

bioremédiation lors de la pollution par l’Exxon Valdez (180 000 tonnes de pétrole

déversés) sur la côte de l’Alaska, grâce à l’utilisation de l’Inipol EAP22 (mis au

point par les équipes d'Elf Aquitaine) précédemment testé par nos équipes en

environnement polaire (Antarctique). Néanmoins, le rôle de la diversité

bactérienne dans la régulation de l’activité de bioremédiation, en prenant en

compte les facteurs de contrôle par les ressources (« bottom-up ») et de contrôle

par la prédation (« top-down ») n’était pas encore abordés.

Dans ce chapitre sont rapportées des études concernant:

-l’impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes pélagiques

côtières marines en condition naturelle. Cette évaluation a été menée (i) à partir

d’études in situ de l’influence relative des HAP comparée à d’autres paramètres

53

physicochimiques sur la structure des communautés bactériennes en milieu côtier

et (ii) en abordant l’impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des

bactéries à l’apport de pétrole et à la biostimulation.

- le contrôle de la diversité des bactéries hydrocarbonoclastes par les ressources

(bottom-up) et par la prédation (top-down)

- un exemple d’identification de la diversité associée à une la dégradation des HAP

par l’utilisation de marquage par des isotopes stables

Figure 20 : Processus abiotiques et biotiques conduisant à l’élimination naturelle du pétrole

en milieu pélagique marin. Les bactéries marines contribuent largement aux processus de

bioremédiation des pétroles.

Dans ce chapitre, nous soulignons l’importance de la prise en compte de la limitation par les

ressources (« top-down ») et par la lyse virale et la prédation par les protozoaires (« bottom-

up ») qui régulent les activités de bioremédiation bactériennes.

54

3.1. Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes pélagiques côtières

marines en condition naturelle

Supports programmatiques relatifs à cette partie: -ANR-INDHYC (2005-2008): Indicateurs biologiques et chimiques de présence, biotoxicité et biodégradabilité

des hydrocarbures pétroliers (HCP) en milieu aquatique continental et côtier

(PI : Ghiglione JF)

-EUROPE-COMMODE (2003-2006): Communities of Marine Micro-organisms for Oil Degradation

(PI Yakimov M)

-EC2CO IBISCUS (2009-2010): Indicateurs biologiques et chimiques de contaminations urbaines en

milieu marin (PI Goutx M)


Delille et al. (2009) Polar Biology (IF 1.51)

Rodriguez-Blanco et al. (2011) Environmental pollution (IF 3.62)

Sauret et al. (1) En correction Marine Environmental Research

Sauret et al. (2) En préparation

Des rejets insidieux

responsables de

contaminations

récurrentes aussi

importantes que les

catastrophes

pétrolières

Si les accidents pétroliers captent l’attention du public et des scientifiques

sur le problème de la réponse des écosystèmes marins aux forçages

anthropiques, la pression d’usage très élevée sur le littoral conduit à une

pollution récurrente plus insidieuse qui est beaucoup moins bien prise en

compte par les études scientifiques. Le littoral Méditerranéen est notamment

le siège d’une pollution récurrente inquiétante par les hydrocarbures pétroliers

puisque le quart des rejets pétroliers mondiaux (environ 80 000 tonnes an-1

)

concernent cette mer quasi-fermée dont le taux de renouvellement des eaux

est de 90 ans. Ce chiffre équivaut à une quantité de pétrole cumulée

équivalente à environ 11 catastrophes du Prestige par an.

La plupart des travaux s’attachant à comprendre la réponse des

microorganismes aux pollutions pétrolières se cantonnent généralement à une

reconstitution plus ou moins fidèle de catastrophes pétrolières en milieu

contrôlé (microcosme ou mésocosme). Ces études ont permis de mettre en

évidence un impact important et rapide des fortes concentrations de pétrole

sur les communautés microbiennes. On assiste en général à une baisse de la

richesse spécifique des communautés bactériennes et à un changement des

espèces dominantes au profit des bactéries « hydrocarbonoclastes »,

avantagées sélectivement par la nouvelle source de matière organique et

particulièrement bien adaptées à la présence de certains hydrocarbures

toxiques. A un premier consortium bactérien capable de métaboliser les

molécules les plus simples succède plusieurs autres consortiums capables de

dégrader des molécules de plus en plus complexes (par exemple les

55

Un rôle évident de

la diversité

bactérienne dans la

régulation de la

dégradation des

pétroles

hydrocarbures aromatiques polycycliques HAP). Cela se traduit par une

alternance de différents groupes bactériens qui se poursuit jusqu’à

l’élimination quasi-complète des hydrocarbures. Ce travaux soulignent ainsi

l’influence de la diversité bactérienne dans la régulation de l’activité de

dégradation des hydrocarbures pétroliers en milieu pélagique (voir par

exemple la revue de Head et al., 2006).

Néanmoins, la plupart de ces travaux réalisés simulant des catastrophes

pétrolières en condition contrôlée ne prennent pas en compte les rejets plus

insidieux, avec des concentrations de polluants plus faibles mais rejetés

régulièrement, qui constituent des écosystèmes pollués chroniquement. Les

travaux rapportés dans ce chapitre visent à (i) évaluer l’influence relative des

HAP comparée à d’autres paramètres physicochimiques sur la structure des

communautés bactériennes en milieu côtier et (ii) à évaluer l’importance de

l’impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à l’apport

de pétrole et à la biostimulation.

3.1.1. Evaluation in situ de l’influence relative des HAP comparée à d’autres

paramètres physicochimiques sur la structure des communautés bactériennes

en milieu côtier

Dans le cadre du programme EC2CO-IBISCUS, nous avons mené

plusieurs campagnes en conditions estivale et hivernale dans 5 sites de la Baie

de Marseille présentant des degrés et des origines de pollutions différentes

(Figure 21).

Figure 21. Stratégie d’échantillonnage reposant sur des transects de 2km à partir de l’intérieur

de 3 ports (Port de Bouc (complexe pétrochimique de Fos-sur-mer), Vieux Port et Saumaty

56

Mise en évidence de

l’importance

relative du polluant

HAP dans la

structuration des

communautés

microbiennes en

milieu côtier

anthropisé

(trafic maritime intense l’été)) et de l’émissaire des eaux usées de Marseille (Cortiou). La

station d’Observation SOFCOM du réseau SOMLIT a également été échantillonnée comme

référence côtière.

Cette étude en milieu naturel a permis de mettre en évidence un changement

de la structure des communautés bactériennes le long du transect de 2km à

partir des ports, associé à un gradient de concentration de HAP. Nous avons

pu montrer que ce changement de communauté avait une influence directe sur

l’abondance des populations hydrocarbonoclastes, révélées par PCR

quantitative et par nombre le plus probable (NPP). Il était néanmoins

important de relativiser l’importance des HAP par rapport à d’autres

paramètres physicochimiques. Si les HAP à eux seuls ne permettent pas

d’expliquer les changements de structure de communauté, ils y contribuent de

manière significative en synergie avec d’autres paramètres tels que la

température, la salinité, le DOC et les sources d’azote et de phosphore. A

notre connaissance, cette étude montrant statistiquement l’importance relative

d’un polluant dans la structuration des communautés in situ ne trouve pas

d’équivalent dans la littérature (Sauret et al. en préparation).

Figure 24. (A gauche) Exemple de dendrogramme UPGMA de la similarité Bray Curtis des

profils CE-SSCP lors du transect de 2km du port de Saumaty qui présente un gradient de

concentration d’hydrocarbure aromatique polycycliques (HAP) – concentration maximale

observée = 10 g l-1

(A droite) Analyse canonique de correspondance révélant l’importance relative des HAP

parmi d’autres paramètres environnementaux pour expliquer les variations de structure de

communauté métaboliquement active (RNA) observées lors de transects aux stations

échantillonnées.

[HAP]

57

La biostimulation

des bactéries

hydrocarbonoclastes

L’hypothèse d’une

meilleure efficacité

de biodégradation

des pétroles dans

des milieux

chroniquement

pollués.

3.1.2. Impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à

l’apport de pétrole et à la biostimulation.

Différents travaux ont permis de mettre en évidence l’importance de certains

paramètres environnementaux dans les processus de dégradation des pétroles,

et notamment l’importance de la limitation en éléments nutritifs (azote et

phosphore essentiellement) et de la biodisponibilité du pétrole à l’attaque

bactérienne (présence d’agent tensio-actifs avec des propriétés de surfactants,

d’émulsifiants ou de dispersants) (voir par exemple la revue de Head et al.

2006). Ces travaux ont permis d’améliorer le « service rendu par les

microorganismes » dans le cas de pollutions pétrolières par la biostimulation

qui consiste en l’ajout de sels nutritifs et de tensio-actifs qui « stimulent »

l’action des bactéries hydrocarbonoclastes (voir par exemple nos articles

Delille et al. 2009, Rodriguez-Blanco et al. 2011).

Différents travaux suggèrent que la présence de pollution récurrente pourrait

également avoir un effet non négligeable sur la biodégradation des

hydrocarbures. L’hypothèse repose sur une biodégradation plus efficace dans

un écosystème chroniquement pollué par rapport à un écosystème non pollué,

du fait de la sélection d’espèces spécialisées dans la dégradation des pétroles.

Néanmoins, si cette hypothèse est souvent citée dans la littérature, elle n’avait

jamais été testée à notre connaissance.

Dans le cadre du programme européen COMMODE, nous avons simulé une

pollution par du pétrole brut sur des communautés bactériennes de deux sites;

un site chroniquement pollué (Baie d’Elefsina –Mer Egée, complexe

pétrochimique) et un site non pollué (Baie d’ Anavyssos). Lors du

prélèvement, les concentrations en hydrocarbures totaux étaient de 0.0014

ppm pour Anavyssos et de 0.171 ppm pour Elefsina. Comme le suggérait

notre hypothèse de départ, nous avons montré que l’addition de 100 ppm de

pétrole brut avait un effet plus visible sur les bactéries originaires du site non

pollué que sur le site pollué. La comparaison des populations totales (ADNr

16S) et actives (ARNr 16S) nous a permis de monter une augmentation de

certaines espèces métaboliquement actives et une inactivation d’autres

espèces sensibles au pétrole, d’autant plus visible dans le site non soumis à

des pollutions chroniques. Par contre, nous avons montré que la

58

biostimulation par ajout de nutriments et d’émulsifiants était aussi efficace

dans les deux sites. Indépendamment de l’historique de pollution du site, la

biostimulation provoque une sélection rapide de différentes communautés

métaboliquement actives qui dégradent le pétrole de manière aussi efficace.

Ces résultats montrent que si la récurrence des pollutions rend les

communautés bactériennes autochtones moins sensibles à un apport de

polluant, elle ne favorise pas la dégradation des pétroles en condition de

biostimulation (Sauret et al. en correction).

Figure 25: Dendrogrammes UPGMA des profils CE-SSCP de l’ADNr 16S et de l’ARNr 16S à

différents temps d’incubation des eaux chroniquement polluées (POLL) ou non polluées (OLIG) avec

le pétrole (0, 65, 93, 134h) en présence ou en absence de pétrole et en condition de biostimulation ou

non (ajout de nutriments ou d’émulsifiants).

59

3.2. Contrôle de la diversité des bactéries hydrocarbonoclastes par les ressources (« bottom-

up » et par la prédation (« top-down »)

Support programmatique relatif à cette partie: -ANR-INDHYC (2005-2008): Indicateurs biologiques et chimiques de présence, biotoxicité et biodégradabilité

des hydrocarbures pétroliers (HCP) en milieu aquatique continental et côtier

(PI : Ghiglione JF)


(PI Yakimov M)





Peu d’études

prennent en

compte les

phénomènes de

prédation et de

lyse virale

Mise au point

d’une

expérience

originale pour

la mesure du

pur « top-

down »

Comme nous l’avons vu précédemment, différents facteurs environnementaux

influencent la diversité et l’activité de dégradation des pétroles en milieu marin. Les

facteurs environnementaux jusqu’alors mis en évidence sont essentiellement la limitation

par les ressources (le contrôle « bottom-up »). Néanmoins, comme nous l’avons souligné

dans le paragraphe 3.1., ces facteurs n’expliquent qu’une partie des changements de

communautés. Nous avons montré notamment que la récurrence des pollutions en

expliquent une autre partie (voir paragraphe 3.2). Peu d’études prennent en compte les

phénomènes de prédation et de lyse virale (contrôle « top-down »).

Pour estimer l’effet exclusif du « top-down » sur la biodégradation des hydrocarbures

et s’affranchir du contrôle « bottom-up », nous avons imaginé une expérience originale

simulant un apport de pétrole dans le cadre d’une biostimulation très contrôlée. Un

échantillon de la station d’Observation SOLA, habituellement peu soumis aux pollutions

pétrolières, a été mis en présence de pétrole (diesel) dans des conditions non-limitantes en

sels nutritifs maintenues tout au long de l’expérience (15 jours). En comparaison avec un

bac non pollué, l’analyse de l’évolution de la structure des communautés bactériennes

ainsi que leur activité en période de forte prédation et lyse virale avait pour objectif de

déterminer l’effet négatif ou positif du « top-down » sur la biodégradation des

hydrocarbures. Ainsi nous avons pu révéler un contrôle de type « top-down » largement

dominé par les virus ayant pour effet d’importants remaniements des communautés

bactériennes à la fois en termes de biomasse et de structure. Nous avons utilisé la

résolution d’un pyroséquençage massif pour identifier les espèces bactériennes stimulées

par l’apport de pétrole puis sensibles ou résistantes à la prédation par les protozoaires ou

la lyse virale. Certaines groupes bactériens se sont ainsi révélés particulièrement sensibles

60

Changement de

communautés

induit lors du

cycle proie-

prédateur

à la prédation et/ou la lyse virale comme le genre Vibrio, alors que d’autres au contraire

comme Percisivirga, Oleispira et Methylophaga, s’avérèrent résistantes, révélant leur rôle

central dans la dégradation du pétrole dans nos conditions (Figure 26). Finalement la forte

influence des virus n’a pas provoqué de diminution dans la biodégradation des

hydrocarbures par les bactéries puisque la pression de prédation a induit un regain

d’activité globale chez celle-ci. Ce résultat original souligne l’importance de prendre en

compte non seulement le compartiment bactérien mais aussi la boucle microbienne dans

son ensemble pour mieux comprendre le processus de biodégradation des hydrocarbures.

Figure 26 : Evolution de la structure de la communauté par CE-SSCP (en haut) et de la diversité

taxonomique bactérienne par pyroséquençage (au milieu) en relation avec le cycle proie-prédateur

(en bas) dans une expérience de biostimulation après ajout de pétrole. Deux phases distinctes

apparaissent autour du pic d’abondance bactérien.

61

3.3. Exemple d’identification de la diversité associée à une fonction par l’utilisation de

marquage par des isotopes stables : cas des bactéries dégradant les HAP


-ANR-INDHYC (2005-2008): Indicateurs biologiques et chimiques de présence, biotoxicité et

biodégradabilité des hydrocarbures pétroliers (HCP) en milieu aquatique

continental et côtier (PI : Ghiglione JF)


(PI Yakimov M)

-IPEV-MICROBIOKER (2005-2007): Impact écologique des hydrocarbures sur la boucle

microbienne en Antarctique (PI Delille D)



-Ingénierie Ecologique (2009-2010) Indicateurs microbiologiques de contamination par les HAP

(PI : Ghiglione JF)


Rodriguez-Blanco et al. (2010) Int J Syst Evol Microbiol (IF 2.38)

Sauret et Ghiglione (2012) Springer Publishers


Relation

diversité-

fonction : un

enjeu de

l’Ecologie

microbienne

Si les méthodes d’inventaire de la diversité et des changements de structure des

communautés bactériennes a largement évolué depuis les années 1990 jusqu’à nos

jours, elles ne permettent que très rarement de relier la présence de certaines

espèces à une ou plusieurs fonctions. La relation diversité-fonction est un enjeu

majeur de l’Ecologie microbienne. Chez les bactéries, la plupart des fonctions ne

sont pas associées à des groupes phylogénétiques (il existe néanmoins de rares cas

comme par exemple des bactéries nitrifiantes ou sulfato-réductrices). La relation

entre la diversité (sur la base du gène ADNr16S) et la fonction (répartie sur tout le

reste du chromosome) est un des enjeux de la génomique environnementale qui

n’en est aujourd’hui qu’à ses balbutiements.

Actuellement, les bactéries hydrocarbonoclastes sont généralement identifiées

de deux manières :

- soit les bactéries hydrocarbonoclastes sont identifiées en utilisant des milieux

de culture avec comme seule source de carbone un ou plusieurs hydrocarbures.

Voir par exemple notre article qui décrit un nouveau genre bactérien

Gallaecimonas pentaromativorans gen. nov., sp. nov. isolé des sédiments

contaminés par l’accident du Prestige en Galice (Espagne) capable de se

développer sur des HAP de 4 à 5 cycles comme seule source de carbone (dont le

62

Des méthodes

actuellement

peu fiables

DNA-stable

isotope

probing

pyrène et le benzo[a]pyrène) (Rodriguez-Blanco et al. 2010). Dans le cadre du

programme ANR INDHYC (PI JF Ghiglione), nous avons annoté le génome

complet de la bactérie Marinobacter hydrocarbonoclasticus sp17 (séquençage

réalisé par le Génoscope) isolée d’un sédiment chroniquement pollué par le pétrole.

Cette souche présente des caractéristiques remarquables : ubiquiste et halotolérante

(0,08 à 3,5M NaCl), capable de dégrader les alcanes récalcitrants à longue chaîne (C8 à

C40), synthétise un osmoprotectant l’ectoïne et présente la capacité de former des biofilms

spécifiquement à l’interface entre l’eau et les composés organiques hydrophobes tels que

les hydrocarbures (Grimaud et al. 2012). Nous travaillons actuellement sur une puce

d’expression de cette bactérie, en étroite collaboration avec l’équipe environnement

et microbiologie (UMR 5254) de l’Université de Pau. Si ces travaux sur des

modèles bactériens sont essentiels pour identifier les gènes impliqués dans les

processus de dégradation des hydrocarbures, l’approche cultivable reste inadaptée

pour l’étude de la diversité des bactéries hydrocarbonoclastes, puisqu’elle ne

représente qu’une très faible fraction de la communauté hydrocarbonoclaste totale.

- soit on étudie la diversité bactérienne totale sur la base de l’ARNr16S et on

associe la présence de certaines OTUs à la disparition de certains composés

pétroliers en condition contrôlée. Evidemment, même si ces études sont associées à

analyses dites « hypothético-déductives » de type analyses des redondances (RDA)

ou analyse canonique des correspondances (CCA), elles ne permettent pas

d’identifier les bactéries hydrocarbonoclastes de manière fiable.

Une des méthodes privilégiées pour aborder spécifiquement cette question est

depuis quelques années le marquage de l’ADN des communautés bactériennes

d’intérêt par des isotopes stables ou « DNA-Stable Isotope Probing » (DNA-SIP).

Cette technique a été mise au point et employée dans les études en milieu tellurique

depuis une dizaine d’années (Hanson et al. 1999). Paradoxalement, elle a été très

peu utilisée pour l’étude des communautés bactériennes marines du fait de la

difficulté d’appliquer la technique en milieu liquide. Nous avons mis en place une

première étude de DNA-SIP en milieu marin pour l’identification des bactéries

phénanthrène-dégradantes (une molécule indicatrice de HAP, particulièrement

surveillée par l’agence de protection environnementale) (Figure 27).

63

Cycloclasticus

sp., un

exemple

d’espèce rare

qui peut

devenir

dominante

lorsque les

conditions lui

deviennent

favorables

Figure 27. Schéma de la méthode de DNA-stable isotope probing mis en place pour

l’identification des espèces utilisant le phénanthrène. L’eau de mer est incubée pendant 2

jours avec du phénanthrène marqué au 13

C de sorte que l’ADN des cellules ayant utilisé ce

substrat soit marqué au 13

C et soit séparé de l’ADN naturel 12

C par un gradient de densité

au Chlorure de Césium. Les ADN lourds et légers peuvent ensuite être séquencés pour

identifier les espèces ayant utilisé le substrat marqué.

L’expérience de DNA-SIP a été réalisée sur trois échantillons naturels ayant des

niveaux de pollutions pétrolières différents (station d’Observation SOLA de

Banyuls sur mer, station d’Observation SOMLIT de Marseille et un échantillon

prélevé à la sortie d’une raffinerie pétrolière de Fos sur mer). L’analyse des

fractions d’ADN enrichies en 13

C-Phénanthrène a montré que quelle que soit

l’origine de l’échantillon, Cycloclasticus sp. était toujours largement majoritaire. Il

est intéressant de noter que Cycloclasticus sp. n’était pas détectable dans les

échantillons naturels par la technique de pyroséquençage, ce qui renforce

l’importance des espèces rares (fraction de la diversité qui représente moins de

0.001% de la diversité totale) qui agissent comme une banque d’espèces (« seed

bank ») et peuvent devenir dominantes lorsque les conditions leur deviennent

favorables. D’autres espèces moins dominantes (moins de 1% de la diversité

trouvée dans la fraction 13

C) sont spécifiques de chaque environnement

échantillonné. L’analyse de la fraction 12

C a permis d’identifier également un

certain nombre d’espèces tolérantes, telle que le genre Glaciecola sp. qui aurait pu

être identifié comme une bactérie capable de dégrader le phénanthrène par une

approche classique hypothético-déductive. Ce genre a en effet été retrouvé dans

différents environnements pollués par des HAP, et notre étude montre qu’il s’agit

d’une espèce opportuniste des milieux pollués qui ne dégrade pas les HAP.

64

Figure 28 : Identification taxonomique de la contribution relative des OTUs présentes

dans les échantillons naturels et dans les fractions marquées au 12

C et au 13

C après deux

jours d’incubation avec du phénanthrène marqué au 13

C.

65

PROJETS DE RECHERCHE

66

La plupart des projets que je développe ou auxquels je participe dans l’UMR7621 LOMIC

s’inscrivent dans la continuité des projets pour lesquels j’ai présenté les premiers résultats dans

le rapport d’activités. J’ai choisi de vous présenter deux projets financés par différents

programmes qui reflètent les deux thématiques prioritaires que j’ai menées de front depuis

plusieurs années et qui vont encore occuper mes recherches dans les prochaines années.

Projet 1 : Rôle de la diversité microbienne dans la régulation de la transformation de la

matière organique dissoute et particulaire lors d’épisodes de convection et de cascades

d’eaux denses en Mer Méditerranée


Europe HERMIONE-MerMeX CASCADE (2010-2012) – Hotspot Ecosystem Research and

Man’s impact on European Seas (PI X. Durrieu-Demadron) ANR MerMeX-DeWEX (2012-2014)- Impacts des formations d'eau dense sur les écosystèmes

pélagiques Méditerranéens (PI P. Conan) soumis

La Méditerranée

Nord Occidentale

pour étudier les

effets des

changements

climatiques :

programmes

HyMeX et

MerMeX

Comme nous avons pu le voir précédemment, la compréhension du rôle de la

biodiversité bactérienne dans la régulation des flux de carbone dans les Océans

nécessite une approche intégrée des processus biotiques et abiotiques dans

l’écosystème étudié. La participation à des campagnes Océanographiques

multidisciplinaire d’envergure est indispensable pour répondre à cette question.

Deux régions océaniques du monde sont maintenant connues comme

particulièrement sensibles au changement climatique : l’Océan Arctique et la

Méditerranée (Giorgi 2006, IPCC 2007). La Méditerranée doit sa sensibilité à

deux facteurs essentiels : sa structure "fermée" par des seuils de faible

profondeur et un temps de résidence des eaux types de l’ordre de 100 ans,

nettement plus faible que le temps de résidence des eaux de l’océan mondial

(plusieurs milliers d’années). En Méditerranée nord-occidentale, la présence de

convection, moteur de la circulation thermohaline du bassin occidental pourrait

être remise en cause ou au moins significativement réduite sous l’impact de ces

changements. Cela en fait une zone d’intérêt primordial et définit les priorités

des projets HyMeX et MerMeX.

Le phénomène de cascade sous-marine, ou plongées d’eau dense, est un courant

de gravité, où l’eau dense, généralement formée par refroidissement des eaux

67

Le phénomène de

cascades sous-

marines entraîne

des quantités

importantes de

matière

organique

dissoute et

particulaire dans

les eaux

profondes

peu profondes du plateau continental, déborde au niveau de la rupture de pente

et s’écoule le long du talus continental jusqu’à leur niveau d'équilibre

hydrostatique. Ce courant de fond produit un échange irréversible d’eau du

plateau vers le bassin (Figure 29). Ce phénomène, recensé dans plus de 70 sites

à travers le monde, contribue à la ventilation des eaux intermédiaires et

profondes des océans et a un impact important sur les cycles biogéochimiques

en entraînant des quantités importantes de matières minérales et organiques,

dissoutes et particulaire (Ivanov et al., 2004). Des estimations suggèrent que les

quantités de carbone organique à la fois sous forme dissoute et particulaire,

transportées par les plongées d’eau dense pendant l’hiver 2005, dépasse

l’exportation moyenne de carbone par convection estimée pour la mer Ligure

(Sanchez et al., 2009).

Figure 29 : A gauche : Représentation schématique des processus de cascading et de

convection (flèches rouges) dans le golfe de Lion en relation avec les principaux

forçages (flèches jaunes = vents, flèches bleues = hydrodynamisme dont le courant nord

méditerranéen). La région du Cap de Creus et son canyon adjacent est la principale zone

d'exportation des eaux denses formées pendant l’hiver sur le plateau continental du

Golfe du Lion (Méditerranée Nord Occidentale).

A droite : Schéma de la plongée des eaux dense le long de la pente continentale

(facilitation par les canyons) et des mélanges verticaux au sein de la cellule de

convection. Ces processus hivernaux sont provoqués par le refroidissement des eaux de

surface, conjugué à l’augmentation de la salinité suite à l’évaporation engendrée par de

forts vents (mistral et tramontane).

Dans le programme européen HERMIONE, une campagne intitulée CASCADE

(CAscading, Surge, Convection, Advection and Downwelling Events) a été

réalisée en Mars 2011. Cette campagne avait pour objectif de caractériser

l'impact des plongées d'eaux denses sur les échanges côte-large de matière, en

particulier de carbone et de contaminants, et sur les perturbations

68

Importance des

microorganismes

dans la

transformation

de la MOD et de

la MOP

transportée dans

les cascades

d’eaux denses

environnementales des écosystèmes profonds, en particulier au niveau des

canyons sous-marins. Des phénomènes de cascade d’eau dense et de convection

ont pu être clairement caractérisés lors de cette campagne. Notre objectif

particulier était d’estimer le rôle de la diversité des microorganismes libres et

attachés aux particules dans la régulation des taux de reminéralisation de la

matière organique dissoute (MOD) et particulaire (MOP) lors de phénomènes de

plongées d’eaux denses. Cet objectif sera également suivi dans le cadre du

programme DEWEX financé par MERMEX (Etude du rôle de la formation

d'eau profonde dans les bilans et la composition chimique de la matière en

Méditérranée), dont les campagnes sont prévues en Février 2013 (période de

formation des eaux denses) et Avril 2013 (période de bloom printannier). Je co-

encadre actuellement une étudiante en thèse (Tatiana Severin 2011-2013) sur ce

sujet.

Projet 2 : Etude écotoxicologique des eaux littorales Supports programmatiques relatifs à cette partie:

EUROPE-AAMP-VERMEILLECOTOX (2012-2013) Etude pluridisciplinaire et spatio-

temporelle des apports de contaminants et de la qualité

Ecotoxicologique sur le littoral de la côte Vermeille (PI JF Ghiglione)

EC2CO-BERTOX (2010-2012) Etude Ecotoxicologique de l’Etang de Berre

(PI O. Radakovitch)

L’Ecotoxicologie

au service de la

protection des

milieux aquatiques

Enjeu écologique et sociétal majeur de ce début de siècle, la protection et la

restauration des milieux aquatiques font l’objet d’évolutions réglementaires

volontaristes, portées au niveau européen par la directive cadre sur l’eau

(DCE) de 2000 pour la surveillance de la qualité des masses d’eau, ou la

règlementation REACH de 2005 sur les substances chimiques. Ces enjeux de

gestion exigent une compréhension accrue du devenir et des impacts des

substances au sein des écosystèmes aquatiques, base de l’Ecotoxicologie

(Lascombe et al. 2008). L’Ecotoxicologie est la science qui étudie le

comportement et les effets toxiques d’agents d’origines anthropiques sur les

écosystèmes. Elle est une discipline phare de la directive cadre stratégie pour

le milieu marin 2008/56/CE, dont le prolongement à l’échelle nationale se

trouve dans le Grenelle de la mer (Livre Bleu, 2009).

Suite au récent rapport du groupe de travail sur la stratégie nationale de

69

Le programme

VERMEILLECOTOX

(PI : JF Ghiglione)

fédérateur des

compétences des

trois UMR de

l’OOB (Banyuls),

du CAMP

(Perpignan) et du

MIO (Marseille)

La Côte Vermeille

comme site atelier

de la qualité

écotoxicologique

des eaux littorales

dans le nouveau

Parc Marin du

Golfe du Lion

recherche en Toxicologie et Ecotoxicologie (2010), j’ai pris un rôle actif dans

le Pôle Tox-Ecotox Sud-Est qui a été créé en 2011. De cette concertation est

né en Mars 2012 le programme VERMEILLECOTOX (PI : JF Ghiglione), qui

est financé par la communauté européenne et l’Agence des Aires Marines

Protégées. Ce programme est fédérateur des compétences des trois UMR de

l’Observatoire Océanologique de Banyuls (LOMIC, BIOM, LECOB), du

CAMP (Centre d’Analyse Méditerranée de Perpignan) et du MIO (Centre

d’Océanologie de Marseille).

L’objectif général de ce projet est de fournir des outils d’évaluation du risque

lié aux apports de contaminants (chimiques, biologiques et nutriments)

déversés sur la côte Vermeille pour définir des mesures de gestion durable de

diminution des risques adaptées à une échelle locale (Figure 30). Il propose de

compléter localement les travaux réalisés dans le cadre de la campagne DCE

2012 sur le district « Rhône et côtiers Méditerranéens »:

(i) en définissant la Côte Vermeille comme un site atelier pour réaliser un

échantillonnage intensif permettant de mieux prendre en compte les

particularités locales de la zone. Dans ce site classé de « qualité écologique et

chimique moyenne » par la dernière campagne DCE menée en 2009, ce projet

propose un échantillonnage mensuel ou plus ponctuel en fonction

d’événements remarquables locaux (changements d’usages – période de

traitement des vignes, de carénage de bateaux, afflux touristique – ou

événements remarquables, crues) de plus de 100 échantillons collectés aux

stations de la DCE mais aussi à 2 stations d’épurations, à l’embouchure de 2

rivières et dans 2 ports. Un tel suivi spatial et temporel garantit une meilleure

prise en compte des usages locaux, des apports de contaminants et de la qualité

écologique du milieu.

(ii) en apportant des outils complémentaires permettant d’obtenir une

information cohérente sur l’état Ecotoxicologique du milieu. Ce projet propose

de mettre en place des outils d’évaluation de l’exposition aux contaminants,

des outils d’évaluation du danger et des outils d’évaluation des effets qui

permettront un meilleur diagnostic des risques et donc une meilleure définition

des mesures de gestion à engager pour les réduire à court et à long terme. Ce

projet a été intégré dans une politique nationale sur la qualité des eaux de

70

rejets en mer menée par l’Agence des Aires Marines Protégées et dans une

politique au niveau Européen par la DCE et le Fond Européen pour la Pêche.

Cette action suivie localement par le Parc Marin du Golfe du Lion assure une

prise en compte des résultats de ce projet pour l’élaboration de mesures de

gestion locales.

Figure 30. Schéma de stratégie de réduction les risques proposé dans le programme

VERMEILLECOTOX à partir d’outils de diagnostics reposant sur les mesures d’exposition, de danger

et d’effets sur le milieu.

Programme

BERTOX :

étude de la qualité

écotoxicologique de

l’Etang de Berre

Une approche similaire est utilisée dans l’Etang de Berre dans le programme

EC2CO-BERTOX (PI : O. Radakovitch). Deuxième bassin industriel de

France, le complexe lagunaire de Berre et a été soumis à trois grands forçages:

un apport important de métaux lourds et d’hydrocarbures, une modification de

son hydrologie suite aux apports depuis 1966 d’eaux douces et limons par un

canal EDF et une eutrophisation parfois importante induite par des apports de

sels nutritifs. Ces forçages ont entraîné une altération complète de

l’écosystème et une diminution drastique des espèces : poissons,

phanérogames et macrofaune benthique. Le programme BERTOX vise à

71

améliorer la connaissance des liens entre contaminants, dynamiques

biogéochimiques des sédiments et impacts sur la macro- et microfaune

benthique ainsi que les herbiers par une approche de terrain intégrant les

échelles spatio-temporelles de sédiments côtiers. Développé sur deux sites

d’une lagune Méditerranéenne impactée dès les années 1950 par des apports

de contaminants et sur un site de contrôle donnant accès au pool régional

d’espèces (ainsi qu’à une des dernières zones de développement de Zostera

noltii) ce programme a pour objectifs de:

1) Définir, grâce à un suivi saisonnier, les interactions entre les dynamiques

des communautés macrofaunistiques et microbiennes du sédiment ainsi que les

herbiers, les facteurs physico-chimiques des eaux porales (oxygène, redox, pH,

nutriments, ETM) et les gradients verticaux de sédimentation et de

bioturbation.

2) Préciser l’influence de contaminants présents dans le sédiment (HAPs,

PCBs, ETM) sur ces interactions et dynamiques en étudiant : 1) l’influence de

la diversité taxonomique et fonctionnelle des microorganismes sur la

biodisponibilité et la toxicité des sédiments 2) la santé et l’aptitude (fitness)

d’espèces sentinelles de la macrofaune ; 3) la spéciation et disponibilité de ces

contaminants ; 4) l’évolution de différents biomarqueurs de dommage et de

défense et 5) l’activité génotoxique des sédiments.

72

73

Références bibliographiques

citées dans le document

74

Acinas, S. G., Rodriguez-Valera, F., and Pedros-Alio, C. (1997). Spatial and temporal

variation in marine bacterioplankton diversity as shown by RFLP fingerprinting of

PCR amplified 16S rDNA. FEMS Microbiology Ecology 24:27–40.

Alonso-Sáez, L., Balaguk, V., Sa, E., Sanchez, O., Gonzalez, J.M., Pinhassi, J., et al. (2007)

Seasonality in bacterial diversity in north-west Mediterranean coastal waters :

assessment through clone libraries, fingerprinting and FISH. FEMS Microbiol Ecol

60: 98–112.

Atlas, R. M. (1981). Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental

perspective. Microbiological Reviews 45(1): 180-209.

Avaniss-Aghajani,E.K. et al. (1994) A molecular technique for identification of bacteria using

small subunit ribosomal RNA sequences. BioTechniques, 17, 144–149.

Azam, F., T. Fenchel, et al. (1983). The ecological role of water-column microbes in the sea.

Marine Ecology Progress Series 10: 257-263.

Cho, B.C., and Azam, F. (1990) Biogeochemical significance of bacterial biomass in the

ocean’s euphotic zone, Mar. Ecol. Prog. Ser., 63, 253-259.

Connon, S.A., and Giovannoni, S.J. (2002) High-throughput methods for culturing

microorganisms in very-low-nutrient media yield diverse new marine isolates. Appl

Environ Microbiol 68: 3878–3885.

Cottrell MT, Kirchman DL (2004) Single-cell analysis of bacterial growth, cell size, and

community structure in the Delaware estuary. Aquat. Microb. Ecol. 34:139-149

Dorigo, U., L. Volatier, et al. (2005). Molecular approaches to the assessment of biodiversity

in aquatic microbial communities. Water Research 39(11): 2207-2218.

Ducklow, H. W (1983). Production and fate of bacteria in the oceans. Bioscience 33 (8): 494-

501.

Fenchel T, Finlay B.J 2004 The ubiquity of small species: patterns of local and global

diversity. BioScience. 54, 777–784.

Fokin SI. 2000. Professor WT Schewiakoff: Life and science. Protist 151:181–189.

Fuhrman, J. A., I. Hewson, et al. (2006). Annually reoccurring bacterial communities are

predictable from ocean conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences

103(35): 13104-13109.

Giere O. 1993.Meiobenthology. Berlin: Springer-Verlag.

Gilbert, J.A., Field, D., Swift, P., Newbold, L., Oliver, A., Smyth, T., et al. (2009) The

seasonal structure of microbial communities in the Western English Channel. Environ

Microbiol 11: 3132–3139.

Gilbert JA, Steele J, Caporaso JG, Steinbruck L, Somerfield PJ, Reeder J, Temperton B, Huse

S, Joint I, McHardy AC, Knight R, Fuhrman JA, Field D. 2012. Defining seasonal

marine microbial community dynamics. ISME J. 6, 298-308.

Giorgi, F. (2006) Climate change Hot‐Spots. Geophysical Research Letters 33 (L08707)

10.1029/2006GL025734IPCC 2007

Giovannoni, S. J., T. B. Britschgi, et al. (1990). Genetic diversity in Sargasso Sea

bacterioplankton. Nature 345: 60-63.

Giovannoni SJ, Rappé M (2000) Evolution, diversity and molecular ecology of marine

prokaryotes. In: Kirchman DL (ed) Microbial ecology of the oceans, Wiley Liss, New

York, p 47–48.

Godon, J.-J., Zumstein, E., Dabert, P., Habouzit, F., and Moletta, R. 1997. Molecular

microbial diversity of an anaerobic digestor as determined by Small-Subunit rDNA

sequence analysis. Applied and Environmental Microbiology, 63(7):2802-2813.

Hanson, J. R., J. L. Macalady, et al. (1999). Linking toluene degradation with specific

microbial populations in soil. Applied and Environmental Microbiology 65(12): 5403-

5408.

75

Head, I. M., D. M. Jones, et al. (2006). Marine microorganisms make a meal of oil. Nature

Reviews Microbiology 4: 173-182.

Head, I. M. and R. P. J. Swannell (1999). Bioremediation of petroleum hydrocarbon

contaminants in marine habitats. Current Opinion in Biotechnology 10(3): 234-239.

Hillebrand H, Azovsky AT. 2001. Body size determines the strength of the latitudinal

diversity gradient. Ecography 24: 251–256.

Hong, H., A. Pruden, et al. (2007). Comparison of CE-SSCP and DGGE for monitoring a

complex microbial community remediating mine drainage. Journal of Microbiological

Methods 69: 52-64.

Ivanov, V. V., Shapiro, G. I., Huthnance, J.M., Aleynik, D.L., Golovin, P.N. (2004). Cascades

of dense water around the world ocean. Progress In Oceanography 60(1): 47-98.

Kirchman, D., E. K'Nees, et al. (1985). Leucine incorporation and its potential as a measure of

protein synthesis by bacteria in natural aquatic systems. Appl. Environ. Microbiol.

49(3): 599-607.

Le Livre Bleu des engagements du Grenelle de la Mer, 07/2009

http://www.legrenelleenvironnement.fr/IMG/pdf/LIVRE_BLEU_Grenelle_Mer.pdf

Lee SH, Fuhrman JA (1991) Spatial and temporal variation of natural bacterioplankton

assemblages studied by total genomic DNA cross-hybridization. Limnol Oceanogr

36:1277-1287

Lee, D. H., Y. G. Zo, et al. (1996). Nonradioactive method to study genetic profiles of natural

bacterial communities by PCR-single-strand-conformation polymorphism. Applied

and Environmental Microbiology 62(9): 3112-3120.

Liu WT, Marsh TL, Cheng H & Forney LJ (1997) Characterization of microbial diversity by

determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding

16S rRNA. Appl Environ Microbiol 63: 4516–4522.

Margulies, M., M. Egholm, et al. (2005). Genome sequencing in microfabricated high-density

picolitre reactors. Nature 437(7057): 376-380.

Moeseneder, M., Winter, C., and Herndl, G. (2001). Horizontal and vertical complexity of

attached and free-living bacteria of the eastern Mediterranean Sea, as determined by

16S rDNA and 16S rRNA fingerprints. Limnology and Oceanography 46:95-107.

Murray, A. E., C. M. Preston, et al. (1998). Seasonal and spatial variability of bacterial and

archaeal assemblages in the coastal waters near Anvers Island, Antarctica. Applied

and Environmental Microbiology 64(7): 2585-2596.

Muyzer, G., De Waal, E.C., and Uitterlinden, A.G. 1993. Profiling of complex microbial

populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain

reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 59: 695-

700.

Muyzer G, Smalla K (1998) Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)

and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Antonie

van Leeuwenhoek 73:127-141Pomeroy, L. R. (1974). The ocean's food web, a

changing paradigm, JSTOR: 499-504.

Osborn AM, Moore ERB & Timmis KN (2000) An evaluation of terminal-restriction

fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis for the study of microbial

community structure and dynamics. Environ Microbiol 2: 39–50.

Prince, R. C. (2005). The microbiology of marine oil spill bioremediation. Petroleum

microbiology: 317-336.

Poulsen, L. K., Ballard, G. and Stahl, D. A. (1993). Use of rRNA fluorescence in situ

hybridization for measuring the activity of single cells in young and established

biofilms. Applied and Environmental Microbiology 59: 1354–1360.

76

Ranjard, L., D. P. H. Lejon, et al. (2003). Sampling strategy in molecular microbial ecology:

influence of soil sample size on DNA fingerprinting analysis of fungal and bacterial

communities. Environmental Microbiology 5(11): 1111-1120.

Riemann, L. (1999). Bacterial community composition during two consecutive NE Monsoon

periods in the Arabian Sea studied by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)

of rRNA genes. Deep Sea Research Part II: Topical Studies in Oceanography 46(8-9):

1791-1811.

Rogers, Y. H. and J. C. Venter (2005). Massively parallel sequencing. Nature 437(7057):

326–327.

Sanchez-Gomez, E., Somot, S., Pasqual, C., Kerherve, P., Calafat, A., Heussner, S.,

Palanques, A., Durrieu de Madron, X., Canals, M., and Puig, P . (2009). Future

changes in the Mediterranean water budget projected by an ensemble of regional

climate models. Geophysical Research Letters 36(21): L21401. American Geophysical

Union 75:217-221.

Sanger F., Nicklen S. and Chase A.R. 1977. DNA Sequencing with Chain Terminating

Inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74(12): 5463 – 5468

Schauer, M., V. Balagué, et al. (2003). Seasonal changes in the taxonomic composition of

bacterioplankton in a coastal oligotrophic system. Aquatic microbial ecology 31(2):

163-174.

Simon M, Grossart HP, Schweitzer B, Ploug H (2002) Microbial ecology of organic

aggregates in aquatic systems. Aquat Microb Ecol 28:175–211

Smalla K, Oros-Sichler M, Milling A, Heuer H, Baumgarte S, Becker R, Neuber G, Kropf S,

Ulrich A, Tebbe CC (2007) Bacterial diversity of soils assessed by DGGE, T-RFLP

and SSCP fingerprints of PCR-amplified 16S rRNA gene fragments: Do the different

methods provide similar results? Journal of Microbiological Methods 69:470-479

Sogin, M.L., Morrison, H.G., Huber, J.A., Welch, D.M., Huse, S.M., Neal, P.R. et al. (2006)

Microbial diversity in the deep sea and the underexplored rare biosphere. P Nat Acad

Sci USA 103: 12115-12120.

Staley, J. T. and A. Konopka (1985). Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic

microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annual Reviews in Microbiology

39(1): 321-346.

Stackebrandt, E. and Goebel, B.M. (1994) Taxonomic note: A place for DNA-DNA

reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species de¢nition in

bacteriology. Int. J. Syst. Bacteriol. 44, 846-849.

Ter Braak, C.J.F. (1986) Canonical correspondence analysis: a new eigenvector technique for

multivariate direct gradient analysis, Ecology, 67: 1167-1179.

Troussellier, M., Schäfer, H., Batailler, N., Bernard, L., Courties, C., Lebaron, P., Muyzer, G.,

Servais, P., and Vives-Rego, J. (2002). Bacterial activity and genetic richness along an

estuarine gradient (Rhone River plums, France). Aquatic Microbial Ecology 28:13–24.

Wu, D., P. Hugenholtz, et al. (2009). A phylogeny-driven genomic encyclopaedia of Bacteria

and Archaea. Nature 462(7276): 1056-1060.

77

ANNEXES

78

ANNEXE 1- CURRICULUM VITAE

GHIGLIONE Jean-François

Chargé de Recherche 1ère

classe (prise de fonction Sept. 2001, promotion CR1 Nov. 2006,

échelon 6)

Né le 19/06/1971 à Nice (06)

Marié, un enfant

Adresse : Observatoire Océanologique de Banyuls - Laboratoire Arago – Université Paris 6 -

Laboratoire d’Océanographie Microbienne UMR7621 - 66651 Banyuls-sur-mer cedex, France

Tél.: (33) 4 68 88 73 16; Fax: (33) 4 68 88 73 98; Courriel: [email protected]

___________________________________________________________________________

1.1. Diplômes universitaires

1992 DEUG Biologie, Université Paris 6

1994 Licence de Biochimie, Université Paris 6

1995 Maîtrise de Biochimie, Université Paris 6 mention assez bien

1996 DEA Ecologie Microbienne, Université de Lyon I major de promotion

2000 Doctorat Ecologie Microbienne, Université Lyon I mention très honorable

1.2. Stages pré- et post-doctoraux

Stage pré-doctoral (Master 2): 6 mois (1996) Observatoire Océanologique de Banyuls –

Université Paris 6 – Dirigé par P. Lebaron

Stage post-doctoral : 1 an (2000-2001) Bourse européenne Marie-Curie – Financement des

recherches dans le cadre du programme Européen MATBIOPOL - Université de Jérusalem

(Israël) – Dirigé par Y. Cohen

1.3. Encadrement d’étudiants et de jeunes chercheurs

Co-direction de 3 thèses (1) Rodriguez-Blanco Arturo – Financement : bourse ministérielle – Université Paris 6.

Soutenue le 25 Mai 2009, à Banyuls sur mer (directeur D. Delille, co-directeur JF

Ghiglione)

(2) Sauret Caroline – Financement: bourse docteur-ingénieur du CNRS. Soutenue le 15

Décembre 2011, à Banyuls sur mer (directeur D. Delille, co-directeur JF Ghiglione)

(3) Severin Tatiana - Financement : bourse ministérielle – Université Paris 6. Début de

thèse Septembre 2011 (directeur P. Conan, co-directeur JF Ghiglione)

Encadrement ou co-encadrement de 5 post-doctorants :

(1) Bottjer D – Financement ANR-CHACCRA, 18 mois (2008-2009)

(2) Miranda-Tello E – Financement Université El Colegio de la Frontera Sur (ECOSUR)

Mexique, 4 mois (2009)

(3) Ortega E – Financement ANR-MALINA, 24 mois (2009-2011)

(4) Sauret C – Financement DGA, 11 mois (2012)

(5) A recruter – Financement EUROPE 12 mois (2013)

Encadrement de 9 stages de Master 1 et 2, BTS, ou Ecole d’ingénieur: (1) Emonet Sébastien – Stage de Master 2 - Université Paris 6 (2001)

79

(2) Persohn Cécile – Stage de 2ème

année de technicien supérieur de la mer CNAM (2002)

(3) Lami Raphaël – Stage de Master 2 - Université Paris 6 (2004)

(4) Denkwitz Léa - Stage de Master 2 - Université Paris 6 (2005)

(5) Auffrey Marc - Stage de Master 1 - Université Paris 6 (2006)

(6) Sauret Caroline - Stage de Master 2 - Université Paris 6 (2008)

(7) Krieger Jean-Philippe – Stage de 2ème

année école d’ingénieur AgroParisTech (2009)

(8) Dumas Chloé - Stage de Master 2 - Université Paris 6 (2010)

(9) Agab M - Stage de Master 2 - Université Paris 6 (2011)

1.4. Responsabilités de recherche, activité d’enseignement et responsabilités

administratives :

Responsabilités de recherche :

- Responsable de l’équipe Qualité écologique des eaux littorales de l’UMR 7621 de 2004 à

2009.

-Coordinateur de 5 projets nationaux (dont un projet ANR et un cofinancement Européen) et

de 1 projet international.

-Participation à 18 projets nationaux (dont 4 projets ANR) et à 7 projets internationaux (dont

4 projets Européens) avec un total de 235 jours de mission en mer (11 campagnes

océanographiques)

-Organisateur du Symposium on single-cell analysis of planktonic microbes (2005)

-Organisateur du stage de formation à l’habilitation de chef de plongée scientifique du CNRS

(2005)

-Participation à 5 jurys de thèse (Horry H, Coulon F, Pineau S, Duflos M, Berjeb L)

-Travaux d'expertise pour l’AERES, l'ANR et pour d'autres programmes nationaux (INSU-

EC2C0, Ministère Ecologie-LITEAU).

-Travaux d’expertise pour des revues scientifiques de rang A (Aquatic Microbial Ecology,

Microbial Ecology, Molecular Ecology, Marine Ecology Progress Series, Microbial

Biotechnology) – avis sur plus de 15 articles scientifiques

Activités d’enseignement:

1996-1999 Monitorat de l'Enseignement Supérieur, Université Lyon I (192 heures éq. TD)

1999-2000 Attaché Temporaire de l'Enseignement Supérieur, Université Lyon I (192 heures

éq. TD)

2001-2011 Cours, TP, TD d’Ecologie microbienne et de Biologie moléculaire pour des

étudiants de master 1 et 2 de l’Université Paris 6 et de l’Université de Perpignan

(~110 heures éq. TD (~10 heures par an depuis 2001)

Responsabilités administratives:

- Membre élu au conseil d'administration (collège B) de l'Observatoire Océanologique de

Banyuls, Université Paris 6, conseil de l'UFR 938 de 2005 à 2008

- Correspondant formation du CNRS de 2003 à 2007

80

81

ANNEXE 2- DIFFUSION DU TRAVAIL

1. Articles scientifiques à comité de lecture (rang A)

1.1. Rapport de citations selon Web of Knowledge (http://apps.webofknowledge.com):

-Nombre total de publication trouvée sur Web of Knowledge : 27 (2 articles sont en cours

de publication).

-Nombre total de citation : 243

-Moyenne des citations par article : 9.35

-h-index : 10

1.2. Liste des articles publiés ou sous presse.

29 articles publiés dont 8 en premier auteur, 9 en deuxième auteur et 4 en dernier auteur.

Pour chaque revue, le facteur d’impact (IF) est indiqué entre parenthèses

(facteur d’impact moyen= 2.96).

1. Lebaron P, Ghiglione JF, Fajon C, Batailler N, Normand P (1998) Phenotypic and

genetic diversity within a colony morphotype. FEMS Microbiology Letters (IF 2.27), 160:

137-143.

2. Clays-Josserand A, Ghiglione JF, Philippot L, Lemanceau P, Lensi R (1999) Effect of

soil type and plant species on the fluorescent pseudomonads nitrate dissimilating community.

Plant and Soil (IF 1.99), 209: 275-282.

3. Ghiglione JF, Philippot L, Normand P, Lensi R, Potier P (1999) Disruption of narG, the

gene encoding the catalytic subunit of the respiratory nitrate reductase A, also affects nitrite

respiration in Pseudomonas fluorescens YT101. Journal of Bacteriology (IF 3.64), 181:

5099-5102.

4. Ghiglione JF, Gourbière F, Potier P, Philippot L, Lensi R (2000) Role of the respiratory

nitrate reductase in ability of Pseudomonas fluorescens YT101 to colonize the rhizosphere of

maize. Applied and Environmental Microbiology (IF 3.80), 66: 4012-4016.

5. Ghiglione JF, Richaume A, Philippot L, Lensi R (2002) Relative involvement of nitrate

and nitrite reduction in the competitiveness of Pseudomonas fluorescens in the rhizosphere of

maize under non-limiting nitrate conditions. FEMS Microbiology Ecology (IF 3.34), 39:

121-127.

82

6. Ghiglione JF, Larcher M, Lebaron P. (2005) Spatial and temporal variation scales of

bacterioplankton community structure in NW Mediterranean Sea. Aquatic Microbial

Ecology (IF 2.38), 40:229-240.

7. Ghiglione JF, Mevel G, Pujo-Pay M, Mousseau L, Lebaron P and Goutx M (2007) Diel

and seasonal variations in abundance, activity, and community structure of particle-attached

and free-living bacteria in NW Mediterranean Sea. Microbial Ecology (IF 2.89), 54:217-231

8. Abboudi M, Jeffrey WH, Ghiglione JF, Pujo-Pay M, Oriol L, Sempéré R, Charrière B,

Joux F (2008) Effects of photochemical transformations of dissolved organic matter on

bacterial metabolism and diversity in three contrasting coastal sites in the Nothwestern

Meditteranean Sea. Microbial Ecology (IF 2.89), 55: 344-357

9. Mével G, Vernet M, Goutx M and Ghiglione JF (2008) Seasonal to hour variation scales

in abundance and production of total and particle-attached bacteria in the open NW

Mediterranean Sea (0–1000 m). Biogeosciences (IF 3.45), 5, 1573-1586

10. Ghiglione JF, Palacios C, Marty JC, Mével G, Labrune C, Conan P, Pujo-Pay M, Garcia

N and Goutx M (2008) Role of environmental factors for the vertical distribution (0-1000 m)

of marine bacterial communities in the NW Mediterranean Sea. Biogeosciences (IF 3.45), 5:

1751-1764.

11. Rodriguez-Blanco A, Ghiglione JF, Catala P, Casamayor EO, Lebaron P (2009) Spatial

comparison of total vs. active bacterial populations by coupling genetic fingerprinting and

clone library analyses in NW Mediterranean Sea. FEMS Microbiol Ecol (IF 3.35) 67: 30–42

12. Lami R, Ghiglione JF, Desdevises Y, West NJ, Lebaron P (2009) Annual patterns of

presence and activity of marine bacteria monitored by 16S rDNA–16S rRNA fingerprints in

the coastal NW Mediterranean Sea. Aquatic Microbial Ecology (IF 2.38) 54:199-210

13. Van Wambeke F, Ghiglione JF, Nedoma J, Mével G, Raimbault P (2009) Bottom up

effects on bacterioplankton growth and composition during summer-autumn transition in the

open NW Mediterranean Sea. Biogeosciences (IF 3.45), 6: 705–720.

14. Goutx M., Guigue C., Aritio D., Ghiglione J.F., Pujo-Pay M., Raybaud V., Duflos M.,

and Prieur L. (2009) Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the

Ligurian sea (NW Mediterranean). Biogeosciences (IF 3.45), 6: 1229-1246.

15. Bourguet N, Goutx M, Ghiglione JF, Pujo-Pay M, Mevel G, Momzikoff A, Mousseau L,

Guigue C, Garcia N, Raimbault P, Pete R, Oriol L and Lefèvre D (2009) Lipid biomarkers

and bacterial lipase activities as indicators of organic matter and bacterial dynamics in

contrasted regimes at the DYFAMED site, NW Mediterranean. Deep Sea Research II (IF

2.17), 56, 1454–1469.

16. Ghiglione JF, Conan P, Pujo-Pay M (2009) Diversity of total and active free-living vs.

particle-attached bacteria in the euphotic zone of the NW Mediterranean Sea. FEMS

Microbiology Letters (IF 2.27), 299: 9–21.

17. Delille D., Pelletier E, Duval A, Rodríguez-Blanco A, Ghiglione

JF (2009) Effects of

nutrient and temperature on degradation of petroleum hydrocarbons in subAntarctic

seawater. Polar Biology (IF 1.51) 32:1521–1528.

18. Rodríguez-Blanco A, Vetion G, Escande ML, Delille D,

Ghiglione

JF (2010)

Gallaecimonas pentaromativorans gen. nov., sp. nov., a novel bacterium carrying 16S rDNA

heterogeneity able to degrade high-molecular-weigh polycyclic aromatic hydrocarbons.

International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IF 2.38) 60: 504–509.

83

19. Rodríguez-Blanco A, Antoine V, Pelletier E, Delille D, Ghiglione

JF (2010) Effects of

temperature and fertilization on total vs. active bacterial communities exposed to crude and

diesel oil pollution in NW Mediterranean Sea. Environmental pollution (IF 3.62), 158: 663–

673.

20. Robinson C, Steinberg DK, Anderson TR, Aristegui J, Carlson CA, Frost JR, Ghiglione

JF, Robison BH, Tamburini C, Tanaka T, Wishner KF, Zhang J (2010) Mesopelagic zone

ecology and biogeochemistry – a synthesis. Deep Sea Research Part II (IF 2.17), 57: 1504-

1518.

21. Berdjeb L, Ghiglione JF, Domaizon I, Jacquet S (2011) A two-year assessment of the

main environmental factors driving the free-living bacterial community structure in Lake

Bourget (France). Microbial Ecology (IF 2.89), 61:941–954

22. Berdjeb L, Ghiglione JF, Jacquet S (2011) Bottom-up versus top-down control of hypo-

and epilimnion free-living bacterial community structure in two neighbouring freshwater

lakes. Applied and Environmental Microbiology (IF 3.80), 77: 3591 – 3599

23. Pujo-Pay M, Conan P, Oriol L, Cornet-Barthaux V, Falco C, Ghiglione JF, Goyet C,

Moutin T, L Prieur (2011) Integrated survey of elemental stoichiometry (C, N, P) from the

western to eastern Mediterranean Sea. Biogeosciences (IF 3.45), 8: 883–899.

24. Durrieu de Madron X, Guieu C, Sempéré R, Conan P, Cossa D, D'Ortenzio F, Estournel

C, Gazeau F, Rabouille C, Stemmann L, Bonnet S, Diaz F, Koubbi P, Radakovitch O, Babin

M, Baklouti M, Bancon-Montigny C, Belviso S, Bensoussan N, Bonsang B, Bouloubassi I,

Brunet C, Cadiou JF, Carlotti F, Chami M, Charmasson S, Charrière B, Dachs J, Doxaran D,

Dutay JC, Elbaz-Poulichet F, Eléaume M, Eyrolles F, Fernandez C, Fowler S, Francour P,

Gaertner JC, Galzin R, Gasparini S, Ghiglione JF et al. (2011) Marine Ecosystems responses

to climatic and anthropogenic forcings in the Mediterranean. Progress in Oceanography (IF

3.27), 91:97-166

25. Ducklow HW, Myers KMS, Erickson M, Ghiglione JF, Murray AE (2011) Response of

a summertime Antarctic marine bacterial community to glucose and ammonium enrichment.

Aquatic Microbial Ecology (IF 2.38), 64: 205–220.

26. Ortega-Retuerta E, Jeffrey WH, Ghiglione JF, Joux F (2012) Evidence of heterotrophic

prokaryotic activity limitation by nitrogen in the Western Arctic Ocean during summer.

Polar Biology (IF 1.51) 35:785–794

27. Ghiglione JF & Murray A (2012) Pronounced summer to winter differences and higher

wintertime richness in coastal sub-Antarctic and Antarctic marine bacterioplankton

Environmental Microbiology (IF 4.91) 14:617-629

28. Marty F, Ghiglione JF, Paisse S, Gueuné H, Quillet L, van Loosdrechta MCM and

Muyzer G (2012) Evaluation and optimization of nucleic acid extraction methods for the

molecular analysis of bacterial communities associated with corroded carbon steel.

Biofouling (IF 3.33), In press

29. Grimaud R, Ghiglione JF, Cagnon C, Lauga B, Vaysse PJ, Rodriguez-Blanco A,

Mangenot S, Cruveiller S, Barbe V, Duran R, Wu LF, Talla E, Bonin P, and Michotey V

(2012) Genome sequence of the marine bacterium Marinobacter hydrocarbonoclasticus SP17

which forms biofilms on hydrophobic organic compounds Journal of Bacteriology (IF 3.72)

in press

84

2- Chapitres d’ouvrages

3 chapitres d’ouvrages internationaux

1. Lebaron P, Fajon C, Ghiglione JF, Batailler N, Cauwet G (1996) Diversity and metabolic

properties of aggregate-attached vs free-living heterotrophic culturable cells in marine

bacterial assemblages in the North Adriatic Sea. In : Hopkins, Artegiani, Cauwet, Degobbis,

Malej (Eds). Ecosystem Research Reports Series - The Adriatic Sea -EU/Environment,

Brussels, 1998, 289-296.

2. Pulido-Villena E, Ghiglione JF, Ortega-Retuerta E, Zohary T and Van-Wambeke F

Bacterial activity and community composition in the Mediterranean Sea – a review. In Life in

the Mediterranean Sea: A look at habitat changes. Nova Science Publishers, Inc., accepted

https://www.novapublishers.com/catalog/product_info.php?products_id=21851

3. Sauret C & Ghiglione JF. Monitoring of oil-degrading bacteria by stable isotope probing.

In Comprehensive Handbook (or Practical Guide) of ecotoxicological terms (Férard, J.F. and

Blaise, C., editors). Springer Publishers, Dordrecht, The Netherlands.

3- Congrès nationaux et internationaux

28 présentations à des congrès internationaux et 10 présentations à des congrès nationaux.

Seules les présentations à des congrès internationaux sont présentées ici:

Congrès internationaux :

1. Third national meeting of Israeli Microbial Ecologists, Mars 2001. Jerusalem

(Israël) J.F. Ghiglione, D. Eisenstadt, I. Primor, E. Meshorer, Z. Aizenshtat, and Y. Cohen.

Role of hypersaline microbial mat in the bioremediation of oil pollution.

2. 37th CIESM congress proceedings –7 to 11th

, June 2004 – Barcelona (Spain) J.F.

Ghiglione, M. Larcher, S. Emonet, P. Lebaron. Spatial and temporal scales for the monitoring

of bacterial community structure in coastal ecosystems. Oral communication

3. European Geosciences Union (EGU), General Assembly, 24-29 April 2005,

Vienna (Autriche) Goutx M., N. Bourguet, J.F. Ghiglione, M. Pujo-Pay, G. Mevel, A.

Momzikoff, P. Raimbault, Lefèvre, V. Andersen, 2005. Bacterial activities and community

structure interactions with organic matter dynamics at diel scale and during seasonal

stratification in the NW Mediterranean. CD Geophysical Research Abstracts. Vol 7, 2005.

4. The 9th Symposium on Aquatic Microbial Ecology – SAME 9 –21-26th August

2005 – Helsinki (Finland) J.F. Ghiglione, G. Mevel, M. Pujo-Pay, P. Lebaron, M. Goutx. Diel

and seasonal variations in abundance, production and community structure of free-living and

particle-attached bacteria in NW Mediterranean water column (0-1000m). Poster.

5. The 9th Symposium on Aquatic Microbial Ecology – SAME 9 – August 21-26th

October 2005 – Helsinki (Finland) J.F. Ghiglione, M. Larcher, R. Lami, P. Lebaron. Spatial

and temporal scales for the monitoring of bacterial community structure in NW

Mediterranean Sea. Poster

6. International Society for Microbial Ecology (ISME-11). 17-22 Août 2006. Vienne,

Autriche.Rodriguez-Blanco A., Thouand G., Delille D., J.F. Ghiglione. Bacterial biosensors

for the monitoring of polycyclic aromatic hydrocarbons in estuarine and marine

environments. Poster

85

7. 38th CIESM Congress - Istanbul, Turkey, 9-13 April 2007. J.F. Ghiglione, G.

Mevel, M. Pujo-Pay, P. Lebaron, M. Goutx. Diel and seasonal variations in abundance,

activity and community structure of particle-attached and free-living bacteria in NW

Mediterranean Sea (0-1000m). Oral communication

8. 38th CIESM Congress - Istanbul, Turkey, 9-13 April 2007. Abboudi M, Jeffrey

WH, Ghiglione JF, Pujo-Pay M, Oriol L, Sempéré R, Charrière B, Joux F (2007) Effects of

photochemical transformations of dissolved organic matter on bacterial metabolism and

diversity in three contrasting coastal sites in the Nothwestern Meditteranean Sea. Oral

communication

9. The 10th Symposium on Aquatic Microbial Ecology – SAME 10 –01-07th

September 2007 – Faro (Portugal). J.F. Ghiglione, Mevel G, Pujo-Pay M, Goutx M. Role of

particle-attached bacteria in the microbial loop: example of the NW Mediterranean Sea. Oral

communication

10. International Symposium on Applied Molecular Microbiology in Oil Systems

(ISMOS) 17 - 18th September 2007-Essex-United Kingdom Rodriguez-Blanco A, Thouand

G, Delille D, Ghiglione JF. Bacterial biosensors for the monitoring of polycyclic aromatic

hydrocarbons in estuarine and marine environments. Poster

11. Corrosion science-2007-(Japon) Pineau S, Ghiglione JF, Quillet L, Caplat C,

Refait P. Relationship between diversity of bacterial biofilmes and marine corrosion of

carbons teel in harbour environments. Poster

12. Census of Antarctic Marine Life (CAML) Final Symposium 18-20 May 2009,

Genoa, Italy Murray A.E.,. Bacterioplankton community composition over the annual cycle at

Kerguelen and Ghiglione J.F Anvers Islands and descriptions of polar-specific

Gammaproteobacteria clades.

13. Aquatic Sciences Meeting ASLO, 25-30 January 2009 in Nice, France Ghiglione

J.F., Palacios C., Marty J.C., Labrune C., Conan P., Pujo-Pay M., and Goutx M.

Environmental factors explaining the vertical distribution (0-1000 m) of marine bacterial

communities in the NW Mediterranean Sea

14. Aquatic Sciences Meeting ASLO, 25-30 January 2009 in Nice, France Böttjer D, P

Conan, ML Escande, JF Ghiglione, F Joux, JJ Naudin and M Pujo-Pay. Viral effect on

primary and bacterial secondary production in the Rhône River plume (North-western

Mediterranean Sea)

15. UK Polar Network Arctic Marine Sciences Workshop 12-13 Octobre 2009 –

Plymouth, united Kingdom Ortega-Retuerta, E, Joux F, Jeffrey WH, Ghiglione JF, Intertaglia

L, Lebaron P. Patterns of microbial activity and diversity in the Beaufort Sea (Western Arctic

Ocean).

16. Third International Conference on Environmental, Industrial and Applied

Microbiology 2009 - Lisbon (Portugal), 2-4 December 2009. Sauret C, Christaki U,

Hatzianestis I, Ghiglione JF. Influence of predation by flagellates on the bacterial response to

crude oil input in unpolluted oligotrophic and chronically oil-polluted mesotrophic

Mediterranean sites

17. CAML Final Symposium, Genoa Italy, May 2009. Murray, AE, JF Ghiglione,

Bacterioplankton community composition over the annual cycle at Kerguelen and Anvers

Islands.

18. Workshop “The microbial view of biogeochemical cycles” - Banyuls-sur-Mer

(France) 19-21 May 2010 Ghiglione JF & Murray AE. Comparison of massively parallel

deep sequencing and molecular profiling to evaluate the seasonal changes in Sub-Antarctic

and Antarctic marine bacterioplankton communities

19. International Society for Microbial Ecology (ISME-11) 22-27 August 2010 -

Seattle, WA, USA Paisse S, Ghiglione JF, Gueune H, Marty F, Muyzer G and Quillet L.

86

Dynamics of bacterial consortia and Sulphate-Reducing Microorganisms associated to ALWC

products in marine port structures.

20. TECHNO-Ocean Network, Kobé (Japon), 14-16 October 2010. Goutx M., Guigue

C., Sauret C., Ghiglione JF. and M. Tedetti. New observation tools (fluorescence sensors) for

monitoring pollutants in marine areas submitted to urban inputs.

21. ASLO Aquatic Sciences Meeting (San Juan, Puerto Rico · USA) 13-18 February

2011 Ortega-Retuerta E, Joux F, Jeffrey WH, Ghiglione JF. Procaryotic heterotrophic activity

and diversity in the Western Arctic Ocean : patterns and controlling factors

22. 4th Congress of European Microbiologists, FEMS 2011 (Geneva, Switzerland)

June 26-30, 2011. Sauret C, Bottjer D, Tallarmin A, Guigue C, Conan P, Pujo-Pay M, Goutx

M, Ghiglione JF Evaluation of pure top-down control (heterotrophic nanoflagellates and viral

predations) on biostimulated diesel-degrading bacterial community.

23. UNR -Molecular Biosciences Symposium. Reno NV, November, 2011. Murray AE

& Ghiglione JF. Metagenome and metaproteome analysis reveal distinct diffferences in

carbon cycling pathways of marine bacterioplankton in coastal Antarctic waters between polar

summer and winter.

24. Microbes: Ecology and Biogeochemistry Symposium, Barcelona, Sept 2011.

Murray, AE, JF Ghiglione, P Galand, T Pommier, C Pedros-Alio, E Maas. A comparison of

Southern and Arctic Ocean bacterioplankton - are the poles still apart after pyrotag analysis?

25. Ocean Sciences Meeting 19-24 February 2012, in Salt Lake City, Utah, USA.

Ortega-Retuerta E, Joux F, Jeffrey WH, Ghiglione JF. Exploring bacterioplankton diversity in

the Canadian Arctic: patterns of bacterial communities from the Mackensie River to the

Beaufort Sea

26. 3rd Microbial Sulfur Metabolism workshop, Noordwijkerhout from April 15-18th,

2012 Florence Marty, Sandrine Païsse, JF Ghiglione, Hervé Gueuné, Laurent Quillet, Mark

van Loosdrecht and Gerard Muyzer Sulfate-reducing and sulfur-oxidizing bacteria dominate

ALWC deposits of marine harbour structures

28. Ross Sea Workshop. San Diego, CA March, 2012. Murray, AE, JF Ghiglione, J

Grzymski, T Williams, H Ducklow, R Cavicchioli, T Pommier, C Pedros-Alio, P Galand, E

Maas. Southern Ocean bacterioplankton: Modulators and indicators of ecosystem function.

87

ANNEXE 3- SELECTION DE TROIS ARTICLES SCIENTIFIQUES

J’ai choisi trois articles significatifs des trois chapitres présentés dans le rapport d’activité:

Article relatif au chapitre 1: Ghiglione JF & Murray A (2012) Pronounced summer to

winter differences and higher wintertime richness in coastal sub-Antarctic and Antarctic

marine bacterioplankton Environmental Microbiology (IF 4.91), 14:617-629.

Article relatif au chapitre 2: Ghiglione JF, Conan P, Pujo-Pay M (2009) Diversity of total

and active free-living vs. particle-attached bacteria in the euphotic zone of the NW

Mediterranean Sea. FEMS Microbiology Letters (IF 2.27), 299: 9–21.

Article relatif au chapitre 3: Rodríguez-Blanco A, Antoine V, Pelletier E, Delille D,

Ghiglione JF (2010) Effects of temperature and fertilization on total vs. active bacterial

communities exposed to crude and diesel oil pollution in NW Mediterranean Sea.

Environmental pollution (IF 3.62), 158: 663–673.

88

89

Résumé

Mon recrutement au CNRS en Sept. 2001 a été effectué sur un poste thématique SDV/SDU

intitulé « Influence de la biodiversité dans la régulation des cycles biogéochimiques ». Cette

problématique reste encore d’actualité et elle constitue un des enjeux majeurs de l’Ecologie

microbienne marine. Les microorganismes, du fait de leur caractère ubiquiste et de leurs

activités métaboliques extrêmement variées, sont à la fois impliqués dans l'épuration de

certains composés toxiques d'origine anthropique, mais aussi de manière plus générale et à

plus grande échelle dans la régulation des différents cycles biogéochimiques. Par voie de

conséquence, le compartiment microbien joue un rôle clé dans la régulation des contraintes

que subit l'écosystème marin face à l'action directe ou indirecte des activités humaines ou des

phénomènes climatiques naturels.

Mes travaux ont porté essentiellement sur l’influence de la biodiversité bactérienne dans la

régulation du cycle du carbone à la fois dans des conditions naturelles et dans le cadre

d’écosystèmes perturbés par des polluants chimiques (hydrocarbures pétroliers).

Les points forts de mes activités durant un peu plus de dix années de recherche au CNRS

ont été :

- d’adapter différentes avancées techniques de la biologie moléculaire (empreinte

moléculaire CE-SSCP et pyroséquençage) pour l’étude de la diversité des communautés

bactériennes totales (ADN) et métaboliquement actives (ARN) en milieu pélagique,

- de définir les échelles spatiales et temporelles de variations de la diversité bactérienne en

milieu côtier et hauturier,

- d’identifier les facteurs environnementaux (« top-down » et « bottom-up ») responsables

des changements de diversité bactérienne en milieu aquatique par le couplage d’outils

moléculaires et d’analyses statistiques multivariées,

- d’améliorer notre compréhension du rôle de la diversité et de l’activité des bactéries

attachées aux particules dans la régulation des flux de carbone dissous et particulaires en

milieu côtier et hauturier,

- d’améliorer notre vision de la diversité associée à une fonction (ici la fonction de

dégradation des hydrocarbures) en adaptant au milieu marin l’outil de DNA-stable isotope

probing couplé aux nouvelles techniques de pyroséquençage,

- d’évaluer l’importance des changements de diversité dans la régulation de l’activité de

biodégradation des pétroles par les bactéries et dans leur bioremédiation.

Ces travaux ont été soutenus par ma participation active à 18 programmes nationaux, 7

programmes internationaux (coordination de 4 programmes nationaux et 2 programmes

internationaux) et 11 campagnes océanographiques (235 jours de mission en mer). Ils ont été

l’occasion de l’encadrement de 9 étudiants de niveau technicien à master, du co-encadrement

de 3 doctorants et de 5 post-doctorants et de la participation à 5 jurys de thèses de doctorat. Ils

ont été valorisés par la publication de 29 articles scientifiques de rang A, 3 chapitres

d’ouvrages, 10 présentations à des congrès nationaux et 28 présentations à des congrès

internationaux (co-organisateur d’un congrès international).

Documents

MEMOIRE D’HABILITATION A DIRIGER DES RECHERCHES DE L