Method · 2020. 5. 7. · 1.1 ÄKTA Purifier 본체의 구성 Figure 1. AKTA Purifier 구성. Box 에는 AKTA Purifier 와 관련된 장비 및 소모품 들을 을 수 있는 공간이

내용

1 시스템의 구성 ....................................................................................................................................................................... 1

1.1 ÄKTA Purifier본체의 구성.................................................................................................................................... 1

1.2 ÄKTA System Flow path ........................................................................................................................................ 2

1.3 ÄKTA 사용을 위한 준비물 ................................................................................................................................... 4

2 ÄKTA 시스템 시작 .............................................................................................................................................................. 4

2.1 시스템과 UNICORN의 연결 ............................................................................................................................... 4

2.2 UNICORN 의 조작 모드 ........................................................................................................................................ 6

2.2.1 UNCORN Tool bar와 Task bar ................................................................................................................. 6

2.2.2 UNICORN 의 4가지 창 ............................................................................................................................... 7

3 시스템의 준비 ....................................................................................................................................................................... 7

3.1 린스 액의 체크 ......................................................................................................................................................... 7

3.2 펌프의 퍼지 (Purge; 기포 제거）.................................................................................................................. 9

3.3 펌프 세정（PumpWash） ................................................................................................................................. 10

3.4 시스템 세정（SystemWash） .......................................................................................................................... 11

3.5 딜레이 볼륨 세팅 (Delay volume setting)................................................................................................. 11

3.6 pH 적정 (pH probe Calibration) ................................................................................................................. 13

3.7 프레셔 영점 적정 (Pressure calibration) .................................................................................................... 14

4 컬럼 (Column) 의 연결 ................................................................................................................................................. 15

4.1 컬럼의 연결과 내압 설정 .................................................................................................................................. 15

4.2 컬럼 내의 20% Ethanol 제거 .......................................................................................................................... 16

4.3 컬럼 내의 D.W를 buffer로 치환 ................................................................................................................. 16

5 Injection valve (Injection valve, INV 907) 의 준비 ............................................................................................ 17

5.1 Syringe를 이용한 Manual Sample 충전 ................................................................................................... 17

5.2 Sample loops의 종류 ......................................................................................................................................... 18

5.3 Super loops의 종류 ............................................................................................................................................ 18

5.4 올바른 Manual Injection 방법 ........................................................................................................................ 19

6 Method 작성 ...................................................................................................................................................................... 21

6.1 크로마토그래피 Method와 컬럼의 설정 .................................................................................................. 21

6.2 Run Set Up의 다른 페이지(탭)로의 확인 항목 ...................................................................................... 27

6.3 Method의 저장 ..................................................................................................................................................... 28

6.4 작성한 Method의 확인과 표시 ..................................................................................................................... 28

7 Method 의 실행 ................................................................................................................................................................ 29

7.1 Sample 준비 ............................................................................................................................................................ 29

7.2 Sampleloop에서 Manual Sample 충전 ..................................................................................................... 29

7.3 Fraction collector의 확인 ................................................................................................................................. 30

7.4 Method실행 ............................................................................................................................................................ 30

7.5 강제 종료 .................................................................................................................................................................. 30

7.6 [System control] 화면의 표시 ......................................................................................................................... 31

7.7 [System control] 화면의 설정 ......................................................................................................................... 32

7.7.1 Run Data .......................................................................................................................................................... 32

7.7.2 Curves ................................................................................................................................................................ 33

7.7.3 마커의 표시 ................................................................................................................................................... 33

7.7.4 Curve의 색과 선 종류의 변경 .............................................................................................................. 34

7.7.5 Y축의 스케일 변경 ..................................................................................................................................... 34

7.7.6 X축의 스케일 변경 ..................................................................................................................................... 35

7.7.7 Curve 확대하기 (참고: 8.2.3) ................................................................................................................ 36

7.7.8 Tool bar ............................................................................................................................................................ 36

7.7.9 Manual 명령 ................................................................................................................................................... 37

7.7.10 자주 사용하게 되는 Manual instructions의 소개 .................................................................... 37

8 데이터 처리（프린트 아웃） ...................................................................................................................................... 42

8.1 데이터의 호출......................................................................................................................................................... 42

8.2 화면 표시 .................................................................................................................................................................. 42

8.2.1 Curve의 선택 ................................................................................................................................................. 43

8.2.2 축의 설정 ........................................................................................................................................................ 43

8.2.3 Zoom Up .......................................................................................................................................................... 44

8.3 Column Packing 후 Evaluation 수행 ........................................................................................................... 45

8.4 Plate height, Asymmetry 값의 분석............................................................................................................. 46

8.5 크로마토그램의 프린트 아웃 ........................................................................................................................... 47

9 시스템 유지 관리 ............................................................................................................................................................. 48

9.1 장비 관리 방법 ...................................................................................................................................................... 48

10 Supplement ......................................................................................................................................................................... 49

10.1 ÄKTA system Platform ........................................................................................................................................ 49

10.2 ÄKTA 관련 소모품 code number ................................................................................................................. 50

10.3 GE Healthcare Life Sciences Korea Home page ..................................................................................... 52

10.4 GE와 함께하는 실험길라잡이 ......................................................................................................................... 52

10.5 [ÄKTA lecture site] ................................................................................................................................................ 53

부록: 크로마토그라피의 기본 원리 및 Column 의 소개. ....................................................................................... 54

1. 젤 여과 크로마토그라피 ........................................................................................................................................ 54

2. 이온 교환 크로마토그라피 (Ionexchange chromatography) ................................................................ 55

3. 소수성 결합 크로마토그라피 ............................................................................................................................... 57

4. 친화성 크로마토그라피 (Affinity chromatography) ................................................................................... 58

`

- 1 -

1 시스템의 구성

해당 설명서는, 처음 ÄKTA Purifier100 을 사용하시는 분을 위한 한글판 사용설명서 입니다.

보다 자세한 사용 방법은, 장비와 함께 제공한 영문 설명서를 참조하십시오.

1.1 ÄKTA Purifier본체의 구성

Figure 1. AKTA Purifier 구성.

Box 에는 AKTA Purifier 와 관련된 장비 및 소모품 들을 넣을 수 있는 공간이 있습니다. Pump A, B 에서는

A, B 버퍼를 가져 올 수 있게 하며, Buffer switching valve 에서는 A1, A2 그리고 B1, B2 등의 같은 계열의

버퍼를 교체 할 수 있도록 해 줍니다. Mixer 는 A, B 버퍼를 섞어주는 기능을 가지고 있습니다. Inject valve

에서는 샘플을 주입하게 되는 Valve 이며, Outlet valve 는 반대로 Fraction collector 또는 Bottle 에 Fraction

sample 을 분리 해 주는 Valve 입니다.

- 2 -

1.2 ÄKTA System Flow path

Figure 2. AKTA system Flow path

A, B Buffer 가 System pump, Mixer, In-line filter 를 통하여 Injection valve 로 들어가게 됩니다. Injection valve 가

Load mode 라면 3⇒2⇒6⇒4 의 유로 그리고 7⇒1 의 유로로 진행이 됩니다. 이때 Sample 을 Injection

하게 되면 Sample loop 에 보관이 됩니다. Buffer 의 경우, 7⇒1 의 경로로 흐르고 있으며, Sample loop 를

거치지 않습니다. Inject valve 를 Inject mode 로 변경하게 되면, 버퍼 의 흐름이 7⇒1 이 아닌, 7⇒6⇒2⇒1 로

변경이 되면서 2⇔6 번 사이에 존재하는 sample loop 을 거쳐서, 안에 있는 Sample 을 Column 에 가져가게

됩니다. Column 에서 나온 elution sample 은 UV, Conductivity sensor, pH sensor 등을 거치게 되며

Fractionation 됩니다.

Figure 3. Inject valve, Loops, Flow restrictor, on line filter.

A. Sample loop

Injection valve V1 의 Port 2, Port 6 에 연결합니다. ÄKTA Purifier 10 에는 10μl, 100μl, 1 ml 의 Sample

loop 가, ÄKTA Purifier 100 에는 500μl, 2 ml 의 Sample loop 가 기본으로 포함되어 있습니다.

B. Super loop

150 ml 까지 Sample 을 첨가하는 경우는, Super loop (옵션)을 사용합니다. Super loop 은 10 ml, 50 ml, 150

ml 의 3 가지 종류가 있습니다.

C. Flow restrictor (FR 902)

Column 에서 기포가 발생되는 것을 방지하기 위해서 back pressure 생성시키는 파트로서, FR-902(0.2

Mpa)와 FR-904n (0.4 Mpa)의 2 종류가 있습니다. 기본으로 FR-902 를 제공하지만, RPC 의 고압 컬럼을

사용하는 경우에는 FR-902 를 FR- 904 로 교환 해야 합니다.

- 3 -

D. On-line filter

버퍼중의 불순물을 제거하기 위해서, Mixer 와 Injection valve 의 사이에 위치하고 있습니다.

Figure 4. Flow restrictor

FR-902 는 Column 내의 압력 차에 의한 Bubble 이 생기는 것을 방지 하기 위하여 반대로 압력을

주게 됩니다. 그렇기 때문에 Column 에 걸리는 실제 압력은 전체 압력에서 0.2Mpa 를 제외한 값이

됩니다. 즉, Max pressure value 가 0.3Mpa 인 Column 과 FR-902 를 함께 장착 할 경우, 실제 Column 이

견딜 수 있는 Max pressure 는 0.5Mpa 이 됩니다.

Figure 5. On-line filter

On-line filter 가 더러워 졌을 경우, Back-pressure 가 높아지며, 새로운 필터(18-1027-11: 10 개 포함)로

교환해야 합니다.

주의

Crude sample 을 Direct injection 하게 될 경우 On-line filter 가 매우 쉽게 막힐 수 있습니다.

- 4 -

1.3 ÄKTA 사용을 위한 준비물

컬럼＆ 컨넥터류

Sample

degas 처리한 3 차 증류수 500 m

Buffer

20 %에탄올

96 %에탄올

Disposable syringe Sample 의 양에 맞춘 용량)

Fraction collector 에서 사용할 tube (15ml & 50ml)

2 ÄKTA 시스템 시작

2.1 시스템과 UNICORN의 연결

① ÄKTA 본체의 메인 스위치를 넣습니다.

주의

② 컴퓨터 스위치를 ON 으로 합니다. 컴퓨터의 전원을 넣으면, 디스플레이에는

자동적으로 아래 그림과 같은 청색의 Login 화면이 나타납니다.

저온 실내에서 사용하는 경우, 결로방지를 위해 본체의 전원은

항상 ON 으로 합니다만, PC 를 켜기 전에 한 번 메인 스위치를 OFF 로 한 후

On 해주세요.

- 5 -

③ Windows 데스크탑상의 UNICORN 의 아이콘을 더블 클릭 합니다.

④ Logon 창이 표시됩니다. 여기에서는 User name 으로 default 를 선택해,

Password 에 ‘default’ 를 입력합니다.

⑤ ÄKTA 본체와 컴퓨터가 접속되면, UNICORN Manager 가 표시됩니다.

⑥ ÄKTA 본체와 컴퓨터가 접속된 것을 확인합니다. 화면 하부의 Task bar 가운데,

System Control 를 클릭합니다. Run data 의 Instruments 의 항목에“Ready”라고

표시되어 있는 것을 확인해 주세요. 이 때 컨트롤 보드 CU-950 의 LED 램프는

Power, PC 및 System 의 3 개 모두 점등되어야 합니다.

- 6 -

2.2 UNICORN 의 조작 모드

2.2.1 UNCORN Tool bar와 Task bar

UNICORN 에는 4 개의 조작 모드(UNICORN Manager, Method Editor, System Control,

Evaluation)가 있어, 화면 최 하단의 Task bar 에 아이콘이 표시되고 있습니다. 각각의

화면상단의 Tool bar 에는 여러 종류의 아이콘이 표시되고 있습니다.

Figure 6. Task bar

A. 파일 관리(Copy, Rename, Delete, Move 등) 하드 디스크에 보존된 파일의 리스트

표시

B. Method 의 작성, 변경, 편집

C. 시스템을 manual 조작, 또는 Method 를 실행

D. 데이터 처리. Chromatogram 의 프린트 아웃, 피크 면적계산 수

Figure 7. UNICORN Manager Tool bar

각종 작업을 간편하게 실행 할 수 있는 Tool bar 입니다.

- 7 -

2.2.2 UNICORN 의 4가지 창 [UNICORN Manager, Method Editor, System Control, Evaluation]

조작 모드의 전환：조작하고 싶은 모드의 아이콘을, Tool bar 또는 Task bar 로 부터

선택해 클릭합니다.

3 시스템의 준비

3.1 린스 액의 체크

시스템 사용 전에 린스 액이 줄어 들지 않았는지, 탁해지지 않았는지를 확인하신 후,

문제가 있는 경우 교환 해야 합니다. 린스액은, Pump 가 움직이고 있을 때에 순환합니다.

공기가 들어가 순환하지 않는 경우에는 Syringe 를 이용해, 린스 액을 세정합니다. 또는,

one way valve 를 초음파 세정합니다. Pump 에 접속되고 있는 린스 튜브가 빠져서

작동 하지 않는지도 확인해 둡니다. 펌프 피스톤의 뒤편을 린스 액(20% 에탄올) 으로 한

달에 한번 정도 교환하는 것을 추천합니다.

- 8 -

Figure 8. System Pump

펌프의 앞부분이 버퍼를 펌핑하는 장소입니다. 피스톤이 움직이면서 발생하게 되는 읍압은 실린더에

존재하는 공을 움직이게 되며, 이에 의하여 버퍼가 실린더에 들어가고 나가게 됩니다. 펌프의 뒤쪽

공간은, 펌프의 피스톤 린스액이 순환하는 장소입니다(A). 린스액을 넣어줘야 할 경우, 20% 에탄올을

보관 통에 채운 후, 펌프와 연결 되어있는 린스 라인 튜브를 뽑아 빼내어 Syringe 와 연결합니다. 그런

후, 천천히 당겨 에탄올을 채워주면 됩니다 (B).

주의

20% EtOH 린스 액이 없을 경우, Piston 과 Piston seal 사이의 마찰열이 발생하여

Piston seal 이 닳거나 망가집니다. 그렇게 되면 Pump 밖으로 EtOH 가 세어 나오거나

또는 버퍼와 EtOH 가 섞일 수 있습니다. 이를 방지하기 위하여 EtOH 의 량을, AKTA

Purifier 를 작동하기 전 미리 확인을 하는 것이 좋습니다. 만약 없다면 EtOH 가 빠져

나오는 관을 이용하여 Purging 을 수행합니다. 이때, 강한 음압을 걸게 되면 Pump

seal 이 망가질 수 있습니다. 천천히 수행하시기 바랍니다.

- 9 -

3.2 펌프의 퍼지 (Purge; 기포 제거）

여기에서는, A1, A2, B1, B2 의 4 개의 Inlet 튜빙의 퍼지 조작 예를 설명합니다.

Figure 9. 펌프의 퍼지

① 펌프 A 의 좌측의 펌프 헤드의 퍼지 밸브를 살짝 열고 Syringe 를 연결하신 후, Air 를 제거합니다.

주의

② 초순수 물이 Syringe 안에 들어오기 시작하면, 그대로 10 ml 흡인하고 밸브를 닫습니다.

③ 펌프 A 의 우측의 펌프 헤드에 대해서도, 1~2 의 조작을 합니다. 이것으로, 인렛 튜브 A1 의 퍼지가

종료됩니다.

④ 계속해, 펌프 B 의 2 개의 펌프 헤드에 대해서도, 동일한 조작을 합니다.

빠른 속도로 퍼지하면 갑작스런 음압에 의하여 기포가 발생합니다.

- 10 -

주의

3.3 펌프 세정（PumpWash）

펌프 내의 용액을 사용할 버퍼로 교환과 동시에 Inject valve 사이의 공간에 해당 버퍼로

채워주는 역할을 수행한다. 펌프 세정을 수행 중에는 Inject Valve 의 Waste line 으로

버퍼가 빠져나가게 됩니다.

[ PumpWash 의 유로： 버퍼 ⇒ 펌프 ⇒ Mixer ⇒ Injection valve(waste) ⇒ 폐수 튜브 W1 ]

Figure 10. PumpWashPurifier

1.1.1 Task bar 의 System Control 를 클릭합니다.

1.1.2 펌프 세정 명령어를 입력합니다(약 5 분에 자동 종료).

1.1.3 A1 (ON), A2 (OFF), B1 (ON), B2 (OFF) → Execute

; 이 경우, A1 과 B1 에 연결된 buffer 로 각각의 pump 내의 용액을 교환하게 됩니다.

(A 펌프, B 펌프 각각 하나씩의 Inlet tube 를 On 하여 수행 할 수 있습니다.)

주의

펌프에 가득 찬 상태에서 Flow 를 주었다면, 연결된 관 모두에 공기가 들어갔을 것

입니다. 이럴 때에는, 펌프 퍼징을 우선 한 뒤에, System wash 를 통하여 모든

공기를 제거와 동시에, 물 또는 버퍼로 채워 주어야 합니다. 만일, Column 에

공기가 들어갔다면, 20% EtOH 를 사용하여 Wash 를 수행 하여봅니다.

(Column 의 경우 공기가 들어가면, 제거도 쉽지 않으며, 결과물에 매우 부정적인

영향을 주게 되니 주의하여 주시기 바랍니다.)

PumpWash 중, 결코 Continue 버튼을 누르지 말아 주세요.

실행 중은 매뉴얼 조작을 받아들이지 않게 Pause 상태를 유지합니다.

Continue 버튼에 의해 강제 중지하면, 오동작 하는 일이 있기 때문에,

자동적으로 종료할 때까지 기다려야 합니다.

- 11 -

3.4 시스템 세정（SystemWash）

Sample 이 흐르는 Injection valve 로부터 아웃렛 밸브까지 세정하며 아웃렛 벨브의

Waste 로 나가게 됩니다. 약 5 분 후 세정은 종료됩니다.

3.5 딜레이 볼륨 세팅 (Delay volume setting)

Delay volume 이란 Sample 이 모니터링 되는 순간과 실제 수집되는 사이에서의 간극을

의미하며, 만일 모니터에서 검출되는 시점부터 즉시 Sample 을 수집하기 시작한다면 아래

그림에서와 같이 검출되기 이전의 것을 수집하게 되어 실제 Sample 을 잃어버리거나

묽어지는 수가 생기게 됩니다. 보통 초반에 엔지니어에 의해 설치가 되었을 경우에는

엔지니어가 입력을 하지만 혹시나 사용되는 tube 가 변동이 된다던가 하는 경우에는

사용자가 직접 측정을 해주어야 하며 이를 측정하는 방법은 2 가지가 있습니다. 첫 번째는

이론적으로 사용되는 tube 의 내경과 길이, 그리고 valve 등에서의 hold volume 등을

더하여 이론적으로 구하는 방법이며, 두 번째는 모니터에서부터 수집되는 부분까지 미리

물을 채워 넣고 루어를 사용하여 모니터에서부터 주사기를 통해 공기를 주입하여 수집된

물의 무게 또는 부피를 실질적으로 측정하는 방법이 있습니다. 이렇게 측정된 Delay

Volume 은 System control>Options>Special 부분에 입력을 해주시면 됩니다.

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Figure 11. Delay Volume Setting

① UV detector 와 Fraction collector 를 연결시키는 Tube 에 Buffer 를 흘려 가득 채웁니다.

② 튜브에 있는 Buffer 를 주사기를 이용하여 전량 회수 한 후 그 량을 정확하게 체크 합니다.

③ Unicorn 의 Task Bar: System control 에 들어갑니다.

④ System 탭을 선택 하신 후, Settings 에 들어갑니다.

⑤ Specials 를 클릭한 후, 튜빙 Volume 만큼 Delay volume 을 세팅 합니다.

⑥ ‘OK'를 선택 하시면 완료 된 것입니다.

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3.6 pH 적정 (pH probe Calibration)

pH electrode 의 경우 실험의 시작 전 수행 하여 주는 것이 좋습니다.

(pH electrode 의 보관방법은 Chapter9. 시스템 유지 관리를 참고 하세요.)

Figure 12. Electrode calibration

① Task bar: System Control 에 있는 System 탭에 들어갑니다.

② Calibrate 에 들어가신 후, Monitor 탭을 pH 로 변경 시켜 줍니다.

③ pH 적정용 Buffer pH7.0 과 pH 4.01 를 준비합니다.

④ Electrode 를 꺼낸 후, Electrode 의 앞부분이 잠기도록 버퍼용액에 넣어 놓습니다.

⑤ Calibration panel 의 오른쪽 Measure value 의 값이 안정화가 되면, Read Value 를 클릭합니다.

※ pH calibration 에 관한 자세한 동영상을 원하시면!

http://ap.gelifesciences.com/kor/esupport/main/akta/model/purifier/calibration


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3.7 프레셔 영점 적정 (Pressure calibration)

시스템에서 갑자기 기존보다 높은 압력이 걸리게 되면 일단 컬럼을 제거해 봅니다.

컬럼을 제거해서 원상태로 돌아온다면 컬럼 내부에서 문제가 있는 것이므로 컬럼을

청소하거나 교체를 해주어야 합니다. 하지만 컬럼을 제거하였는데도 불구하고 압력이

높게 걸리는 경우에는 유속을 주지 않은 채, 영점을 맞추기 위해 압력센서에 연결된

튜브를 풀어놓은 뒤 Calibration 에서 Pressure Sensor 의 Zero offset 을 해본 뒤 다시 점검을

진행합니다. 유속을 준 상태에서 압력이 높아진다면

I. Online filter 의 오염 여부

II. Loop 나 tube 중간이 막힌 곳이 있는 지 (연결부위를 하나하나 풀러 보면서 점검)

III. Flow restrictor 가 막혔는지 (Flow restrictor 제거 전후 비교)를 점검해볼 수 있습니다.

Figure 13. Pressure calibration

① Task bar: System Control

② System Panel 에서 Calibration 에 들어간 후, Monitor 에서 P900Press 를 선택 하여 줍니다.

③ Pressure sensor 의 G1/G2 valve 를 열어줍니다.

④ Start calibration 을 클릭합니다.

⑤ AKTA purifier 와 컴퓨터의 전원을 내립니다.

⑥ AKTA Purifier 를 작동시키고, Unicorn 에 접속하게 되면 Pressure 가 Zero 에 가 있는 것을 확인

할 수 있습니다.

※ Pressure calibration 에 관한 자세한 동영상을 원하시면!



- 15 -

4 컬럼 (Column) 의 연결

4.1 컬럼의 연결과 내압 설정

컬럼의 파손을 막기 위해서, 시스템의 내압 설정을 합니다.

입력하는 내압치는 컬럼에 따라서 다릅니다. 컬럼 설명서를 반드시 참조해 주십시오.

① UNICORN 에의 입력은, 매뉴얼 조작 화면으로부터,

Manual↓Alarms&Mon ⇒ Alarm_Pressure ⇒ HighAlarm(컬럼의 내압) ⇒ Execute

HiTrap column 의 경우, FR902 가 장착된 경우에는 0.5 Mpa, 없는 경우에는 0.3 Mpa 가

일반적으로 선택되지만, 장비의 상태에 따라 이 값은 달라질 수 있습니다.

② Column 에 연결하기 위해 flow 를 입력합니다.

[ Manual↓Pump ⇒ Flow ⇒ 0.5 ml/min ⇒ Execute ]

③ 컬럼에 공기가 들어가지 않게, drop-to-drop 으로 연결합니다.

④ Column 과 장비가 연결되면, END 버튼을 클릭해 종료합니다.

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4.2 컬럼 내의 20% Ethanol 제거

주의

컬럼의 Pressure limit 의 설정:

Manual↓larms&Mon ⇒ Alarm_Pressure ⇒ High Alarm(컬럼의 내압) ⇒ Execute

① 치환하는 컬럼 선택 밸브의 포지션을 선택

Manual↓Flowpath ⇒ ColumnPosition ⇒ 치환하는 컬럼 포지션 ⇒ Execute

② 유속의 설정

20% 에탄올이 컬럼에 남아 있는 동안은 백 프레셔가 높아집니다.

물로 바꿀 때 초기에는 조금 낮은 flow rate 으로 흘려 주세요.

③ 컬럼 볼륨의 3 배 이상 흘려서, UV, Cond, Pressure 커브가 안정되면 END 버튼을

클릭해 종료합니다.

4.3 컬럼 내의 D.W를 buffer로 치환

사용하고자 하는 버퍼에 루어를 넣은 뒤, 펌프 세정을 수행하여 줍니다 (3.3 참고). 펌프

세정이 끝나면 버퍼 치환을 원하는 컬럼으로 버퍼를 컬럼 볼륨의 4 배 정도를 흘려줍니다

(4.2 참고). 이때의 유속은 Max pressure 에 따라 조절하며, 컬럼 구매지 동봉되어 오는

매뉴얼을 참고 해 주시기 바랍니다.

20% 에탄올로 충전되어 있는 컬럼은, 사용 전에 반드시 3 차 증류수로 치환합니다.

- 17 -

5 Injection valve (Injection valve, INV 907) 의 준비

5.1 Syringe를 이용한 Manual Sample 충전

여기에서는, Sampleloop 를 사용하고, Syringe 로 Sample 을 주입하는 방법에 대해

설명합니다.

먼저 올바르게 배관이 되고 있는지를 확인합니다.

① Injection valve 의 Port 2 번과 6 번 Port 에 Sample loop 를 연결 합니다.

② Injection valve Port 3 에 Injection fill Port 를 접속합니다.

③ Injection valve Port 4 및 5 에 연결되고 있는 테플론 튜빙이 폐수 bottle 에 들어가 있는

것을 확인합니다.

Figure 14. Injection valve flow path

Load mode – Sample 을 Sample loop 에 Load 할 때 선택합니다.

Injected sample 의 flow path: 3 ⇒ 2 ⇒ (Sample Loop) ⇒ 6 ⇒ 4 (Waste)

Buffer flow: 7 ⇒ 1 ⇒ Column valve ⇒ Outlet valve

Injection mode – Sample loop 에 있는 Sample 을 Column 에 보낼 때 선택합니다.

Injected sample 의 flow path: 3 ⇒ 5 (Waste)

Buffer flow: 7 ⇒ 6 ⇒ (Sample loop) ⇒ 2 ⇒ 1 ⇒ Column valve ⇒ Outlet valve

Sample 을 sample loop 로 Loading 할 때는 Load mode 에서 수행을 하셔야 하며, Inject mode

에서 sample 을 넣게 되면 Waste 로 빠져나가니 주의해 주시기 바랍니다. (7.2 참고)

주의

Injection valve 의 Port 4 의 폐수 튜브에 FR-902 가 장착되어 있는 경우는, 제거합니다.

해당 포트에 FR-902 를 장착하게 되는 경우는, Sample loop 또는 Super loop 가 아닌

Sample pump 를 이용한 sample 의 injection 일 경우 필요합니다. 해당 장소에서 FR-902 를

달지 않은 상태로 Sample pump 를 이용하게 되면 Injection valve 에서 Column valve 로

가는 flow path 위에 Leak point 가 발생하게 되어 Sample 이 세어나 오게 됩니다.

- 18 -

5.2 Sample loops의 종류

Sample loop 는 1 ㎕, 10 ㎕, 100 ㎕, 500 ㎕, 1ml, 2ml 을 사용 하실 수 있습니다. 아래 그림을

이용하여 필요한 Sample loop 를 신청, 사용 해 주시기 바랍니다.

5.3 Super loops의 종류

Super loops 는 대량의 Sample 을 load 하기 위하여 사용됩니다. 간단하게, 큰 Sample loop

라고 생각하시면 됩니다. 작게는 10ml 부터 50ml, 150ml 까지 준비가 되어있습니다.

Figure 15. Super loop 의 조립 및 연결 방법

① 유리관(4: Glass tube) 및 O-ring(5)이 달려있는 하얀 블록(2: Inner end piece; 3: Movable seal)을 물에

적혀 줍니다.

② 그 후, 3 번을 넣고 2-1 을 넣어줍니다(정확히 붙여서). 이때 해당 두 개 블록은 숫자가 큰 방향에

끼어져야 하며 블록의 O-ring 은 그 반대 방향(숫자가 작은 방향)으로 향합니다(그림과 동일).

③ 1-1 을 사용하여 고정을 하고, 6 번을 끼워줍니다.

④ 유리관에 물을 가득 넣어줍니다. 그런 뒤에 2-2 번을 유리관에 넣어줍니다.

⑤ 마지막으로 1-2 번을 끼워 정확히 고정을 시켜줍니다.

⑥ 숫자가 큰 방향으로 연결된 Tube 는 Injection valve 6 번 포트에 연결 하여 주며, 작은 방향에 연결된

Tube 는 Inject valve 의 2 번 포트에 연결 하여 줍니다.

⑦ 연결이 완료 되면, Inject mode 에서 Flow 를 약 5ml/min 으로 수행을 합니다. 그렇게 되면 조립 시

채워놓았던 물이 2-2 을 통과하여 빠져나가면서 Outlet valve 의 Waste line 을 통하며, 2-1 번과 3 번

사이에 Running buffer 가 채워집니다. 그리고 3 번 블록은 2-2 번과 붙게 되며, 해당 두 블록의 O-

ring 은 마주보게 됩니다.

- 19 -

⑧ Running buffer 로 가득 차게 되면 Pause 를 하고, Load mode 로 바꿔준 뒤 Continue 를 수행 하여

줍니다.

⑨ 그 뒤 Sample 을 주사기를 이용하여 Inject valve 에 넣어주게 되면 3 번, 2-2 번 사이에 Load 가 되며,

모두 Load 가 된 후, Inject mode 로 변경하게 되면 Column 으로 들어가게 됩니다.

Figure 16. Super loops 의 종류 및 Specifications.

5.4 올바른 Manual Injection 방법

Manual injection 을 수행할 때, injection loop Volume 의 2 배를 Loading 하거나, 그 용량의

반을 Loading 해야 합니다. 주사기로 넣게 되면 튜브의 가운데가 가장 압력이 강하게

걸림으로 아래와 같이 꼬깔 모양이 됩니다. Injection loop 의 두 배 Volume 을 넣게 되면

Loop 에 가득 차지만 소량의 샘플은 Waste 로 나가게 되며, 반을 줄여 Loop 에 걸게 되면

버려지는 Sample 이 없이 전량 Loading 됩니다. 이는 사용하고자 하는 Column 에 따라

선택하여야 합니다. 예를 들어, Gel filtration 을 하신다면, 전체 Column volume 의 2%되는

Sample (또는 그 이하)을 넣으셔야 하며, 정확하게 넣기 위하여 Injection loop 의 볼륨을

계산한 뒤 Loop 에 Loading 하셔야 합니다.

- 20 -

Figure 17. 올바른 Sample loop 이용 방법.

Sample 의 소실이 없이 Sample loop 에 Loading 하기 위해서는 Sample loop volume 의 1/2 을

Loading 하셔야 합니다. 만약, Sample loop 의 Volume 만큼의 Sample 이 필요할 경우 Loop volume 의

2 배만큼 Loading 하게 되면, 가득 채워지게 됩니다. 이때에 Sample 의 반은 소실에 되게 됩니다.

실험을 수행하기 전 자신에 맞는 Loading 방법을 선택하여 수행 하셔야 하며, 여의치 않으실 때는

Super loops 의 사용을 권해 드립니다.

- 21 -

6 Method 작성

6.1 크로마토그래피 Method와 컬럼의 설정

Method Editor Task bar 를 선택한 후, Method Wizard 를 선택합니다.

[ AKTA Purifier 10/100 을 선택 ⇒ Wizard 선택 ⇒ OK ]

① Main Selection: 원하시는 chromatography 를 선택합니다.

② Column: 사용하고자 하는 컬럼을 선택합니다.

③ Column position: 사용할 Column 의 위치를 설정

- 22 -

④ Flow Regulation of the system pump: 압력을 조절해 줍니다. (설정 하지 않아도

됩니다.)

단백질 detection 을 위해서, 280nm 가 기본으로 세팅 되어 있습니다.

측정하고자 하는 파장대가 있으시면, Wavelength 2 와 3 에 입력합니다.

① Start concentration B [0 -100]%B: B 버퍼를 A 버퍼와 섞어주는 량의 설정.

단백질의 경우 안정성을 확보하기 위하여 일정량의 염을 요구할 경우가 있습니다.

이러한 이유로 Binding Buffer 를, 염이 없는 A 버퍼만 사용하는 것 보다 100mM 정도의

염을 포함시켜 (B 버퍼를 섞어서) 실험을 수행하면 좀더 단백질의 안정성을 높일 수

있습니다.

② Equilibration Volume [0-999999]CV: 기존 컬럼의 보존액(예, 물 또는 20% EtOH)을 Running

버퍼로 교체 하여줄 때 Running 버퍼가 요구되는 량. (CV: Column volume)

일반적으로 4~5 CV 정도를 흘려주면 됩니다.

- 23 -

① Injection Technique: 샘플의 Injection 방식을 고릅니다.

Sample loop, Super loop 의 경우 Manual 을 선택합니다.

② Empty Loop with [0 – 9999] ml: 샘플을 Column 으로 가져가는데 사용할 버퍼 량.

Sample loop 를 사용할 경우 Sample loop 의 2~3 배 volume 을 사용하면 충분합니다.

Super loop 를 사용할 경우 Column 에 사용할 Sample 량만큼 넣어줍니다.

주의

Fraction collector 를 선택하며, Column 에 sample 을 loading 한 후, 2CV 량만큼 Running

buffer 를 사용하여 Wash 을 할 것인지 선택 할 수 있습니다.

Gel filtration 의 경우 Column volume 의 2%만큼의 Sample 을 Column 에 사용 할

수 있으며, Empty Loop with[0 – 99999]ml 의 경우 Sample loop 의 1.2 배만큼

사용하여 줍니다.

- 24 -

① Flow through Fractionation: Flow through 를 Fraction collector 를 통해서 받을 것인지

결정합니다.

② Fraction Volume: 각각의 Fraction 량을 결정합니다.

③ Tube Type: Fraction collector 에 사용할 Tube 의 사이즈를 결정합니다.

④ Start at: Fraction collector 의 어느 지점에서 시작할 것인지 결정합니다. (First tube 선택)

First tube: 처음 Tube 부터 Fraction 시작.

Next tube: 전에 작업한 Tube 다음부터 Fraction 시작.

Elution 에 사용 할 Fraction collector 를 선택하고, Fractionation 의 방식을 선택 하여

줍니다.

① Fixed volume and Peak Fractionation: 각각의 Fraction 을 고정된 량으로 받으며, Peak 만

받습니다.

② Fixed volume: 각각의 Fraction 을 고정된 량으로 전부 받습니다.

③ Peak Fractionation: Peak 만 받습니다.

④ Fraction volume [0 – 99999] ml 0 = OFF: 각각 Fraction 의 Volume 을 설정합니다.

⑤ Tube Type: 사용할 Tube 을 설정해 줍니다.

⑥ Start at: Next tube 를 선택 하여 줍니다. 만약, 앞의 Flow through 를 받지 않았다면 First

tube 를 선택 하셔도 됩니다.

- 25 -

Fixed volume and Peak fractionation 을 선택 하였을 때 활성화 되는 창입니다.

Peak 이 아닌 것의 Fractionation 은 앞의 Fraction volume 으로 Fraction 되며, Peak 이

나타날 경우 해당 창에서 설정한 값으로 Fractionation 됩니다.

선택지의 내용은 위와 동일합니다.

① Elution Technique: Elution 을 하는데 사용할 방법을 선택합니다.

첫 실험일 경우, Linear gradient 를 선택합니다. 이 경우, B 버퍼를 조금씩 추가해 가며

Elution 을 수행하며, Elution 의 조건을 살펴 보는데 매우 유용한 선택지 입니다.

- 26 -

Isocratic: 단일 용매로 elution 하는 경우에 선택. Sample 의 첨가 종료직후부터

fraction 회수를 시작합니다. Desalting 의 경우는 Isocratic 를 선택합니다).

Isocratic with Delayed Fractionation: Void volume 분을 회수하지 않는 겔 여과

크로마토그래피 인 경우에 선택합니다.

Linear Gradient: 기본적인 Linear Gradient 입니다.

Segmented Gradient Advanced: 9 단계까지의 Step 및 Gradient 을 작성하는

경우에 선택합니다. 각 단계에서 Step 또는 Gradient 를 선택할 수 있습니다.

② Target Concentration: B 버퍼가 투입되는 퍼센트를 결정합니다. 100%의 경우 B 버퍼만

들어갑니다.

③ Gradient Length[0 – 999999] CV: 위에서 설정한 B 버퍼의 Target Concentration 까지

도달하는데 까지 사용되는 버퍼의 Volume.

④ Use Cond or ConcB to Start and Stop Fractionation: No 를 선택 하여 줍니다.

⑤ Clean after Elution at 100%B [5CV]: Elution 이 끝나고 B 버퍼를 Column volume 의 5 배만큼

넣어 씻어줍니다.

⑥ Reequlibration after Elution[5CV]: Elution 또는 위의 Cleaning 단계가 끝나면 A buffer

100%로 다시 씻어 줄 것인지 선택 하는 것 입니다.

실험을 끝내고 다음날 해당 버퍼로 다시 수행 할 경우 Reequlibration after Elution[5CV]을

수행해 놓으면 됩니다. 염이 많이 들어있는 경우 물로 보관 해야 하며, 장기간 보관 시

20% EtOH 로 보관합니다.

Wizard 를 통하여 만든 Method 상태를 보여주며, 전체적으로 살펴본 뒤, 재 설정 할

것이 있으면 수정 한 후, 저장합니다.

- 27 -

6.2 Run Set Up의 다른 페이지(탭)로의 확인 항목

[Frac-950 의 fraction 조건 설정]

Rack: 여기서 표시되는 Rack 이, Wizard 로 지정한 Rack 과 일치하는지 확인합니다.

Fraction order: Fraction 방향 (4 종류 중에서 선택)을 선택합니다.

[Gradient 의 페이지]

이 Method 의 경사 커브가 표시됩니다. X 축을 클릭하면, 베이스(min / ml / CV)의 변환이

생깁니다.

- 28 -

6.3 Method의 저장

File↓Save As... (을)를 선택합니다.

Method Name: 파일명을 입력합니다.

Technique: 방법을 선택합니다.

Method 는 이 화면에서 선택한 디렉터리에 저장됩니다. 입력/선택 후, OK 버튼을

클릭합니다.

주의

6.4 작성한 Method의 확인과 표시

화면 최하단의 Task bar 로부터 UNICORN Manager 아이콘을 클릭합니다.

보존한 파일을 여는 경우, 파일명을 더블 클릭 합니다. 좌측의 Method 창에 표시됩니다.

Method 를 실행하면, Method name 의 뒤에“001”로부터 시작되는 번호가 붙은

Result 파일이 작성됩니다.

- 29 -

7 Method 의 실행

Sampleloop 를 사용한 Sample 첨가 방법과 Method 의 실행 순서를 설명합니다. Task bar 의

System Control 를 클릭합니다.

7.1 Sample 준비

Sample 은 반드시 사용 직전에 0.2μm 의 필터로 여과 해 주세요. 이온 교환의 경우에는,

Sample 의 염농도, 버퍼 pH 에도 주의가 필요합니다.

7.2 Sampleloop에서 Manual Sample 충전

① Injection valve 부근의 배관이 Sampleloop 용으로 되어있는지, 확인합니다.

② Sample 량에 맞은 용량의 Sampleloop 를 Injection valve Port 2 와 Port 6 에 연결합니다.

③ Injection valve 의 포지션이 Load 인 것을 확인해, 버퍼를 채운 Syringe 를 Port 3 에

접속하고, Sampleloop 내를 세정합니다.

(Sampleloop 체적의 3 배량 이상의 버퍼로 세정합니다.）

④ Sampleloop 용량보다 조금 좀 많은 Sample 을 Syringe 에 채워 Port 3 에 꽂아, 천천히

주입합니다.

⑤ Method 시작 후, Sample 이 컬럼에 주입될 때까지는, Syringe 는 절대로 뽑지 않습니다.

Figure 18. Inject valve 의 Flow path (5.1 참고)

주의

Sample 이 컬럼에 첨가되기 전에 Syringe 를 뽑아 버리면, 루프내의 Sample 액이

Injection valve Port 4 로부터 배출됩니다.

- 30 -

7.3 Fraction collector의 확인

Fraction collector 에 필요한 수의 시험관이 준비되어있는지 확인합니다. Frac-950 에서는

Rack 의 종류, Frac-900 에서는 튜브 센서의 위치도 아울러 확인합니다.

※ Flow through fractionation 이 Outlet valve F3 로 지정되어 있는 경우, 저장 용기에 F3 과

연결된 tubing 이 위치하고 있는지를 확인해 주십시오.

7.4 Method실행

① 실행하고자 하는 method 를 선택하고, OK 버튼을 클릭합니다.

② Method 작성으로 지정한 파라미터가 확인을 위해 표시됩니다. 내용을 확인해

[Next]를 클릭합니다.

③ Frac-950 을 사용하고 있는 경우는, 아래와 같은 창이 표시됩니다.

④ Rack, Fraction order 를 재확인합니다.

⑤ Start 버튼이 표시되는 마지막 창까지, Next＞버튼을 클릭해, Start 버튼을 클릭합니다.

7.5 강제 종료

실행중의 Method 를 강제 종료시키는 경우는, 다음과 같이 조작합니다.

① 화면상부의 tool bar 로부터 END 버튼을 클릭하면, End Method 다이얼로그 박스가

표시됩니다.

② 강제 종료까지의 데이터를 보존해 두고 싶은 경우는, 여기서 표시되는 save partial

result 의 체크를 제외하지 않고 OK 버튼을 클릭합니다.

- 31 -

7.6 [System control] 화면의 표시

Figure 19. System Control 의 화면

Rundata: System 의 상황을 실시간으로, 그리고 수치로 나타내어줍니다.

Curves: Rundata 에 의하여 연속성 있게 그려지는 커브 입니다.

Flow Scheme: Flow Path 를 알기 쉽게 나타내어 줍니다.

Logbook: 작동 명령을 확일 할 수 있습니다.

Figure 20. Customize panes

Rundata, Curves, Flow Scheme, Logbook 창을 활성/비활성화 시킬 수 있습니다.

- 32 -

7.7 [System control] 화면의 설정

7.7.1 Run Data

① Run Data 창에 커서를 이동시켜, 마우스의 오른쪽 버튼을 클릭합니다.

② Properties 를 선택해, Run Data Groups 의 페이지를 표시합니다.

③ 표시하고 싶은 항목을 클릭해, 체크합니다.

④ 지정한 레이아웃을 보존하는 경우는, New Group 를 클릭해, 레이아웃을 지정하여,

그룹 명을 입력합니다.

⑤ OK 버튼을 클릭합니다.

- 33 -

7.7.2 Curves

① Curves 창에 커서를 이동시켜, 마우스의 오른쪽 버튼을 클릭합니다.

② Properties 를 선택해, Curves 의 페이지를 표시합니다.

③ 표시하고 싶은 항목을 클릭해, 체크합니다. 한번 더 클릭하면 해제됩니다.

④ 모든 커브를 표시하고 싶은 경우는, Select All 버튼을 클릭합니다.


7.7.3 마커의 표시

마커를 통하여, 원하는 Curve 의 특정 포인트 값을 살펴볼 수 있습니다.

① Curves 창에 커서를 이동시켜, 마우스의 오른쪽 버튼을 클릭해, Marker 를

선택합니다.

② 커서를 마우스로 드래그 해서, 값을 읽고 싶은 위치까지 이동합니다.

③ 커서가 있는 위치의 X 축, Y 축의 값이 창 우측 상부에 표시됩니다.

④ 표시하는 값의 변경은 X 축, Y 축을 클릭해, 보고 싶은 축을 표시합니다.

⑤ 커서를 지우는 경우는 마우스의 오른쪽 버튼을 클릭해, Marker 를 클릭합니다.

- 34 -

7.7.4 Curve의 색과 선 종류의 변경

① Curves 창에 커서를 이동시켜, 마우스의 오른쪽 버튼을 클릭해, Properties 를

선택합니다.

② Curve Style and Color 페이지를 선택합니다.

③ 리스트로부터 커브의 색과 선의 종류를 선택합니다.

④ OK 버튼을 클릭합니다.

7.7.5 Y축의 스케일 변경


선택합니다.

② Y 축에서 Auto 로 선택하시면 전체 면적이 표시됩니다. 고정 축으로 변경할

수도 있습니다.

- 35 -

③ Y-Axis 의 페이지를 클릭합니다.

④ 고정 축에서 표시하고 싶은 커브를 선택해서 Fixed 버튼을 클릭해, 표시하고

싶은 범위를 입력합니다.

⑤ 다른 커브에 대해서도 동일하게 실시합니다.

⑥ OK 버튼을 클릭합니다.

7.7.6 X축의 스케일 변경


선택합니다.

② X 축을 클릭하면, Time(min), Volume(ml) 표시의 변환이 생깁니다.

③ X-Axis 의 페이지를 클릭합니다.

④ Time (min) 또는 Volume(ml)을 선택 합니다.

- 36 -

⑤ 축의 스케일을 선택해, Total 또는 Window 를 선택 합니다. Total 은 실행중인

커브가 모두 화면에 표시되며, Window 는 지정한 범위만 표시됩니다.

⑥ OK 를 클릭합니다.

7.7.7 Curve 확대하기 (참고: 8.2.3)

① 확대하고 싶은 범위를 드래그 합니다.

② 마우스의 버튼을 놓으면, 드래그를 수행한 범위가 확대됩니다.

③ 반복하면 한층 더 확대할 수 있습니다.

④ 이전 화면으로 되돌리는 경우는 마우스의 오른쪽 버튼을 클릭해서, Undo

Zoom 를 선택합니다.

⑤ Zoom 을 해제해서 원래 사이즈로 되돌리는 경우는 마우스의 오른쪽 버튼을

클릭해서 Reset Zoom 를 클릭합니다.

7.7.8 Tool bar

Run: Method 가 실행되고 있을 때는 그레이로 비활성화 됩니다.

Hold: Flow 를 멈추지 않고, 지금의 상황을 유지하고 싶은 경우에 클릭합니다.

(Method 의 내용은 Continue 버튼이 클릭될 때까지 정지합니다.)

Pause: Flow 를 멈추어 지금의 상황을 일시 정지하고 싶은 경우에 클릭합니다.

(Method 의 내용은 Continue 버튼이 클릭될 때까지 정지합니다. 시스템에

에러가 일어났을 경우 자동적으로 Pause 가 됩니다.)

Continue: Hold, Pause 를 해제 합니다.

End: 실행하고 있는 Method 를 중단, 종료합니다.

- 37 -

7.7.9 Manual 명령

Figure 21. Manual instruction 실행

Method 실행은, 6 장에서 설명한 Wizard 뿐만 아니라, Manual 조작을 통하여 명령을 추가하거나 변경

실행 수 있습니다.

도구모음의 Manual 또는 Run Data 에 있는 화살표를 클릭하면, Manual instruction 창이 활성화 됩니다.

해당 창에서 원하는 실행명령들을 Insert 하여, Execute 를 클릭합니다.

(하나의 명령인 경우, Insert 할 필요 없이 바로 Execute 하게 되면, 수행하게 됩니다.)

7.7.10 자주 사용하게 되는 Manual instructions의 소개

A. Flow

- 38 -

B. Gradient

C. PumpWashPurifier

D. SystemWash

E. InjectValve

- 39 -

F. ColumnPosition

G. OutletValve

H. PumpAInlet

I. PumpBInlet

- 40 -

J. Wavelength

K. AutoZeroUV

L. Alarm Pressure

M. Man Fractionation

- 41 -

N. FractionationStop

O. Set Mark

P. End Timer

Q. Pause Timer

- 42 -

8 데이터 처리（프린트 아웃）

8.1 데이터의 호출

① Task bar 의 Evaluation 를 클릭합니다.

② 파일을 지정합니다. (File ⇒ Open ⇒ Result...)

③ Open Result 창 중에서 목적의 파일을 선택해, OK 버튼을 클릭합니다.

8.2 화면 표시

① 표시된 Curve 창에 커서를 이동해, 마우스의 오른쪽 버튼을 클릭합니다.

② 메뉴로부터 Properties 를 선택합니다.

③ Chromatogram Layout 창가 표시됩니다.

- 43 -

8.2.1 Curve의 선택

① Curves 페이지를 클릭합니다.

② 화면 표시하고 싶은 커브를 지정합니다. 체크하고 있는 것이 표시됩니다.

(지정을 해제하는 경우는 한번 더 클릭합니다.)

③ OK 버튼을 클릭합니다.

8.2.2 축의 설정

① Y-Axis 페이지를 클릭합니다.

② 축의 설정을 하고 싶은 커브를 클릭해 선택합니다.

③ 선택한 커브의 스케일 표시를, Auto 또는 Fixed 로 표시할 수 있습니다.

- 44 -

④ 3 개의 UV 커브를 같은 스케일로 표시하고 싶은 경우는, All with this unit 를

클릭합니다.


⑥ X-Axis 페이지를 클릭합니다.

⑦ X 축의 베이스(시간, 볼륨, 컬럼 볼륨)의 지정과 스케일 표시를, Auto(또는 Fixed)로

표시할 수 있습니다.

⑧ Adjust retention zero to injection number 를 체크하면, Sample 첨가 시점의 Retention

time (볼륨)을 0 min(ml)로서 표시합니다.

⑨ OK 버튼을 클릭합니다.

8.2.3 Zoom Up

커브의 임의의 범위를 Zoom Up 할 수 있습니다.

① Zoom Up 하고 싶은 범위에 커서를 이동합니다.

② 마우스의 왼쪽 버튼을 드래그 합니다.

③ 점선이 표시되기 때문에, 그 점선으로 Zoom Up 하고 싶은 범위를 둘러쌉니다.

- 45 -

④ 키보드의 Page Down 으로 Zoom In, Page Up 으로 Zoom Out 이 됩니다.

⑤ Zoom Up 을 해제하는 데는, Curve 창의 마우스의 오른쪽 버튼을 클릭합니다.

⑥ Properties 에서 Reset zoom 를 클릭하면 원래 화면으로 돌아옵니다.

8.3 Column Packing 후 Evaluation 수행

① Task bar: Evaluation 으로 들어갑니다.

② Column packing date 를 불러온 후, Peak Integration 을 클릭합니다.

③ 사용한 UV 범위를 선택하고, 나타내고 싶은 테이블을 Target peak table 에서

선택합니다.

④ Column height, Column Volume 을 넣어줍니다.

- 46 -

8.4 Plate height, Asymmetry 값의 분석

Plate height: 한 단의 높이.

Plate / meter (N/m): 미터당 단의 개수.

Asymmetry: Elution value 에서 Peck height 의 10%에 해당하는 지점의 전 / 후 폭의

비율. 일반적으로 1.0 이 이상적인 값이며, Gel filtration 의 경우 0.8-1.2 의 범위가

이상적입니다.

미터당 단의 개수는 Column 마다 권장하는 것이 다릅니다. 그렇게 때문에 Column

manual 을 참고하여 주시기 바랍니다.

Plate height / Bead diameter value 가 1~2 정도가 되어야 이상 적입니다. 이는 Bead 가

정상적으로 한 단 을 이루는 가를 알아보는 계산입니다.

※ Column packing 에 관한 work shop 이 준비 되어있습니다. 날짜를 확인 하신 후 신청해

주신다면, 많은 도움이 되실 것입니다.

http://ap.gelifesciences.com/kor/esupport/workshop

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8.5 크로마토그램의 프린트 아웃

① 표시되고 있는 Chromatogram 을 프린트 아웃 합니다.

(File ⇒ Print ⇒ Print Chromatograms 창을 표시합니다. )

② Print format 를 선택합니다.

③ 굵은 라인으로 프린트 아웃하고 싶은 경우는 Use thick lines 를 체크합니다.

④ Preview 를 클릭하면 Customized Report 화면이 표시되어 여기서 프린트 아웃의 프리뷰를

확인할 수 있습니다.

⑤ Exit 버튼으로 프리뷰를 종료합니다.

이 화면으로부터 레이아웃의 변경 및 리포트 포맷으로서의 보존도 가능합니다.）

⑥ OK 버튼을 클릭합니다.

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9 시스템 유지 관리

9.1 장비 관리 방법

A. System 의 Eluent Leakage 를 확인합니다.

B. 압력이 증가할 때는 on-line filter 를 점검하고 교체합니다.

C. Eluent 를 바꿀 때는 trapped air 를 제거하기 위해 pump wash 를 사용하여 1 분 이상

퍼지 합니다.

D. pH electrode 는 사용 전에 calibration 합니다.

E. pH electrode 를 사용하지 않을 경우, flow cell 에서 제거하여 pH 4 buffer 와 1M KNO3 의 1:1

mixture 에 항상 보관합니다.

F. UV cell, pH flow cell, conductivity flow cell 의 cleaning 을 포함한 system 의 cleaning 은 1M

NaOH 를 사용하여 한 달에 한번 20 - 30 분 동안 1ml/min 로 cleaning 하고, 곧바로

D.W 로 충분히 washing 합니다.

G. Rinsing solution 은 항상 20% ethanol 을 사용하고 주기적으로 교체합니다.

H. 3 일 이상 사용하지 않을 경우 D.W 로 system 을 washing 하고, 모든 tubing 과 flow

path 는 20% ethanol 로 채워 둡니다.

주의

pH probe 를 사용하지 않으면 Dummy 를 넣어 두어야 합니다. 특히, NaOH 로

Washing 하는 경우 절대 pH probe 가 장착되어 있으면 안됩니다. 또한 FR-904 의 장착은

pH probe 와 함께 장착이 불가능 합니다. pH probe 가 FR-904 에 의하여 발생하는

0.4Mpa 을 견디지 못하기 때문입니다.

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10 Supplement

10.1 ÄKTA system Platform

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10.2 ÄKTA 관련 소모품 code number

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10.3 GE Healthcare Life Sciences Korea Home page (http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/Home/ko/GELifeSciences-kr/)

10.4 GE와 함께하는 실험길라잡이 (http://ap.gelifesciences.com/kor/esupport/main)

http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/Home/ko/GELifeSciences-kr/http://ap.gelifesciences.com/kor/esupport/main

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10.5 [ÄKTA lecture site] (http://ap.gelifesciences.com/kor/esupport/sitemap)

http://ap.gelifesciences.com/kor/esupport/sitemap

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부록: 크로마토그라피의 기본 원리 및 Column 의 소개.

단백질은 여러 특성을 가지고 있습니다. 첫 번째로, 단백질을 구성하고 있는 아미노산의 종류 와,

3 차 구조에 의하여 고유한 전기적 성향을 가지고 있습니다. 이러한 고유한 전기적 성향은

Isoelectronic point (pI)를 가지게 하며, 이온교환 크로마토그라피는 이를 응용하여 원하는 단백질을

정제 합니다. 두 번째, 특정 단백질은 특정 아미노산 시퀀스를 지니거나 클로닝을 통하여 표지인자를

붙일 수 있습니다. 이러한 표지인자 또는 특정 아미노산 시퀀스에 특이적으로 결합 할 수 있는

친화성 분자를 이용하여 원하는 단백질을 얻을 수 있습니다. 세 번째, 단백질은 다양한 크기를

지니고 있습니다. 젤 여과 크로마토그라피의 레진은 특정 크기의 구멍을 지니고 있어 작은 단백질은

해당 구멍으로 들어가게 되며, 빠져 나오는데 까지 오랜 시간이 걸리도록 유도합니다. 그래서

상대적으로 큰 단백질은 구멍에 들어가지 못하여 빨리 빠져 나오게 됩니다. 네 번째, 단백질은

소수성의 특징을 지닐 수 있습니다. 이러한 특징을 이용하여, 다수의 염이 있는 조건에서 레진과

소수성 결합을 유도하고, 염을 제거함으로써 원하는 단백질을 얻는 등으로 응용됩니다. 이러한 특징

중 하나만 사용하여 정제하는 것은 순도 측면에서 좋지 않으며, 적어도 두 가지 이상을 혼합하여

사용하는 것을 추천 드립니다.

1. 젤 여과 크로마토그라피 (Gel filtration chromatography / Size exclusion chromatography)

Figure 1. 젤 여과 크로마토그라피의 원리

크기가 작은 단백질의 경우 레진을 통과하면서 내려와야 하기 때문에 크기가 큰 단백질에 비해 느리게

내려오게 됩니다. 이를 응용하여 크기 별로 분리 해 낼 수 있으며, 또한 샘플이 존재하는 버퍼를

교환하는데 사용 할 수 있습니다.

[Gel Filtration Selection Guide(Code: 18-1124-19)를 참고하십시오. ]

http://www2.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/4a0f132842ea4d354a25685d0011fa04/b2940c7029eb21aa4925755f002d74bd/$FILE/gel_filtration_columns_and_media.pdf

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2. 이온 교환 크로마토그라피 (Ionexchange chromatography)

Figure 2. 음이온 교환 크로마토그라피 와 양이온 교환 크로마토그라피의 비교

음이온 교환 크로마토그라피에 사용되는 레진의 경우 양의 전하를 띄고 있습니다. 그렇기 때문에 음의

전하를 띄는 단백질을 분리 할 때 사용 합니다. 양이온 교환 크로마토그라피는 음의 전하를 띄고 있으며,

양의 전하를 띄는 단백질을 분리 할 때 사용 합니다. 버퍼의 선택 또한 원하는 레진에 방해가 되지 않는

전하를 가지는 것을 선택하는 것이 좋습니다.

[Ion Exchange Selection Guide Code no: 18-1127-31 을 참고하십시오.]

Table 1. Buffer for cation exchange chromatography

http://www2.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/AttachmentsByTitle/korea_esupport1/$FILE/18112731AH.pdf-%20IEX%20selection.pdf

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Table 1. Buffer for anion exchange chromatography

- 57 -

3. 소수성 결합 크로마토그라피

(Hydrophobic interaction chromatography)

Figure 3. hydrophobic interaction chromatography

HIC 는 단백질의 소수성 차이에 따라 단백질을 분리합니다. 이러한 분리는 단백질과 크로마토그래피 매질의

소수성 표면 간의 가역적인 상호작용에 발생합니다. 이 상호작용은 높은 이온 강도를 가진 완충액에 의해

향상됩니다.

[Hydrophobic Interaction Chromatography Selection Guide(Code: 28-4110-07)를 참고하십시오. ]

https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1314742967685/litdoc11003452AF_20110831010912.pdf

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4. 친화성 크로마토그라피 (Affinity chromatography)

Figure 4. 친화성 크로마토그라피의 원리

AC 는 단백질(혹은 단백질 집단)과 크로마토그래피 매트릭스에 부착된 특이 리간드 간의 가역적인

상호작용을 기초로 하여 단백질을 분리합니다. 적합한 리간드가 사용 가능하다면 언제든지 AC 를 이용할

수 있습니다. 표적 단백질은 상보적 결합 물질(리간드)에 특이적, 가역적으로 부착합니다. 시료는 특이적

결합이 잘 일어나는 조건 하에 적용됩니다. 결합되지 않은 물질은 씻겨 내려가고 결합된 표적 단백질은

탈착이 잘 일어나는 조건으로 바꾸어 줌으로써 회수됩니다. 탈착은 경쟁적 리간드를 이용하여 특이적으로

이루어지거나 pH, 이온 강도 혹은 극성을 변화시켜 비특이적으로 탈착이 일어나게 합니다. 결합하는 동안

농축된 단백질은 정제되고 농축된 형태로 회수됩니다.

[Affinity Chromatography Selection Guide (Code: 28-9365-50) 를 참고하십시오. ]
https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1336733513434/litdoc18112186_20130705231106.pdf

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Method · 2020. 5. 7. · 1.1 ÄKTA Purifier 본체의 구성 Figure 1. AKTA Purifier 구성. Box 에는 AKTA Purifier 와 관련된 장비 및 소모품 들을 을 수 있는 공간이