Mk2006-2007 Design des amorces Recherche et optimisation des amorces pour la PCR Les amorces doivent être spécifiques, stables et compatibles Etape cruciale

mk2006-2007Design des amorces

Recherche et optimisation des amorces pour la PCR

Les amorces doivent être spécifiques, stables et compatibles

Etape cruciale de la réussite de la PCR


Amorce gauche et amorce droite

5 ' 3 '

A m orce d roite (an tisen s) 3 ' 5 '

5 '3 '

A m orce gauch e (sen s)3 '5 '

Séquen ce iden tiqueà la séquen ce 5 -3 ' com plém en t in verse

de la séquen ce 5 '-3 '

Séquen ce cible

Peut être déterminé à l’aide de SMS2

Sequence Manipulation Suite 2


Zone d’hybridation unique

L’amorce doit s’hybrider avec une seule zone de l’ADN matrice

5’-TGATACATCGCCGTCGTCGT……………………CGACATCGCCGTCGTACCCGTCGTCCGTCGGG-3’

Amorce spécifique

Amorce non spécifique

Il est nécessaire d’établir la carte d’hybridation des amorces avec l’ADN matrice

Résultat obtenu avec Sequence Manipulation Suite 2

EXEMPLE

|||||||||||| 5’-CGACGGACGACG-3’

5’-CGACGGCGATGT-3’||||||||||||

5’-CGACGGCGATGT-3’||||||||||||


Spécificité de l’amorce

L’amorce doit être spécifique du gène ou de l’espèce recherchée. Elle ne doit pas s’hybrider avec un ADN contaminant

Pour le vérifier on peut réaliser un alignement local avec BLAST

5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’

Amorce gauche utilisée pour détecter Salmonella sp

*Letters in Applied Microbiology 2003, 36, 217–221

EXEMPLE


Longueur des amorces

La longueur de l’amorce influe sur la température de fusion (Tm), la température d’hybridation (Ta) et la spécificité

En général 18-30 nucléotides

Spécificité et Tm augmentent avec la longueur


Composition des amorces

La composition en bases de l’amorce influe sur la température de fusion (Tm), la température d’hybridation (Ta) et la spécificité

En général compris entre 40-60%

La Tm augmente avec le %GC

Il faut éviter les zones riches en AT ou en CG, la répartition des bases doit être de préférence aléatoire


Détermination du Tm et Ta

Tm = 4 . (nG + mC) + 2 . (pA + qT)

Tm = 81,5 + 16,6 . Log([M+]) + 0,41 . (%GC) – 675 / L

+ΔHTm= - 273,15 +16,6 .Log[M ]

ΔS+R .Ln (C/4)

Règle de Wallace

Règle tenant compte de la longueur et les sels monovalents (M)

Méthode thermodynamique (nearest-neighbour base model)

Ta = 0,3 . Tm(amorce) + 0,7 . Tm(amplicon) - 14,9

Melting temperature

Annealingtemperature

Liens pour détermination Tm par différentes méthodes

Méthode la plus précise car elle tient compte de la séquence (forces d’empilement des bases) et pas uniquement du %GC


Stabilité de l’extrémité 3’

La stabilité de l’extrémité 3’ conditionne une bonne initiation de la polymérisation.

5’ 3’ 5’3’

Extrémité 3’ stable Extrémité 3’ instable

On privilégie la présence de quelques bases GC en 3’, mais pas en grand nombre car on risque de provoquer des fixations non spécifiques

5’-TGATACATCGCCGTCGTCGT……………………CGACATCGCTCGTCCGTCGGTCGTCCGTCGGG-3’

5’-CGACGGACGAGCG-3’|||||||||||||

GCG-3’|||

5’-CGACGGACGA

False priming


Dimères et épingles à cheveux

Les amorces ne doivent pas s’autohybrider (self-dimer) ni s’hybrider entre elles (dimer), ni former des structures en

épingles à cheveux (hairpin)

La stabilité de ces structures est évaluée par le G.

Liens pour analyser les primers (Netprimer)


Compatibilité des amorces

Les amorces doivent avoir des Ta procheset par conséquent des Tm proches

La différence des Ta ne doit pas excéder 2 à 3 °C


Exercice

Recherche du gène invA de Salmonella typhimurium dans GENBANK

Recherche d’amorces simples et vérification de leur qualité

Recherche d’amorces optimisées avec Primer3

Recherche d’amorces optimisées avec PerlPrimer


Recherche du gène invA de Salmonella typhimurium


Résultats


Séquence du gène invA de Salmonella typhimurium

Séquence du gène au format FASTA

>gi|154154|gb|M90846.1|STYINVA Salmonella typhimurium InvA (invA)GATATTGCCTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCGTACTATTGAAAAGCTGTCTTAATTTAATATTA ACAGGATACCTATAGTGCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGT ACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCA CTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAA CGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCATTATCGATCAGTACCAGTCGTCTTAT CTTGATTGAAGCCGATGCCGGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCGTTATTGGCGATAGCCTGGCG GTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGTG TCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTT GAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCCGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTT TACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTG TGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACTCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCCCTGTCTAC TTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCATTGTTGATTGCGATTAGTGCC GGTTTTATCGTGACCCGCGTAAATGGCGATACGGATAATATGGGGCGGAATATCATGACGCAGCTGTTGA ACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTGACCATTTCAATGGGAACTCTGCCGGGATTCCCACT GCCGGTTTTTGTTATTTTATCGGTGGTTTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGT AGCGCCGCCAAACCTAAAACCAGCAAAGGCGAGCAGCCGCTCAGTATTGAGGAAAAAGAAGGGTCGTCGT TAGGACTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAG CCGGCGTGAAGATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGC GTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGAGATGGCGAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTATTGTTGATTA ATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTATTTTGATTTGATGCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT CGTGTCCTTTGGTATTAATCCAACAATCCATCAGCAAGGTAGCAGTCAGTATTTCTGGGTAACGCATGAA GAGGGGGAGAAACTCCGGGAGCTTGGCTATGTGTTGCGGAACGCGCTTGATGAGCTTTACCACTGTCTGG CGGTGACCGTGGCGCGCAACGTCAATGAATATTTCGGTATTCAGGAAACAAAACATATGCTGGACCAACT GGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCTCAGACATGCCACGGTACAACGTATATCTGAAGTT TTGCAGCGTTTGTTAAGCGAACGTGTTTCCGTGCGTAATATGAAGTTAATTATGGAAGCGCTCGCATTGT GGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTTGTGGAGCATATTCGTGGAGCAATGGCGCGTTATATTTG TCATAAATTCGCCAATGGCGGCGAATTACGAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGC AAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTCAGCCTTGACCCGGAAGCCTCCGCTAATTTGATGG ATCTCATTACACTTAAGTTGGATGATTTATTGATTGCACATAAAGATCTTGTCCTCCTTACGTCTGTCGA TGTCCGTCGATTTATTAAGAAAATGATTGAAGGTCGTTTTCCGGATCTGGAGGTTTTATCTTTCGGTGAG ATAGCAGATAGCAAGTCAGTGAATGTTATAAAAACAATATAAGGGCTTAATTAAGGAAAAGATCTATGCAACATTT

Séquence cible à amplifier (300 nt)


Amorces non optimisées

>gi|154154|gb|M90846.1|STYINVA Salmonella typhimurium InvA (invA)GATATTGCCTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCGTACTATTGAAAAGCTGTCTTAATTTAATATTA ACAGGATACCTATAGTGCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGT ACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCA CTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAA CGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCATTATCGATCAGTACCAGTCGTCTTAT CTTGATTGAAGCCGATGCCGGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCGTTATTGGCGATAGCCTGGCG GTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGTG TCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTT GAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCCGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTT TACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTGTGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACTCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCCCTGTCTAC TTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCATTGTTGATTGCGATTAGTGCC GGTTTTATCGTGACCCGCGTAAATGGCGATACGGATAATATGGGGCGGAATATCATGACGCAGCTGTTGA ACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTGACCATTTCAATGGGAACTCTGCCGGGATTCCCACT GCCGGTTTTTGTTATTTTATCGGTGGTTTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGT AGCGCCGCCAAACCTAAAACCAGCAAAGGCGAGCAGCCGCTCAGTATTGAGGAAAAAGAAGGGTCGTCGT TAGGACTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAG CCGGCGTGAAGATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGC GTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGAGATGGCGAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTATTGTTGATTA ATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTATTTTGATTTGATGCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT CGTGTCCTTTGGTATTAATCCAACAATCCATCAGCAAGGTAGCAGTCAGTATTTCTGGGTAACGCATGAA GAGGGGGAGAAACTCCGGGAGCTTGGCTATGTGTTGCGGAACGCGCTTGATGAGCTTTACCACTGTCTGG CGGTGACCGTGGCGCGCAACGTCAATGAATATTTCGGTATTCAGGAAACAAAACATATGCTGGACCAACT GGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCTCAGACATGCCACGGTACAACGTATATCTGAAGTT TTGCAGCGTTTGTTAAGCGAACGTGTTTCCGTGCGTAATATGAAGTTAATTATGGAAGCGCTCGCATTGT GGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTTGTGGAGCATATTCGTGGAGCAATGGCGCGTTATATTTG TCATAAATTCGCCAATGGCGGCGAATTACGAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGC AAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTCAGCCTTGACCCGGAAGCCTCCGCTAATTTGATGG ATCTCATTACACTTAAGTTGGATGATTTATTGATTGCACATAAAGATCTTGTCCTCCTTACGTCTGTCGA TGTCCGTCGATTTATTAAGAAAATGATTGAAGGTCGTTTTCCGGATCTGGAGGTTTTATCTTTCGGTGAG ATAGCAGATAGCAAGTCAGTGAATGTTATAAAAACAATATAAGGGCTTAATTAAGGAAAAGATCTATGCAACATTT

Amorces déduites des séquences en amont et en aval

5’-TTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’

Amorce gauche

5’-CCGCCAATAAAGTTCACAAA-3’

Amorce droite


Analyse de l’amorce gauche avec Netprimer

Mauvaise amorce : formation d’épingle,

de dimères


Analyse de l’amorce droite avec Netprimer

Pas d’épingle, pas de dimères

Mais Tm très différent de l’amorce gauche


Recherche d’amorces avec Primer3

http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm


Résultats avec Primer3

Légende

****** cible >>>>>> amorce gauche <<<<<< amorce droite

Plusieurs couples d’amorces sont proposés

On remarque que le logiciel a trouvé d’autres amorces

plus optimisées mais pas à la même position


Recherche d’amorces avec PerlPrimer

Il s’agit d’un logiciel libre téléchargeable

Copier/coller la séquence

Définir la région à amplifier

Recherche des amorces

Visualisation et analyse des amorces

Visualisation de la séquence et des amorces


Résultats avec PerlPrimer

On peut réaliser un Blast directement pour vérifier la

spécificité des amorces

Analyse de la qualité des amorces


Résultats de l’analyse avec Blast

Les primers choisies s’alignenent en

uniquement avec des séquences provenant

de Salmonella

Documents

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