QuickTime™ et undécompresseur TIFF (LZW)

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Mesure des niveaux d'expression des gènes chez les bactéries par la technique des biopuces

Analyse du transcriptome de la bactérie Buchnera aphidicola en condition de stress trophique de son hôte, le puceron Acyrthosiphon pisum

Laboratoire BF2I, UMR INRA/INSA de Lyon 203

Bât. Louis Pasteur, 69 621 Villeurbanne, France.BSMC, Biologie Cellulaire et Modélisation Cellulaire

DTAMB Université Claude Bernard Lyon 1

Hubert Charles & Fédérica Calevro

22/6/05 2

Inférer (ou valider) un modèle de réseau de régulation… à partir de données d’expressions de puces à ADN

Temps (min)

22/6/05 3

HYBRIDATION

LECTURE DE L’EMPREINTE

DEPOT DES SONDES

EXTRACTION DES DONNEES ET ANALYSE

0,4413 0,5254 0,1527 0,4413 0,5254 0,15270,7584 0,1477 0,1965 0,7584 0,1477 0,19650,1358 0,1899 0,1236 0,1358 0,1899 0,12360,4413 0,5254 0,1527 0,4413 0,5254 0,15270,7584 0,1477 0,1965 0,7584 0,1477 0,19650,1358 0,1899 0,1236 0,1358 0,1899 0,1236

Extraction des ARNm

Marquage des cibles

A

B

D

C

Robot de dépôt

Matériel biologique

Cy5

Cy3

(1)

(2)

Choix des sondes

Interprétation des résultats

85,6

13,1

1,3

Scanner

Choix du plan de dépôt

Introduction : la technique des puces à ADN

QuickTime™ et undécompresseur TIFF (non compressé)

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QuickTime™ et undécompresseur TIFF (non compressé)

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22/6/05 4

De l’image de la puce… aux résultats interprétés1. Nature des données d’expression

2. Problématique biologique

3. Mesure des données d’expression31. Acquisition de l’image32. Acquisition des données issues de l’image 33. Filtration des données34. Analyse qualité35. Normalisation36. Gestion des données de puces

4. Plans expérimentaux41. Plan de la puce42. Analyses comparatives (statiques)43. Analyses dynamiques

5. Conclusions

22/6/05 5

1. Nature des données d’expression Grands volumes de données (pb logiciel, pb algorithmique) Dissymétrie du tableau de données (gènes x conditions) Les données sont relatives (pas de niveau 0, pas de mesure

absolue) Distribution non-normale des données

-> Transformation log2

Non-indépendance des données Des connaissances associées très hétérogènes (annotation par

exemple)

121314151617181920212223240100000060000001100000016000000

22/6/05 6

2. Problématique biologique : la symbiose chez le puceron Acyrthosiphon pisum Buchnera est une bactérie symbiotique intracellulaire associée à la

majorité des pucerons d’importance économique. L’association est très ancienne (250 Ma). Les partenaires sont devenus dépendants.

Buchnera complémente l’alimentation de son hôte (acides aminés et vitamines)

Buchnera possède un génome de taille très réduite (400 à 600 kb), très riche en bases A et T et incluant de nombreuses mutations délétères (adaptatives ?). -> Bon modèle d’étude à un niveau théorique (simple)-> très difficile à manipuler expérimentalement (incultivable)

QuickTime™ et undécompresseur TIFF (LZW)

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 Le génome de Buchnera est « dégénéré »

-> Comment Buchnera régule-t-elle l’expression des ces gènes ?-> Comment Buchnera s’adapte-t-elle aux variations des besoins nutritionnels de l’hôte ?

22/6/05 7

2. Problématique biologique : stress nutritionnel chez le puceron

– Expérience 1 (8 lames) :

Milieu complet Milieu Tyr0/Phe0

A B

4 lames : A-Cy3 / B-Cy54 lames : A-Cy5 / B-Cy3

Expérience en flip-flop

Analyse statistique : test de t-modifié (SAM), approche bayésienne

22/6/05 8

– Expérience 2 (16 lames) :aa équilibré aa déséquilibré

0.5 M saccharose A B

1 M saccharose C D

2 répétitions indépendantes de 8 lames :

A/B, B/C, C/D, D/A, A/C, B/D, D/B, C/A

A B

CD

2. Problématique biologique : stress nutritionnel chez le puceron

Analyse statistique : modèles d’analyse de la variance

22/6/05 9

3. Mesure des niveaux d’expression

31. Acquisition de l’image 32. Acquisition des données issues de l’image  33. Filtration des données : analyse qualité 34. Normalisation 35. Analyse statistique et interprétation des résultats

-> Ces différentes phases ne sont pas distinctes

22/6/05 10

31. L’image brute

bloc (12 x 16)

aiguille1

aiguille2

aiguille3

aiguille4

= =

Contrôles (+ et -)

Doublets de spotsOligo 5’

Oligo 3’

3ème oligo

Superposition des 2 images (R et G)

22/6/05 11

32. Acquisition des données issues de l’image

Acquisition de l’image : réglage des PMT– limite de la saturation (216) – valeurs de PMT identiques (proches) pour toutes les lames d’un

même jeu de données

Quelle mesure du signal ?– Volume du spot (peu utilisé)– Moyenne (médiane) des pixels du spot

Faut-il retrancher un bruit de fond local ?– Estimation du bruit de fond sur les contours des spots (biais

d’estimation)– Estimation sur la base de témoins négatifs répartis sur toute la

surface de la puce

22/6/05 12

33. Filtration des données durant l’acquisistion (logiciel GenePix)

Filtration des données (ajout de « flags »)– Flag « absent » des spots vides (- 50)– Flag « not found » des spots non détectés (- 75)– Flag « bad » des mauvais spots (- 100) :

• Spots sous les taches et rayures (manuel), diamètres extrêmes, spots saturés (F635%sat, script Genepix), spots éloignés du nuage (moyenne / médiane), spots à forts CVF et CVB…

– Flag « good » des bons spots (+ 100)• %B635+1SD > 55 et %B532+1SD > 55 (script GenePix)

– Flags (- 40) des valeurs corrigées négatives

22/6/05 13

34. Analyse qualité

Analyse de la variabilité (critères de qualité)– Variabilité inter sondes identiques

– Variabilité intra-groupe de spottage

– Variabilité intra-gène

– Variabilité géographique

– Variabilité inter lames

-> Utilisation de CV

-> L’analyse de la variabilité permettra de décider de l’arrêt ou de la poursuite de la filtration puis du choix de la technique de normalisation

22/6/05 14

34. Analyse qualité : représentations graphiques

Graphe RG Bruit de fond

MA plot Distribution de F532

22/6/05 15

35. Normalisation des données

Il n’existe pas de mesure absolue de fluorescence Les fluorochromes ont des propriétés différentes

(linéarité du signal, quenching, sensibilité, stabilité…) Les PMT fournissent des valeurs relatives Les réactions de marquage ont des rendement

différents ...

-> Il est nécessaire d’effectuer une normalisation des données (la plus simple possible)

22/6/05 16

35. Normalisation : différents modèles

Soit Ig l’intensité du signal de fluorescence et xg l’abondance de l ’ARNm correspondant :

Effet de bruit de fond :

Effet de saturation (non linéarité de la détection) :

Erreurs additives et multiplicatives :

€

Ig = bxg + ε

€

Ig = a + bxg + ε

€

Ig

=b

1x

g

a + b2x

g

+ ε

€

Ifg

= af

+ bfx

fge

η g +ζ fg + εg

+ δfg

22/6/05 17Cui et al. 2002

Effet de saturation

Effet des erreurs additives (faibles intensités)

Effet des erreurs multiplicatives (fortes intensités)

Différence de bruit de fond entre vert et rouge

M=

log 2(

R/G

)

A=(RG)1/2

35. Normalisation : différents modèles

22/6/05 18

35. Normalisation des données : trois cas de figures

(1) Le nombre de gènes est très grand. (H) : La plupart des gènes analysés ne varient pas, ou se répartissent équitablement du coté des sur- et des sous-exprimés.

-> Normalisation sur tous les points

(2) Le nombre de gènes est moyen et H n’est plus applicable. On dispose d ’un échantillons de gènes invariants (contrôles, gènes de ménage) ou on calcule cet échantillon (Tseng et al., 2001).

-> Normalisation sur l’échantillon de gènes invariants

(3) le nombre de gènes est faible. Il faut disposer d’un jeu de contrôles répartis sur toute la gamme des intensités.

-> Normalisation sur les contrôles

22/6/05 19

35. Normalisation globale Normalisation « par la moyenne ou par la médiane »

– On calcule le rapport des moyennes (ou des médianes) pour les deux couleurs et on le rapporte à 1.

– La transformation :

– Le modèle sous-jacent :

-> Applicable si : (1) pas de bruit de fond, (2) linéarité du graphe MA, (3) pas d’effet aiguille, (4) pas d’effet géographique

€

T = Rg

g=1

N

∑ / Gg

g=1

N

∑

€

′ R g

= Rg

′ G g

= TGg

⎧ ⎨ ⎩

€

Ig = bxg + ε

22/6/05 20

35. Normalisation globale Normalisation « par régression linéaire »

– Le modèle sous-jacent :

– La transformation est la suivante :

-> Applicable si : (1) pas de bruit de fond, (2) linéarité du graphe MA, (3) pas d’effet aiguille, (4) pas d’effet géographique

€

Rg

= aR

+ bRx

g

Gg

= aG

+ bGx

g

⎧ ⎨ ⎩

⇒ Rg

= aR

−b

R

bG

⎛ ⎝ ⎜ ⎞

⎠a

G+

bR

bG

⎛ ⎝ ⎜ ⎞

⎠G

g

€

⇒′ R =

R

α′ G = G b

⎧ ⎨ ⎩

22/6/05 21

35. Normalisation globale Normalisation « par régression linéaire locale» (fonction loess)

– Le modèle et la transformation sont les mêmes que précédemment, mais appliqués sur une classe d’intensité.

-> Applicable si : (1) pas de bruit de fond, (2) linéarité du graphe MA, (3) pas d’effet aiguille, (4) pas d’effet géographique

22/6/05 22

35. Normalisation locale (spatiale) Toutes ces méthodes peuvent s’appliquer de façon à normaliser

par groupe d’aiguille ou par bloc (effet géographique)

-> Applicable si : (1) pas de bruit de fond, (2) linéarité du graphe MA, (3) pas d’effet aiguille, (4) pas d’effet géographique

-> coût sur H ou sur le nombre de témoins très importants

22/6/05 23

35. Normalisation des données Buchnera

La normalisation est basée sur un jeu de gènes invariants déterminé a posteriori

Normalisation « PrintTip loess »

22/6/05 24

36. Un système d’informations pour la gestion des données de puces (SI-TRANS)

http://sitrans.insa-lyon.fr

22/6/05 25

4. Plans expérimentaux

41. Plan de la puce

– Les sondes doivent être spécifiques– Les sondes doivent montrer des rendements homogènes– Les sondes doivent être choisies dans des régions propices– Les sondes devraient être réparties aléatoirement sur la lame– Le nombre de répétitions doit être fixe pour toutes les sondes

(calcul de moyennes)– La puce doit comporter des témoins négatifs répartis sur toute la

surface– La puce doit comporter des témoins positifs répartis sur toute la

gamme d’intensité si l’hypothèse de non variation de la majorité des gènes ne peut pas être faite.

22/6/05 26

4. Plans expérimentaux

QuickTime™ et undécompresseur TIFF (LZW)

sont requis pour visionner cette image.

http://pbil.univ-lyon1.fr/roso

22/6/05 27

- Comparaison de 2 conditions :Tests de t modifiés (SAM) ou inférence bayesienne

- Comparaison de différentes conditions dans un plan factoriel :Modèles d’ANOVA

- Comparaison de conditions multiples :Analyse discriminante, interclasse, non-supervisée

A B

CD

A B C D

R

4. Plans expérimentaux : analyse statique

Plan en boucle Plan en référence

22/6/05 28

- Analyse à différents tempsProfil d’expression temporel : classification supervisée ou non, corrélation de

profils

Cycle cellulaire, Cycle circadien : classification, transformée de fourrier, PLS…

t1 t2 t3 t4

R = t1 ou asynchrone ou externe

4. Plans expérimentaux : analyse dynamique

Plan en référence

- Peng X et al. (2005) Identification of cell cycle-regulated genes in fission yeast. Mol Biol Cell. ;16(3):1026-42- Remondini et al. (2005) Targeting c-Myc-activated genes with a correlation method: Detection of global changes in large gene expression network dynamics. Proc Natl Acad Sci U S A. 10;102(19):6902-6.- Luan Y & Li H (2004) Model-based methods for identifying periodically expressed genes based on time course microarray gene expression data. Bioinformatics. 12;20(3):332-9.

22/6/05 29

4. Plans expérimentaux : analyse dynamique

Plan en boucles répétées

- Analyse à différents temps avec une covariable qualitative :Effet d’une drogue au cours du temps : analyse statique à chaque temps, sélection des gènes significatif pour 50% des temps, puis analyse des profils par classification

t2

control

traitement

t3

control

traitement

t4

control

traitement

t5

control

traitement

t1

control

traitement

- Lin et al. (2004) Discovery of estrogen receptor alpha target genes and response elements in breast tumor cells.Genome Biol. 2004;5(9):R6.

22/6/05 30

5. Conclusion

Le plan d’expérience est primordial pour réaliser les analyses statistiques et ou la modélisation

Toujours utiliser des plans en flip-flop Le modélisateur doit être partie prenante dans la

préparation des données (qualité, filtration, normalisation)

22/6/05 31

5. Conclusions

inhibited by sucrose stressat 50% aa

inhibited by sucrose stressat 25% aa

Activated by sucrose stressat 50% aa

Activated by sucrose stressat 25% aa

Sucrose effect

yjjTrplSrpsLrpsF

trpBflgBflgCyhbZyleA

atpHftsYrpmGytfNcarByba2

mesJydiCrplFyheMmutLiscU

mopAargHyibNligfabBdcd

fabGfmt

murBdnaG

nthdnaJguaC

lipByciL

rpmB

fldAhscA

ygbByqhA

fliJcvpAaceE

murGgrpE1yfgB

phrBpnpinfB

22/6/05 32

5. Conclusions

Recherche des gènes impliqués dans la réponse à un stress trophique chez Buchnera

Recherche des voies métaboliques dans lesquelles ils sont impliqués

Analyse des séquences régulatrices des gènes coexprimés

– Détection d’éléments régulateurs

Analyse génomique et analyse de la corrélation entre le niveau d’expression et l’organisation du génome de Buchnera

– Détection de mécanismes de régulation