Modification de Conformation des Sous-unit& Ribosomigues 30 S en Relation avec L9activit6 de la Streptomycine: Etude par Fluorescence

B e y le 13 septembre, 1972

LENFANT, M., et FORGET, A. Modification de conformation des sous-unit& ribosomiques 30 S en relation avec I'activitC de la streptomycine: Ctude par fluorescence. Can. J. Biochem. 51, 741-746 (1973 ).

Nous avons suivi par fluorescence l'incorporation du bromure d'Cthidiurn (BET) dans le RNA 16 S des sous-unites 30 S ribosomiques sensibles et rksistantes la streptomycine (Sm- CHQ). L'intensitC de la fluorescence du complexe BET- sous-unites 30 S sensibles est plus tlevCe que celle du complexe BET - sous-unit& 30 S rbsistantes. L'intensitk de la fluorescence du complexe BET - sous-unit& 30 S sensibles est diminuke lorsque les sous-unitCs 30 S sensibles sont au prCalable chargCes avec de la Sm-CHB. Par contre, l'additicsn de streptomycine aux sous-unit& 30 S resistantes ne modifie pas I'intensitb de fluorescence du complexe form6 avec le colorant. Par ailleurs, nous n'avons pas csbservC de variation de fluorescence des complexes BET-sous-unit& 30 S sensibles ou r6sistantes lorsque celles-ci sont chargCes avec la strepto- mycyloxime (Sm-CH=NQH) , dkrivt biologiquement inactif de la streptomycine.

Ces rksultats indiquent que la structure quaternaire, notammewt 19accessibilitC du colorant aux rCgions des bases apparikes du RNA 16 S, des sous-unit& 30 S ribosomiques rksistantes 2 la streptomycine est modifiCe par rapport B celle des sous-unites 30 S sensibles. Les sous-unit& 30 S sensibles subissent une modification comparable en prCsence de l'antibiotique.

LENFANT, M., and FORGET, A. Modification de conformation des sous-unit& ribosomiques 30 S en relation avec YactivitC de la streptomycine: Ctude par fluorescence. Can. J. Biochem. 51. 741-746 (1973).

Ethidium bromide (ETB) has been bound to the 30 S ribosomal subunits of both a strepto- mycin (Sm-CHQ) sensitive and resistant strain of E. coli. The fluorescent intensity of the complex ETB - 30 S sensitive subunit is higher than that of the complex ETB - 30 S resistant subunit. When the 30 S sensitive subunit is previously treated with Sm-CHQ, the intensity of the ETB - 30 S sensitive subunit complex is reduced. In contrast, the pretreatment of the 30 S resistant subunit by Sm-CHQ does not affect the fluorescence of the dye complex. In addition no perturbation of the fluorescent complexes can be noted when either the 30 S resistant or 30 S sensitive subunit was pretreated with streptomycine oxime (Sm-CH=NON), a biologically inactive derivative of Sm-GNQ. These results indicate that the accessibility of the dye to the base-paired region of the 16 S RNA, the target of ETB, has been modified as resistance is conferred to the 30 S subunit.

The modification of the quaternary structure of the 30 S resistant subunits as shown by fluorescence is similar to the Sm-GNQ modification of the pretreated 30 S sensitive subunit.

Spotts et Stanier ( I ) ont montrk que la sensi- bilitC de E. coli B la streptomycine (Sm-CHB) est due B l'action de l'antibiotique sur les ribosomes. La Sm-CHO agit sur la sous-unit6 ribosomique 30 S oh une prot6ine est Q la fois responsable de la sensibilit6 du ribosome ii l'antibiotique, et in- dispensable Q la fixation de ce dernier (29. La prdsence de l'antibiotique modifie de plusieurs fa~ons le fonctionnement du ribosome: il intro- duit des erreurs dans le d6codage du RNA mes- sager, bloque la synthhe peptidique au niveau de l'initiation et pr6vient la dissociation du ribo-

some en sous-unit& 30 S et 50 S (3, 4). Ces modifications seraient la cons6quence d'une dis- torsion du ribosome provoquCe par la Sm-CHO. Sherman et coll. (5, $9, en mesurant les vitesses d'6change de l'hydrogkne contre des atomes de tritium fix& sur les ribosomes, ont montr6 que la fixation de l'antibiotique provoque effective- ment une modification de leur structure quater- naire. Cette modification peut affecter soit l'ar- rangement des protCines les unes par rapport aux autres en conservant intact la conformation du 16 S RNA, soit bouleverser l'interaction pro-

'Nouvelle adresse: Institut de Chimie des Substances t6ines - RNA ' s et la structure Naturelles, C.N.R.S. 91190--Gif-~ur-~vette, France. tiaire de ce dernier. Des informations sur ce

Can

. J. B

ioch

em. D

ownl

oade

d fr

om w

ww

.nrc

rese

arch

pres

s.co

m b

y SA

VA

NN

AH

RIV

NA

TL

AB

BF

on 1

1/13

/14

For

pers

onal

use

onl

y.

742 CAN. 9. BIOCHEM. VOL. 51, 1973

point peuvent $tre obtenues par une technique Qe fluorescence. En effet, Lepecq et Paoletti (9) ont ktudik la fixation du brsmure d76thidium (BET), colorant trypanocide, sur les aeides nu- clbiques. Ils ont dkrnontr6 que le BET s'intercale dans les rigions en double Mice des polynu- clkotides pour former un complexe caraetkrisk par une forte augmentation de I'intensitk de fluorescence du colorant fix& Bollen et colk. (10) ont prouvk que cette technique pemettait, au cours de la reconstitution du ribosome, de dkter- miner Hes protkines qui inted2rent directement avec les rkgions apparikes du RNA 16 S.

Afin de prkciser, si les modifications de con- formation affectent l'inter-relation protkines - RNA dans le ribosome, nous avons suivi dans des sous-unit& 30 S sensibles et risistantes, la pknktration du bromure d9kthidium, marqueur Wmorescent (9, 1Q), A l'intbrieur des rkgions en double hilice du WNA 3 6 S lsrs de la fixation de Sm-CHO. Nos rCsultats indiquent, d9une part, que cet antibiotique modifie la conformation du ribosome sensible en r6duisant aaotamrnent le nombre de bases apparikes du RPJA 16 S acces- sible~ au colorant, et d9autre part, qu9il existe une diffbrence de conformation affectant le %aNA 16 S entre les sous-unit& 30 S d'une souche sensible et d9une ssuche rksistante de E. coli.

Souches et cultures bacte'riennes La souche Q13 (Gilbert) de Escheric8aia codi a 6tt

choisie comme souche sensible B la streptomycine (croissance inhibCe gar 4 pg/ml de I'antibiotique). Un mutant rksistant spontanC, dCrivC de cette souche, a CtC isolB en prgsence de B mg/mI de Sm-CHO.

La croissance aCrCe de ces deux souches sensible et rCsistante dans le milieu de Gilbert (0.5% d'kydrolysat de castine, 0.5% d'extrait de levures et 0.5% de NaCI) s'effectue A 37" avec un mtme temps de doublement de 64 min. Ce temps de doublement de la souche rksistante w'est par changt par I'addition de 1 mg/ml de Sm-CHB dans le milieu de culture, bien que 5 rng/rnI de I'antibiotique en inhibe complktement la croissance.

Pour la prCparation des ribosomes, les cellules sensibles et rCsistantes one CtC cuItivCes en fermenteur dans le milieu de Gilbert et rCcoltbes au milieu de la phase exponentielle.

PrPparatiora des ribosomes Les ribos~mes ont he6 prhparhs seHow Tissihes et

cob/. (1 1 ), dans un tampon Tris-HCl0.01 M, KC1 0.05 M , acttate de M g 0.81 M, mercaptoCthanol 0.05 M (pH 7.4). Aprh dialyse contre un tampon Tris-HCI 0.01 M, acCtate de Mg 0.001 M, NHLl 0. I M, mercap- totthan08 0.005 M (pH 7-41, les sous-unit& 30 S et

50 S one CtC s6parCes par centrifugation zonale B 105 000 g pendant 18 k (centrifugeuse International B-60, rotor type BXHV) dans un gradient linbaire de 6 ii 60% de sucrose prkparb dans le tampon de dialyse. Les ribosomes ont kt6 csnservCs - 80" dans le tampon Tris-HCl 0.01 h4, NH4Cl 0.05 M acCtate de hag 0.01 M (pH '7.4). L'intCgritC des sous-unitis 30 S a CtC vCrihCe en rnesurant par ultracentrifugation analytique leur vitesse de ~Cdirnentaeion.

Fixation de la dih~~drostreptonzycirre uux sous-unit&s SO S sensibles et rksistantss

k s sous-unit& 30 S ont 6tC rkactiv6es (12) par chauffage h 3'7" pendant 30 min dans Be tampon Tris- HCl 0.01 M , NH4CI 0.2 hf, acktate Be Mg 0.2 M (pH 7.4), guis dialyskes contre %e tampon "A? Tris-HC1 8.05 M , NH4Cl 0.1 h4, acCtate de Mg 0.02 M (pH '7.4). E'incubation des ribosomes ( 1 U de D.0.2w) avec 1.7 18' d.p.m. de sulfate de dihydrostreptomycine tritike (Sm-CSH20H) (Amersham, 3 Ci/mmol) a 6tC effec- tu6s dans 0.16 ml Be tampon "A" pendant 15 rnin B 25". Aprks incubation le mCIange rCactisnnel a CtC refroidi B O", diluC avec 2 ml de tampon hltrb sur filtre millipore (pore, 0.45 p), puis lavC trois fsis avec 2 ml de tampon "A". La radioactivitk fixCe sur les filtres a CtC dCterminCe au compteur B scintillation liquide (Packard).

La radioactivitk hCe par les sous-unit& 30 S a CtC 6valaa& en soustrayant de la radioactivitk mesurCe en d.p.m. la radioactivitC du contrdle en d.p.m. La valeur moyenne du contr6le (4380 dz 156 d.p.m.) a 6th obtenue en filtrant dans nos conditions expkrimentales 1.7 10' d.p.m. de Sm-CSH20H.

Fixation de Ia streptornycine sur les sous-unit& 33 S Les sous-unitCs 30S rCactivCes (24 U de D.O.

mesurbe ?i 260 nm) ont CtC incubCes B 25" pendant 15 min en prCsence ou non de 35.8 pg de sulfate de streptomycine (Sm-CHO), dans le 1.5 ml de tampon "A".

Mesure ale !a fluorescence Les intensitks de fluorescence ont 6tC mesurCes SUH

des solutions qui contiement respectivement dans 2 mB de tampon A: ( 1 ) 19.5 pg de BET, (2) 19.5 pg de BET et 24 U D.0.rGo de 30 S, (3) 19.5 pg de BET, 24 U D.O.,&, de 30 S et 35.8 pg de Sm-CHO.

Les mesures ont CtC effectukes sur le spectrofluori- rnktre Zeiss (ZFMc) dans les conditions suivantes: longueur d'onde d'excitation 480 nm (fente 2 mm); longueur d'onde d'tmisaisn 630 wm (fente 1 mm) . Pendant les mesures, I'intensitC de la lumibre d'excita- tion a CtC maintenue B une valeur constante en mesurant la Iumiere diRu&e par un verre fluorescent standard fourni par 2kiss. k s spectres d'excitatim et d'6rniasion ont CtB emegistrb sur le spectrofluorirnttre Amirnco- Bowman.

Fixation de la streptomycine aux soles-~nite's 38 S

Nous avons vkrifik l'aptitude des sous-unitis 30 S provenant de la sgluche sensible et de la

Can

. J. B

ioch

em. D

ownl

oade

d fr

om w

ww

.nrc

rese

arch

pres

s.co

m b

y SA

VA

NN

AH

RIV

NA

TL

AB

BF

on 1

1/13

/14

For

pers

onal

use

onl

y.

LENFANT ET FORGET: MODIFICATION DES SOUS-UNITES RIBOSOMIQUES 30 S

Cone. BET bg/rnl) FIG. 1 . Fluorescence du BET et du complexe BET - sous-unit& 30 S sensibles. Bes quantitCs variables de BET ont

CtC aioutkes B 12 U B.0.26c de sous-unit& 30 S dans le tampon "A9'. L'intensitC de fluorescence (1%;) a CtC mesurCe sur le fliorimktre Jobin Yvon. (X) BET, (a) BET - sous-unit& 30 S sensibles, (0) (BET - sous-unit& 30 S sensibles) - BET.

souche rksistante a la streptsmycine B fixer la dihydrostreptsmycine radioactive (Sm-C3H2- OH). Ees mesures de la fixation de l'antibistique sur les sous-unit& 30 S Ctant effectukes par radioactiviti nous avons utilisk pour cette 6tude le csmposC Sm-C3H20H, sachant qu'il se fixe aussi bien que la streptomycine (Sm-CHO) sur les sous-unitis ribosomiques 30 S (13). Afin de privenir les fixations non spicifiques de l'anti- biotique sur les sous-unit& au cours des incuba- tions de ces produits, nous avons utiIis6 des qumtitks de Sm-C3H20H infirieures ou kgales a 30 fois celles des sous-unit& (14). La fixation de Sm-CH20H par les sous-unit& sensibles (17 375 k 294 d.p.m.) est If fois plus impsr- tante que pour les sous-unit& resistantes (1 652 * f 6 d.p.m.), valeur nigligeable par rapport B celle obtenue pour le contrble.

Ees complexes BET - sous-unit& 30 S sensi- bIes et BET - (sous-unit& 30 S i- Sm-CHO) ont 6t6 prCpar6s dms le tampon "A" (concentra- tion en sel > 0.01 M), en prCsence de BET de 2.5 x 1 0 - W . Cette concentration en colorant permet d'observer pour le complexe BET - sous-unitis 30 S sensibles une intensit6 de fluo- rescence trhs proche de la fluorescence maxi-

male, sbtenue en saturant Ie RNA de cette sous-unit6 par le BET. B'autre part, l'intensite de la fluorescence obtenue pour cette concentra- tion du colorant se situe dans la partie linkaire de la courbe de titration Ctallon du BET (Fig. 1 ). Dans ces conditions de formation du complexe BET - sous-unit& 30 S sensiblles, la fixation du colorant par liaison ionique sur les groupes phos- phates du RNA ne se produit pas; le complexe se forme uniquement par insertion a l'intkrieur des rkgions en double hClice du RNA ribosomi- que, avec une augmentation de ll'intensitk de fluorescence du colorant insCri (9). Ees spectres d'excitation des solutions BET - sous-unit& 30 S sensibles et BET - (sous-unit& 30 S sensi- b l e ~ i- Sm-CHO) ont it6 enregistris sur le spec- trophotomktre Aminco-Bowman (Fig. 2). Ces spectres prisentent par rapport B celui d'une solution de BET libre une augmentation de l'in- tensiti de fluorescence et un klargissement vers les grandes longueurs d'onde. kes spectres des complexes BET - sous-unitis 30 S sensibles et BET - (sous-unit& 30 S sensibIes i- Sm-CHO) difTkrent cependant par Ia valeur du maximum dYntensitC de la fluorescence qui est moindre dans le cas ou les sous-unitis 30 S sensibles sont

Can

. J. B

ioch

em. D

ownl

oade

d fr

om w

ww

.nrc

rese

arch

pres

s.co

m b

y SA

VA

NN

AH

RIV

NA

TL

AB

BF

on 1

1/13

/14

For

pers

onal

use

onl

y.

CAN. J. BIOCHEM. VOL. 51, 1973

FIG. 2. Spectres apparents d9excitation des solutions de BET, BET - sous-unit& 30 S sensibles, BET - (sous-unit& 30 S sensibles + Sm-CHO). Les solutions contiement dams 2 ml de tampon "A": dl) (- - -) 1.95 10-2 mg de BET. (2) (-) BET - sous-unit& 30 S sensibles: 1.95 1 0 - b g de BETet 24 U D.0.260 de 30 S. (3) (. . - .) BET - fsous-unit& 38 S sensibles - Sm-CHO) : 1.95 10-2 mg de BET, 24 U D.0.260 de 30 S et 3.58 10-2 mg de Sm-CHO.

chargkes de Sm-CHO. L'enregistrement des spectres d96mission a reproduit le m i h e ph6- n o d n e . Nous avons efiectuk des mesures de l'intensitk de fluorescence de ces solutions au spectrophotom&tre Zeiss. Pour une intensite de fluorescence IF1' - 100 + 0.6 de la solution de BET libre, l'intensitk correspondante de la solu- tion du complexe BET - sous-unit& 30 S sensi- bles est IF2" = 229 * 2.5 et celle du complexe BET - (sous-unit& 30 S sensibles + Srn-GHO) est IF," = 196 * 2.5.

Ces rksultats indiquent que la fixation de Sm- CHO sur les sous-unit& 30 S sensibles entraine une baisse de 6.5 9% de l'intensitk de fluorescence du complexe BET - sous-unit& 30 S sensibles ragportbe B la valeur de IF,. Pour montrer que la diminution de l'intensitk de la fluorescence est due effectivement A l'activiti biologique de Sm-

T e s valeurs des intensitks de fluorescence IF1, IF2 et IF3 sont les moyemes obtenues sur dix mesures.

Tes valeurs HFr et IFs correspondent la somrne des intensitCs de fluorescence dues aaa BET lib au ribo- some et au BET libre dans la solution.

CHO sur les sous-unit& 30 S sensibles, nous avons effect& deux expkriences contr6les.

(1) Nous avons substituh la. Sm-CHO par un d6riv6 biologiquement inactif (1 5) mais de struc- ture chimique voisine, la streptomycyloxime (Sm-CH=NOH). Les complexes BET - sous- unit& 30 S sensibles e& BET - (sous-unit& 30 S sensibles + Sm-CH=NOH) ont respectivement des intensit& de fluorescence cornparables IF =

209 * 2 et IF = 207 * 2, par contre dans le cas du complexe BET - (sous-unit& 30 S sensibles + Sm-CHO) on retrouve une intensit6 de fluor- escence diminuke IF = I96 * 2. On note par ailleurs que ni SM-CHO ni Sm-CH=NOH n'ont d'action sus I'intensitk de fluorescence du BET (tableau 1).

(2) Nous avons r6pkt6 cette fois avec les sous-unites 30 S prkparkes B partir du mutant rksistant, des mesures de I'intensitk de fluores- cence des complexes BET - sous-unit& 30 S r6sistantes contenant ou non du Sm-CHO. Les valeurs obtenues montrent que 17intensit6 de fluo- rescence du complexe BET - (sous-unit& 30 S

Can

. J. B

ioch

em. D

ownl

oade

d fr

om w

ww

.nrc

rese

arch

pres

s.co

m b

y SA

VA

NN

AH

RIV

NA

TL

AB

BF

on 1

1/13

/14

For

pers

onal

use

onl

y.

LENFANT ET FORGET: MODIFICATION DES SOWS-UNITES RIBOSOMPQUES 30 S

TABLEAU 1. Influence de la streptomycine et la streptotmycyloxirne sur la fluorescence du BET et du cotmplexe BET - sous-unit6 30 S sensible

Concentration Concentration Concentration Concentration BET 30 S Snl-CHO Sm-C#=NOH

(rg /ml) (U B.O. /rnl) ( ~ ~ c g h l ) /ml) IF

NOTE: L'incubation des ribosomes 30 S en prCoence de Sm-CH=NOK a CtC effectuke dans les con- ditions dkcrites pour Sm-CHO. IF est la valeur moyenne de I'intcnsitk de fluorescence, calculke sur 10 mesures, effectuies sur deux Cchantillons diffkrents.

risistantes f Sm-CHO) IF, = 189 9 2.5 ne pr6- sente aucune difference significative avec celle IF2 = 187 9 2.5 obtenue pour le csmplexe BET - sous-unitks 30 S rkistantes.

On peut supposer que la diminution de la fluorescence du BET - sous-unites 30 S sensi- b l e ~ caus6e par l'interaction de la Sm-CHO et des sous-unitks 30 S sensibles est relike A l'ac- tivit6 biologique de cette dernihe. Ce phknom- kne est fonction de la concentration de Sm-CHO fix6e sur les sous-unites ribosomiques 30 S sen- sible~ (tableau 1).

Par ailleurs, si nous comparons les mesures de fluorescence des complexes BET - sous- unites 30 S des souches sensibles et rksistantes, nous remarquons une diminution significative de 10% de l'intensitk de fluorescence du complexe BET - sous-unit6s 30 S rksistantes par rapport B celle du complexe BET - sous-unit& 30 S sensibles.

Bollen et eoll. (10) interpretent les diminu- tions d9intensitk de fluorescence du complexe BET - RNA 16 S observkes lors de la recons- titution de la sous-unit6 30 S, comme une modi- fication par certaines protkines de la structure tertiaire du RNA et notamment des r6gions des bases apparikes, ce qui entraine l'exclusion de mol6cules de BET inskr6es B l'intkrieur de la structure en double h6lice du polynuclkotide. Nos expkriences, qui montrent une diminution faible mais significative du BET ins6r6 dans la sous-unit6 30 S sensible lorsqu'elle est prCalable- ment chargee de Sm-CHO, signifient que l'anti- biotique provoque une modification de la con- formation du ribosome et iventuellement du

RNA 16 S en rkduisant les rkgisns des bases apparikes accessibles au colorant. Ceci est en accord avec les observations de Sherman et cokk. (5, 8) qui ont montrk que la Sm-CHO provoque une modification de la structure quaternaire du ribosome. La diminution de l'accessibilite du RNA 16 S du ribosome au colorant, pourrait s'expliquer soit par une modification par la streptomycine de l'organisation protkines-RNA soit par une action directe de l'antibiotique sur le RNA.4 Cette dernikre possibilit6 n'est pas en contradiction avec le fait qu'une proteine soit respnsable de la fixation de Sm-CHO sur la sous-unit6 30 S sensible (2)' le r61e de cette pro- t6ine serait d'induire une conformation du RNA propice B la fixation de l'antibiotique. La d B 6 rence observ6e entre l'intensitk de fluorescence des complexes formes h partir des sous-unites 30 S sensibles et resistantes pourrait s'expliquer de la mSme f a ~ o n et signifier, elle aussi, une conformation modifiee de la sous-unit6 30 S ribo- somique de la souche risistmte, ce que nous tenterons de confirmer en r6pCtant cette ktude avec differents mutants r6sistants h Ia strepto- mycine.

Les auteurs remercient le Dr. M. Ewald et le Dr. 8. Cedergren pour leurs conseiHs pertinents, le Profes- seur W. Verly qui a bien voulu reviser le manuscrib, le Dr. G. Gingras et le Dr. G. Durocher qui ont mis B notre disposition le fluorimktre Aminco-Bowman.

Ce travail a CtC subventionnt en partie par le ministhre de la santC national et du bien-&re social.

'Note ajout6e B la correction des Cpreuves: Cette hypothkse est soutenue par le rCcent travail de Biswas et Gorini (16).

Can

. J. B

ioch

em. D

ownl

oade

d fr

om w

ww

.nrc

rese

arch

pres

s.co

m b

y SA

VA

NN

AH

RIV

NA

TL

AB

BF

on 1

1/13

/14

For

pers

onal

use

onl

y.

446 CAN. J. BIBCHBM. VOL. 51, 1973

1. SPBTTS, C. R., et STANHEW, R. Y.: Nature, 192, 593 (1961).

2. OZAKI, M., MIZUSHHMW, S., et NOMUWA, M.: Na- ture, 222,333 (1969).

3. ?+~BSMURA, M.: BacterisI. Rev. 34, 228 ( f 940). 4. HAHN, F. E. : Antibiot. Chemother. 17, 29 ( 194 1). 5. SHERMAN, M. I., CHUANG, D., et SIMPSON, M. V.:

Symp. Quant. BicsI. 34, 109 (1969). 6. SHERMAN, M. I.: Prsc. Natl. Acad. Sci. U.S. 64,

1388 (1969). 7. SHERMAN, M. I., et SIMPSON, M. V.: Symp. Quant.

BioI. 34, 220 (1969). 8. SHERMAN, M. I. : Eur. J. Biochem. 25,29 1 ( 1972). 9. EEPECQ, J. B., et PWOLETTI, G.: J. M01. BioI. 27,

87 (1967).

10. BOLLEN, A., H E ~ O G , A., FAVRE, A., THIBAULT, J., et Gaos, F. : FEBS Lett. 11,49 ( f 940).

1 1 . TISI~RES, A. T., WATSON, B. D., SCHLESSMGER, D., et HOLLHNGWOR~, R. R.: B. Mo1. Biol. 1, 221 (1959).

12. VOGEL, Z., VOGEL, T., ZAMIR, A., EESON, E.: J. Mol. Biol. 54,379 (1978).

13. KAJI, N., et TANAKA, Y.: J. M01. Bid . 32, 221 (1968).

14. CHANG, F. N., et FLAKS, J. G.: Fed. Proc. 29, 604 (1940).

15. REGNA, P. P.: In Antibiotics, their chemistry and non medical uses. Redige' par H. Goldberg. D. Van Nostrand Co. 1959. p. 69.

16. BISWAS, D. K., et GQWINI, L.: Prse. Nat1. Acad. Sci. U.S. 69,2141 (1972).

Can

. J. B

ioch

em. D

ownl

oade

d fr

om w

ww

.nrc

rese

arch

pres

s.co

m b

y SA

VA

NN

AH

RIV

NA

TL

AB

BF

on 1

1/13

/14

For

pers

onal

use

onl

y.