Métabolisme des RNA de la peau embryonnaire de poulet

BIOCHIMIE, 1976, 58, 563-578.

Mdtabolisme des RNA de la peau embryonnaire de

J ' acque l ine DESV~.Aux-CHABnOL.

Institut d'Embryologie du C.N.R.S. et du Coll~ge de France, ~9 bis avenue de la Belle Gabrielle, 9~130 Nogent-sur-Marne.

(6-10-1975).

poulet.

Summary. - - Explants from 7, 8, 9, 11, 1 3 - d a y chick embryonic skin incorporating [3H] Urid, ine for different periods (1 hr, 3 or 4 hrs, 1 h r and a chase with actinomyein) are studied with respect to free (F) or membrane bound (B) eytopla.smie polysomes and to RNA extracted from them.

Polysome specific activity decreases at older stages but the amount of polysomes increases due to increased protein synthesis. At each stage B polysomes are less abundant but more radioactive than F polysomes.

RNA extracted f rom each kind is analysed on sucrose gradients : on.e half of each fraction is precipitated by TCA to es t imate total radioactivity, the o ther is retained on mill ipore at high salt concentration to est imate rad,ioaetivity in messenger-like RNAs due to their poty-A sequences.

The pattern of the labelling of the different fractions of RNA changes wi th the length of incorporation, the stages of explants and the kind of polysomes (F or B) ; at 11-13 days the incorporation is slow, radioactivi ty is low and distr ibuted am,ong several peaks of poly-A RNA ; at 7-8 days the incorporation is rapid, dispersed throughout the gradient ; at 9 days, a midway stage, incorporation, is par t icular ly high into 12S and 24S fractions from B RNA.

In the 5 studied stages the labelling of this 12S occurs early, remains for a longer t ime and cannot be chased. These observations suggest s tabil i ty of the 12S RNA. Since, in 14-day chick embryos, feather keratin m RNA has been shown to sediment at 12S and al though our experiments have been done with total skin because ttris differentiating tissue is the site of extensive interactions between dermis and epidermis, they suggest that this 12S RNA is the actual keratin m RNA and might be synthesised some days before the onset of keratin synthesis. Its template, abi l i ty will be investigated at ear l ier stages.

La p e a u e m b r y o n n a i r e de P o u l e t est un ma t6 r i e l t, r6s ut i l is6 p a r les exp6r imen ' t a t eu r s d,6sireux d '6tu- d i e r la d i f f6 , rencia t ion au cou r s de l ' o rganogen6se . De n o m b r e u x / r a v a u x por~tent su r les aspec t s cy to- log iques ou p u r e m e n t b i o c h i m i q u e s de la c o m p o s i - t ion en ac ides amin6s des p l u m e s mats le m6ta- bo l i sme des ac ides nuc l6 iques dans ce t i ssu ne semble pas avo i r susci t6 b e a u c o u p d ' in t6r~t , mal - gr6 te t r ava i l de Bell [1] d6s 1964 sur le change - m e n t des p o l y s o m e s de la p e a u d ' e m b r y o n s de p o u l e t au cours du d6ve loppemen~. Tr~s r6cem- ment , des b i o c h i m i s t e s aus t r a l i ens d ' u n e 6qu ipe an im6e ' p a r Rogers , r i c h e s des c o n n a i s s a n c e s a c q u i s e s su r les po l l s de cobaye , ont pub l i6 p lu- s ieurs 6,tudes sur la syn~h6se des k6 ra t ines des p l u m e s chez l ' e m b r y o n de p o u l e t [2, 3]. I ls son / a r r iv6s A i so le r le m e s s a g e r de la k 6 r a t i n e ou p lu- tSt des k6 ra t ines e/ m 6 m e h e s t i m e r le n o m b r e de g6nes c o d a n t p o u r ces p r o t 6 i n e s dans le g6nome de p o u l e t [4].

Ces r e c h e r c h e s ne d o n n e n t pas d '616ments d i r ec t s p o u r su iv re Ie p h 6 n o m 6 n e de k6ra t in i sa -

t i on de la p e a u e m b r y o n n a i r e , qu i ne se man i - fes te sous des aspec t s m o r p h o l o g i q u e s et dans des l o c a l i s a l i o n s u l t r a s t r uc tu r a Je s p r6c i s e s qu 'h p a r / i t du 15 e jour . D 'ap r6s W a l k e r [5], Roge r s [6] e s t ime que les k 6 r a t i n e s des p l u m e s son / des mol6cu le s c o m p l e x e s cons / i tu6es de 25 c h a l n e s p o l y p e p t i d i - ques avec des p o i d s m o l 6 c u l a i r e s vo i s in s d ' env i - r o n 10.000, don t la c o m p o s i t i o n n ' e s / p a s la m 6 m e s u i v a n t l '~ge, sur gels de p o l y a c r y l a m i d e : A 11 jours , p lus j eune s tade examin6 , peu de b a n d e s s o n / c o m m u n e s avec eel les de 14 jours qu i ne eom- p r e n n e n t el les m 6 m e s que c e r t a i n e s des b a n d e s ex t r a i t e s des p l u m e s d u pous s in h l '6.closion [3, 6, 7, 8]. L ' a p p a r i t i o n s u c c e s s i v e de ces nouve l l e s p r o - t6 ines n6cess i /e la raise en p l a c e des m 6 c a n i s m e s d ' a b o r d de la t r a n s c r i p t i o n pu t s de la t r a d u e t i o n des m e s s a g e r s c o r r e s p o n d a n / s , p r o c e s s u s qu i peu- v e n t 6tre su iv i s au n i v e a u des polysornes .

Le t r ava i l ex,pos6 ic i fair su i te A une 6rude, en c o l l a b o r a t i o n a v e c S o r i a n o [9], su r les RNA to t aux de la p e a u e m b r y o n n a i r e de p o u l e l h des s /odes an t6 r i eu r s h la k 6 r a t i n i s a t i o n et i l p o r t e su r la

564 J. Desveaux-ChabroI.

synth~se des RNA po lysomiques h ces diff6rents s tades. La p r e m i e r e pub l i ca t ion de Par t ing ton , Kemp et Rogers en novembre 1973 [2], 6 tabl issant qu 'un RNA, s6d imentan t sur g rad ien t de saccharose h 12iS, ex t ra i t de p lumes d ' embryons de poule t de 14 jours, 6tait capab le de p r o m o u v o i r la synth~se de prot~ines ident i f i~es h des k6.ratines, a st imul6 notre recherche . En effet, au cours d 'exp6- r i ences pr6.1iminaires d ' i n c o r p o r a t i o n d ' u r i d i n e tr i- ti6e dans les RNA po lysomiques de 9 jours, nous avions remarqu6 la synlhbse pr6coce d 'un RNA s6dimentan t ~ 12S, poss6dant un groupe poly-a.d6- ny l ique et p o u v a n t de ce fair pos tu le r A un r61e de messager [10]. Ce moyen de ca rae t6 r i sa t ion s imple a 6t6 utilis6, selon l 'usage couran t actuel et malgr6 les probl~mes soulev6s, pour dis t inguer , de la rad ioac t iv i t6 ac ido-p r6c ip i t ab le des RNA totaux, cel le li6e aux RNA polyad6ny.16s qui seror~t ind i f f6 remment appel6s << de type messager >> [11]. Ainsi une inves t iga t ion p lus sys t6mat ique des cin6t iques d ' i n c o r p o r a t i o n de p r6cu r seu r s dans la peau explant6e /t 9 jours et h des ~ges vois ins a condui t ~ pose r ce r ta ins p rob lbmes re la t i fs h l '6vo- lut ion des RNA dans la phase p r 6 p a r a t o i r e h la k6ra t in isa t ion .

Puisque les in t e r r e l a t ions morpho log iques ent re de rme et 6p iderme sont b ien 6tablies aux s tades jeunes [12], la peau a 6t6 envisag6e comme un tout, un organe off ces 6troites re la t ions 6pLth61io-m6- sodermiques se mani.festent au niveau b ioch imi - que, en p a r t i c u l i e r celui des RN.A messagers . Ainsi l '6 tude de la peau totale, impos&e p a r l ' imposs i - bil i t6 mat6r ie l le de d issoe ie r en grande quanti t6 des t issus jeunes ex t r6mement fragiles, se t rouve t-cite justifi~.e.

On peut aussi se d e m a n d e r si les p remibres p ro- t6ines s p6cif iques form6es dans cet organe peuvent 6tre consid6r6es comme des pro t6 ines seer6- t6es p a r les futures k6.rat inocytes ou d6jh comme des pro t6 ines de s t ructure . La d i s t inc t ion ent re po lysomes l ibres dans le cy top la sme et po lysomes li6s aux membranes du r6 i icu lum endoth61ial, les p r e m i e r s ayan t 6t6 envisag6s comme si~ges possi- bles de la synthbse des pro t6 ines s t ruc tura les et les seconds ceux des prot6ines de fonc t ionnemen t [13, 14, 15], a 6t6 uti l is6e pou r abo rde r cette ques- t ion et p r6c i se r la pa r l des RaNA de type messager dans ces deux groupes de polysomes.

MATEI~It~L ET METHO/)ES.

1. ~ M A R Q U A G E D E L A P E A U .

La peau dorsa le est pr61ev6e sur des embryons de pou le t ( race Whi t e Leghorn) de 7, 8, 9, 11, 12, 13 ou 14 jours d ' incuba t ion , d6pos6e (en quanti t6

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 5;

in f6r ieure ou 6gale h 1 mI) dans des e r lens de 5 ml con tenan t 1,6 ml de solu,tion de T y r o d e et 0,4 ml de jus d ' e mbryons de poule t de 9 jours . Ce mi l ieu est add i t ionn6 d ' u r i d ine t r i t i6e A la concen t r a t ion de 40 ~CI /ml (activit6 sp6cif ique 25 Ci /mM) ou de t h y m i d i n e tr i t i6e (10 ou 20 ~Ci/ ml, act ivi t6 sp6.cifique 2.'5 Ci/mM), p r6cur seu r s fournis p a r le C.E.A. Les er lens sont plac6s dans un agi ta teur g i ra to i re h l ' i n t6 r ieur d ' un incuba- teur h humid i t6 contr616e h 38 ° duran t le temps choisi . Deux minutes avant l ' a r r6 t de 1 ' incubation, de la cyc lohex imide (2~00 ~g/m]) est ajout6e dans eer.taines s6ries p o u r st.abiliser les po lysomes .

Dans les exp6r iences de chasse les explants sont incub6s la p remi6 re heure dans les cond i t ions pr6- c6demment expos6es en pr6sence d ' u r i d ine tr i t i6e, puts r inc6s p lus ieurs fois avec du Ty rode ~ 38 °, ensui te plac6s dans un mi l i eu T y r o d e - j u s d 'em- b ryon con tenan t de l ' a c t i n o m y c i n e h la concen t ra - t ion de 5 ~g /ml qui d iminue la synth6se de tous les nouveaux RNA ; l ' i ncuba t ion est a lors poursu i - vie p e n d a n t 2 ou 3 heures selon les s6ries exp6ri- men,tales.

2. ~ I S O L E M E N T D E S laOLYSOME:S .

A la fin des marquages les explants sont soi- gneusement lav6s avec du T y r o d e glac6 et routes tes op6ra t ions suivantes se d6ro~lent h 4 °. D ' abo rd la peau est homog6n6is6.e dans un b roye u r de type Dounce dans 2 volumes et demi de t a m p o n Tr i s pH 7,6 50 mM, KCl 100 raM, MgC½ 5 raM, h6par ine 40 ~g/ml , 15 p. cent de saccharose , p a r 10 h 20 coups de p i s ton selon l'~ge, puts centr i fug6e une p remi6 re lo is h 600 g. Les po lysomes son.t s6par6s d ' apr6s la m6thode de Venkatesan et Steele [14], modif i6e p a r d ' au l res che rcheu r s [15, 16] suivant le p r i n c i p e que les po lysomes li6s aux membranes r6 t icu la i res s6dimentent h 27.000 g. Le su rnagean t de 600 g est centr i fug6 A 8.0.00 g ; le eu lo t de 8:.000 g, r e suspendu dans le t ampon d 'homog6n6isa t ion avec 1 p. cent de Nonide t P 40, l ib6re les po lysomes at tach6s aux m e m b r a n e s n,u- cl6aires et m i tochondr i a l e s (B), aprbs une r a p i d e cent r i fuga t ion le su rnagean t est s6diment6 A tra- vers 2 ml de t ampon TKMH-,2M sac chai 'ose pendant 17 heures ~ 45 008 r p m dans le ro to r S W 50-1. Le su rnagean t de 8 000 g est centr i fug6 h 27 000 g ; le su rnagean t de 27 000 g con t ien t les po lysomes ] ibres (F) dans le cy top lasme qui sont eux aussi sbdiment6s h t ravers une couche de 2 ml de 2 M saccharose 17 heures h 45 0,00 rpm. Le culot de 27 000 g c o r r e spond aux po lysomes lids aux mem- b ranes de l 'endoth61ium r6 t icu la i re (B) qui sont suspendus dans le m6me t ampon TXMH et l ib6r6s avec du Nonide t h 1 p. cent de concen t ra t ion

R N A de peau embryonna i re . 565

f inale en s6 jou rnan t 15 m n d a n s la g l ace ; i ls son t fa ib le quan t i t6 de p o l y s o m e s B r6cupdrds p a r ce ensu i te sdd iment6s h t r a v e r s u n e c o u c h e de 2 M proc6dd .

Ta~J.~au I.

Schema des operations de fractionnement pour isoler les polysomes et les RNA.

Homogdndisation des explants dans TKMH 15 p. cent saeeharose

Centrifugation 600 g I

/ l Y 3"

Noyaux (~cartds) Surnageant 600 g I

Centrifugation 8 000 g I

(I) Culot 8 000 g (2) Surnageant 8 000 g (polysomes et membranes nucldomitochondriales, resuspendu dans TKMH Centrifugation ~ 27 000 g

-]- Nonidet 1 p. cent) L

(3) Culot 27 000 g (4) Surnageant 27 000 g (polysomes attachds

aux membranes du r . e . , suspendu dans TKMH ~- Nonidet 1 p. cent)

I) Isolemenl des pol!tsomes i I

Centrifugation 17 h. ~t 45 000 rpm sur 2 ml de TKMH 2 M sacch, rotor SW 50 I I

Polysomes 13 8000 Polysomes B 27000

Polysomes B Polysomes F I[) Exlraclion des RNA

(1) Culot 8000 g (3) Culot 27000 g (2) S 8000 g (4) S 27000 g

centrifugation 1 h. 45 000 rpm sur 0,2 ml centrifugation 1 h. 45000 rpm TKMH 40 p. cent saeeharose rotor SW 50 ~¢ ~¢

f I RNP -~- Polysomes totaux RNP q- Polysomes F / I L I

v ~7 ~, v RNA B lqNA totaux RNA F

s a e c h a r o s e 17 h e u r e s h 45000 r p m ( c o m m e les au t res types de po ly somes ) . Les p o l y s o m e s t o t a u x p r o v i e n n e n t du s u r n a g e a n t 8 000 g t ra i tds avec du N o n i d e t h I p. cen t de c o n c e n t r a t i o n f inale et s6dimen~ds h t r a v e r s une c o u c h e de 2 M saccha - rose 17 h e u r e s h 45 000 r p m .

D a n s les p r e m i e r e s sdries e x p d r i m e n t a l e s d o n t il est t e n u c o m p t e dans ]es r6s,ultats gdndraux, la m d t h o d e de B'lobel et P o t t e r [191 de sdpa ra f ion des po, lysomes apr~s hoanog6ndis,at ion sur les gra- d i en t s d i s c o n t i n u s de s a c c h a r o s e a 6t6 u t i l i sde ma i s a b a n d o n n d e p a r la sui te h cause de la tr~s

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 5.

Les culots p o l y s o m i q u e s , to taux , F ou B, son t a lors r e s u s p e n d u s dans le m i n i m u m de t a m p o n T r i s p H 7,6 50 raM, KC1 250 re.M, MgC12 5 raM, h b p a r i n e 40 ~ g / m l et cen t r i fug6s su r un g r a d i e n t l i n6a i r e de s a c c h a r o s e 15-4.0 p. c e n t p rdpa r6 avee ce m 6 m e t a m p o n , 2 h e u r e s h 2 ° h 25 000 r p m dans le rotor SW 50'.

L ' a b s o r p t i o n h 254 n m est e n r e g i s t r d e p a r un a b s o r p t i o m ~ t r e I seo et les f r a c t i o n s de 0,2 ml sont r ecue i l l i e s , p r6e ip i tdes au T.C.A. 5 p. c e n t glac6, f i l tr6es su r des f i l t res de f ibre de , v e r r e GFA, sdeh6es, ra ises dans des f io les eontena,n~ 5 ml de

566 J. D e s v e a u x - C h a b r o L

l iquide s c i n t i l l a n t h b a s e de tolu6ne pour d6ter- m ine r leur radioactivi t6 darts un compteur h sc in - ti l lations.

Le tableau I r6sume les diff6rentes 6tapes de la m6thode utilis6e.

3 . - EXTRACTION El" FI~ACTIONNE'MENT DES RNA.

Les RNA peuvent 6tre ob[enus h par t i r des culots polysomiques F ou B purifi6s, ou h par t i r des polysomes et r ibonucl6oprotfi ines du surnageant pos tmi tochondr ia l . Dans ce cas les surnageants de 8 000 g ou 27 000 g sont centrifuges 1 heure h 45000 r p m ; les culots de 8000 g ou 27 000 g, en suspension dans le t ampon d 'homo- g6nisation, sont d~pos6s sur un coussin de 0,2 ml de saccharose 40 p . cent dans le m~me tampon et centrifug6s aussi 5 45 000 rpm pendan t 1 heure.

Ces culots sont alors suspendus darts le volume m i n i m u m de tampon Tris pH 7,6 50 raM, KCI 50 mM, MgCl~ 1 mM puts du Tris pH 9 est ajout6 jusqu'h concent ra t ion finale 0,1 M selon la technique de Brawerman [20] et l ' ext ract ion est effec- tu6e h froid avec du SDS 0,5 p. cent et du ph6nol f ra ichement distill6 ; une deuxi6me extract ion est

30 mn h 12 000 g, lav6s deux fois avec de l 'alcool & 70 ° - NaC1 lif0 mM ; le culot final est s6eh6 sons vide et dissous clans le plus peti t volume possible d'eau glac6e. La concent ra t ion en RNA est estim6e par l ' absorpt ion h 254 nm.

Les RNA sont fract ionn6s sur gradients l in6aires de saccharose 5-20 p. cent pr6par6s avec le tampon NaC1 100 mM, EDTA 10 mM, Tris pH 7,6 10 mM, SDS 0,2 p. cent h 45000 rpm pendan t 2 heures h 12 ° darts un rotor SW 5.0 I. La densit~ optique est enregistr6e en cont inu dans un absorp- t iom6tre ISCO ; les fract ions successives de 0,1 ml sont alternati~-ement soit pr6cipit6es au TCA 5 p. cent, puts filtr6es p o r t estimer la radioac'2vit6 totale, soit trait6es, d 'apr6s la technique de Bra- we rman [20], avec du tampon glac6 : Tris pH 7,6 50 mM, KC1 50'0 mM MgC12 1 mM et retenues sur des filtres de ni trocellulose pr6incub6s avec le m6me tampon h forte concent ra t ion saline pour estimer la radioactivi t6 des RNA poss6dant des chaines polyad6nyl iques h leurs extr6mit6s. Les filtres de fibre de verre re tenan t le pr6cipi t6 acido-

i n s o l u b l e et les mil l ipores s o n t s6chSs, d6pos6s darts des fioles contenant 5 ml de sc in t i l lant et compt6s dans un scint i l lateur .

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20 30 F r a c t i o n s

l a l b FIG. 1. - - Polysomes de peau de 9 jours marqade 1 h 5 t'uridine tritide :

a) Polysomes F ; b) Polysomes B 2'7 000 g ; c) Polysomes B 8000 g.

0,1-

0.05-

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× I E

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\ \ 2

,,,, .......... ,, ........ , .............. 10 20 30 F r a c t i o n s

l c

effectu6e sur la premi6re phase ph6nol ique ; les deux phases aqueuses m61ang6es sont soumises h une deuxi6me extract ion ph6nol ique puts ajust6es h 100 mM de NaC1, Les RNA sont pr6cipit6s par de l '6 thanol 12 heures h - - 2 0 ° C , puts centrifug6s

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 5.

4.~REMA~QUES.

Les condi t ions exp6rimentales ne sont jamais s t r ic tement ident iques pour plusieurs causes : d ' u n e par t il y a eu quelques var ia t ions dans les

RNA de peau embryonnaire . 567

techniques d ' i so lement des polysomes enlre des s6ries plus ou moins r6centes, d 'aut re par t l 'acti- vit6 sp6cif ique des pr6curseurs peut diff6rer 16gb- rement et les condi t ions d ' incubat ion darts un mil ieu en r i ch i au jus d ' embryon peuvent ne pas 6tre tout ~ fait semblables ; mais surtout le mat6- r iel b iologique lui m6me est sujet ~ des var ia t ions saisonnibres et statist iques consid6rables darts le stade du d6.veloppement at.teint apr6s le m6me temps d ' incubat ion. N6anmoins si les valeurs abso- lues peuvent diffdrer d 'une s6rie exp6r imenta le

l 'autre, il est hautement s igni~cat i f que les valours relat ives restent comparables . Aussi les prof i ls des gradients figur6s dans ce texte correspondent- i ls ~ l ' ensemble des r6sultats d 'une s6rie exp6r imentale r6elle choisie comme la plus repr6- sentat ive d 'un s t a d e ; les donn6es qui n 'ont pu 6tre recuei l l ies dans cette s6rie n 'ont pas 6.t6 rem- plac6es par la moyenne d 'autres r6sultats dont il a 6t6 cependant tenu compte dans l ' in terpr6ta t ion.

RESULTATS.

I. - - POLYSOMES.

A - - Quantit~ relative des polysomes.

La m6thode de Blobel et Pot ter [19] de frac- tionn.ement sur gradient d iscont inu n 'a pas con- duit, dans nos premi6res exp6riences, h une r6cu- p6rat ion de polysomes B non d6grad6s en quan- tit6s mesurables. La m6thode de centr i fugat ion diff6rentiel le [16] a donn6 de meiHeurs r6sultats surto:ut quand les tampons d 'homog6n6isat ion et de resuspension des culots de 8 00,0 g et 27 000 g corn-

1 p. cent, s 'est montr6 plus favorable fl la conser- vat ion des polysomes B que l 'associat ion Doc et Tri ton X 100.

L 'object i f 6tant une Oude compara t ive des diff6- rents types de polysomes h des stades successifs de la diff6renciat ion de la peau et non la recher - che de 1cur isolement quanti tat if , la p r6occupa t ion dominante a 6t6 d '6vi ter les d6gradat ions en fai- sant subir le m i n i m u m de t ransfer ts de tubes et de t ra i tements aux c~lots polysomiques ; aussi les lavages et la r6cup6rat ion des solutions de lavage ont-ils 6t6 supprim6s au d6tr iment d 'une cer ta ine contamina t ion des polysomes B par les polysomes F restds dans les culots apr6s les centr i fu- gations fi 8 000 g e t 27 000 g e t d 'une per te en polysomes F et B rest6s dans le p r e m i e r culot de ddbris nucldaires et m i tochondr i aux /~ 600 g.

En plus d 'une sdparat ion i ncomplOe entre les types de polysomes, il pour ra i t y avoir une con- taminat ion globale p rovenan t de fragments nucldaires entrainds aux 6tapes successives du frac- t ionnement . L 'examen au mic roscope ~ contraste de phase et au mic roscope 61ectronique de goutte- ~ettes de surnageants de 8 0,00 g manifeste la prd- sence de quelqnes 6tdments autres que des r ibosomes et des polysomes ; pa r contre les surnageants de 27 000 g e t les culots de 2,7 000 g trait6s au Nonidet et recentr i fugds n 'en cont iennent pra- t iquement plus.

Les condi t ions expdrimentales dtant ident iques aux trois stades 6tndids 9-1.2-14 jours, on peut admet t re que la par t des trois types de polysomes, perdus au cours des op6rat ions ou associds "~ un

TABLEAU II.

Evolution des quantitds relatives des divers types de polysomes.

Nombre d'embryons

Age Type (on jours) des polysomes

50 ~ 9

25 I 12

20 I 14

B 8 000 g I B 27 000 g

F B 8 000 g B 27 000 g

F B 8 000 g B 27 000 g

de ~ • I P cent r . cent . . ". .. Absorption . . . . . iqe l'ansorpuon i aosorpuon de " 254 nm , totale spoiysomes

I~ s t i r

68 100 17 25 } 45 14,5 i 20 83 100

9 , 6 12 I 22 8 , 0 4 10

80 100 11 13'5t 25 9,2 11,51

16 4 3 , 4

96 11 ,2

9

648 88 75

p rennen t une concent ra t ion en KCI de 250 mM et de l 'h6par ine comme inh ib i t eur de la RNase ; l 'u t i l isat ion d 'un d6tergent anionique, Nonidet h

BIOCHIMIE, 1'976, 58, n ° 5.

autre type, est homologue et, en tenant comple de ces res t r ic t ions, on peul donc compare r les quan- tit6s relat ives de polysomes aux trois stades. Le

568 J. Desveaux-Chabrol.

tableau H donne les r6sultats de trois s6ries exp6- rimentales. I1 apparait qu'R 9 jours les polysomes de type B 8 0,00 g attach6s aux membranes nucl6o- mitochondria les correspondent ~ 25 p. cent, ceux attach6s aux membranes r6ticu,laires h 20 p. cent

d e s p o l y s o l n e s F, so i t r e s p e c t i v e m e n t ~ 68 p. c en t , 17 p. c e n t et 14,5 p. c e n t d e s p o l y s o m e s to taux . A 12 jours et h 14 jours , l e s p r o p o r t i o n s d e c h a q u e t y p e s o n t v o i s i n e s tes trees d e s autres i n d i q u a n t u n e e e r t a i n e s t a b i l i s a t i o n d a n s les r a p p o r t s en tre

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0.I -O.S

~0 20 30 Fractions

0 . 2 -

2 a 2 b Fro. 2. - - Pol~tsomes de peau de 12 j o u r s m a r q u e e I h & Furid ine lr i t i~e :

a) Po lysomes F ; b) Po lysomes B 27 000 g ; c) P o l y s o m e s B 8 0,00 g.

~02-

0.%

8 0 5 I

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, , , . . . I , , H . , , . , . , , . , , , , . , , , , , , ' ' ' ' '

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I 401

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10 20 30 Froctions

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0.1-

80B

I

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\

2

........ ,~ ....... ,£ ....... ~,,.~;~..o..

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 5.

Fro. 3. - - P o l y s o m e s de peau de 14 j o u r s m a r q u e e 1 h 6 l 'ur id ine lr i t i~e : ~I P olysomes. F ;

Po lysomes B 27 0{)0 g ; e) Po lysomes B 8 0,00 g.

T m co g

o . u

I I

L01

"0.5

3 a 3 b 3 c

RNA de peau embryonna i re . 569

les F et les B. E n t r e 9 j o u r s et ies s t a d e s p l u s ~g6s les q u a n t i t 6 s de p o l y s o m e s F o n t d o u b l 6 p a r r a p - p o r t /i la s o m m e des d e u x t y p e s de p o l y s o m e s B.

B. - - Profil de s~dimentation.

L ' a n a l y s e en g r a d i e n t s de s a c c h a r o s e des po ly - s o m e s c o m p l b t e ces d o n n 6 e s . Les q u a n t i t 6 s de f o r m e s agr6g6es p a r r a p p o r t aux m o n o s o m e s aug-

fo rmenL u n l a r g e p ic , c a r a c t 6 r i s t i q u e des ce l lu le s en s y n t h ~ s e p r o t 6 i q u e i n t e n s e (fig. 1, 2, 3).

Ces c h a n g e m e n t s de p r o f i l n ' a , p p a r a i s s e n t que t r b s d i s c r ~ t e m e n t d a n s les p o l y s o m e s d 6 t a c h 6 s de l ' e n d o t h 6 t i u m r 6 t i c u l a i r e et p a s d a n s c e u x d 6 t a - ch6s des m e m b r a n e s n u c l 6 a i r e s off les p o l y s o m e s s u p 6 r i e u r s h 4 ou 5 u n i t ~ s s o n t p e u a b o n d a n t s .

TABLEAU III .

Evolution des activitds sp~cifiques et pourcentage de radioactivit~ des divers types de polysomes.

Nombre d'embryons

50

25

20

Age (en jours)

12

14

Type !es polysomes

F B 8 000 g

F 27 000 g

F B 8 000 g B 27 000 g

F B 8 000 g B 27 000 g

hctivit6 sp6cifique P. cent A.S.

cpm/ totale t U.A.~.m

50 10 :~ 61 103 70 10 '~

83 10 '2 86 10~

123 10 ~ 68 10 e

120 10 ~ 132 10 e

27,6 33,7 38,7

28,4 29,4 38,7

21,2 37 41,2

P. cent A.S. B/F

100 122 140

100 104 148

100 176 190

P. cent de la

radioactivit6 totale

47,1 28,7 25,2

74 10,4 15

79,4 9

11,6

P. cent de la

radioactivit6 des polysomes

B/F

100 61 53

100 14 20

100 11,2 14

Les activit6s sp6cifiques sont donn~es eomme ordre de g randeur car etles ne sont pas r igoureusement eom- para.bles entre les divers stades.

TABLEAU ~[V.

R~partition de la radioactivit~ entre les tractions successives marquees.

Homog6nat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Surnageant de 600 g . . . . . . . . . . . . . . . . Culot de 600 g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Surnageant 8 000 g . . . . . . . . . . . . . . . . . . Culot de 8 000 g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Surnageant 27 000 g . . . . . . . . . . . . . . . . . Culot de 27 000 g . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Uridine [nil]

9 jours 7 jol

100 100 35 26 58 35 38 29

1 18 5 ,7

Thymidine [3HI

9 jours 7 jours

100 100 1,8 1,6

90 64,3 1,8 1,7 0 ,77 0 ,45 0 ,8 0,1 0 ,23 0,08

Peau de 9 j ou r s marqu6e 3 heures, peau de 7 j ou r s marquee 1 heure soit h l'urid~ine [3I-I] (40 ~g /ml , ac. sp. 25 ~Ci/mM') soit h la t h y m i d i n e [3HI (20 t tg/ml, ac. sp. 25 ~ C i / m ~ ) .

m e n t e n t au c o u r s d u d 6 v e l o p p e m e n t d a n s les p o l y - s o m e s F. A 9 jou r s , le p r o f i l es t assez p l a t a v e e u n p i e de d i m b r e s p r o 6 m i n e n t et u n e r 6 p a r t i t i o n h o m o g b n e de p o l y s o m e s h c o e f f i c i e n t de s 6 d i m e n - t a t i o n m o y e n et 6Iev6 ; les p o l y s o m e s t o t a u x aug- m e n t e n t ,aux s t a d e s p l u s ~g6s : i ls s o n t i m p o r t a n t s des t r i m 6 r e s a u x h e x a m b r e s h 12 jou r s , et, 14 jou r s , les ag r6ga t s s u p 6 r i e u r s h 6 m o n o m ~ r e s

C. - - Incorporation d'uridine triti~e.

La d u r 6 e d ' i n c u b a t i o n a 6t6 de 1 h e u r e p o u r la p e a u de 9 j ou r s , de 1 h e u r e et d e m i e p o u r la p e a u de 12 j o u r s et de 2 h e u r e s ,pour la p e a u de 14 j o u r s en vue de teni,r c o m p t e d u r a l e n t i s s e m e n t d u m6 ta - b o l i s m e q u ' u n e 6rude p r 6 c 6 d e n t e [9] a v a i t m i s e n 6 v i d e n c e et qu i s ' e s t t r o u v 6 largemeni c o n f i r m 6 p a r les i n c o r p o r a t i o n s d a n s les RNA.

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 5. 38

57'0 J. D e s v e a u x - C h a b r o l .

Les d o n n ~ e s cons ign6:es dar ts le t a b l e a u I I I f o n t a p p a r a i t r e u n e d i m i n u t i o n n e t t e de l ' a c t i v i t ~ sp~- c i f i q u e d e s t r o i s t y p e s de p o l y s o m e s d u s t a d e j e u n e a u x s t a d e s p l u s fig~s m a t s p e u de c h a n g e - m e n t s d a n s les r a p p o r t s des ac t i v i t~ s s p ~ c i f i q u e s des po , lys~mes F et B e n t r e les t r o i s s,tad.es, ee l ]e des p o l y s o m e s B r ~ t i c u l a i r e ~ t a n t p l u s ~lev~e q u e ce l le des p o l y s o m e s F.

La d 6 c r o i s s a n c e r e l a t i v e de la r a d i o a e t i v i t ~ des p o l y s o m e s B e n t r e les s ta t ics 9 et 14 j o u r s p o u r r a i t i n d i q u e r u n d 6 p l a c e m e n t g loba l de la r a d i o a c t i v i t ~ v e r s les p o l y s o m e s F, ce qu i n ' e s t p a s i n c o m p a t i b l e

p o n d p a s h des R,NA d i r i g e a n t des s y n t h e s e s p r o - t 6 iques ; el le est h d ~ d u i r e de l ' a c t i v i t ~ s p ~ c i f i q u e de ce s p o l y s o m e s r a m e n 6 e a lo r s h u n ni .veau "cot- s i n de ce lu i des p o l y s o m e s l i b r e s ; el le p o u r r a i t ~ t re e n r e l a t i o n a v e c le m 6 t ~ b o l i s m e t r ~ s ac t i f des RNA h 6 t ~ r o g ~ n e s n u c l 6 a i r e s ou des RNA p r 6 c u r - s e u r s des R:NA r i b o s o m i q u e s . D a n s ces I~o!ysomes le m a r q u a g e est p a r t i c u l i ~ r e m e n , t f a i b l e s u r les z o n e s ~ s 6 d i m e n i a t i o n r a p i 4 e don~ l ' a b s o ~ p t i o n h 254 n m est d ' a i l l e u r s m i n i m e .

P a r c o n t r e les p o l y s o m e s F p r ~ s e n t e n t u n e r ~ p a r t i t i ( m de la r a d i o a c t i v i t ~ d i s t r i b u t e e n t r e les

TABLEAU V.

Activi td spdcif iqne des RNA totaux (A.S. en cpm/U.A. 254 urn) et pourcentage (p. cent) de la radio- activitd Poly-A snr la radioactioit~ totale des RNA extraits des po lysomes F et B h divers stades

Age

7 j rad.

8 j .

9 j. tad. - -

l t j . rad. - -

13 j. rad. - -

A.S. et p. cent de radioactivit6

A°S° poly-A tn ta le

A.S.

A.S. poly-A totale

A.S. poly-A totale

A.S. poly-A totale

D u r 6 e

30 ou 45 mn 60 mn 180 mn ou 240 mn 60 mn -~- ehasse

B

36~03 6 8 ~ 03

25 p ' cent135 p. cent

45 l0 s 67 10 s

20 10 s 33 10 ~-

F i l I

160 103 !

20 p. cent

23 l0 s

32 p. cent

12 10 ~

27 p. cent

1,7 l0 "2 34 p. cent

49 10 .2

43 p. cent

18 10 ~

24 p. cent

3 ,3 10 ~-

44 p. cent

F I B

87 l0 s 95 10 ~-

28 p. cent 40 p. cent

33 10 e 35 10 e


6 ,6 103 7 ,8 103


F B

60 10 "~ 73 10 ~


27 10 ~ 31 10 ~


3,8 102 4 ,6 10"-'

14 p. cenl. 22 p. cent

Les activit6s spdcifiques sortt donn~.es eomme ordre d,e g randeur car elles ne sont pas r igoureusement corn- parab les en.tre les, d ivers sta(~es.

a v e c le m a i n t i e n et m ~ m e u n e 16g6re a u g m e n t a t i o n de l ' a c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e des p o l y s o m e s B p a r r a p - p o r t aux p o l y s o m e s F.

La l o c a l i s a t i o n des m a r q u a g e s s u r les g r a d i e n t s de s a c c h a r o s e f o u r n i t des i n d i c a t i o n s c o m p l 6 m e n - t a i r e s . Aux t r o i s s t a d e s ~]es p o l y s o m e s B d 6 t a c h ~ s des m e m b r a n e s n u c l 6 a i r e s et m i t o c h o n d r i a l e s (fig. l c , 2c, 3c) p r 6 s e n t e n t u n e f o r t e i n c o r p o r a t i o n s u r les m o n o s o m e s et les s o u s - u n i t 6 s r i b o s o m i q u e s ee qu i n ' e s t p a s le cas des p o l y s o m e s l i b r e s (fig. l a , 2a, 3a) et des p o l y s o m e s d6ta.eh6s des m e m b r a n e s endoth61i, a les (fig. l b , 2b, 3b) off l e m a r q u a g e es t r e .pa t t i s u r les p o l y s o m e s h l ' e x c l u s i o n des m o n o - sprees . Cet te a c t i v i t 6 s u r les m o n o s o m e s ne c o r r e s -

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 5.

d i m ~ r e s , les o l i g o m ~ r e s et les zones p l u s l o u r d e s , en 5 p i c s ca r ac t~ r i s~s , le p l u s ~lev~ ~ t an t a u x t r o i s s t a d e s s u r les d i m ~ r e s (fig. l a , 2a, 3a). On p e u t s u p p o s e r que les d i v e r s g r o u p e s de RNA m e s s a g e r s en ac t iv i t~ se m o d i f i e n t p e u au c o u r s de ce t t e p h a s e de 1.a s p ~ c i a l i s a t i o n t i s s u l a i r e . Les po ly - sp rees liSs a u x m e m b r a n e s de l ' e n d o t h ~ l i u m r~t i - c u l a i r e on t u n e a c t i v i t ~ s p ~ c i f i q u e s u p ~ r i e u r e h cel le des p o ] y s o m e s l i b r e s aux t r o i s s t a d e s et u n m a r q u a g e r ~ p a r t i en p l u s i e u r s p i c s s u r l ' e n s e m b l e , p a r t i c u l i ~ r e m e n t su r les o l i g o m ~ r e s (fig. l b , 2b,

3b). U n p i c ~lev~ su r les t r i m ~ r e s h 9 j o u r s , p o u r -

r a i t i n d i q u e r u n e i n c o r p o r a t i o n i n t e n s e h ce s t a d e

p r e c i s d a n s u n e esp~ce de R N A m e s s a g e r .

R N A d e p e a u e m b r y o n n a i r e . 571

II. - - C I N I ~ T I Q U E D ' I N C O R P O R A T I O N D A N S L E S R N A .

Les m6thodes d ' isolement des polysomes F, B nucl6aires et B r6ticulaires ont 6t6 utilis6es pour connai t re l 'origdne des RNA, m,ais dans les cas nombreux off les polysomes eux m6mes n '6taient pas 6tudi6s, les RNA 6taient extrai ts des culots s6diment6s h 45 0~)0 rpm pendan t une heure.

A. - - C a r a c t ~ r i s a t i o n des t y p e s de R N A .

Les RNA extraits des polysomes B lib6r6s des membranes nucl6o-mitochondria les (culot de

branes endoth6liales sont done att6ma6es dans les RNA provenan i des membranes nucl.6aires. Aussi, et devant la n6cessit6 de comparer entre elles les valeurs d 'une m6me s6rie exp6rimentale, les culots de 8 0OOg ont-ils 6t6 6cart6s le plus souvent ou associ6s, h ceux de 27 000 g comme RNA B.

Le t e nne RNA F concere done les RNA prove- nant h la fois des r ibosomes s6pards et associ6s en polysomes se t rouvant l ibres dans le cytoplasme et le terme RNA B les RNA lib6r6s des membranes du syst6me r6t iculaire en.doth6Iial.

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12 18 i ' I

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10 20 30 Fractions

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¢ 28 5

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2

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0.0~

010a

0.02

0.01

185 28 5 i

, , , , , , . . . . . . . . . . . . , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , I

10

4a 4b 4c FIG. 4. - - RNA de la peau de 7 jours marqude ~5 ran 5 l 'uridine tritide :

a) Extraits des Polysomes F ; b) Extraits d, es Po]ysomes B 27 000 g ; c) Extraits des Po]ysomes B 8 000 g.

-1

20 30 :r'actions

8 000 g trait6 par les d6tergents) ont 6t6 compar6s h ceux lib6r6s de l 'endoth61ium r6t iculaire (culot de 2,7 00 '0g trait6 par les d6tergenis) d,ans plusieurs s6ries exp6rimentales : h 7 jours les RNA extraits des polysomes B mi tochondr iaux ont une activit6 sp6cifique inf&rieure, une incorpora t ion moins forte dans les zones h coefficient de s6di- menta t ion 61ev6e et pas de pie sur la fract ion 12.S (fig. 4). A 9 jours les. RNA h poly-A des polysomes B 8 00,0 g ont une activit6 sp6eifique infdr ieure el le marquage est moths net sur les fract ions 12 et 24S que sur les correspondantes des polysomes B 27 000 g. De m~me, apr6s une heure, les activitds s,p6ci,fiques sont un pen plus faibles darts les RNA h poly-A des polysomes nucl6o-milochon- dr iaux flue des polysomes r6ticulaires mats leur d is t r ibut ion sur le gradient est identique. Les caractdrist iques des RNA provenan t des mere-

Le pro blbnae d 'une 6ventuelle con tamina t ion nu- cl6aire, d6jh 6voqu6 par l ' examen inicroscopique des diverses fractions, a 6t6 repr is par le marquage de ]a peau h la thymid ine triti6e. Les exp6- r iences comparat ives ont port6 sur des peaux de 7 et 9 jours pour profi ter de l ' intensi t6 du m6ta- bolisme. Des aliquotes pr61ev6es aux diff6rentes 6tapes du f rac t ionnement d 'homog6nats marqu6s dans des condi t ions identiques, les uns avec l 'ur i - dine triti6e, les autres avec la thymid ine triti6e, sont mesur6es pour leur absorpt ion h 254 nm,.pr6- cipit6es au TCA, filtr6es et compt6es.

Les bi lans (tabIeau IV) mon t ren t des r6cup6ra- t ions de la radioact ivi t6 due h ] 'u r id ine et h ]a thymid ine assez proches, sQit respeet ivemerd 67 et 6,5 p. cent h 7 jours et.88 e t 95 p. c en t / i 9 jours, r6sultats obtenus en add i t ionnan t les epm du,culot 600 g, du culot 8 000 g, du culot 27 090 g e t du

BIOCHIMIE, 1'976, 58, n ° 5. . ~ :

572 J . D e s v e a u x - C h a b r o l .

surnageant 27 000 g, en notant que la per te au cours des op6rations est plus forte sur ]es volumes r6duits de la peau de 7 jours. La r6part i t ion, pa r contre, est totatement diff6rente : quand le pr6- curseur est la t hymid ine le culot nucl6aire de 600 g cont ient 90 p. cent de la radioact iv i t$ et le surnageant s.eulement 1,6 p. cent ; la p ropor t ion tombe aux alentours de 1 et 0,1 p. cent dans les surnageants et culots de 27 000 g. Au cont ra i re l '6qui l ibre se main t ien t entre culots et surnageants

2) l 'acfivit6 sp6cif ique des R,NA B e s t sup6- r ieure h celle des R.NA F ;

3) le p ourcentage de radioact iv i t6 dans les RNA h poly-A sur 1,a radioact iv i t6 totale des RNA est g6n6ralement sup6rieure dans les R:NA B ce qui pour ra i t sdgnifier que le m6tabolisme des Rb~A de type messager des polysomes accroch6s aux membranes est plus intense que celui des RNA prove- nant des polysomes libres.

121820 2 8 5 12 18 2 8 5

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10 20 30 F r a c t i o n s '10 20 30 F r a c t i o n s

5a 5b Fro. 5. - - RNA de la peau de 8 jours marqude 60 m n dt l 'uridine triti~e :

a) Extraits des Polysomes F ;

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b) Extraits des Polysomes B. c) RNA de la peau de 9 jours marqude 30 mn & l 'uridine tritide extraits des Polysomes F.

marqu6s h l 'ur id ine . La tr6s faible activit~ r6si- duelle due h la t hymid ine pour ra i t p r o v e n i r d 'un en l ra inement non s,p6cifi,que et n 'a pas 6t6 con- sid6r6e d.ans, cette ~tude du m6tabol isme des RNA cytoplasmiques.

B. - - R~ su l t a t s g l o b a u x .

La d iminut ion du m6.tabolisme des RNA des stades jeunes aux stades fig6s, 6vidente au niveau des polysomes, se manifes te par la d6croissance de l 'act ivi t6 sp6cif ique de ces RNA F et B. Le tableau ¥ r6sume des donn6es conce rnan t des s6ries exp6rimentales homog6nes ckacune. I1 appa- ral t :

1) l 'act ivi t6 sp6cif ique dans les RNA totaux F et B augmente avec la dur6e de l ' i ncorpora t ion et se place, dans les exp6riences de chasse, ~ une valeur in te rm6dia i re entre ce]les de 1 et 3-4 heures ;

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 5.

C. ~ L o c a l i s a t i o n s u r les g r a d i e n t s .

Sur les prof i ls des gradients de saccharose 5-20 p. cent de la peau de 9 jours , les RNA poiy-A extraits des polysomes F (fig. 5c) pr6sen- tent d6s 30 minutes un seul p ic net de radioact i - vii& sur la f rac t ion 12S ; ~ 60 minutes ce p ic 12S s'est accru (fig. 6), net tement individual is6 et, de plus, une incorpora t ion massive s 'effectue sur Ies f ract ions de 20S ~ 24S, puts 26S et sup6rieures 28S. Apr~s 180 minutes, le marquage sur la fraction 12S subsiste mats dilu6 dans les autres zones qui p rennen t une impor tance croissante. Le transfert du marqu.age des RNA totaux vers les formes stables se p rodu i t durant l a chasse de 2 heures avec l ' ac t inomycine , ainsi le p ic sur le RNA 28S est plus 61ev6 que celui du 18S ce qui n ' appara l t pas encore avec 3 heures de marquage continu. Ce changement de la d is t r ibut ion de la rad ioac t i - vit6, net aussi sur les RNA ~ poly-A, signale une diff6rence entre le marquage de la f rac t ion 12S,

R N A d e p e a u e m b r y o n n a i r e . 573

p r 6 c o c e , s tab le ou it r e n o u v e l l e m e n t p e r m a n e n t et le m 6 t a b o l i s m e toujours trbs ac t i f de s f r a c t i o n s 24 et 26S d u r a n t toute la p 6 r i o d e d ' i n c o r p o r a t i o n .

]es R.NA de t y p e m e s s a g e r se s y n t h 6 t i s e n t ou se r e n o u v e l l e n t tr~s a c t i v e m e n t dans toute la z o n e s 6 d i m e n t a n t :de 16S h 28.S a v e c un m a x i m u m it 24S

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6 a 6 b 6 c FIG. 6. - - RNA de la peau de 9 ]ours extraits des Po lysomes F.

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7 a 7 b FIG. 7. - - RNA de la peau de 9 ]ours extraits des po lysomes B.

a) m,arqu4e 60, mn ; b) m, arqu4e 11~0 nan ; c) marquee 60 n~n plus 1.2:{) mn de chasse h l 'actinomycin¢.

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Les p r o f i l s de s R,NA h po, ly-A e x t r a i t s d e s p o l y - s o m e s B (fig. 7), a c c e n t u e n t la p r 6 6 m i n e n c e de l ' i n c o r p o r a t i o n pr6.coce dans la f r a c t i o n 1 2 S ; aprbs 180. m i n u t e s et d u r a n t l ' ex ,p6r i ence de c h a s s e

BIOCHIMIE, 1'976, 58, n ° 5.

en c o n s e r v a n t u n p i c i n d i v i d u a l i s 6 sur la f rac - t i o n 12S.

Lors d ' e x p 6 r i e n c e s p r 6 1 i m i n a i r e s a v e c ta peau de 11 ]ours, un c e r t a i n r a l e n t i s s e m e n t du m 6 t a b o -

574 J. Desveaux-Chabrol.

l i sme s'6tait mani,fest6. Aussi les dur6es d'incuba- t ion ont-elles 6t6 prolongbes jusqu'h 240 minutes. En effet apr6s une heure l ' incorporation est faible dans les RNA ~ poly-A extraits des polysomes F (fig. 8), des pics sont amorc6s sur les fracti.ons 9, 12, 20,S ; aprbs quatre heures i ls sont bien indiv i -

dualis6s, avec, comme clans la peau de 9 jours, une incorporat ion importante dans les fractions lourdes quand la dur6e d' incubation s'accrolt. La chasse & l 'ac t inomycine est tr6s efficace en ce qu'elle i n h i b e nettement le marquage total des RNA ribosomiques en d6masquant la raise en

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FIG. 8. - - RNA de la peau de 11 j o u r s ex t ra i t s des P o l y s o m e s F m a r q u e e : a) 60 m n ; b) 2~0, nm ; c) 6,0 m n p l u s 1~0 m n de c h a s s e & l ' a e t i n o m y c i n e .

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Fro. 9. - - RNA de la peau de 11 j o u r s ex t ra i t s des P o l y s o m e s B m a r q u 6 e : a) 6,0 m n L ; b) 240 ran , ;

BIOCHIMIE, 1'976, 58, n ° 5.

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R N A de peau e m b r g o n n a i r e . 575

p l a c e et la s y n t h ~ s e c o n t i n u e sur les m 6 m e s f rac - t i o n s 12, 20 et 24S. On p e u t n o t e r qu'& 9 jours u n e i n c o r p o r a t i o n sur la fra.et ion ~0S ne se m a n i f e s t a i t

A 13 ]ours les c h a n g e m e n t s o b s e r v 6 s e n t r e la d i s t r i b u t i o n de la r a d i o a c t i v i t 6 de 9 jours et de 11 ]ours s ' a c c e n t u e n t dans l e s R N A des p o l y -

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19 a 10 b 10 c

FIG. 10. - - RNA de la peau de 13 jours extraits des Polysomes F marquee : a) 6,0 m n~ ; b) ~4~ ran; c) 6'0 mn plus 180' mn de chasse h l 'act inomycine.

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11b FIG. 1~1. - - RNA de la peau de 13 jours extrai ts des Polysomes B marquee :

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pas . Cette p a r t i c u l a r i t 6 se r e t r o u v e dans la c i n 6 - t ique des R N A e x t r a i t s de s p o ' l y s o m e s B a v e c u n e acu i t6 p a r t i c u l i S r e p o u r l ' e x p 6 r i e n c e de c h a s s e off, s eu l e s , s o n t n e t t e m e n t m a r q u 6 e s l e s f r a c t i o n s 12 et 2A)S a lors que les 2,4S le son t p e u (fig. 9).

BIOCHIMIE, 1'976, 58, n ° 5.

s o m e s F et B ; s eu l s a p p a r a i s s e n t ]es p i c s 12 et 2'0~S & la p r e m i S r e h e u r e , le p i c 24-Z6S n'est mar - qu6 qu'aprbs 4 h e u r e s et aprSs c h a s s e d a n s ]es R N A des p o l y s o m e s B s e u l e m e n t (fig. 10 et 11) .

576 J. D e s v e a u x - C h a b r o l .

Avant 9 jours, au contraire , hes RNA h pohy-A manifes tent une activit6 intense duran t les incubat ions conrtes : ~ 8 ]ours apr6s une heure les RNA F pr6sentent d6jh tous les pics observ6s h 9 jours aprbs 3 heures avec un pic h 12S bien caract6ris6, des pics 61ev6s h 20, 2,4, 26S et un marquage impor tan t sur la zone sup6rieure h 28S (fig. 5a). Dans les R~NA des pohysomes B l ' incorpora t ion intense sur ha fract ion 12S et les fract ions entre 18 et 26S ressenlble h la d is t r ibut ion des RNA B de 9 jours apr6s 3 heures ou chasse (fig. 5b). Dbs 45 minu tes ~ 7 ]ours (fig. 4 a) les RNA F pr6sentent des pies h 9, 12, 16-18S et un sur ha zone sup@ieure h 2~S, aucun marquage sur la f ract ion 24S alors que les RNA des polysomes B (fig. 4 b) ont des pics nombreux rassemblant tous eeux qui se re t rouveront aux stades ult6rieurs aprbs des incuba t ions beaucoup plus longues. On peut noter route,lois ha pr6sence pe rmanen te de l ' i ncorpora t ion dans ha f ract ion 12'S.

DISCUSSION ET CONCLUSION.

I . - - Au NIVEAU POLYSOMIQUE.

Les~ faits observ6s au cours de cette 6tude pour- ra ient se r6sumer ainsi :

1) Les polysomes libres dans le cytoplasme, iso- 16s fi 9 et h 14 jours, sont respect ivement 3 et 5 fois plus nomhreux que les polysomes attach6s aux inembranes.

2) Les profils de s6dimentat ion mont ren t que cette augmenla t ion des polysomes F porte sur la zone moyenne h 12 jours et plus par t icu l i6rement sur la zone h coefficient de s6dimentat ion 61ev6 14 j0urs ; le profi l des polys~omes B change peu.

3) L ' incorpora t ion d 'u r id ine triti6e par uni t6 d'abso~rpfion d6'croit aux stades successifs, mats l'activi~6 sp6cifique des polysomes F par rappor t aux polysomes B d iminue seuhement d 'un quart. L'activit6 sp6cifique des polysomes li6s aux membranes du re t iculum endoth61ial est env i ron une fois et demi celle des pohysomes libres.

La signification de ces observat ions peut 6tre discut6e du poin t de rue des m6thodes d'isohement et des r6sultats obtenus avec d'autr.es tissus puisque les exp6riences de mavquage ~ la t hymid ine triti6e permet tent d'61imine~ une con tamina t ion nucl6aire notable.

Les techniques de s~paration par centr i fuga- t ions diff~rencielJes suivies de pur i f ica t ions sur gradients de saccharose 6tablie par Venkatesen [16] s~)nt uti l is6es par de nombreux chercheurs de

BIOCHIMIE, 1'976, 58, n '° 5.

p'r6f6rence h celle de Blobel et Potter [19]. Ainsi les rendements obtenus par Poir6e et al. [151, avec des cellnles de thyroide en cttlture sont trois lois sup6rieurs pour les polysomes F et 8 fois sup6- r ieurs pour les polysomes B h ceux obtenus par la m6thode classique. Ce,pendant il est possible qu 'une bonne pa t t ie des polysomes trouv6s dans le culot de 8 00,0 g de nos explants de peau eon t ienne des d6bris n,u~e]6omitoc'hondriaux. En effet pour pr6servev l'in,t~,grit.6 des polysomes, nous avons v~lonta i rement 6vit6 les tar.ages, con t ra i rement la nouvelJe m6thode de fra,ct ionnement cellulaire raise au point par O'Toole et PoHak [18J pour une ~6eup6ration quant i ta t ive des divers lypes de polysomes.

Une autre in te rpre ta t ion de l'origin,e des p01y- somes eontenns dans le cu]ot de 8 000 g peut 6tre envisag6e : s:i Rosbach et P e n m a n n ont sugg6r6 une do~uble popula t ion polysomique li6e aux membranes, l 'une plus sol idement que l 'autre [22], Harr ison et al. ; est iment que dans les cellules de mye,lome les po~ly:somes li~s aux membranes passent par le st.a~d,e d 'a t tachement t.~che a,u d6.but de la sy.nth6se des immunoglobuhines puts s 'a t tachent plus sol idement aux membranes de l'endoth~.hium r6ticulaive avant de l ib6rer les chalnes peptidiques [23] ; il y aurai t done cont inui t6 biologique entre les deux types de polysomes B et s6parat ion artificielle due aux conditions, d 'extract ion. I1 est possible que le cuhot de 8 00,0 g cont ienne un m~- lange de ces formes polysom.iques faible,ment atta- eh6es en plus des RNA nucl6omitoe 'hondriaux et celui de 2'7 00,0 g seuhement des polysomes forte- ment attach6s ce qui expl iquerai t le com~portement et l 'aetivit6 sp6cifique voisins des deux types.

Dans de nombreux travaux, l ' impor tanee relative ,des polysomes F et B parai t en re la t ion avec le genre de prot6i~es synth6tis'6es, s t ructurales suv les polysomes l ibres et fonctionnehles sur les polysomes li6s. Cepeudant une revue de Tata [14] tempbre cette d is t inct ion trop nette h l 'a ide d 'exemples pris dans des organes en croissance, comme t e fo i e embryonna i r e [183, la glande mam- maire stimul6e par la prolac t ine [21], les cellules de thyro ide stimul.6e par hormone [171 off les polysomes B sont les plus nombrenx mais avec une activit6 sp6cifique, en pr6sence d 'ad6nosine tviti6e, inf6r ieure h celhe des polysomes F. Ce r6sultat est inverse de ceux obtenus dans la peau embryonna i re mais laisse supposer une dissocia- t ion entre la synth~:se prot6ique et he m6tabolisnle des RNA messagers.

Ainsi, suivant les sySt6mes biologiques, l ' un ou l'aut.re type de polysomes d o m i n e e t la p ropor t ion

R N A de p e a u e m b r y o n n a i r e . 577

de chacun peut 6voluer sous l ' inf luence du d6ve- loppement ou de la physiologie. De m6me l 'acti- vit6 sp6cifique reflbte l '6volution du m6tabolisme de leurs RNA messagers et il est pr6matur6 de t i rer des ind ica t ions sur les relat ions entre types de polysomes et nature des prot6ines tradui[es avant l ' i solement des messages.

II. - - CINETIQUE DES RNA.

L' intensi t6 de t ' i ncorpora t ion d 'un pr6curseur ne repr6sente pas d i rectement l ' accroissement de la quantit6, de RNA mats signale ]e niveau m6!abo- l ique qui peut 6tre, soit une accumula t ion de nou- veau mat6riel, soit un renouvel lement acc616r6 en r6ponse h une d6gradation rapide, soit un renou- vellement ~ vitesse constante. Dans ce dernier cas, la radioact ivi t6 se dis tr ibue sur un gradient l in6aire de saccharose suivant le m6me profil que celui de l ' absorpt ion h 254 nm et correspond aux RNA stables r ibosomiques et de transfert. C'est le r6sultat obtenu par Buckingham et aI. [24] avec des cultures de myoblastes marqu6es 2 heures h l ' u r id ine triti6e. I1 leur est possible de dis t inguer ensuite tes diverses esp~ces de RNA A poly-A par leur dur6e de vie pendan t 'des chasses qui se pro- longent jusqu'h 3,6 heures. Au cont ra i re de ces cellules en culture, p ra t iquement synchronis~6es, la peau est un syst6me h6t6rog6ne od avec la m6- thode utilis6e, l ' incorpo,rat ion d ' u r id ine triti6e at teint un plateau aprbs 180 h 240 minutes [9], plateau qui se situe h u n niveau sup6r ieur dans les jeunes stades. La radioact ivi t6 ne se d is t r ibue pas aussi r6gulibrement sur les R~NA de la peau que des myoblas tes ; eependant h par t i r d 'un marquage suffisamment long, la r6par t i t ion englobe les zones des 18S et plus tardiCement des 28,S. Par contre dans les marquages courts l ' u r id ine s ' incor- pore pr6f6rent ie l lement dans les zones h RNA polyad6nyl6s inf6rieures h 18S, entre 2~0 et 26 e¢ au delh de 28~S.

La radioactivi t6 des RNA h poly-A sur les zones lourdes est d 'une impor tance variable suivant les s6ries expbrimentales h l ' in t6r ieur d 'un m6me stade, mats elle m6rite d'etre soulign6e bien qu'elle soit diffieile h in terpr6ter. L 'absence de d6bris nu- clbaires dans les surnageants, et suspensions de 27 000 g d iminue la probabi l i t6 d 'une contamina- t ion des R.NA cytoplasmiques par des RNA nu- el6aires h6t6rogbnes. Cependant d 'aprbs Per ry et al. [25] une bonne pa~rtie de ces RNA h poly-A se d6gradent et se renouvel lent rap idement h l ' int6- r i eu r du noyau tandis que ~5 p. cent se t rouvent sous forme de pr6-messagers et passent rapide- ment sur les polysomes. Ces r6sultats, obtenus avec des cultures stabilis6es, pour ra ien t s ' appl iquer aux tissus embryonna i res ou la p ropor t ion des RNA

ad6nyl6s sur les RNA totaux est sup6rieure [26, 27]. En cons6.quence m6me si cer tains RNA h6t6- rog~nes nucl6aires h poly-A 6taient extraits avec les RNA cytoplasmiques, ils s6dimentera ient soizt avec les RNA messagers soit comme pr6curseurs des messagers darts la zone h coefficient 61ev6.

L 'ut i l isat ion de l ' ac t inomycine comme inhib i - teur des synth6ses de RNA est contest6e dans la mesure off cette substance alt6re les cellules. Pour- rant avec une concent ra t ion de 4 ~g/ml de mil ieu La Torre et Per ry ont obtcnu une r6duct ion de 20 p. cent de l ' incorpora t ion d'uridin.e darts les polysomes des cellules L [28], effets comparables au ra lent issement des incorpora t ions totales de 30 p. cent et des modif icat ions sign~ficatives dans leur r6par t i t ion sur les polysomes de la peau. La bri6v.et6 des chass.es ne permet pas une est imation des dur6es de vie de chaque esp6ce de RNA mats seulement de leur stabilit6 duran t cette p6.riode. C'est le cas .des fract ions 12S et 9 et 11 jours, qui pT6sentent un marquage plus 61ev6 par rappor t h celui des autres fra.ctions apr6s la chasse qu 'apr6s un apport .con.tinu .de pr6curseur , con t ra i rement h d 'autres fract ions comme le 24S de 9 jou,rs.

L ' impor tance du marquage pr6coce sur la frac- t ion 12LS 6tait apparue 1ors d 'exp6ri¢nces pr61imi- naires sur les RNA totaux extraits de peau de 9 jours [10]. Cette incorpora t ion se retrouvc h tons les st~des quelle que soit la dur6e de l ' i ncuba t ion et dans les deux types de polysomes mats elle est par t icu l i6rement 61ev6e darts les polysomes B de 8 et 9 jours. Elle se confi rme dans 1.es exp6.riences de chasse h 9, 11 et 13 jours. Ainsi cette esp6ce de RNA tr6s rap idement marqu6e qui se renouvel le et s 'accumule pendan t route la p6riode de diff6- renc ia t ion consid6r6e autorise h penser qu ' i l s 'agit d 'un messager s t a b l e .

Par con~re l e R N A 24S si actif aux stades 8 et 9 jours ne pr6sente pas les m6mes caract6res. On peut se demander s ' i l est un pr6curseur , comme des observations recueil l ies dans d 'autres syst6mes [29, 30] pour ra ien t le faire supposer, ou une forme t ransi toi re h un stade off le messager 12S devien- drait foncf ionnel dans le tissu. On peut pens.er aussi qu' i l s 'agit d 'un RNA propre h u n stade comme le 20S h 11 jours.

Ces questions pour ron t t rouver une r6ponse quand cette fract ion 12S purifi6e, isol6e des polysomes F et B sera utilis6e dans un syst~me acellu- laire r6alisant la synthbse des prot6.ines sp6cifi- ques de la peau. Des recherches s o n t e n cours pour obtenir h des stades plus jeunes les r6sultats acquis h par t i r de peau d 'embryons de 14 ]ours par Par t ing ton et al. E2] et pour pouvoir ident i f ier

BIOCHIMIE, 1'976, 58, n ° 5.

578 J. D e s v e a u x - C h a b r o l .

lc m e s s a g e r ties k @ a t i n c s h c e RNA d6j'h p r 6 s e n t et m 6 t a b o l i q u e m e n t tr6s ac t i f d6s 7 jou:rs.

l , ' 6 lude p r 6 s e n t e a l ' in t6 r6 t de s ' a p p l i q u e r h des quan t i t 6 s fa ib les de RNA e x t r a i t s de q u e l q u e s m g de peau j eune et de d o n n e r u n e r u e d ' e n s e m b l e de l '6volu t ion des p o l y s o m e s et des RNA d u r a n t la sp6c i a l i s a t i on d ' un t i ssu gr$ce h des s6r ies cxp6r i - m e n l a l e s h o m o g 6 n e s . Des r e n s e i g n c m e n t s p e u v e n t en O r e t ir6s sur la d i m i n u t i o n du m 6 l a b o l i s m e des RNA ,btudi6e au n iveau p o l y s o m i q u e et s u r les p h 6 n o m b n e s l "~ccoml)agnant : l ' i n c o r p o r a t i o n tr6s r a p i d e et r 6pa r t i e s u r de n o m b r e u s e s e spbces de RNA aux s t ades j e u n e s se r c t r o u v e au c n u r s de m a r q u a g e s p lus longs d a n s q u e l q u e s f r a c t i o n s sp6- c i f i ques tie s t ade aux ~ges p r o c h e s du d6bu t de la k6 ra t i n i s a l i on . 11 fant s o u l i g n c r que malgr6 la d o m i n a n c e q u a n t i t a t i v e des p o l y s o m e s l i b r e s d a n s le c y t o p l a s n l e , l ' ac t iv ih! s p 6 c i f i q u e des p o l y s o m e s li6s aux m e m b r a n e s est s u p 6 r i e u r e h tous les s t a d e s et que les RNA ex t r a i t s de ces d e u x t y p e s p r 6 s e n t e n l c h a c u n une i n c o r p o r a t i o n p a r t i c u l i b r e - m e n l ne t te su r la f r a c t i o n 12S.

R~SUM~..

L' incorporation d 'uridiue triti/ie dans la peau d 'embryons de poulet, explant~e h 7, 8, 9, 11 et 13 jours est ineub~e pendant soit 1 heure, soil 3 ou 4 heures, soit 1 heure suivie d 'une chasse h l 'aet inomycine, es¢ ~tudi~e au niveau des polysomes et au nivcau des RNA extrai ts des polysomes fibres dans le eytoplasme (F) et des polysomes li~s aux membranes (13).

L'activitti sp~ciflque des polysomes decroit suivant l'hge tandis que la qnantit~ des polysomes par rapport aux monosomes augmente grhce h l ' acc ro i s~ment des synth6ses peptidiques. A chaque stade, les polysomes B sont moins abondants mats plus radioaet ifs que les polysomes F.

Les RNA soar fraetionn~!s sur gradients de saecha- rose ; leur radioactivit~ totale acido-pr@ipitable et la radioaetivitt~ retenuc sur mHlipores h haute concen- trat ion saline enrrcspondant aux R,NA h poly-A de type messager, sont compar6cs pour chaque fraction.

La r6parti t ion de la radioactivit~ entre les diffd- rentes fractions des RNA 6vohle selon la durde de l ' ineulmlion d 'une part, selon l'~ge des explants d 'autre part, et d 'une mani6re diff6rente dans les RNA F et clans les R N A B : h 11.-13 jours, l ' ineorporat ion est tardivc, moins 61evde, mats rdpartie en plusieurs pies de R~NA messagers ; h 7-8 jours, les synth6ses sont tr6s abondantes et v:~ri~es pr@ocement ; h 9 jours, stade intermddiaire, les incorporat ions sont exceptionnelle- merit 61ev6es sur les fractions 12 et 24S des RNA B.

Dans les cinq stad~es t!tudi(!s, ee type de RNA 12S, pr~isent d6s le d~but de l ' incubation se renouvelle et s 'accumule comme le mont ren t les experiences de chasse ; ees observat ions laissent supposer sa stabilitd.

Or olr salt que chez les embryons de ponlet de 14 jours, le messager de la k~ratine plumaire s~dimente h 12S. Quoique nos experiences portent sur la peau totale, ear ce tissu en difftirencialion cst le si/~ge de n o m - b r e u s e s interactions entre derme et ~piderme, elles sugg6ren~ l ' identit~ de ee I~NA 12S avec le messager de la k~ratinc qui serait, alors, synthdtis~, par la peau quelques jours avant l 'appari t ion de ces protdines. Sa eap acit~ fonetionnelle a ux jeunes stades est h l 'dtude.

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Métabolisme des RNA de la peau embryonnaire de poulet