Méthodes d’étudesen biologie cellulaire

7/24/2019 Mthodes dtudesen biologie cellulaire

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Chapitre 2 :Mthodes dtudes

en biologie cellulaireDocteur Laurent PELLETIER

Anne universitaire 2010/2011

Universit Joseph Fourier de Grenoble - Tous droits rservs.

UE2 : Biologie cellulaire


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Mthodes dtudes

Cellule animale : 10-20 m

Microscopie photonique

0,2 m 1 mm

1838 : Doctrine cellulaire de Schleiden et Schwann

Microscopie lectronique

1940 : 1-2 nm

Fixation, colorations


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Mthodes dtude

DNA : 1944 O.T. Avery

1953 J.D. Watson & F.H.C. Crick

Genetic code : 1961-1966 M. Nirenberg

& H.G. Khorana

DNA cloning : 1972 P. Berg

Hybridization : 1975 E.M. Southern

Fast Sequencing : 1977 W. Gilbert & F. Sanger

PCR : 1983 K. Mullis

Transgenesis : 1993 S. Spielberg Human genome sequenced : 2001

Historique


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Mthodes dtude

Lancet 2010; 375: 152535

Aujourdhui

Squenage du gnomedun patient :

- Infarctus du myocarde

- Diabte type II

- cancers

Cet exemple nest pas

apprendre

par coeur


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Mthodes dtude


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Mthodes dtude

Mme gnomeAdipocyte Neurone

Expression diffrente


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Mthodes dtude

Genome Statique, connu

Transcriptome Dynamique, dpendant ducontext, inconnu

Proteome Dynamique, dpendant ducontext, inconnu

30 000 gnes30 000 gnes

100 000 protines100 000 protines


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Mthodes dtude

Immuno-histochimie

Immuno-fluorescence

Hybridation In Situ

Les techniques de ciblage molculaire


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Mthodes dtude

Immuno-histochimie, Immunofluorescence, FACS,

Hybridation In Situ, Southern-blot, western blot,

northern-blot

mme combat !

Cible

Sonde

Secondaire

Enzyme, fluorochrome


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Mthodes dtude

Immuno-histochimie

CD31


PCNA

Fort immuno-marquage nuclaire

PCNA des cellules pithliales

normales du colon.Marquage modrdans les cellules musculaires.


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Mthodes dtude

Immuno-fluorescence

Immunohistochemistry markers

to distinguish between vascular

smooth muscle and endothelial

cells. A cryosection of mouse

heart ventricle was

simultaneously stained with

FITC-conjugated smooth muscle

-actin antibody (A) and an

antibody against the apical

endothelial membrane protein,ICAM-2 (B). The secondary

antibodies to detect ICAM-2 was

Cy-5 conjugated donkey anti-rat

(pseudo-colored red for clarity).

Panel C is an overlay of the

preceding two panels.ICAM-2 (Cy5)

Actine -SM (FITC)



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Mthodes dtude

Hybridation in situ (HIS)


Section de cerveau de

souris :

Les points noirs indiquent

lexpression dun gne dansdes rgions spcifiques


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FACS

Cytomtrie en flux

(FACS : FluorescenceActivated Cell Sorter)


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FACS

2N-2C 2N-4C

2N-2C

2N-4C

2N-42C

2N-24C


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FACS

DNA Analysis

0 200 400 600 800 1000

Intensit de Fluorescence1Q 2Q

Nombre

decellules

75

15

0

225

300

Pic daneuplodie

(DNA index 1.21)


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ELISA

(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)

Dosage dun anticorps

Dosage dun antigne


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ELISA

ELISA

anticorps anti-HIV GP120

http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/dosages/D3.html


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Southern blot Sparation des fragmentsgnomiques dans un gel

Fragmentation mnage

du gnome

Transfert des fragments

spars sur une membrane

Incubation de la membrane

avec une sonde

Rvlation du marquage

(visualisation de la cible)

W t bl t


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Western blot

Coloration des

protines au bleu deCoomassie

Sparation & transfert des protines+ dtection protine dintrt

= WB

Electrophorse en gel dacrylamide

ou PAGE-SDS

(PolyAcrylamide Gel

Electrophoresis SodiumDodecyl Sulfate)


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Western blot

Prparation et sparation des protines


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Western blot

Electro-transfert sur nylon ou nitrocellulose


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Western blot


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Culture cellulaire

Culture cellulaire 1907 : doctrine neuronale

Explants tissulaires

Cellules isoles

Dissociation mcanique, enzymatique, EDTA

Slection

EDTA : Acide thylne diamine ttractique


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Culture cellulaire

Slection


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Culture cellulaire

Culture primaire :

Population polymorphede cellules

Cellule unique

(clonage)

Culture primaire

Culture secondaire

Culture

secondaire

Culture

secondaire


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Culture cellulaire

Observation

Microscopie contraste de phase

Vido-microscopie


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Culture cellulaire

Observation

Immunofluorescence

Mitochondries : jaune

Filaments dactine : vertADN : rouge

Mitochondries : rouge

Filaments dactine : vertADN : bleu


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Culture cellulaire

Conditions de culture

37C, pH, sels, CO2

Milieu de culture

Milieu de base

+/- Srum

Facteurs de croissance

Support


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Culture cellulaire

Immortalisation

Les cellules normales ont un nombre dedivisions limit

Cr

oissance

cellulaire


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Culture cellulaire

Immortalisation

Introduction dun oncogne (SV 40, Myc)qui immortalise la cellule sans la rendre

tumorale

Cellules tumorales

exple : He(nrietta) La(cks)

Culture cellulaire


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Culture cellulaire

Cellulenormale

Celluleimmortalise

Celluletransforme

Divisions

Ancrage,

Fact. Croiss.,

Inhib. Contact.

Cellules normales cellules cancreuses

Culture cellulaire

Ulex Europeaus Agglutinin-1

(UEA 1)

Culture de cellules de

ll h i


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Culture cellulaire(UEA-1)

Collagne IV

Facteur de Von Willebrand (vWF)

moelle osseuse humaine

N

N

NN

C lt ll l i


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Culture cellulaire

vWFActine SMABC

Techniques dtude des fonctions


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C E

Ultrasonicdissociation

Aspirating canula

"human auto-culture medium"

Dissociatedtissues

Techniques d tude des fonctions

cellulaires


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Mthodes dtude in vivo

Greffes de cellules

cellules souchescellules tumorales

Transfert de gnes Souris transgniques

souris mucoviscidose

souris prdisposes au cancer

Souris Knock-out



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0 3 6 9 12 15

Tmoin

Anti-angiognique

Temps (jours)

Volumetumoral

Mthodes d tude in vivo

Tmoin

Modles de tumorigense

Anti-angiognique


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Transfert de gnes :

Modifications exprimentales du patrimoine gntique

Transfert de gnes in vitro ou in vivo

Vecteurs viraux ou non viraux

Une exprience heureuse ou malheureuse lhpital Necker ?

Mth d dt d i i


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Transfert de gne

Promoteur

Profil dexpression

spatial et temporel

cDNA Intron

Gne dintrt

AAAA

AAAA

Transgne

200kb

Mth d dt d i i


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Transfert de gne

Promoteur

cDNAGain de fonction

- Gne sauvage

- mutant

1- Constitutif2- Spcifique dun tissu (Cerveau, foie, muscle )

3- Inductible (ttracycline, interfron...)

Perte de fonction

- dominant ngatif

- antisens

Mth d dt d i i


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Gne rapporteur :

Gne X

Promoteur

du gne X

Gne rapporteur

-galactosidase

- Lucifrase

- GFP

- autres.

Promoteur

du gne X

GFP : Green Fluorescent Protein

Aequorea victoria

Mth d dt d i i


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Green FluorescentProtein (GFP)

Tmoin

Mth d dt d i i


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Cellules demoelle osseuse

GFP

Souris irradielthalement

Coupes de cervelet

4 semaines 15 semaines

?Cellules sanguines




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A

C D

BHmisphre tmoin Hmisphre ls

1 jAprs lsion

14 j

Aprs lsion



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FVB/N-TgN(MMTVneu)202Mul

Promoter: MMTV, mouse mammary tumor virus

Gene : Erbb-2 (HER-2; HER2; Neu; Neu oncogene; c-erbB2; c-

neu; neu protooncogene)

Souris homozygotes viables et fertiles

Pas de phnotype chez les mles

Expression du transgne dtectable dans lpithliummammaire normal, les glandes salivaires et le poumon.

Tumeurs focales apparaissent autour de 4 mois

Exemple de thrapie gnique


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Alain Fischer, Hpital Necker, Paris - 1999

Dficit Immunitaire Combin Svre li lX

(DICS-X)

Moelle osseuse : cellules prcurseurs

c : sous-unit des R des IL-2, 4, 7, 9, 15

c absente ou inoprante

p p g q



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Dficit Immunitaire Combin Svre li lX (DICS-X)

10 patients de 1-9 mois

Aspiration mdullaire

Selection des progniteurs CD34+

Exposition des vecteurs rtroviraux contenant le

cDNA de la chane c

Greffe des cellules




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Suivi prcoce :

T, NK Reconstitution normale du pool

Rponses vaccinales normales

3 mois : Retour la maison



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Science 17th October 2003

Octobre 2002 : 2 patients dveloppent une leucmie

Vecteur rtroviral intgr dans ou proximit de LMO2

Surexpression de LMO2





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NON !!!

Insertion dans

la chromatine ouverte

transcriptionnellement active

Intgration alatoire

Des rtrovirus



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