Métabolisme du bisphénol A, de la vinchlozoline et de la ... · J’ai également été accueilli chaleureusement à Stockholm, dans l’équipe de Ingemar Pongratz et Katarina

N° d’ordre : 2589

Thèse

présentée

pour obtenir le titre de

DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE

École doctorale : SEVAB

Spécialité : Pathologie, Toxicologie, Génétique et Nutrition

Par

Julian BURSZTYKA

METABOLISME DU BISPHENOL A, DE LA VINCHLOZOLINE ET DE LA GENISTEINE DANS LES SYSTEMES BIOLOGIQUES UTILISES

POUR ETUDIER LES PERTURBATEURS ENDOCRINIENS

conséquences en terme de toxicité

Soutenue le 21 Janvier 2008 devant le jury composé de :

Mme CASELLAS Claude Rapporteur

Mme BENNETAU-PELISSERO Catherine Rapporteur

M. PERIQUET Alain Examinateur

M. ALVINERIE Michel Examinateur

M. MEUNIER Jean-Roch Examinateur

M. CRAVEDI Jean-Pierre Directeur de thèse

1

Je tiens à remercier en premier lieu Jacques Tulliez, le Directeur de l’Unité des Xénobiotiques qui m’a accueilli il y a quatre ans lors de mon stage de DEA de Toxicologie et ensuite lorsque je suis resté au Laboratoire pour y effectuer mon doctorat. Je remercie également vivement Jean-Pierre Cravedi, mon directeur de thèse, actuel Directeur de l’Unité, pour son accueil et la proposition qu’il m’a faite de m’engager dans des travaux de thèse au sein du Laboratoire, à l’aide d’un financement européen dont le plus beau des inconvénients m’obligeait à travailler quelques mois dans des laboratoires situés à Stockholm et Grenade. Jean-Pierre Cravedi a dirigé ce travail et m’a transmis son savoir faire scientifique. Toujours disponible, il a été un guide précieux, m’autorisant une grande liberté d’action. C’est avec Elisabeth Perdu que j’ai réalisé l’essentiel des travaux de ces trois années de thèse. Elle m’a fait découvrir le monde de l’in vitro, et m’a accompagné avec une bonne humeur invincible dans mon combat contre la scoumoune. Je ne sais comment la remercier pour tout cela. Je remercie également Laurent Debrauwer et Cécile Canlet dont les travaux d’identification des métabolites, qui en masse, qui en RMN, ont représenté pour moi comme des cadeaux de Noël hors saison. Je remercie Daniel Zalko, avec qui j’ai pu discuter science, mais pas que : tous nos échanges ont été pour moi toujours profitables. Je tiens particulièrement à apporter mes remerciements les plus chaleureux à Maryse Baradat, qui m’a formé à l’usage de l’HPLC et des divers compteurs de radioactivité du laboratoire lors de mon stage de DEA, et qui à cette occasion m’a donné l’envie d’en savoir toujours un peu plus. Enfin, je remercie toutes celles et tous ceux avec qui j’ai pu discuter de mes travaux et partager des connaissances, scientifiques ou non. Travailler et vivre avec vous tous fut toujours des plus agréable et des plus profitable. J’ai également été accueilli chaleureusement à Stockholm, dans l’équipe de Ingemar Pongratz et Katarina Pettersson, et à Grenade, dans l’équipe de Nicolas Olea et Marietta Fernandez. I thank you very much for your excellent help and your kindness. Stockholm et Grenade sont deux villes extrêmement agréables. Je souhaite également remercier les membres du Jury de thèse , Madame Claude Casellas, Madame Catherine Bennetau-Pellissero, Monsieur Alain Périquet, Monsieur Michel Alvinerie et Monsieur Jean-Roch Meunier qui m’ont fait l’honneur de consacrer de leur temps à lire et juger ce travail. Je ne pourrai jamais remercier assez mes parents, sans qui je n’en serais pas là. Je leur dois tout ce que je suis. Je voudrais enfin remercier Marie Ya, qui, malgré les 220 kilomètres qui nous ont séparés pendant ces trois années, a toujours su m’accompagner au quotidien et m’apaiser quand mon humeur flanchait.

2

Maëster 2006

http://maester.over-blog.com/10-archive-02-2006.html

3

SOMMAIRE

Remerciements Abréviations INTRODUCTION 1 Perturbation endocrinienne.

1-1 Brefs rappels d’endocrinologie.

1-1-1 Mode d’action des hormones 1-1-2 La super famille des récepteurs nucléaires.

1-1-2-1 Mode d’action et classification 1-1-2-2 Les récepteurs aux estrogènes (ER). 1-1-2-3 Le récepteur aux androgènes (AR).

1-2 Perturbateur endocrinien (PE). 1-3 Modes d’action

1-3-1 Interactions directes avec les récepteurs aux hormones. 1-3-1-1 Action agoniste. 1-3-1-2 Action antagoniste.

1-3-2 autres interactions. 1-3-2-1 Modification de la concentration en hormone. 1-3-2-2 Modification de la concentration en récepteurs.

1-4 Interférences avec les hormones stéroïdiennes.

1-4-1 Les notions d’ « (anti-)estrogénicité » et d’ « (anti-)androgénicité » 1-4-2 Effets sur la faune sauvage et les espèces d’élevage . 1-4-3 Observations chez l’Homme

2 Méthodes de screening des perturbateurs endocriniens.

2-1 Tests de liaison au récepteur. 2-2 Tests de prolifération cellulaire. 2-3 Tests utilisant un gène rapporteur. 2-4 Limitations de ces tests in vitro. 3 Métabolisme et activité endocrinienne

3-1 Les systèmes de biotransformation 3-2 Exemple des stéroïdes endogènes 3-3 Rôle du métabolisme dans l’activation et l’inactivation des perturbateurs endocriniens 3-4 Conséquences vis-à-vis de l’évaluation de l’activité perturbatrice endocrinienne à l’aide de tests in vitro.

4 La génistéine

4-1 La génistéine et autres phytoestrogènes 4-2 Sources et voies d’exposition de l’homme

p.1

p.7

p.9

p.12

p.12 p.12 p.13 p.13 p.14 p.16

p.17

p.19 p.19 p.19 p.19 p.20 p.20 p.21

p.21 p.21 p.22 p.22

p.24

p.24

p.25

p.25

p.26

p.27

p.27

p.29

p.31

p.31

p.32

p.32

p.34

4

4-3 Données toxicologiques

4-3-1 Absorption, distribution, métabolisme et élimination 4-3-2 Propriétés estrogéniques

4-3-2-1 In vitro 4-3-2-2 In vivo

4-3-3 Fertilité et développement des organes reproducteurs 4-3-4 Système nerveux central 4-3-5 Système immunitaire 4-3-6 Ostéoporose 4-3-7 Système cardiovasculaire 4-3-8 Génotoxicité et mutagénicité 4-3-9 Cancérogénicité 4-3-10 Autres propriétés

5 Le bisphénol A

5-1 Propriétés physiques et chimiques 5-2 Origine 5-3 Usages 5-4 Devenir du BPA dans l’environnement

5-5 Sources et voies d’exposition de l’homme

5-5-1 Contamination par l’environnement 5-5-2 Contamination par l’alimentation

5-5-2-1 Migration du BPA dans les aliments depuis les revêtements 5-5-2-2 Ingestion de BPA


5-6-1 Toxicocinétiques, distribution et métabolisme 5-6-2 Toxicité aiguë 5-6-3 Toxicité subaiguë, subchronique et chronique 5-6-4 Génotoxicité et mutagénicité 5-6-5 Cancérogénicité 5-6-6 Reprotoxicité et embryotoxicité 5-6-7 Perturbation endocrinienne

5-6-7-1 Effets estrogéniques 5-6-7-2 Effets antiandrogéniques 5-6-7-3 Effets à faibles doses in vivo 5-6-7-4 Autres effets

6 la vinchlozoline

6-1 Propriétés physiques et chimiques

6-2 Usages

6-3 Devenir de la vinchlozoline dans l’environnement

6-3-1 Hydrolyse 6-3-2 Photodégradation 6-3-3 Biodégradation

6-4 Sources et voies d’exposition de l’Homme

p. 35

p.35 p.36 p.36 p.37 p.37 p.38 p.38 p.39 p.39 p.39 p.40 p.41

p.41

p.41

p.42

p.42

p.43

p.43

p.43 p.44 p.44 p.45

p.46

p.46 p.47 p.48 p.48 p.49 p.49 p.50 p.50 p.51 p.51 p.53

p.53

p.54

p.54

p.54

p.54 p.55 p.56

p.56

5


6-5-1 Absorption, distribution, métabolisme, élimination 6-5-2 Toxicité aigüe 6-5-3 Toxicité subaigüe, subchronique, et chronique 6-5-4 Reprotoxicité et embryotoxicité 6-5-5 Mutagénicité, génotoxicité 6-5-6 Carcinogénicité 6-5-7 Propriétés antiandrogéniques

7 Présentation et objectifs de la thèse RESULTATS Chapitre 1 : Biotransformation de la génistéine et de la vinchlozoline

Article 1 : COMPARISON OF GENISTEIN METABOLISM IN RATS AND HUMANS USING LIVER MICROSOMES AND HEPATOCYTES Article 2 : BIOTRANSFORMATION OF VINCLOZOLIN IN RAT PRECISION-CUT LIVER SLICES: COMPARISON WITH IN VIVO METABOLIC PATTERN Chapitre 2 : Caractérisation des capacités métaboliques de trois lignées cellulaires utilisées dans l’étude des propriétés des PE in vitro. Article 3 : BIOTRANSFORMATION OF GENISTEIN AND BISPHENOL A IN CELL LINES USED FOR SCREENING ENDOCRINE DISRUPTORS CONCLUSION BIBLIOGRAPHIE

p.56

p.56 p.57 p.57 p.57 p.58 p.58 p.58

p.59

p.63

p.65

p.69

p.83

p.99

p.103 p.137

p.145

6

7

Abréviations : AhR : récepteur aux arylhydrocarbones AR : récepteur aux androgènes ADN : acide désoxyribonucléique AMPc : adénosine monophosphate cyclique BPA : Bisphénol A CE50 : concentration effectrice 50% CI 50 : concentration inhibitrice 50% CL 50 : concentration létale 50% CLHP : chromatographie liquide haute performance DAG : diacylglycérol DDE : dichlorodiphényldichloroéthylène DDT : dichlorodiphényltrichloroéthane DES : diéthylstilbestrol DHT : dihydroxytestostérone DHEA : dihydroépiandrosétrone DL 50 : Dose létale 50% E2 : estradiol ER : récepteur aux estrogènes ERE : élément de réponse aux estrogènes GnRH : gonadolibérine HRE : élément de réponse aux hormones IP3 : inositol triphosphate LH : Hormone lutéïnisante LOAEL : Lowest Observed Adverse Effect Level NOAEC : No Observed Adverse Effect Concentration NOAEL : No Observed Adverse Effect Level PCBs : polychlorobiphényls PE : perturbateur(s) endocrinien(s) PVC : chlorure de polyvinyle RMN : résonance magnétique nucléaire. T3 : triiodothyronine T4 : tétraiodothyronine UGT : Uridine diphosphate glucuronyltransférase

8

9

INTRODUCTION

10

11

Lors des deux dernières décennies, l’attention des scientifiques, des media puis du

public vis à vis des effets délétères pouvant résulter d’une exposition de l’homme ou de la

faune à des substances chimiques ayant la propriété d’interférer avec le système endocrinien

est allée croissant. D’après John McLachlan (2001), l’une des toutes premières références à la

problématique posée par ce qu’on appelle désormais « les perturbateurs endocriniens » est

due à Roy Hertz qui, en 1958, estimait « qu’il fallait prendre en considération le fait que

l’utilisation d’hormones dans l’alimentation animale risquait d’exposer certains individus à

ces hormones, alors qu’ils n’auraient jamais du être en contact de leur vie avec de telles

molécules. […], que nous étions en train de créer un cycle des stéroïdes dans notre

environnement, et que nous devions sérieusement prendre en considérations les implications

que cela pouvait entraîner pour notre développement, notre croissance et peut-être pour nos

fonctions de reproduction ». Le meilleur exemple permettant de souligner ces propos est le

cas du diéthylstilbestrol ou DES. Cette molécule découverte en 1938, a montré une activité

estrogénique bien plus importante que toutes celles synthétisées auparavant. Moins onéreuse à

produire que les estrogènes de synthèse ou naturels, le DES a connu un rapide succès en

médecine et, plus tard, en production animale. Ses usages médicaux incluaient les thérapies de

substitution estrogénique, la suppression de la lactation, la contraception post-coïtale, le

traitement du cancer de la prostate, et la prévention de l’avortement spontané. En agriculture,

il était utilisé pour stériliser chimiquement les poulets et stimuler la croissance du bétail. Ce

n’est qu’au début des années 1970 que le monde scientifique et médical réussit à faire le lien

entre le DES et une série d’anomalies du tractus génital observées chez les jeunes femmes

exposées durant leur vie fœtale, en particulier l’apparition d’adénocarcinome à cellules claires

du vagin et des malformations des organes reproducteurs. Les individus de sexe masculin

exposés in utero ont également révélé des anomalies structurales et fonctionnelles du tractus

génital, telles que hypospadias, microphallus, cryptorchidie, mais aussi baisse de la fertilité

(Newbold, 2004). Des malformations du tractus génital ont été également observées chez les

souris femelles et mâles (cryptorchidie, testicules atrophiés, fertilité réduite, sperme anormal,

tumeurs génitales) (McLachlan et al., 1975). L’utilisation du DES pour ses propriétés

estrogéniques a ainsi entrainé un problème majeur de santé publique qui reste d’actualité, plus

de trente ans après la fin de l’utilisation de cette molécule chez l’Homme. Ces effets délétères

différés et de ce fait difficiles à mettre en évidence, ont été associés à la même époque à un

nombre croissant de troubles de la reproduction dans la faune sauvage des pays industrialisés.

En 1980, l’hypothèse d’une perturbation endocrinienne d’origine environnementale était

avancée et les molécules associées à cette perturbation étaient appelées « estrogènes

12

environnementaux ». Depuis, l’intérêt pour ce sujet croît régulièrement et le nombre de

publications sur les « perturbateurs endocriniens » a atteint près d’un millier en 2006.

Selon MacLachlan (2001), le phénomène de perturbation endocrinienne pourrait être

l’évènement de santé publique le plus important depuis la découverte de la mutagenèse

d’origine chimique.

1 Perturbation endocrinienne.

1-1 Brefs rappels d’endocrinologie.

1-1-1 Mode d’action des hormones

Bien que l’ensemble des tissus et organes d’un organisme puisse être exposé aux

hormones empruntant la circulation sanguine, seuls certains répondront de manière spécifique

à une hormone donnée. Les hormones peuvent être classées en deux grandes catégories pour

ce qui concerne leur site d'action initiale : les hormones hydrophobes qui traversent les

bicouches lipidiques des membranes plasmiques et les hormones hydrophiles qui ne le

peuvent pas. Ces dernières agissent en se liant à des récepteurs membranaires.

Il existe plusieurs types de récepteurs transmembranaires dont les mécanismes de

transmission du signal hormonal sont différents mais conduisent tous, en une ou plusieurs

étapes, à l'activation d'une ou plusieurs protéine-kinases intracellulaires. Une majorité

d’hormones (dont l’adrénaline, le GnRH, le glucagon ou la LH) se lient à des récepteurs

protéiques complexes appelés récepteurs à 7 domaines transmembranaires. Après liaison de

l’hormone, ces récepteurs interagissent avec divers composants membranaires conduisant

ainsi à la biosynthèse d’un ou plusieurs seconds messagers intracellulaires (AMPc, IP3 et

DAG…) qui activent les protéine-kinases intracellulaires. Il existe d’autres types de

récepteurs membranaires comme les récepteurs à un seul segment transmembranaire qui

interagissent directement avec les kinases, ou les récepteurs ayant eux-mêmes une activité

protéine-kinase (récepteurs tyrosine-kinase ou sérine/thréonine-kinase).

Les hormones hydrophobes, comme l’acide rétinoïque, les hormones thyroïdiennes ou

stéroïdes, traversent les membranes plasmiques des cellules et agissent en se fixant à des

récepteurs spécifiques appelés récepteurs nucléaires.

13

1-1-2 La super famille des récepteurs nucléaires.

Il s’agit d’un large groupe de protéines, agissant comme récepteurs à des ligands

endogènes et/ou exogènes (fig.1). Les récepteurs nucléaires sont impliqués dans la régulation

d’un très grand nombre de fonctions physiologiques chez les organismes eucaryotes comme la

croissance, la multiplication et la différentiation cellulaires ou le maintien de l’homéostasie.

Fig.1 : Domaines structuraux d’un membre type de la famille des récepteurs nucléaires.

(d’après Gillesby & Zacharewski, 1998).

Fig.2 : mécanisme général de transduction du signal par les récepteurs nucléaires (Janosek et

al., 2006). La formation d’homo- ou d’hétérodimères, ou encore l’absence de liaison d’un

coactivateur sont également possibles. NR = récepteur nucléaire.

1-1-2-1 Mode d’action et classification

Ces récepteurs sont appelés « nucléaires » du fait de leur mode d’action commun

(fig.2). Après la liaison d’un ligand spécifique, leur conformation structurale change et le

A/B C D E F

Fonction d’activation-1

Fonction d’activation-2

Signal de localisation nucléaire

Domaine de liaison des ligands

14

récepteur, souvent après une dimérisation avec un modulateur, migre dans le noyau cellulaire,

se lie sur l’ADN à un élément de réponse spécifique et déclenche l’expression du gène qui en

dépend (Janošek et al., 2006). Leurs ligands (dont font partie les hormones) sont le plus

souvent des molécules de faible poids moléculaires, spécifiques d’un récepteur.

Quarante huit récepteurs nucléaires ont été identifiés et ont été classés parmi trois

sous-classes en fonction de leurs ligands respectifs (Jacobs et al., 2003) :

• Les récepteurs de type I pour les hormones stéroïdes : récepteur à la

progestérone (PR), récepteurs aux estrogènes (ER), aux androgènes (AR), aux

glucocorticoïdes (GR) et aux minéralocorticoïdes (MR)).

• Les récepteurs de type II : récepteurs thyroïdien (TR), à la vitamine D (VDR),

récepteurs aux rétinoïdes totaux (RXR) et récepteurs à l’acide rétinoïque all-

trans (RAR), récepteurs au proliférateur de péroxysome activé (PPAR) et

récepteur à l’aryl hydrocarbone (AhR).

• Les récepteurs de type III : les récepteurs orphelins qui n’ont pour l’instant pas

de ligands spécifiques connus, dont font partie les « pregnan X receptor »

(PXR ou SXR) et le « constitutive androstane receptor » (CAR).

Seuls les récepteurs nucléaires liés aux hormones stéroïdiennes seront traités ici.

1-1-2-2 Les récepteurs aux estrogènes (ER).

Le 17-β-estradiol, l’estrone et l’estriol sont les ligands endogènes majeurs de l’ER,

produits principalement au niveau des ovaires, mais également par le placenta, le cortex des

glandes surrénales et par les tissus graisseux périphériques. Au moins deux sous-types ont été

identifiés chez les mammifères, l’ERα et l’ERβ (fig.3) (Green et al., 1986, Kuiper et al., 1996,

Mosselman et al., 1996), et un troisième, ERγ, a été décrit chez les poissons (Drummond et

al., 2002).

15

Fig.3 : Les deux sous-types de récepteurs aux estrogènes identifiés chez l’Homme. Les

nombres au dessus des représentations schématiques indiquent le nombre d’acides aminés de la

séquence. Les nombres dans la représentation schématique de l’hERα indiquent le pourcentage

d’acides aminés identiques par rapport à l’hERβ. (d’après Phytoestrogen & health, 2003).

Il s’agit d’une protéine cytosolique associée aux protéines chaperonnes de poids

moléculaire 70 et/ou 60 kDa (HSP70/60) (Massaad et al., 2002) qui bloquent le site de liaison

à l’ADN du récepteur et masquent le domaine d’adressage nucléaire. La liaison d’un ligand

spécifique à ce complexe provoque des changements conformationnels menant à sa

translocation dans le noyau. La liaison des ER à un élément de réponses aux estrogènes (ERE)

de l’ADN est responsable de la différentiation médiée par l’estradiol. Les ER peuvent

également se lier aux sites AP-1 (« activating protein 1 ») et Sp 1 (« GC-box binding

protein »), et influencer les voies impliquées dans la prolifération (Gustafsson, 2003, Paech et

al., 1997). Des études in vitro ont montré que des homodimères (ERα-ERα ou ERβ-ERβ) ou

des hétérodimères (ERα-ERβ) pouvaient être formés. L’existence de ces deux sous-types

d’ER permet une modulation de l’activité des molécules estrogéniques en fonction de leur

expression tissulaire et de l’affinité différente de ces molécules pour l’un ou l’autre des sous-

types (Barkhem et al., 1998, Gustafsson, 2003, Gustafsson and Warner, 2000, Kuiper et al.,

1997, Kuiper and Gustafsson, 1997). Par exemple, l’utilisation d’anticorps spécifiques de l’un

ou l’autre récepteur a montré qu’ERα aussi bien qu’ERβ étaient exprimés dans les glandes

mammaires de rat, mais la présence et la distribution cellulaire des deux récepteurs étaient

distinctes (Saji et al., 2000). Ainsi, les ER sont présents ensembles ou non, ou dans des

proportions différentes, dans la plupart des tissus et organes (Jacobs et al., 2003, Nilsson and

Gustafsson, 2000) (tableau n°1).

16

Tableau n°1 : distribution tissulaire des sous-types de l’ER chez l’Homme et les

Rongeurs (d’après Kuiper et al. (1997) et Phytoestrogen & Health, 2003)

Homme Rongeurs Organe/tissus

ERα ERβ ERα ERβ

Poumon - X - X

Vaisseaux X X - -

Surrénales X - X -

Reins X X X -

Prostate - X - X

Testicules - X X X

Cœur X X X X

Cerveau X X - X

Thymus - X - X

Glandes mammaires X X - -

Utérus X X X X

Endomètre X X - -

Vagin X - - -

Trompes de Fallope - X - -

Ovaires X X X X

Vessie - X - X

Epididyme - X X X

Hypophyse X X X X

Hypothalamus X X X -

Foie X - X X

Muscles - - X X

Graisse - - X X

Tractus gastrointestinal - X - X

Colon - X - X

Intestin grêle - X - X

Os X X X X

1-1-2-3 Le récepteur aux androgènes (AR).

La structure de cette protéine est très proche de celle du récepteur à la progestérone et

des récepteurs aux minéralocorticoïdes. Il existe deux isoformes de l’AR, l’AR-A et l’AR-B.

Les AR-A et B diffèrent par la longueur de leur séquence amino-terminale (McPhaul and

Young, 2001). L’AR est associé aux protéines chaperonnes HSP90 et 70. La fixation d’un

agoniste provoque la dissociation du complexe, et un changement conformationnel du

récepteur, qui se dimérise puis se fixe aux éléments de réponse de l’ADN nucléaire qui

régulent l’expression de gènes spécifiques.

17

L’AR est principalement exprimé dans les testicules, mais il est également présent

dans la prostate, les glandes surrénales, les reins, le cerveau et l’hypophyse (Ikeuchi et al.,

2001). Ses ligands endogènes sont la testostérone et son métabolite, la 5α-

dihydroxytestostérone (5α-DHT), ainsi que l’androstènedione et la dihydroépiandrostérone

(DHEA). La testostérone est produite principalement par les testicules, et dans une moindre

mesure par les glandes surrénales.

Le rôle du récepteur aux androgènes chez les organismes mâles est très similaire à

celui des récepteurs aux estrogènes chez les organismes femelles. Les androgènes jouent un

rôle clé dans le développement des caractéristiques sexuelles primaires et secondaires

masculines. Ils régulent également la masse musculaire et la croissance osseuse.

1-2 Perturbateur endocrinien (PE).

Plusieurs définitions du terme « perturbateur endocrinien » ont été proposées. L’une

des premières à avoir été établie fait la distinction entre un perturbateur endocrinien, et un

perturbateur endocrinien potentiel (1996, Weybridge, Royaume-Uni) :

« Un perturbateur endocrinien est une substance exogène provoquant des effets délétères sur

la santé dans un organisme intact, ou sur sa descendance, suite à des changements dans ses

fonctions endocriniennes. Un perturbateur endocrinien potentiel est une substance possédant

des propriétés qui pourraient éventuellement provoquer une perturbation endocrinienne dans

un organisme intact. »

En mai 1997, un groupe de travail sur la perturbation endocrinienne (EDSTAC) de l’agence

de protection de l’environnement des Etats-Unis (EPA) a établi la définition suivante,

étendant le principe de perturbation endocrinienne aux populations :

« Un perturbateur endocrinien est une substance chimique ou un mélange qui, d’après les

principes et les données scientifiques, le poids de l’évidence, et le principe de précaution,

altère une ou plusieurs fonctions du système endocrinien et provoque des effets délétères au

niveau de l’organisme, de sa descendance, des populations ou des sous-populations. »

Une troisième définition précise les modes d’actions des perturbateurs endocriniens, indiquant

qu’ils sont « des substances qui, interférant avec les fonctions du système hormonal, risquent

d’influer négativement sur les processus de synthèse, de sécrétion, de transport, d’action ou

d’élimination des hormones » (UE 2002). La perturbation endocrinienne n’est pas considérée

18

Fig.4 : Structures chimiques de différents perturbateurs endocriniens estrogéniques ou

principalement estrogéniques (A) et antiandrogéniques ou principalement antiandrogéniques

(B). Le 17β-estradiol et la 5α-DHT, hormones naturelles, sont présentés à titre indicatif afin de

comparer leur structure à celle des PE.

B

A

19

comme un effet adverse en soit, mais comme un mode d’action pouvant mener à des

changements fonctionnels et à des effets délétères au niveau de l’individu ou des populations.

Ainsi, les PE pris dans leur ensemble n’ont pas d’autre point commun que la propriété

qui les définit. Leurs structures chimiques comme leurs origines sont extrêmement variées

(fig.4). Les PE englobent un grand nombre de classes chimiques, incluant les hormones

naturelles et synthétiques, des constituants de plantes, des pesticides, des composés utilisés

dans l’industrie des plastiques et des produits de consommation, des sous-produits industriels

et des polluants. Ils sont souvent largement répandus dans notre environnement. Certains sont

persistants, et peuvent être transportés sur de grandes distances jusqu’à des régions peu

fréquentées par l’homme. D’autres, fugaces, sont rapidement dégradés dans l’environnement,

mais peuvent néanmoins contaminer des êtres vivants à des périodes critiques de leur

développement.

1-3 Modes d’action.

Les mécanismes selon lesquels les PE peuvent interférer avec les systèmes de

régulation hormonale sont nombreux et un PE peut agir selon plusieurs mécanismes à la fois.

Les plus étudiés sont ceux faisant intervenir les récepteurs hormonaux.

1-3-1 Interactions directes avec les récepteurs aux hormones.

1-3-1-1 Action agoniste.

Une molécule exogène agoniste est capable de se lier à un récepteur comme le fait une

hormone et de l’activer, entraînant les effets normalement provoqués par l’hormone

endogène. La réponse dépend de son affinité pour le récepteur et de sa capacité à l’activer.

1-3-1-2 Action antagoniste.

Une molécule exogène antagoniste est capable d’empêcher ou de diminuer l’activation

d’un récepteur en présence d’une molécule agoniste. Cette inhibition peut être compétitive si

l’agoniste endogène et l’antagoniste exogène sont en compétition pour le même site de liaison

du récepteur, ou non compétitive si l’inhibiteur se lie au récepteur ou au complexe (récepteur

+ hormone) ailleurs que sur le site d’activation.

20

Fig.5 : modes d’action agoniste et antagoniste par interaction directe avec le récepteur

hormonal (d’après McLachlan et al., 2001).

1-3-2 autres interactions.

1-3-2-1 Modification de la concentration en hormone.

Une molécule exogène peut perturber indirectement les fonctions d’une hormone en

influant sur sa concentration, via une modification de sa métabolisation (production ou

élimination), de son transport ou de sa libération depuis son lieu de stockage.

Ainsi, un inhibiteur de l’aromatase empêchera ou diminuera la formation de 17-β-

estradiol à partir de la testostérone, amenant une concentration plus élevée que la normale en

cette dernière hormone et une concentration plus faible en estrogène. Ce type de mécanisme

est par exemple responsable des effets du tributylétain (une des substances actives des

peintures anti-salissures utilisées pour protéger les carènes) observés sur les populations de

bulots en mer du Nord. Il a été observé chez ces gastéropodes marins un phénomène

d’imposex (les femelles possèdent des organes sexuels masculins en plus des organes

féminins) provoqué par l’inhibition de l’acylcoenzyme A:testostérone acyltransférase

normalement responsable de l’inactivation de la testostérone (Gooding and LeBlanc, 2001).

De même, l’induction des enzymes impliquées dans le métabolisme des hormones peut

modifier leur niveau circulant. Ainsi, l’induction au niveau du foie du cytochrome P450 1A1,

impliqué dans l’hydroxylation de l’E2, serait responsable de l’activité anti-estrogénique de

certains PCBs substitués en positions non-ortho, en facilitant l’inactivation et l’élimination de

l’E2 (Pang et al., 1999).

Enfin, une interaction avec le transport plasmatique des hormones peut également

aboutir à une perturbation endocrinienne. En effet, seule une petite partie des molécules

lipophiles circule librement dans le sang. La majeure partie circule liée à des protéines de

Agoniste Antagoniste Récepteur hormonal Récepteur hormonal

Toxique A Toxique B

Réponse hormonale

Pas d’effet

21

transport comme l’albumine par exemple. Une substance entrant en compétition avec une

hormone pour les sites de liaison de son transporteur peut provoquer un accroissement de sa

fraction libre qui est active et capable de se lier à son récepteur. Par exemple, les PCB et en

particulier leurs métabolites hydroxylés entrent en compétition avec les hormones

thyroïdiennes pour leurs protéines sériques de transport, dont la transthyrétine. Ainsi, tandis

que des concentrations élevées, de l’ordre de 20 ppm (microgrammes par gramme), doivent

être atteintes dans les tissus cibles pour que les métabolites hydroxylés des PCB altèrent de

façon significative la liaison de la T3 à son récepteur, des concentrations de seulement 0,017

ppm seraient suffisantes pour que ces mêmes métabolites altèrent le transport de la T3 via la

transthyrétine, rendant ce mécanisme d’action prépondérant par rapport à une interaction

directe avec le récepteur nucléaire (Cheek et al., 1999).

1-3-2-2 Modification de la concentration en récepteurs.

Si la concentration en ligand joue sur sa capacité à entraîner un effet, il en va de même

de son récepteur. Ainsi, certains PE peuvent agir en modifiant la concentration en récepteur

d’une hormone. C’est le cas en particulier de la 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD).

Cette dernière est un agoniste d’origine exogène pour l’AhR, dont l’activation induit une

augmentation de l’expression des enzymes responsables de la dégradation du récepteur aux

estrogènes (Safe and Krishnan, 1995). Cet effet se cumule d’ailleurs avec une augmentation

de l’expression des enzymes du métabolisme de l’E2 et une inhibition de l’expression des

gènes contrôlés par cette même hormone.

1-4 Interférences avec les hormones stéroïdiennes.

Les activités perturbatrices mises en évidence pour un grand nombre de molécules

naturelles ou synthétiques vis-à-vis des hormones stéroïdiennes ont été les plus étudiées. Ce

sont d’ailleurs elles qui sont à l’origine de la prise de conscience de la communauté

scientifique de l’existence des phénomènes de perturbation endocrinienne et des risques qu’ils

représentent.

1-4-1 Les notions d’ « (anti-)estrogénicité » et d’ « (anti-)androgénicité ».

Un xénobiotique est considéré comme estrogénique lorsqu’il agit selon le même

mécanisme que les estrogènes naturels et/ou qu’il provoque toute ou partie des effets des

22

estrogènes naturels. Ces effets peuvent être mis en évidence par des tests in vivo chez la souris

ou la rate immature ou ovariectomisée comme l’induction de la cornification vaginale, la

hausse du poids de l’utérus, ou la prolifération de l’épithélium utérin. Ils peuvent également

être évalués in vitro par la mesure de la prolifération cellulaire sur des lignées sensibles aux

estrogènes, ou encore en déterminant la liaison aux récepteurs (ERα ou ERβ), en déplaçant la

liaison estradiol-récepteur, en étudiant l’expression des gènes cibles des estrogènes

(McLachlan, 2001). Un xénobiotique est antiestrogénique lorsqu’il empêche l’activité d’un

estrogène naturel. De même, un xénobiotique est androgénique lorsqu’il agit selon le même

mode que les androgènes et/ou qu’il induit des effets similaires à ceux d’androgènes naturels.

Il est antiandrogénique lorsqu’il empêche leur activité et provoque l’apparition d’un

phénotype plus ou moins féminisé.

1-4-2 Effets sur la faune sauvage et les espèces d’élevage.

Seuls quelques exemples significatifs sont rappelés ici. Chez les oiseaux, l’exposition

au DDT a provoqué une diminution des capacités de reproduction, en particulier en altérant la

calcification des œufs, laquelle est dépendante des estrogènes et de la vitamine D . Le DDT et

son métabolite, le DDE, ont également été à l’origine de troubles de la reproduction chez

l’alligator. En effet, des anomalies des organes génitaux mâles (micro-pénis) et des

concentrations anormalement basses de testostérone chez les crocodiles mâles du lac Apopka

en Floride ont été relevées après une contamination massive, en 1980, par un pesticide qui

contenait du dicofol et du DDT. Les poissons d’eau douce ont fait l’objet d’un grand nombre

d’études relatives à l’action des PE (en particulier des substances estrogéniques) dans le

milieu aquatique. Par exemple, des phénomènes d’inversion sexuelle ont été rapportés chez

des populations de poissons vivant immédiatement en aval des stations d’épuration d’eau du

réseau domestique (Hemming et al., 2001). Parmi les substances responsables de ces effets

figurent le 17-β-ethinylestradiol (entrant dans la composition des pilules contraceptives) et le

p-nonylphénol (produit de dégradation de certains détergents). Ces composés entrainent à

faible dose (< 50 µg/L) une diminution des capacités de reproduction et une synthèse de

vitellogénine chez les poissons mâles (White et al., 1994).

1-4-3 Observations chez l’Homme.

La perturbation des effets des hormones stéroïdiennes a été relevée dès les années

1940 chez l’homme, quand il a été observé que les pilotes d’avions d’épandage avaient une

diminution du nombre de spermatozoïdes liée à leur exposition au DDT (Singer, 1949). De

23

manière plus générale, et sans qu’un lien de cause à effet avec un PE particulier ait pu être

déterminé, des études épidémiologiques et des méta-analyses ont fait état d’une fréquence

accrue d’anomalies liées au développement du système reproducteur masculin. Ainsi, Auger

et al. (1995), Carlsen et al. (1993), Irvine et al. (1996) et Swan et al. (1997) ont observé une

diminution de la qualité du sperme (concentration spermatique, mobilité et caractéristiques

morphologiques des spermatozoïdes) mais avec des différences géographiques marquées. Ces

dernières suggèrent l’implication de facteurs environnementaux, tels que l’exposition à des

contaminants. L’incidence du cancer des testicules, qui touche le plus souvent les hommes

entre 20 et 35 ans, a augmenté significativement dans les pays industrialisés, mais là aussi,

avec des différences géographiques marquées (Adami et al., 1994, Dearnaley et al., 2001).

Les facteurs de risques principaux reconnus pour le cancer des testicules est la cryptorchidie

(non descente des testicules dans le scrotum) suivie de l’hypospadias. L’hypospadias se

caractérise par un déplacement du méat urétral vers la face inférieure du pénis. Malgré les

différences dans les méthodes d’analyse et de diagnostic d’une étude à l’autre (Toppari et al.,

2002), des indications claires montrent que sa fréquence a augmenté dans les pays européens,

aux USA et au Japon (Dearnaley et al., 2001, Jensen et al., 1995, Paulozzi et al., 1997).

L’accident de Seveso en 1976 en Italie s’est traduit quelques années plus tard par une hausse

de l’incidence de l’hypospadias chez les enfants dont les pères avaient été exposés à la

dioxine (Baskin et al., 2001). En outre, une hausse du risque transgénérationnel d’hypospadias

a été relevé chez les fils des femmes qui ont été exposées in utero au diethylstilbestrol (Klip et

al., 2002). Par ailleurs, certaines études suggèrent un risque accru de cryptorchidie chez les

fils de femmes travaillant avec des pesticides (Weidner et al., 1998). Il est avancé que ces

anomalies seraient liées entre elles et ont été liées à un « syndrome de dysgenèse testiculaire »

(Edwards et al., 2006, Skakkebaek et al., 2001). Néanmoins, il demeure difficile d’associer un

pesticide particulier à des effets observés chez les populations exposées. Ainsi, les media

(parmi lesquels « Le Monde » du 19 septembre 2007) ont récemment évoqué le cas de la

pollution des Antilles françaises au chlordécone (képone), un insecticide dont l’usage est

interdit en France depuis 1990 mais qui s’est poursuivi jusqu’en 1993. Ce pesticide chloré

présente des propriétés estrogéniques in vitro et agit comme un agoniste compétitif pour les

ER α et β (Kuiper et al., 1998). Il est associé à des effets estrogéniques chez l’Homme d’après

des cas de troubles de la reproduction et de neurotoxicité chez des hommes exposés lors d’un

accident sur leur lieu de travail dans les années 1970 (Taylor et al., 1978). Le chlordécone

induit un œstrus persistant, des troubles de la fertilité ainsi qu’une diminution de la taille et du

nombre des portées chez la souris (Good et al., 1965). Le chlordécone augmente également la

24

mortalité embryonnaire et fétale chez le rat et la souris, et, lors des études de toxicité

chronique, il a provoqué une atrophie testiculaire et des carcinomes mammaires chez le rat

(Chernoff and Rogers, 1976, Reuber, 1978). Malgré l’importance des concentrations

environnementales en chlordécone et de l’exposition à ce pesticide mesurées en Guadeloupe

et en Martinique, aucune donnée épidémiologique ne permet d’associer les observations

relevées au sein des populations exposées (telles l’incidence du cancer de la prostate qui est la

plus élevée au monde en Guadeloupe) au chlordécone.

2 Méthodes de « screening » des perturbateurs endocriniens.

Les méthodes de « screening » des perturbateurs endocriniens incluent des tests

réalisés in vivo et in vitro. In vivo, les perturbateurs endocriniens sont capables d’interférer à

différents niveaux des mécanismes complexes de régulation du système endocrinien. Ils

peuvent être pris en charge par les différents systèmes métaboliques de l’organisme. Les tests

in vivo permettent ainsi d’observer les effets entrainés par une molécule testée en prenant en

compte l’ensemble de ces interactions (Eertmans et al., 2003, Gray et al., 2002). Bien que les

tests utilisant des animaux présentent des avantages liés à la prise en compte de cette

complexité mais également des différences interespèces (Zacharewski, 1998), ils sont longs et

coûteux et de très nombreuses méthodes alternatives sont développées. Par ailleurs, il est

aujourd’hui nécessaire de se préoccuper du bien être de l’animal lors de l’élaboration des

protocoles expérimentaux. Ce soucis éthique se traduit par la réduction du nombre d’animaux

dans les expérimentations scientifiques voire par la substitution des essais in vivo par des tests

in vitro.

2-1 Tests de liaison au récepteur.

Les tests de liaison à un récepteur particulier sont utilisés pour détecter des molécules

capables d’interagir directement avec un récepteur endocrinien, comme les récepteurs α et β

aux estrogènes ou le récepteur aux androgènes. Ces tests permettent de mesurer l’affinité de

liaison du récepteur pour les ligands testés. Ils sont basés sur l’étude de la compétition entre la

molécule testée non radiomarquée et un ligand standard radiomarqué pour le récepteur (Wong

et al., 1995). Le défaut principal de ces tests est qu’ils ne fournissent aucune information sur

l’activité hormonale du composé testé, c'est-à-dire qu’ils ne permettent pas de faire la

25

différence entre une activité agoniste ou antagoniste (Branham et al., 2002, Eertmans et al.,

2003). Il est donc impératif d’utiliser un autre test fonctionnel in vitro pour la déterminer.

2-2 Tests de prolifération cellulaire.

Le test E-Screen est l’exemple le plus connu de ce type de tests. Il est basé sur la

propriété qu’ont les cellules MCF7 à proliférer lorsqu’elles sont en présence d’une molécule

estrogénique dans le milieu de culture (Soto et al., 1995). Ce test est l’un des plus sensibles

pour analyser l’estrogénicité des molécules et permet de distinguer entre une activité agoniste

ou non. Ainsi, une molécule est considérée comme un antagoniste pur lorsque (a) il n’affecte

pas le nombre de cellules en absence d’estrogène, (b) il bloque les effets prolifératifs de

l’estradiol, et (c) ce blocage est réversible en augmentant la dose d’estradiol tout en gardant

constante la concentration de l’antagoniste (Sonnenschein and Soto, 1998). Néanmoins, du

fait de la sensibilité du test aux conditions de culture (sous-clones cellulaires différents, lots

de sérum), la variabilité des résultats inter- et intra-laboratoire est relativement importante

(Eertmans et al., 2003). Des tests de prolifération cellulaire ont également été développés pour

détecter les molécules ayant une activité androgénique ou antiandrogénique. Ces tests « A-

Screen » utilisent les cellules de carcinome de la prostate d’origine humaine LNCaP-TAC,

dont la prolifération est dépendante de la présence d’un androgène dans le milieu de culture

(Sonnenshein et Soto, 1998). Comme il a été démontré que cette lignée cellulaire présentait

un point de mutation au niveau du site de liaison aux androgènes provoquant une affinité pour

les estrogènes, une lignée de cellules MCF7 transfectées pour exprimer de façon stable le

récepteur aux androgènes a été développées (Sonnenshein et Soto, 1998). Cette lignée répond

de façon spécifique aux androgènes par une diminution de sa vitesse de prolifération.

2-3 Tests utilisant un gène rapporteur.

Le principe des tests d’expression d’un gène rapporteur est de mesurer l’induction de

la transcription de ce gène suite à l’activation d’un récepteur hormonal. Ces tests sont basés

sur le développement de cellules de mammifères ou de levures (Saccharomyces cerevisiae)

génétiquement modifiées (Balaguer et al., 1996). Les cellules sont transfectées de façon

transitoire ou stable avec un plasmide vecteur portant les séquences ADN d’un élément de

réponse à une hormone (« Hormone response element » ou HRE) couplé à un gène rapporteur

comme celui de la β-galactosidase ou la luciférase. Ce plasmide peut également contenir la

26

séquence ADN codant pour un récepteur hormonal spécifique (par exemple un récepteur aux

estrogènes ou le récepteur aux androgènes). Cette séquence est indispensable pour les souches

de levure et pour les cellules qui n’expriment pas le récepteur étudié. L’exposition à une

molécule active vis-à-vis du récepteur hormonal visé provoquera une liaison de cette

molécule et de ce récepteur. Le complexe ligand-récepteur formera un dimère qui interagira

avec le HRE, entrainant une activation de la transcription et l’expression du gène rapporteur.

Si par exemple ce gène est la β-galactosidase, elle métabolisera un substrat spécifique présent

dans le milieu de culture comme le CPRG (chlorophénol rouge-beta-D-galactopyranoside),

conduisant à une coloration rouge due à la libération de chlorophénol. Cette coloration peut

être mesurée avec un spectrophotomètre (De Boever et al., 2001). L’intensité de la coloration

est un indicateur de l’estrogénicité de la molécule testée.

Ces tests utilisant un gène rapporteur ont l’avantage de permettre une quantification de

l’activité agoniste ou antagoniste des molécules testées en évitant l’utilisation de molécules

radiomarquées, d’être assez rapides à mettre en œuvre, et d’être adaptables à divers récepteurs

hormonaux. Ils permettent en outre de tester des mélanges de xénobiotiques (Arnold et al.,

1996).

2-4 Limites des tests in vitro.

Si ces tests fournissent des moyens rapides et relativement économiques d’obtenir des

informations sur l’activité d’une molécule testée vis-à-vis d’un récepteur donné, ils ne sont

néanmoins pas dépourvus de défauts. Le premier est qu’on ne peut simuler in vitro les

systèmes endocriniens intégrés des organismes vivants et plus précisément les conséquences

toxiques à l’échelle d’un organisme entier d’une perturbation endocrinienne. Une autre

limitation concerne les carences métaboliques, tant qualitatives que quantitatives des modèles

in vitro quand on les compare au métabolisme in vivo.

27

3 Métabolisme et activité endocrinienne.

3-1 Les systèmes de biotransformation.

La connaissance du métabolisme d’une substance est particulièrement importante dans

l’évaluation de son éventuelle toxicité. Elle peut fournir des informations sur le potentiel de

cette substance à être bioaccumulée, à être convertie en une molécule plus active (activation

métabolique) ou au contraire moins active (détoxication métabolique).

Les étapes clés de la biostransformation des xénobiotiques ou des hormones

stéroïdiennes sont (1) l’oxydation de ces composés (par des enzymes dites de phase I ou de

fonctionalisation) (2) souvent suivie de la conjugaison de la fonction ainsi introduite avec des

molécules très polaires comme l’acide glucuronique, l’acide sulfurique, le glutathion ou

encore un glucose (conjugaison par les enzymes dites de phase II) (fig.6).

Fig.6 : Etapes clés de la biotransformation des xénobiotiques ou des hormones stéroïdiennes

X X XOH XOR

O2

XOR

Phase I fonctionnalisation

Phase II conjugaison

ROH

Phase III : Expulsion du produit parent ou des métabolites conjugués par des systèmes de transport actifs

XOH

XOH

28

Les enzymes clés d’oxydation sont principalement les isoformes de la superfamille des

cytochromes P450 (CYP). Les CYP catalysent les réactions de mono-oxygénation, de

réduction, et d’hydrolyse de nombreux substrats, les rendant plus polaires et solubles dans

l’eau, plus facilement pris en charge par les enzymes de phase II et potentiellement plus

rapidement éliminés. Néanmoins, la phase I du métabolisme, et dans une moindre mesure la

phase II, peuvent amener à la formation de métabolites plus actifs ou toxiques que le composé

parent. Les principaux CYP impliqués dans la métabolisation des xénobiotiques chez

l’homme sont les CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9,

CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7 et CYP4A11. Les CYP ont une

localisation essentiellement hépatique (CYP1A2, 1B1, 2A6, 2C8, 2C9, …), parfois

extrahépatique (CYP1A1), parfois ubiquitaire (CYP2D6). Parmi toutes ces enzymes, le

CYP3A4 est le plus abondant dans le foie humain et joue un rôle clé dans le métabolisme des

stéroïdes et des xénobiotiques.

Les enzymes de phase II catalysent la conjugaison des métabolites générés par les

enzymes de phase I du métabolisme à des molécules polaires, solubles dans l’eau, comme

l’acide glucuronique ou le glutathion. Le composé parent peut également être directement pris

en charge par des enzymes de phase II, sans intervention préalable d’enzymes de phase I, s’il

possède les fonctions chimiques adéquates. Les réactions de phase II entraînent généralement

la détoxication du xénobiotique actif ou de ses métabolites. Les sulfotransférases

appartiennent à une large classe d’enzymes qui transfèrent un groupe sulfate du donneur de

sulfate universel qu’est la 3’-phosphoadénosine 5’-phosphosulfate (PAPS). Les molécules

prises en charge sont de natures chimiques extrêmement diverses, allant des petites molécules

endogènes comme les hormones stéroïdes ou thyroïdiennes ou les vitamines, aux

macromolécules comme les glycosaminoglycanes ou les peptides. Les fonctions les plus

susceptibles d’être conjuguées sont les hydroxyles aromatiques et aliphatiques. (Scrott et al.,

1996 et 2002). Les sulfotransférases sont présentes dans le cytosol et les membrane de

l’appareil de Golgi des cellules. Les UGT sont un ensemble de deux familles d’enzymes

possédant de nombreux isoformes catalysant la glucuronidation de composés exogènes et

endogènes. Elles sont présentes dans le réticulum endoplasmique des cellules. Les deux

familles – UGT1 et UGT2 – n’ont pas les même substrats. Les UGT1 métabolisent la

bilirubine, les amines et les phénols tandis que les UGT2 ont un spectre de métabolisation

plus large (stéroïdes, acides biliaires, opioïdes...).

Ainsi, in vivo, les molécules endogènes comme exogènes voient leur activité modulée

par l’ensemble des enzymes du métabolisme capables de les prendre en charge.

29

3-2 Exemple des stéroïdes endogènes.

Tous les stéroïdes sont dérivés du cholestérol. La synthèse des hormones stéroïdes est

effectuée au niveau des cellules du cortex des glandes surrénales, des cellules de la thèque de

l’ovaire et des cellules de Leydig des testicules. La pregnénolone, produit initial de la réaction

de clivage de la chaîne latérale du cholestérol par le CYP11A1, est utilisée dans différentes

voies de synthèse menant à la formation de stéroïdes variés dont les glucocorticoïdes et les

minéralocorticoïdes dans les surrénales, et les stéroïdes sexuels (androgènes, estrogènes et

progestérone) dans les gonades (fig.7). Les stéroïdes endogènes peuvent être convertis en

métabolites actifs ou inactifs dans les tissus cibles (revue par Steimer, 2003). La conversion

des androgènes par l’aromatase, membre de la famille des cytochromes P450 (CYP19), est

une étape essentielle de la biosynthèse des estrogènes dans les ovaires, le placenta et les

testicules (fig.8). Les tissus non stéroïdogènes exprimant l’aromatase incluent le foie, le tissus

adipeux et le système nerveux central.

Ces étapes de phase I du métabolisme permettant l’obtention d’estrogènes et

d’androgènes à partir du cholestérol, sont l’exemple parfait démontrant qu’elles peuvent

activer un substrat et en modifier radicalement l’activité.

Fig.8 : Exemple de l’influence des réactions de biotransformation sur l’activité des molécules

métabolisées : rôle de l’aromatase dans la conversion des androgènes en estrogènes.

30

Fig.7 : Voies de synthèse des hormones stéroïdes (d’après Mensah-Nyagan et al., 1999).

31

3-3 Rôle du métabolisme dans l’activation et l’inactivation des perturbateurs

endocriniens.

Le rôle du métabolisme dans l’activation ou la modification de l’activité des

perturbateurs endocriniens peut être souligné par quelques exemples. Ainsi, la conversion du

tamoxifène en un dérivé 4-hydroxylé par les CYP 3A4 et 2D6 est requise pour conférer à

cette molécule l’activité anti-estrogénique suffisante pour laquelle elle est utilisée en

médecine (Dehal and Kupfer, 1999). Alors que le p,p’-DDT est un estrogène

environnemental, son métabolite p,p’-DDE ne se lie que très faiblement au ER (Kelce et al.,

1995). Néanmoins, l’administration de p,p’-DDE (100mg/kg/jour) à des rates en gestation

entre les 14ème et 18èmes jours de gestation réduit la distance anogénitale et provoque le

maintien des mamelons thoraciques chez les nouveau-nés mâles. En outre, le p,p’-DDE se lie

in vitro au AR avec une affinité modérée et inhibe l’activation transcriptionnelle induite par la

DHT aussi efficacement que l’hydroxyflutamide, un médicament antiandrogénique. Le

mécanisme responsable de cette inhibition, qui indique un effet antiandrogénique de ce

métabolite, est l’inhibition de la liaison AR-ADN (Kelce et al., 1995).

3-4 Conséquences vis-à-vis de l’évaluation de l’activité perturbatrice endocrinienne à

l’aide de tests in vitro.

Il est reconnu que les tests employant des lignées cellulaires ne permettent pas de

prendre en compte une activation métabolique des xénobiotiques (Gray et al., 2002), du fait

de l’expression réduite voire de l’absence des enzymes de phase I. Le risque dans ce cas

particulier est donc d’observer des faux négatifs, c'est-à-dire que le test puisse donner une

réponse négative alors que l’activité endocrinienne existe in vivo. En outre, une éventuelle

métabolisation des molécules testées n’est pratiquement jamais prise en compte lors de

l’analyse des résultats obtenus avec ces lignées cellulaires. Ainsi, si une activation de la

molécule n’est pas prise en compte, son inactivation par des enzymes de phase II non plus

alors que dans un tel cas, la réponse observée pourrait être sous évaluée. Enfin, ces essais

peuvent entrainer des réponses faussement positives lorsque les molécules sont testées à des

concentrations plus élevées que celles observées in vivo (Gray et al., 2002).

32

4 La génistéine.

Fig. 9 : structure chimique de la génistéine

4-1 La génistéine et autres phytoestrogènes.

Les phytoestrogènes sont des substances présentant des propriétés estrogéniques qui

sont produites naturellement par certaines plantes. La majorité des phytoestrogènes appartient

au groupe des flavonoïdes (tableau n°2), parmi lesquels se distinguent trois classes : les

isoflavones, les coumestans et les flavonoïdes prénylés. Un autre groupe de phytoestrogènes

rassemble des molécules non flavonoïdes.

Tableau n°2 : Classification structurale des phytoestrogènes (les composés entre parenthèse

ne sont pas présents dans les plantes mais sont issus de la biotransformation des molécules de

leur classe)

Phytoestrogènes

Flavonoïdes Non flavonoïdes

Isoflavones Coumestanes Prénylflavonoïdes Lignanes

Génistéine Coumestrol 8-prénylnaringénine Laricirésinol

Daidzéine 6-prénylnaringénine Isolaricirésinol

(Equol) Xanthohumol Matairésinol

Glycitéine Isoxanthohumol Sécoisolaricirésinol

Biochanine A (Entérodiol)

Formononetine (Entérolactone)

Les isoflavones sont définies par leur structure moléculaire, basée sur le squelette indiqué

figure 10.

O

O

O H

O H O H 4'

1 2

5 6

7 8

4

3 A

B

C

Génistéine

* 2'

3'

5'

33

Fig.10 : structure d’une isoflavone.

Les phytoestrogènes possèdent des propriétés estrogéniques qui peuvent s’expliquer en raison

des analogies structurales qu’ils partagent avec l’estradiol (fig.11).

Fig.11 : structures chimiques de quelques phytoestrogènes comparées à celle de l’estradiol.

34

4-2 Sources et voies d’exposition de l’homme.

Les sources d’exposition humaine à la génistéine (et aux phytoestrogènes en général)

sont essentiellement alimentaires, via la consommation de plantes telles le soja et de leurs

produits de transformation. La concentration en phytoestrogènes des plantes peut être très

variable. Les facteurs mis en cause sont l’espèce de plante considérée, la souche, l’année et/ou

la zone géographique de récolte (Wang and Murphy, 1994). Ainsi, les concentrations en

phytoestrogènes peuvent varier de quantités indétectables jusqu’à des concentrations de

l’ordre du gramme par kilogramme de plante (poids frais). Dans les plantes, les isoflavones

sont présentes principalement sous forme conjuguée au glucose. Le soja est la source majeur

en phytoestrogènes, et en génistéine en particulier (Mazur and Adlercreutz, 1998), de telle

manière que l’ingestion quotidienne d’isoflavones est généralement corrélée avec la

consommation de soja (Wiseman et al., 2002). Les produits préparés par fermentation du soja,

tel que le miso ou le tofu, ou par cuisson contiennent également de fortes concentrations en

isoflavones. Les isoflavones y sont alors majoritairement présentes sous forme d’aglycone.

Les isoflavones, dont la génistéine, sont ainsi retrouvées dans les laits infantiles à base de soja

(18 – 41 mg d’isoflavones par litre). La consommation d’isoflavones chez les nourrissons

âgés de 4 mois nourris à ces laits maternels serait de 4,5 à 8 mg/kg pc/j (Setchell et al., 1998).

Les enfants nourris au sein maternel peuvent également être exposés aux isoflavones, en

fonction du régime alimentaire de leur mère. Ainsi, des concentrations allant de 5,1±2,2 à

70,7±19,2 nM voire 200 nM d’isoflavons ont été retrouvé dans les laits de mères consommant

de la nourriture à base de protéines de soja (Francke et al, 1998 & 2006). L’injestion

journalière de génistéine, sur la base d’un régime végétarien, serait en moyenne de 0,1 mg/kg

pc/j (Clarke et al., 2003), tandis qu’un régime normal apporterait moins d’1 mg d’isoflavones

totales par personne (Wiseman et al., 2002).

Enfin, il existe sur le marché des suppléments riches en phytoestrogènes vendus

comme traitements hormonaux substitutifs afin de traiter les troubles climatériques ou pour

développer « naturellement » chez la femme la taille de la poitrine. Leurs contenus en

phytoestrogènes sont extrêmement variables, autant qualitativement que quantitativement. Ils

sont même très souvent inférieurs à ce qui est indiqué par les fabricants (Nurmi et al., 2002,

Setchell et al., 2001).

Il est à noter qu’en Asie orientale, la consommation quotidienne d’isoflavones, dont la

génistéine, est bien plus élevée qu’en Europe ou aux USA, du fait de l’utilisation habituelle du

soja comme ingrédient dans les régimes traditionnels. Ainsi, au Japon, la consommation

35

d’isoflavones serait de l’ordre de 20 à 50 mg/j sous forme glycosylée pour la population

générale (Arai et al., 2000, Nagata et al., 2000). Des valeurs deux fois intérieures ont été

rapportées pour la Chine (Chen et al., 1999, Mei et al., 2001) et la Corée (Kim and Kwon,

2001), mais avec une variation très importante entre les communautés.

4-3 Données toxicologiques.

4-3-1 Absorption, distribution, métabolisme et élimination

Comme les autres isoflavones, la génistéine est présente dans les plantes non

transformées principalement sous forme de glucoside (la génistine). Pour être absorbée, la

génistine doit être hydrolysée et libérer la génistéine (Setchell et al., 2002). L’hydrolyse de la

forme glycosylée est effectuée par la β-glucosidase de l’instestin grêle, mais également par la

microflore intestinale (Barnes et al., 1996, Xu et al., 1995). La microflore intestinale joue

d’ailleurs un rôle très important dans le métabolisme de la génistéine avant même que celle-ci

soit absorbée, formant la dihydrogénistéine et l’acide 4-hydroxyphényle-2-propionique. Une

fois absorbée, la génistéine est facilement conjuguée à l’acide glucuronique et/ou au sulfate en

position 3’ et 7 au niveau du foie mais aussi de l’épithélium intestinal qui possède des

activités glucuronosyl transférase et sulfotransférase (Setchell, 1998, Sfakianos et al., 1997).

Après administration orale chez le rat de [14C]-génistéine, la radioactivité retrouvée

dans les organes reproducteurs (vagin, utérus, ovaires et prostate) est supérieures à celle

mesurée dans autres organes périphériques (Coldham and Sauer, 2000). Toujours chez le rat,

après administration intrapéritonéale, la génistéine inchangée est retrouvée dans le cerveau

(Setchell, 1998). La génistéine circule principalement sous forme conjuguée à l’acide

glucuronique dans le plasma (Holder et al., 1999). Les concentrations plasmatiques et

tissulaires en génistéine augmentent avec la dose ingérée chez le rat (Chang et al., 2000).

Chez l’homme, la génistéine a été retrouvée dans de nombreux fluides biologiques, tels que

l’urine, le plasma, les fèces, le fluide prostatique, la bile, la salive, le lait maternel

(Adlercreutz et al., 1995). La concentration plasmatique maximale est atteinte environ 8 h

après l’ingestion en une prise d’environ 30 mg de génistéine sous forme de poudre de soja

(Watanabe et al., 1998). L’excrétion par voie urinaire est majoritaire chez le rat. En effet,

Coldham et Sauer (2000) ont retrouvé dans les urines de rats mâles et femelles 66% de la dose

de [14C]-génistéine administrée par voie orale (4 mg/kg pc). Soixante-dix à 80 % de la [14C]-

génistéine administrée par voie orale chez le rat est excrétée sous forme conjuguée à l’acide

glucuronique par voie biliaire. La génistéine est ensuite à nouveau déconjuguée par la flore

36

intestinale et subit un cycle entérohépatique (Barnes et al., 1996). La demi-vie plasmatique de

la génistéine varie de 8,5 à plus de 20 h chez l’Homme, avec des phénomènes de recirculation

entérohépatique (Setchell et al., 2003, Busby et al., 2002, Vergne et al., 2007). Après une

ingestion unique de 16 mg/kg pc de génistéine, la Cmax pour la génistéine non modifiée est de

0,07 µM, et pour la génistéine et ses conjugués 7,7 µM (Busby et al., 2002). Néanmoins, le

métabolisme et l’excrétion des isoflavones chez l’Homme sont sujets à des variations

interindividuelles importantes (Setchell, 1998), liées à la flore intestinale ou au régime

alimentaire. Des variations liées au sexe on été observées chez le rat (Coldham et al., 1999,

Coldham and Sauer, 2000).

Enfin, la génistéine et ses métabolites présents dans le plasma sont retrouvés dans le

lait maternel (Franke et al., 1998). Chez la rate en gestation recevant par gavage 20, 34 ou 75

mg/kg pc, la recherche des résidus chez le fœtus montre que la génistéine et ses métabolites

sont retrouvés dans le plasma et le cerveau de fœtus exposés in utero (Doerge et al., 2001). La

concentration en génistéine était plus faible que dans le plasma maternel, mais la proportion

de forme aglycone était plus importante (> 90 % dans le cerveau, pour 0,2 pmol/mg de

génistéine totale contre 8 % pour 3,5 µM dans le plasma maternel).

4-3-2 Propriétés estrogéniques.

4-3-2-1 In vitro.

La génistéine présente une affinité pour les deux sous-types de l’ER. Néanmoins, son

affinité est plus marquée pour l’ERβ que pour l’ERα (Kuiper and Gustafsson, 1997). Les

essais de liaison aux récepteurs aux estrogènes donnent une affinité de liaison relative à

l’estradiol de 0,0001 pour l’ERα et 0,0088 pour l’ERβ.

la génistéine présente des propriétés stimulatrices (à faible concentration) et inhibitrice

(à concentration plus élevée) de la croissance auprès des lignées cellulaires dépendantes des

estrogènes. Seul l’effet à faible dose serait lié à un mécanisme médié par les ER, puisque ces

faibles concentrations ne stimulent pas la croissance des cellules dépourvues d’ER alors qu’à

forte concentration, la croissance de ces dernières est toujours inhibée. D’après la Cmax (la

concentration en composé qui promeut une prolifération cellulaire maximale) ou l’EC50, la

génistéine est considérée comme étant environ mille fois moins active que l’estradiol

(Breinholt and Larsen, 1998, Wang and Kurzer, 1997).

Lors des essais basés sur des cellules ou des levures recombinantes, exprimant un gène

rapporteur sous le contrôle d’un ERE, l’estrogénicité de la génistéine allait de 1.10-6 à 2.10-3

(relativement à l’estradiol). Cette amplitude pourrait être liée aux différences de métabolisme

37

cellulaire et de transport membranaire de la génistéine depuis les milieux d’incubation (Nagel

et al., 1999, Nagel et al., 1998).

4-3-2-2 In vivo.

La nourriture standard pour rongeurs peut contenir des phytoestrogènes (dont la

génistéine) en quantité suffisante pour présenter un effet estrogénique, comparée à une

alimentation spécifiquement dépourvue en phytoestrogènes (Odum et al., 2001).

Les expérimentations basées sur le test d’utérotrophie chez la souris ont montré que la

génistéine est 100 000 fois moins puissante que le DES (Song et al., 1999). L’injection sous-

cutanée de 500 mg de génistéine/kg pc/j à des rates prépubères (16, 18 et 20ème jours après la

naissance) intactes ou ovariectomisées induit des effets estrogéniques tels qu’une hausse

significative du poids relatif de l’utérus et une hypertrophie de l’épithélium luminal et

glandulaire de l’utérus (Cotroneo and Lamartiniere, 2001). Une hausse du poids de l’utérus a

également été observé chez les souris femelle traitées par voie sous-cutanée avec 50 mg/kg

pc/j le 15ème jour après la naissance (Newbold et al., 2001).

4-3-3 Fertilité et développement des organes reproducteurs.

Les phytoestrogènes ont été associés pour la première fois à des effets délétères au

niveau du développement et de la fertilité chez des brebis ayant consommé de grandes

quantités de trèfle (« syndrome du trèfle »), et chez lesquelles ont été mesurées des

concentrations plasmatiques anormales en hormones endogènes accompagnées d’une perte de

fertilité (Moersh et al., 1967). De nombreuses études complémentaires ont été menées chez

les rongeurs afin d’évaluer le risque lié à une forte consommation de phytoestrogènes tels que

la génistéine, sur la fertilité humaine.

Par exemple, l’exposition de rates à 0,2 mg de génistéine/kg pc/j via la nourriture du

10ème jour de gestation jusqu’au 70ème jour après la naissance a provoqué une diminution du

poids de leur utérus et de leurs ovaires et un oestrus irrégulier (Awoniyi et al., 1998).

Néanmoins, des doses supérieures (0,4 et 4 mg/kg pc/j) via l’alimentation n’ont eu aucun effet

sur le nombre et poids des nouveaux-nés (Kang et al., 2002). L’ouverture du vagin chez les

femelles n’a pas été modifiée, tandis que le nombre de spermatozoïdes et leur mobilité étaient

normaux chez les mâles. Cent jours après la naissance, il n’y avait pas de différences dans le

poids et l’histologie des organes reproducteurs ni chez les mâles ni chez les femelles.

L’injection sous-cutanée à des rats mâles de 4 mg de génistéine /kg pc/48h du 2ème au 18ème

jours après la naissance a provoqué une réduction du poids des testicules, une augmentation

38

de l’apoptose des cellules germinales et une formation retardée de la lumière des tubules

séminifères (Atanassova et al., 2000). Globalement, les expériences menées chez les rongeurs

ont montré que la génistéine avait des effets estrogéniques à la fois chez les femelles et chez

les mâles, les effets les plus marqués étant obtenus lors d’une exposition pendant les étapes

périnatales, néonatales et prépubertaires du développement, mais aussi à des doses souvent

supérieures à celles auxquelles l’Homme est exposé, et parfois administrées par voie sous-

cutanée, qui exclut le métabolisme du premier passage gastrointestinal et hépatique.

4-3-4 Système nerveux central.

Les récepteurs aux estrogènes sont présents dans le système nerveux central (Kuiper et

al., 1998). Les estrogènes sont connus pour agir sur de nombreuses aires du cerveau et pour

influencer le comportement, le mouvement, la réflexion, la sensibilité à la douleur. Ils ont

également un effet protecteur vis-à-vis du développement de maladies neurodégénératives

(McEwen, 1999). Les phytoestrogènes, tels que la génistéine, pourraient donc exercer des

effets similaires. Chez les rats, la génistéine passe la barrière hématoméningée, mais les

concentrations retrouvées dans le cerveau sont plusieurs centaines de fois inférieures à celles

mesurées dans le plasma (Chang et al., 2000). Néanmoins, chez l’homme, la barrière

hématoméningée n’est pas complètement développée à la naissance ce qui laisse penser que le

système nerveux central pourrait être plus accessible aux phytoestrogènes in utero ou à la

naissance.

Les études réalisées chez les rongeurs montrent qu’une exposition via l’alimentation

(600 mg d’isoflavones / kg de nourriture) ou par injection sous-cutanée (< 1 mg génistéine/j)

peut provoquer une diminution du comportement d’accouplement chez les femelles (Patisaul

et al., 2001).

4-3-5 Système immunitaire.

Les estrogènes, en particulier l’estradiol, sont impliqués dans le développement et

l’organisation des tissus lymphoïdes (via l’ERα) et dans l’activité des cellules vectrices des

fonctions immunitaires. Les femelles présentent ainsi des réponses immunitaires plus

vigoureuses que les mâles (Ansar Ahmed et al., 1985, Grossman, 1984). En contrepartie, les

femelles sont plus susceptibles de développer des pathologies auto-immunes (Ansar Ahmed et

al., 1985, Jacobson et al., 1997). Si in vitro la génistéine (37 µM) inhibe la prolifération des

cellules T humaines, la production d’interleukine-2 et l’expression du récepteur de cette

dernière (Atluru and Atluru, 1991), les effets observés in vivo sont contradictoires.

39

4-3-6 Ostéoporose.

L’activité ostéoclastique est favorisée par une déficience en estrogène. L’ostéoporose

est donc un problème particulier chez les femmes ménopausées, du fait de l’accélération de la

perte osseuse liée à des taux d’estrogènes réduits. Les traitements hormonaux substitutifs ont

montré leur efficacité dans la prévention de la perte osseuse chez les femmes ménopausées

(Felson et al., 1993).

Les études menées chez les rongeurs ont montré que les isoflavones, dont la génistéine,

jouaient un rôle bénéfique dans la prévention de la perte osseuse due à une ovariectomie

(Ishimi et al., 2000, Nakajima et al., 2001, Wu et al., 2001). Les mécanismes évoqués pour

expliquer ces effets positifs des phytoestrogènes sont multiples, tels qu’un accroissement de

l’absorption de calcium (Omi et al., 1994), une suppression de l’activité ostéoclastique par

inhibition de la tyrosine kinase (Blair et al., 1996) ou encore une stimulation de facteurs

paracrine dérivés des ostéoblastes modulant la formation et l’activation des ostéoclastes

(Viereck et al., 2002). Chez l’homme les données épidémiologiques indiquent que la

consommation de phytoestrogènes est associée à une densité minérale osseuse plus élevée

dans les populations consommant plus de soja que la moyenne (Ho et al., 2001, Horiuchi et

al., 2000, Somekawa et al., 2001).

4-3-7 Système cardiovasculaire.

Des études épidémiologiques ont montré que les régimes riches en soja ou en

protéines de soja avaient un effet hypocholestérolémiant chez l’Homme (Ho et al., 2000,

Ridges et al., 2001). Néanmoins, les phytoestrogènes ne seraient pas les seuls responsables

presentis, les fibres ou les phytostérols du soja, structurellement similaires au cholestérol, ont

montré des effets hypocholestérolémiants (Ling and Jones, 1995). En outre, des études

menées chez des sujets sains ou souffrant d’hypercholestérolémie auxquels ont été

administrées des comprimés d’isoflavones (40 à 80 mg/j) n’ont montré aucun effet (Simons et

al., 2000, Uesugi et al., 2002).

4-3-8 Génotoxicité et mutagénicité.

L’activité génotoxique et mutagène de la génistéine a été étudiée in vitro. Kulling et

Metzler (1997) ont démontré que la génistéine (> 25 µM) induisait des micronoyaux dans les

cellules de hamster chinois V79. En outre, la génistéine à la concentration de 25 µM provoque

une augmentation significative de la fréquence des mutations du gène de l’hypoxanthine

40

guanine phosphoribosyl transférase. Il a été également montré que la génistéine induisait des

cassures de l’ADN (7-118 µM), des mutations (10-80 µM) et des micronoyaux (6-100 µM)

(Boos and Stopper, 2000). La génistéine (25 µM) induit des cassures de chromatides, des

« gaps » et des échanges de chromatides sœurs dans des lymphocytes en culture (Kulling et

al., 1999). Ce phytoestrogène provoque une inhibition de la croissance des cellules de tumeur

de prostate humaine LNCaP et PC-3 à des concentrations inférieures à 10 µM, ainsi que des

cassures de l’ADN dans ces cellules (Mitchell et al., 2000). Le mécanisme mis en jeu

impliquerait la formation de métabolites hydroxylés de la génistéine. Ces catéchols

formeraient des quinones pouvant réagir pour former des adduits à l’ADN (Liehr and Roy,

1990).

La génistéine est un inhibiteur de la topoisomérase II in vitro, une enzyme nucléaire

impliquée dans la réplication, la transcription, la recombinaison, l’intégration et la

transposition de l’ADN (Kaufmann, 1998, Polkowski and Mazurek, 2000). L’inhibition de

cette enzyme pourrait expliquer les effets clastogéniques de la génistéine.

4-3-9 Cancérogénicité.

Les incidences de plusieurs cancers hormono-dépentants, dont ceux de la prostate et

du sein, sont plus élevées dans les pays occidentaux (Europe et USA) qu’en Chine ou au

Japon (Tham et al., 1998). Les études épidémiologiques, incluant les individus ayant migré

d’une région à l’autre, indiquent que le régime alimentaire joue un rôle primordial dans

l’étiologie de ces maladies. Or, l’une des particularités alimentaires des populations extrême-

orientales est la consommation importante de soja et d’aliments dérivés du soja. Les résultats

de certaines études épidémiologiques suggèrent que la consommation de soja durant l’enfance

aurait un effet protecteur vis-à-vis du développement de cancers du sein lors de la vie adulte.

Cette hypothèse expliquerait en partie pourquoi le risque réduit de développer certains cancers

observés chez les migrants d’Asie extrême-orientale augmente au fur et à mesure des

générations installées dans un pays occidental (Ziegler et al., 1993). Les données

expérimentales obtenues sur des modèles animaux de cancers induis par des produits

chimiques montrent un effet protecteur de la génistéine, administrée par voie alimentaire ou

par injection sous-cutanée chez les rats nouveaux nés et avant la puberté (Hilakivi-Clarke et

al., 1999, Lamartiniere et al., 1995). Néanmoins, des études similaires réalisées chez des

souris greffées avec des tumeurs mammaires (cellules MCF-7) montrent que la génistéine

stimule la croissance de ces tumeurs (Ju et al., 2001). Enfin, in vitro, les propriétés

estrogéniques de la génistéine provoquent la multiplication, médiée par les ER, des cellules

41

MCF-7 (Hsieh et al., 1998). Néanmoins, la génistéine présente également des effets

cytotoxiques indépendants des ER (Maggiolini et al., 2001). Elle provoque en effet un arrêt du

cycle cellulaire en phase G2/M et stimule l’apoptose chez les cellules MCF-7 (Constantinou et

al., 1998a, Santell et al., 2000).

4-3-10 Autres propriétés.

La génistéine présente des propriétés antioxydantes in vitro. Elle inhibe en effet la

formation de dommages à l’ADN induits par des radicaux libres avec une CI50 de 9 µM

(Harper et al., 1999). Une inhibition de l’oxydation de certaines fractions du cholestérol

(LDL) a également été observée chez l’Homme, bien que cette propriété ne puisse pas être

attribuée avec certitude au contenu en phytoestrogènes du soja (Tikkanen et al., 1998,

Wiseman et al., 2000).

La génistéine, ainsi que la daidzéine et la biochanine A, inhibent la thyropéroxydase,

une enzyme impliquée dans la synthèse de T3 et T4 (Divi et al., 1997). La CI50 calculée pour la

génistéine est de 3,2 µM. In vivo chez le rat, des quantités relativement importantes en soja

dans l’alimentation associée à une déficience en iode peut entrainer un effet goitrogène (Ikeda

et al., 2001). Chez l’Homme, des effets goitrogènes ont été observés chez des nouveaux nés

nourris avec du lait maternisé à base de farine de soja (Hydovitz, 1960). Ces effets ont été

supprimés en utilisant des protéines de soja extraites plutôt que de la farine, et en

supplémentant la formulation avec de l’iode.

5 Le bisphénol A.

Fig.12 : structure chimique du bisphenol A

5-1 Propriétés physiques et chimiques.

Le Bisphénol A est le nom usuel du 2,2-(4,4-dihydroxyphényl)propane. Sous

conditions ambiantes de température et de pression, le BPA est solide. Sa solubilité dans l’eau

est de 120 à 300 mg/l, et son pKa de 9,6 à 10,2 (Staples et al., 1998). Son coefficient de

partition octanol-eau log Kow est de 3,40. Ces données sont résumées dans le tableau n°3.

OH HO

42

Tableau n°3 : Propriétés physiques et chimiques du BPA

Paramètre Valeur

No. CAS 80-05-7

Poids moléculaire 228,29 g/mol

Formule brute C15H16O2

Densité spécifique Entre 1,060 et 1,195 g/cm3

Point de fusion Entre 150 et 155°C

Point d’ébullition 220°C à 4 mm Hg

398°C à 760 mm Hg

Solubilité dans l’eau 120 à 300 mg/l

Log Kow 3,40

5-2 Origine.

En 1936, Dodds et son équipe décrivent le premier estrogène synthétique dépourvu de

noyau phénanthrène qui est la structure commune aux stéroïdes (Dodds and Lawson, 1936).

Dans cet article, ils évaluent une série de molécules diphényles et concluent que seules celles

possédant deux groupes hydoxyles en position para présentent une activité estrogénique ;

parmi celles-ci, le di-(p-hydroxyphényl) diméthylméthane, ou bisphénol A (BPA). Le BPA

pourrait ainsi être la première molécule synthétique décrite ayant une activité modulatrice

sélective du récepteur aux estrogènes. Ces études structurales culminèrent en 1938 avec la

découverte du diéthylstilbestrol (DES) (Dodds et al., 1938).

5-3 Usages.

Au début des années 1950 sont découverts le polycarbonate et la résine époxy obtenus

par polymérisation du BPA. Ses propriétés une fois polymérisé (haute résistance à la chaleur,

caractéristiques optiques, facilité d’utilisation) en ont fait une molécule de choix dans

l’industrie des plastiques. En 1999, 65 % du BPA produit était utilisé dans la fabrication de

polycarbonate, et environ 25 % dans celle de résine époxy. Les 10 % restant ont été utilisés

dans la production de résines polyester ou de retardateurs de flamme bromés comme le

43

tétrabromobisphénol A. La production mondiale de BPA était de 2,2 millions de tonnes en

2003, avec une croissance de la demande attendue de 6 à 10 % par an (Richter et al., 2007).

Les principaux producteurs de BPA sont les compagnies General Electric, Bayer et Dow. Les

usages du BPA sont très nombreux. Il entre dans la fabrication de nombreux produits tels que

disques compacts (CD), revêtement intérieur des cannettes en métal, papier thermique pour

fax, casques de sécurité, bouteilles et conteneurs en polycarbonate (dont les bouteilles d’eau),

plastiques de voitures, adhésifs, revêtements de protection, isolants pour les pièces électriques

et électroniques… Le BPA est également utilisé dans la fabrication du PVC en temps

qu’inhibiteur de réaction et antioxydant.

5-4 Devenir du BPA dans l’environnement.

Certains données disponibles attestent de la biodégradation relativement rapide du

BPA dans les eaux de surface et par les populations microbiennes acclimatées ou non utilisées

dans les usines de traitement des eaux usées. Ainsi, plus de 80 % à 90 % du BPA est

biodégradé en 28 jours suivant les méthodes standards employées. Les bactéries capables de

biodégrader le BPA sont présentes dans les eaux de surface et la demi-vie moyenne du BPA

dans ces eaux est inférieure à 5 jours en moyenne (Ike et al., 2000, Kang and Kondo, 2002a,

Kang and Kondo, 2002b, Klecka et al., 2001). Néanmoins, des variations importantes dans la

biodégradabilité du BPA peuvent être observées en fonction des espèces bactériennes

présentes dans l’eau, de leur densité et des conditions aérobies ou anaérobies. Ainsi, le BPA

peut être retrouvé non dégradé après 3 mois en conditions anaérobies (Kang et al., 2006).

5-5 Sources et voies d’exposition de l’homme.

5-5-1 Contamination par l’environnement.

Les sources d’entrée de BPA dans l’environnement sont multiples. Au niveau des

usines de fabrication et d’élaboration, de faibles quantités de BPA sont autorisées à être

directement rejetées dans l’atmosphère et dans les eaux de surface. Les concentrations en

BPA mesurées dans des rivières des USA, d’Allemagne, des Pays-Bas et du Japon étaient

inférieures ou égales à 8 ng/ml (Belfroid et al., 2002, Fromme et al., 2002, Kang et al., 2006).

Des mesures dans l’air ont donné des concentrations en BPA allant de 2 à 208 ng/m3 dans

trois échantillons d’air sur 7, dont un pris à proximité d’une usine de fabrication de plastiques

(Rudel et al., 2001). Le BPA peut être adsorbé au niveau des sols et des sédiments où il est

44

plus concentré que dans les eaux de surface (Fromme et al., 2002). La demi-vie du BPA dans

les sols, où il forme alors des résidus liés, pourrait être inférieure à 3 jours (Fent et al., 2003).

Néanmoins, dans les zones à forte densité de population humaine, la contamination des sols

par le BPA est entretenue par les déchets domestiques et industriels (Kawahata et al., 2004).

5-5-2 Contamination par l’alimentation.

Si les objets contenant du BPA se trouvent partout dans notre environnement

immédiat, et si ce dernier contient du BPA monomère (air, eau, sol), notre exposition se fait

principalement par voie orale, au travers de la consommation d’aliments ayant été

conditionnés dans des emballages fabriqués à partir de BPA polymérisé. Des molécules de

BPA monomère, non polymérisé, peuvent en effet migrer vers les matrices alimentaires ou

l’eau de boisson depuis les plastiques (bouteilles, conserves, cannettes, biberons…). Les

amalgames dentaires sont une autre source d’exposition au BPA monomère.

5-5-2-1 Migration du BPA à partir des emballages alimentaires.

Du BPA a été détecté dans des légumes, des boissons, des viandes, des poissons, des

produits laitiers et des laits en poudre maternels en conserves ou contenus dans des

emballages plastiques à base de BPA (tableau n°4).

Les facteurs principaux influençant la migration de BPA monomère depuis les

revêtements intérieurs des conserves sont la durée de chauffage et les températures utilisées

pendant la fabrication des produits (étape de stérilisation). Depuis les contenants en

polycarbonate, le facteur principal est leur usure (plastique vieilli, rayé) (Brede et al., 2003,

Takao et al., 1999). Brede et al. (2003) ont mesuré des concentrations moyennes en BPA de

0,2, 8,4 et 6,7 µg/l après avoir testé des biberons respectivement neufs, utilisés depuis 51 jours

et utilisés depuis 169 jours. Ainsi, bien que le polycarbonate soit considéré comme stable, une

hydrolyse peut avoir lieu à pH alcalin ou à haute température, telles celles employées pour

stériliser les biberons. La limite de migration spécifique autorisée par la législation de l’Union

européenne est de 3 mg de bisphénol A par kg de nourriture (EU risk assessment report,

2003).

45

Tableau n°4 : Concentrations en BPA dans des aliments en conserves exprimées en ng/g

(d’après Kang et al., 2006).

Aliments en conserves Nombre d’échantillons Concentration (moyennea, (valeurs extrêmes)) Références

8 130 (17-602) 1

5 110 (17-380) 2 Viande

6 21 (<20-98) 3

10 22 (ND-43) 2

8 23 (<20-109) 3 Poisson

9 30 (<5-102) 4

14 25 (2-75) 1

9 42 (ND-95)b 5

10 25 (9-48) 2

10 20 (ND-76) 6

Fruits et légumes

33 6 (<10-24) 3

11 <1 (ND-<7) 2

80 18 (ND-212) 5 Boissons

4 <10 3

Produits laitiers 3 31 (21-43) 7

Lait maternel 14 5 (0,1-13) 8 a Les concentrations indétectables ont été calculées comme égales à zéro. ND = non détectables.

b concentrations en BPA dans la matière sèche.

N° des références : 1=Imanaka et al., 2001, 2=Goodson et al., 2002, 3=Thomson and Grounds, 2005, 4=Munguia-Lopez et

al., 2005, 5=Yoshida et al., 2001, 6=Brotons et al., 1995, 7=Kang and Kondo, 2003, 8=Biles et al., 1999.

5-5-2-2 Ingestion de BPA.

L’analyse d’échantillons d’urine humaine a démontré que l’exposition humaine est

considérable (Calafat et al., 2005, Matsumoto et al., 2003, Yang et al., 2003). Calafat et al.

(2005) ont détecté la présence de BPA (≥ 0,1 ng/ml) dans 95 % des échantillons d’urine

collectés parmi 394 adultes d’âges, de sexe et de lieux de résidences différents. Les hautes

concentrations en BPA urinaire seraient corrélées avec la consommation de nourriture en

conserves (Matsumoto et al., 2003). Ainsi, si l’eau, l’air ou le sol sont des sources

d’exposition, la principale source de contamination serait l’alimentation. Les amalgames

dentaires constitués de BPA-diglycidyléther sont une autre source d’exposition au BPA par

voie orale (Olea et al., 1996, Pulgar et al., 2000). Il a été calculé que l’exposition moyenne

des consommateurs de nourriture en conserve et de vin est de 9 µg/kg/jour (EU risk

assessment report, 2003). La limite réglementaire d’ingestion maximale de BPA (DJA) est de

50 µg/kg/jour dans l’Union européenne. Néanmoins, des études scientifiques ont suggéré que

les BPA pourrait avoir des effets délétères à des doses inférieures à cette limite.

46


5-6-1 Toxicocinétiques, distribution et métabolisme.

Environ 28% de la dose administrée à trois groupes de 4 rats mâles a été retrouvée

dans les urines au cours des 8 jours qui ont suivi l’administration par voie orale d’une dose

unique de BPA (800 mg/kg) (Knaak and Sullivan, 1966). Le reste a été éliminé par voie

fécale. Une heure après l’administration par voie orale d’une dose unique de 10 mg/kg de

BPA, environ 90 % du BPA présent dans le sang de rates Wistar en gestation était sous forme

glucuronoconjuguée. La concentration en BPA glucuronoconjugué a diminué de moitié

pendant 3 h avant de revenir à sa valeur initiale après 8 h, suggérant un cycle entérohépatique

du BPA (Miyakoda et al., 2000).

Dès 1 heure après administration par gavage, le [14C]-BPA est retrouvé dans le lait, le

sang, le plasma, et dès 2 h dans la graisse sous cutanée, le foie, les reins, les poumons, les

embryons, les testicules de rates et de rats traités par gavage. Néanmoins, la majeure partie du

BPA administrée par gavage est retrouvée dans les intestins et leur contenu (Miyakoda et al.,

2000, Snyder et al., 2000).

Le BPA subit un effet de premier passage hépatique. La métabolisation du BPA (100

mg/kg p.o.) chez les rates F344 et CD en gestation donne majoritairement du BPA

monoglucuronoconjugué (> 80 % après 24 h) dans les urines, tandis que c’est principalement

le BPA inchangé qui est retrouvé dans les fécès. Le BPA glucuronoconjugué est également le

métabolite majoritaire dans le plasma et le lait de ces rates, dès 1 h après le gavage (Snyder et

al., 2000). L’injection sous cutanée de 25 µg/kg de BPA à des souris CD-1 a montré que les

voies de biotransformations du BPA étaient plus complexes, avec la formation majoritaire de

BPA monoglucuronoconjugué, mais aussi de BPA sulfate, de diconjugués, de diconjugués

méthoxylés et/ou déshydratés et d’hydroxy-BPA retrouvés dans les urines et/ou les fécès

(Zalko et al., 2003). Le métabolisme du BPA a été exploré à l’aide de cultures primaires

d’hépatocytes de rates Wistar (Elsby et al., 2001). L’incubation de 100 et 500 µM de BPA

pendant 2 h a mené à la formation de BPA glucuronoconjugué (métabolite majoritaire), mais

aussi de BPA sulfate et de 5-hydroxy-BPA à la concentration la plus élevée. La formation de

BPA conjugué au sulfate et conjugué à la fois au sulfate et à l’acide glucuronique après

incubation avec des hépatocytes humains, de rat et de souris a été rapportée (Nakagawa and

Suzuki, 2001, Pritchett et al., 2002). L’incubation de BPA à la concentration de 200 µM avec

des microsomes d’origine humaine ou murine indique la formation de 5-hydroxy-BPA (Elsby

et al., 2001). L’incubation de BPA à la concentration de 100 µM pendant 2h avec des

47

microsomes de foie de souris CD-1 a permis l’identification d’un grand nombre de

métabolites, certains issus du clivage du BPA (phénol + glutathion, isopropylphénol,

isopropylephénol + glutathion, 2,2-bis-(4-hydroxyphényl)1-propanol, BPA+glutathion, 5-OH-

BPA) (Jaeg et al., 2004). La vitesse moyenne de glucuronidation (Vmax) du BPA par les

microsomes humains est de 5,9 et 5,2 nmol/min/mg de protéines respectivement chez

l’homme et la femme. Ces résultats indiquent qu’il n’y a pas de différence significative dans

les capacités métaboliques vis-à-vis du BPA observées in vitro entre les microsomes de foie

d’homme et de femme. Selon cette même étude, la conjugaison du BPA à l’acide

glucuronique serait plus rapide dans les microsomes de foie de rates en gestation (Vmax = 31,6

nmol/min/mg). Enfin, la bisphénol-O-quinone pourrait être formée in vivo par un ou plusieurs

CYP et former des adduis à l’ADN (Atkinson and Roy, 1995a, Atkinson and Roy, 1995b).

Fig.13 : voies métaboliques majeures du BPA identifiées à la fois in vivo et in vitro chez le rat

et la souris. GlcA=acide glucuronique.

5-6-2 Toxicité aiguë.

La toxicité par inhalation est considérée comme relativement faible chez le rat, où la

CL50 est supérieure à 170 mg/m3 (Nitshke et al., 1985a cité dans EU risk assessment report,

2003).

OH HO

OH GlcA-O

OH GlcA-O OH

OH

OH HO3S-O

OH HO

HO

BPA

48

La DL50 par voie orale se situe entre 3,3 g/kg et 5 g/kg chez le rat, avec une sensibilité

plus grande des femelles. Les valeurs sont sensiblement les mêmes chez la souris et le lapin,

indiquant une faible toxicité aigüe du BPA.

La toxicité aigüe par voie dermique a été évaluée chez le lapin. Elle semble faible,

avec une DL50 > à 2 g/kg.

5-6-3 Toxicité subaiguë, subchronique et chronique.

Une étude d’inhalations répétées chez le rat a révélé une légère inflammation de

l’épithélium du tractus respiratoire supérieur, avec une NOAEL mesurée de 10 mg/m3

(Nitshke et al., 1985b cité dans EU risk assessment report, 2003).

Takahashi et Oishi (2001) ont observé une perte de poids de rats mâles F344 exposés à

466 et 950 mg/kg/jour pendant 44 jours via l’alimentation. Ils ont relevé une baisse du poids

du foie, de la prostate et des glandes séminales, en particulier pour la plus forte dose. Une

NOAEL de 74 mg/kg a été établie à partir d’une étude de deux ans chez le rat (EU risk

assessment report, 2003).

Les études d’exposition via l’alimentation chez la souris indiquent que le foie est une

cible chez cette espèce, avec en particulier des changements dans la taille et le noyau des

hépatocytes lors des études 90 jours et 2 ans. L’incidence et l’importance de ces hépatocytes

hypertrophiés et multinucléés étaient plus importantes chez les mâles (LOAEL de 120 mg/kg)

que chez les femelles (650 mg/kg) (EU risk assessment report, 2003).

5-6-4 Génotoxicité et mutagénicité.

Le BPA, jusqu’aux plus fortes doses testées (500 µg/ml), n’entraîne pas la formation

de révertants dans le test d’Ames mené sur Salmonella typhimurium (Schweikl et al., 1998). Il

a été observé que le BPA provoque une aneuploïdie sans activation métabolique après

incubation avec des cellules de hamster chinois V79 (Ochi, 1999, Pfeiffer et al., 1997), et

dans une expérience d’aneuploïdie non conventionnelle utilisant des cellules d’embryon de

hamster syrien en culture (Tsutsui et al., 1998), probablement par perturbation de la formation

des microtubules (Pfeiffer et al., 1997). Atkinson et Roy (1995a et b) ont détecté la formation

de plusieurs adduits après incubation pendant 2 h de BPA avec de l’ADN de rat purifié en

présence d’un système d’activation peroxydase. La formation de ces adduits était inhibée par

la présence d’inhibiteurs des CYP. Néanmoins, le BPA ne semble pas provoquer de mutations

de l’ADN ni d’aberrations chromosomiques dans des cellules de mammifères en culture (EU

49

risk assessment report, 2003). In vivo, le BPA provoque la formation d’adduits dans les foie

de rats traités par voie orale (200 mg/kg/jour) (Atkinson et Roy, 1995a).

5-6-5 Cancérogénicité.

In vivo, le BPA administré dans l’aliment (0, 74 et 135 à 148 mg/kg/j) chez des rats

F344 n’a pas provoqué de hausse significative de l’incidence de tumeurs. De même, le BPA

administré via l’alimentation (120 et 600 mg/kg/j chez les mâles et 650 et 1300 mg/kg/j chez

les femelles) n’a eu aucun effet significatif sur l’incidence de tumeurs chez les souris B6C3F1

(NTP, 1982 cité dans EU risk assessment report, 2003). Néanmoins, un dose de 10 µg/kg/j

administrée à des rats Sprague-Dawley par voie sous cutanée entre les 1er et 5ème jours après la

naissance a provoqué la formation de lésions néoplasiques interépithéliales de la prostate chez

tous les mâles à l’âge adulte, ces lésions étant considérées comme précancéreuses (Ho et al.,

2006). De même, l’administration de BPA à une dose de 2,5 µg/kg p.c./j à des rates en gestion

est à l’origine de la formation de lésions prénéoplasiques et néoplasiques au niveau des

glandes mammaires chez les rates exposées in utero (Murray et al., 2007).

5-6-6 Reprotoxicité et embryotoxicité.

L’administration par voie orale ou sous-cutanée de 10 µg/kg/j de BPA à des souris

femelles n’affecte pas l’implantation des embryons. Cette dernière n’est significativement

diminuée qu’à la dose de 70 mg/kg/j (Berger et al., 2007).

Certains effets négatifs sur la fertilité chez le rat et la souris ont été relevés lors

d’études multigénérationnelles. Ainsi, lors d’une étude menée avec des rats Sprague-Dawley,

seule la plus forte (500 mg/kg/j p.o.) dose a entraîné une diminution du nombre de nouveau-

nés à chaque mise-bas. Une NOAEL de 50 mg/kg/j a été avancée chez le rat concernant les

effets sur la fertilité. La LOAEL chez le rat pourrait être de 500 mg/kg, et 300mg/kg chez la

souris (EU risk assessment report, 2003). Aucun effet sur le développement des embryons et

des nouveaux né n’a été relevé d’après les tests standards chez le rat et la souris (NOAEL de

640 mg/kg/j et 1000 mg/kg/j chez les fœtus respectivement de rat et de souris).

50

5-6-7 Perturbation endocrinienne.

5-6-7-1 Effets estrogéniques.

In vitro

Le BPA présente une activité estrogénique passant par l’activation des récepteurs aux

estrogènes dans différents tests in vitro. Ainsi, le BPA montre une activité estrogénique

10 000 fois moindre que l’E2 dans les système utilisant des levures recombinantes (Coldham

et al., 1997, Sohoni and Sumpter, 1998). Le BPA entre en compétition avec l’[3H]E2 pour la

liaison à l’ERα et l’ERβ avec une affinité 10 000 fois plus faible que l’E2 et induit une activité

de gènes rapporteurs médiée par les deux récepteurs (Kuiper et al., 1998, Matthews et al.,

2001). Le BPA déplace l’E2 lié au ERα avec une CI50 de 10-5 M (Nakagawa and Suzuki,

2001). Dans des cellules d’hépatocarcinome humain HepG2 transfectées avec soit ERα soit

ERβ et un plasmide de réponse codant pour l’activité luciférase, le BPA a montré une CE50 de

6,4.10-7 M vis-à-vis de l’ERα et 8,9.10-7 M vis-à-vis de l’ERβ (respectivement 1,9.10-9 et

1.10-8 M pour l’E2) tandis qu’aucune expression significative médiée par l’un ou l’autre des

récepteurs n’était observée avec le BPA glucuronoconjugué (Snyder et al., 2000). Le BPA

induit également une prolifération des cellules MCF7 (Coldham et al., 1997, Dodge et al.,

1996, Krishnan et al., 1993, Soto et al., 1995) ainsi que le 3-OH-BPA, à des concentrations de

10-7 à 10-6 M (Nakagawa and Suzuki, 2001). L’hydroxytamoxifène, un antagoniste des

estrogènes agissant au niveau de leurs récepteurs, inhibe la prolifération des cellules MCF7

induite par le BPA (Olea et al., 1996).

In vivo

L’activité estrogénique du BPA a été évaluée dans de nombreuses études in vivo

utilisant généralement le test utérotrophique chez le rat. Par exemple, (Ashby and Tinwell,

1998) ont observé que des rates Alpk :AP immatures recevant par gavage 400, 600 ou 800

mg/kg de BPA pendant trois jours montraient une hausse du poids sec de l’utérus de 40 à 150

%. Le test utérotrophique ne répond généralement pas aux faibles doses de BPA (inférieures à

50 mg/kg/j) (Richter et al., 2007), néanmoins, il a pu être relevé une hausse statistiquement

significative du poids de l’utérus chez des rates Sprague-Dawley ovariectomisées ayant reçu

10 et 40 mg/kg/j pendant 4 jours par gavage (Dodge et al., 1996).

Un certain nombre de résultats expérimentaux indiquent chez la souris adulte que l’E2,

en agissant sur l’ERα, inhibe le nombre d’adipocytes ainsi que de la lipogenèse. Le retrait des

estrogènes par ovariectomie ou une mutation d’ERα provoque une intolérance au glucose et

51

une résistance à l’insuline en plus d’augmenter la masse corporelle (Cooke et al., 2001, Heine

et al., 2000). Or, il a été rapporté que le BPA diminuait le poids des souris (Al-Hiyasat et al.,

2002, Nunez et al., 2001). En outre, de très faibles doses de BPA stimulent la sécrétion rapide

d’insuline par les cellules β pancréatiques de souris en culture via un système de réponse aux

estrogènes non classique et non génomique (Alonso-Magdalena et al., 2006). Les mêmes

auteurs ont observé qu’une exposition prolongée à 10 µg/kg/jour par voie orale provoquait

une stimulation de la sécrétion d’insuline chez la souris adulte contrôlée classiquement par les

récepteurs nucléaires. La sécrétion prolongée d’insuline était suivie d’une insulino-résistance.

5-6-7-2 Effets antiandrogéniques.

Dans une expérimentation utilisant une souche de levure contenant un système

d’expression codant pour la β-galactosidase inductible par les androgènes, le BPA s’est

montré pratiquement aussi puissant que l’anti-androgène flutamide dans l’inhibition de

l’activité de la dihydrotestostérone (Sohoni and Sumpter, 1998). Des tests de compétition de

liaison à l’AR ont montré que 50 nM de BPA inhibaient au maximum la liaison de [3H]5α-

dihydrotestostérone de 40 % (Lee et al., 2003). La même équipe a évalué, à l’aide d’un

système de levure hybride reflétant l’interaction entre l’AR et son coactivateur (ARSC1 :

« ARhLBD-activating signal cointegrator 1 »), que le BPA agissait comme antagoniste de

l’AR de façon aussi forte que l’acétate de ciprotérone (antagoniste puissant de l’AR). Dans la

même étude, il est démontré que le BPA diminue la translocation de l’AR vers le noyau à

l’aide d’une protéine de fusion (GFP)-AR. Enfin, dans des essais de transfection transitoire, le

BPA inhibe l’activité transcriptionnelle induite par l’activation de l’AR par un androgène

(Lee et al., 2003).

5-6-7-3 Effets à faibles doses in vivo.

Des dizaines d’études rapportent des effets significatifs du BPA chez les rongeurs à

des faibles doses, c'est-à-dire inférieures à la LOAEL de 50 mg/kg/j (vom Saal and Hughes,

2005).

Le BPA administré à 25 et 250 µg/kg/j augmente le nombre d’ERα et β dans

différentes aires du cerveau chez des rats mâles Wistar exposés depuis le 8ème jour de

gestation jusqu’à la naissance (Ramos et al., 2003). Des modifications induites par le BPA ont

été observées dans les fonctions de l’axe hypothalamus-hypophyse-gonades chez les rats

mâles et femelles. Ainsi, des nouveau-nés femelles exposées pendant la gestation et

l’allaitement à 1,2 mg/kg/j de BPA ont montré un cycle de l’oestrus perturbé et prolongé

52

(Rubin et al., 2001). Des altérations de l’axe hypothalamus-hypophyse-thyroïde ont également

été rapportées. L’exposition de rats Sprague-Dawley par voie orale à des doses de 1, 10 ou 50

mg/kg/j du 6ème jour de gestation jusqu’au sevrage a provoqué une hausse significative en T4

sérique (Zoeller, 2005). En outre, des effets des faibles doses de BPA sur les structures du

cerveau dépendant du sexe ont été observées chez les souris CD-1 (Rubin et al., 2006).

La concentration en testostérone testiculaire chez des rats mâles Long-Evans a été

diminuée par l’administration par voie alimentaire de 2,4 µg/kg pc/j de BPA à la mère depuis

le 12ème jour de gestation jusqu’au sevrage, sans qu’une baisse des taux de LH sérique soit

observée (Akingbemi et al., 2004). De même, l’administration à des souris CD-1 en gestation

de 2 µg/kg pc/j de BPA via l’alimentation, entre les 11ème et 17ème jours de gestation,

provoque une diminution de la testostérone sérique chez les mâles exposés in utero (Kawai et

al., 2003). Enfin, le traitement de rats mâles Sprague-Dawley par voie orale pendant leur

puberté (du 23ème au 30ème jours après la naissance) par 40 µg/kg/j de BPA diminue la

testostérone de façon persistante, même à l’âge adulte (Della Seta et al., 2006).

Le BPA provoque également une hausse du poids de la prostate et du nombre d‘AR

prostatiques chez la souris adulte lorsqu‘une exposition à de faibles doses a lieu in utero

(Gupta, 2000, vom Saal et al., 1998). Des souris CF-1 mâles exposées in utero au BPA (mère

en gestation consommant 2 µg/kg/j de BPA) ont montré une diminution du poids de

l’épididyme et des glandes séminales, une hausse des glandes préputiales et de la prostate.

Une dose de 20 µg/kg/j a provoqué chez ces souris une diminution de la production

journalière de sperme, exprimée par gramme de testicule (vom Saal et al., 1998). Il a été

observé que l’exposition par voie orale de rats mâles Sprague-Dawley à des doses allant de 20

µg/kg/j à 200 mg/kg/j provoque une diminution significative de la production journalière de

sperme, la diminution maximale (environ 40 %) étant observée dans le groupe exposé à la

plus faible dose de BPA (Sakaue et al., 2001). De même, l’exposition de souris adultes à 25

ou 100 µg/kg/j pendant un mois a provoqué une diminution de la production journalière de

sperme associée à une diminution de la fertilité tandis qu’une dose de 5 µg/kg/j diminue le

poids des testicules et des vésicules séminales (Al-Hiyasat et al., 2002).

Enfin, le développement des glandes mammaires est modifié par une exposition

périnatale à de faibles doses de BPA chez la souris (Maffini et al., 2006, Markey et al., 2001,

Munoz-de-Toro et al., 2005) et chez le rat (Murray et al., 2007). Un accroissement significatif

(P<0,05) du nombre et de l’extension des canaux galactophores a été observé chez des souris

CD-1 de 6 mois exposées in utero à partir du 9ème jour de gestation au BPA (25 et 250 µg/kg

p.c. de la souris en gestation/j). L’apparence des glandes mammaires de ces souris vierges est

53

identique à celle de souris en début de gestation (Markey et al., 2001). Une exposition fœtale

à 2,5 µg /kg p.c./j provoque une hyperplasie des canaux galactophore des rates agées de 50 et

95 jours (Murray et al., 2007).

5-6-7-4 Autres effets.

Le BPA se lie au récepteur aux hormones thyroïdiennes et inhibe l’action de la T3

(Moriyama et al., 2002, Zoeller, 2005) avec un Ki d’environ 10-4 M mais inhibe

significativement l’expression de gènes sous le contrôle du récepteur thyroïdien dès 10-6 M.

Le BPA modulerait certaines fonctions immunitaires à des doses comprises entre 2,5

et 30 µg/kg/jour, incluant la production de cytokines et d’anticorps, la réponse à une infection

et l’évolution de maladies autoimmunes chez la souris (Richter et al., 2007, Sawai et al., 2003,

Yoshino et al., 2003).

Enfin, le BPA induirait l’expression de l’AhR, de l’Arnt (AhR nuclear translocator), et

d’enzymes du métabolisme des xénobiotiques (CYP1A1, UGT et GST) chez la souris ICR

après exposition in utero à des doses pour la mère allant de 0,02 à 20000 µg/kg/j (Nishizawa

et al., 2005). (Hanioka et al., 1998) ont observé que l’administration par voie i.p. de BPA à

des rats à des doses de 20 et 40 mg/kg diminuait la concentration en CYP2C11 et 3A2

(respectivement testostérone 2α-hydroxylase et 6β-hydroxylase) dans les microsomes de foie

préparés après traitement. Ces auteurs ont également observé que l’expression des CYP4A1 et

2 était augmenté. (Niwa et al., 2001) ont en revanche mis en évidence une inhibition du

CYP17, alors que (Pfeiffer and Metzler, 2004) ont montré une inhibition du CYP2C11 mais

pas du 3A4.

6- la vinchlozoline.

Fig.14 : structure chimique de la vinchlozoline

Cl

Cl

N O

C H 3

C H

O

O C H

2

Vinchlozoline

54

6-1 Propriétés physiques et chimiques.

La vinchlozoline (3-(3, 5-dichlorophenyl)-5-ethenyl-5-methyl-2,4-oxazolidinedione)

est un solide cristallin blanc et sans odeur à température ambiante, très faiblement soluble

dans l’eau.

Tableau n°5 : Propriétés physiques et chimiques de la

vinchlozoline

Paramètre Valeur

No. CAS 50471-44-8

Poids moléculaire 268,1 g/mol

Formule brute C12H9Cl2NO3

Densité spécifique 1,51 g/cm3

Point de fusion Entre 108°C

Point d’ébullition 131°C à 0,05 mm Hg

Solubilité dans l’eau 2,6 mg/l à 20°C

Log Kow 3

6-2 Usages.

La vinchlozoline est un fongicide dicarboximide d’usage non systémique à action

protectrice commercialisé par BASF AG sous le nom de Ronilan®. Elle prévient la

germination des spores de Botrytis et Sclerotinia spp. sur les vignes, les graines de colza, les

fruits et légumes et les plantes d’agrément, Monilia spp. sur certains fruits dont les fruits à

noyau, Sclerotinia, Helminthosporium et Corticium spp. sur le gazon. Le Journal Officiel du

24 mars 2007 indique que « la date limite d’écoulement des stocks et d’utilisation des produits

phytopharmaceutiques contenant de la vinchlozoline est fixée au 30 juin 2007 pour la

distribution et au 31 décembre 2007 pour l’utilisation ».

6-3 Devenir de la vinchlozoline dans l’environnement.

6-3-1 Hydrolyse.

La vinchlozoline est instable en milieu aqueux où elle s’hydrolyse pour donner deux

produits de dégradation par ouverture de l’hétérocycle. La formation de l’acide 2-[[(3,5-

55

dichlorophényl)carbamoyl]oxy]-2-méthyl-3-buténoïque, appelé M1, est réversible tandis que

la formation du 3’,5’-dichloro-2-hydroxy-2-méthylbut-3-énanilide, appelé M2, ne l’est pas

(fig.15). Le produit de dégradation final de la vinchlozoline dans l’eau est la 3,5-

dichloroaniline (M3) (Szeto et al., 1989). A pH basique, la réaction menant à M1 est

favorisée, tandis qu’à pH acide, c’est la production de M2 qui l’est. Les facteurs accélérant

l’hydrolyse de la vinchlozoline sont la température et un pH basique. Ainsi à une température

de 35°C, à pH 7,5 la demi-vie de la vinchlozoline est de 2,8 heures, tandis qu’à pH 4,5 elle est

supérieure à 500 heures (Szeto et al., 1989).

Fig.15 : schéma d’hydrolyse de la vinchlozoline en milieu aqueux (Szeto et al., 1989)

6-3-2 Photodégradation.

La vinchlozoline et M2 dissous dans l’eau peuvent subir une photodégradation s’ils

sont exposés à la lumière du soleil, donnant en particulier la 3,5-dichloroaniline et du 3,5-

dichlorophényl isocyanate. Environ 10 % de la vinchlozoline est dégradée après une

exposition aux UV (λ ≥ 290 nm) pendant 8 h (Schick et al., 1999).

Cl

Cl

N H

O H

C H

C H 3

O

C H 2

Cl

Cl

N O

C H 3

C H

O

O C H

2

Vinchlozoline

Cl

Cl

N H

C H

C H 3

C H 2

O

H O O C M1

M2

O

56

6-3-3 Biodégradation.

Une perte d’efficacité de la vinchlozoline a été constatée après des traitements

successifs sur un même sol, phénomène lié à une dégradation microbienne accrue (Mercadier

et al., 1998, Mitchell and Cain, 1996). Ainsi, la demie-vie mesurée de la vinchlozoline dans

un sol jamais traité précédemment, est de 22 jours après le premier traitement, et seulement

2,15 heures après le 6ème (10 mg de vinchlozoline par kg de sol sec, 20 % d’humidité, à 28°C)

(Mercadier et al., 1998). Le produit de dégradation final obtenu est la 3,5-dichloroaniline. M3

était retrouvé avec M1 après le premier traitement, tandis qu’il était retrouvé avec M2 après

les traitements successifs.

6-4 Sources et voies d’exposition de l’Homme.

L’exposition de l’homme à la vinchlozoline est avant tout professionnelle. Chez les

ouvriers agricoles travaillant sous serre et utilisant de la vinchlozoline, l’exposition a été

évaluée à 25 mg après 8 h de travail, et l’exposition dermique à 2,5 mg/jour, cette valeur étant

supérieure aux limites autorisées aux USA ou dans l’UE (Nilsson and Papantoni, 1996). La

concentration en vinchlozoline non métabolisée dans les urines de deux opérateurs sous serre

a été évaluée à 64,4 ng/ml (Carlucci et al., 2005). L’évaluation de l’exposition de 67 ouvriers

travaillant dans la synthèse et la formulation de la vinchlozoline conduit à des valeurs

supérieures à 25 µg/kg pc/jour (Watson, 1995). Les résidus de traitements phytosanitaires des

fruits et légumes constituent la principale voie de contamination des consommateurs.


6-5-1 Absorption, distribution, métabolisme, élimination.

Chez les rats traités par voie orale par la [U-14C-phenyl]-vinchlozoline administrée

pendant 7 jours à une dose de 40 mg/kg pc/j, une moyenne de 47 % de la quantité totale

adminitrée a été éliminée par voie urinaire et 54 % dans les fèces six jours après la dernière

dose. Aucune radioactivité n’a été détectée dans la carcasse ou dans l’air expiré à ce moment

là. La canulation du canal cholédoque après une prise orale unique a montré une excrétion de

65 % de la radioactivité administrée dans la bile, 19 % dans l’urine et 15 % dans les fèces. Le

pic plasmatique a été détecté après environ 1 h et la demi-vie plasmatique était de 20 h. Après

7 doses, les concentrations les plus élevées en radioactivité ont été détectées dans le foie, les

57

reins, le tractus gastrointestinal, la graisse, les glandes surrénales et les ovaires (Watson,

1995).

6-5-2 Toxicité aigüe.

La DL50 aigüe par voie orale chez le rat est supérieure à 10000 mg/kg, et d’environ

8000 mg/kg chez le cobaye. La vinchlozoline est un irritant modéré de la peau, des voies

aériennes supérieures et des yeux (Kidd et al., 1991).

6-5-3 Toxicité subaigüe, subchronique, et chronique.

Lors d’expérimentations de 2 à 3 mois avec différentes souches de souris consommant

de la nourriture traitée avec 100 à 5000 ppm de vinchlozoline, la NOAEL était équivalente à

20 mg/kg pc/j, sur la base des signes en rapport avec les effets anti-androgéniques, des signes

d’hépatotoxicité, et des changements touchant les surrénales. Chez le rat, des atteintes des

glandes surrénales ont été observées dès la dose de 4 mg/kg pc/j (NOAEL) pendant trois

mois. Chez le chien, une hausse du poids des glandes surrénales chez les mâles et les femelles

a été provoquée par une exposition à 7,5 mg/kg/j p.o. et les mâles avaient une hypertrophie de

la prostate. La NOAEL relevée était de 2,4 mg/kg pc/j d’après les changements

histopathologiques touchant le foie, la prostate, les testicules ou les glandes surrénales.

Les études multigénérationnelles chez le rat ont montré que la vinchlozoline

provoquait une infertilité des males, du fait de la féminisation des organes génitaux externes,

lors de l’exposition par l’alimentation à des doses de 1000 ppm ou plus. A 300 ppm, les rats

males avaient une fertilité inférieure à la normale. A 50 ppm, le seul effet délétère relevé était

une diminution du poids de l’épididyme chez les nouveaux-nés de la génération F2,

conduisant à une NOAEC de 40 ppm, soit une NOAEL d’environ 4 mg/kg pc/j. Ces

problèmes de fertilité seraient liés aux effets transgénérationnels de la vinchlozoline via un

mécanisme épigénétique, transmissible par les mâles uniquement (Anway et al., 2006).

6-5-4 Reprotoxicité et embryotoxicité.

Chez les rats, l’indicateur le plus sensible de tératogénicité est une réduction de la

distance anogénitale. La NOAEL déterminée à partir de cet effet est de 15 mg/kg pc/j. La

NOAEL pour la fœtotoxicité est d’environ 100 mg/kg pc/j, d’après les signes de retard du

développement.

58

6-5-5 Mutagénicité, génotoxicité.

La vinchlozoline administrée chez la souris à des doses de 312.5 à 1250 mg/kg

provoque une augmentation significative des érythrocytes micronucléés trouvés dans la

moelle osseuse. Par ailleurs, la morphologie des micronoyaux formés indiquent un mode

d’action à prédominance clastogénique (Hrelia et al., 1996). Néanmoins, ces résultats ont été

contredits par ailleurs (Kevekordes et al., 1996) et le test d’Ames s’est révélé négatif (IPCS,

1995).

6-5-6 Carcinogénicité.

L’étude de carcinogénicité chez les souris C57Bl/6 exposées via l’alimentation à des

doses de 0, 15, 150, 3000, ou 8000 ppm, a permis de mettre en évidence des carcinomes

hépatocellulaires à la plus forte dose. Des effets toxiques (hépatotoxicité et hyperplasie des

cellules de Leydig) ont été relevés à partir de 3000 ppm. La NOAEC est de 150 ppm, soit une

NOAEL de 24 mg/kg pc/j. Une exposition in utero lors de la formation des gonades chez le

rat (génération F1) a provoqué l’apparition de tumeurs au niveau des glandes mammaires chez

les rates des générations F1 à F4 (Anway et al., 2006).

6-5-7 Propriétés antiandrogéniques.

M1 et plus particulièrement M2 sont responsables de l’activité antiandrogénique

imputable à une exposition à la vinchlozoline. Ce sont en effet, in vitro et in vivo, des

inhibiteurs compétitifs des androgènes au niveau de l’AR humain (Ki>700 µM pour la

vinchlozoline, 92 µM pour M1 et 9,7 µM pour M2) et des inhibiteurs de l’expression de gènes

induite par les androgènes (Kelce et al., 1997, Kelce et al., 1994). D’après les résultats de tests

basés sur l’emploi de cellules MCF7 transfectées de façon stable avec l’AR et sur l’emploi de

gènes rapporteurs (activité luciférae) exprimé dans des cellules d’adénocarcinome de la

prostate humaine (PC-3) ou d’ovaire de hamster chinois, les concentrations inhibitrices

médianes (CI50) de la vinchlozoline sont comprises entre 1,1.10-7 et 4,7.10-7 M (Korner et al.,

2004).

Les rats nouveaux nés exposés in utero à la vinchlozoline pendant la période de

différenciation sexuelle présentent un phénotype féminisé (distance ano-génitale réduite,

tétons, hypospadias, testicules topiques suprainguinaux, poche vaginale fermée) (Gray et al.,

1994). En outre, chez l’adulte, le poids de la prostate ventrale est réduit en permanence dès

6,5 mg/kg/j et les tétons féminisés sont permanents (Gray et al., 1999). Une administration

59

péribubertaire par voie orale de vinchlozoline à 10, 30 et 100 mg/kg/j provoque un retard de la

puberté et une réduction des glandes sexuelles accessoires et de la croissance de l’épididyme

(à 30 et 100 mg/kg/j) ainsi qu’une hausse de la LH sérique à toutes les concentrations

(Monosson et al., 1999). Enfin, le test Hershberger de 10 jour chez le rat Sprague-Dawley

castré a montré que la vinchlozoline à 50 et 100 mg/kg/j inhibait l’activité androgénique de la

testostérone (0,4 mg/kg/j) diminuant la croissance des tissus dépendant des androgènes

(prostate ventrale, glandes séminales, muscle levator anibulbocavernosus) par rapport aux

contrôles ne recevant que la testostérone (Kang et al., 2004).

Chez les guppies (Poecilia reticulata), la vinchlozoline entraine une démasculinisation

(réduction de la coloration orange, inhibition du développement du gonopodium, réduction du

nombre de spermatozoïdes et suppression du comportement de cour) (Bayley et al., 2002).

Une modification du sexe ratio en faveur des femelles, ainsi qu’une maturation des mâles

retardée et une diminution de leur fertilité (Bayley et al., 2003). Une concentration de 5 mg/L

de la formulation Ronilan®, équivalent à 2,5 mg/L de vinchlozoline, a provoqué une faible

incidence d’intersex ainsi que des troubles de la spermatogenès chez le medaka japonais

(Orysias latipes) (Kiparissis et al., 2003).

Enfin, il a été observé que la vinchlozoline induisait les CYP1A2 et 2B10 chez la souris CD-1

mâle adulte après administration de 160 mg/kg/jour par gavage pendant 21 jours. Chez ces

souris traitées, une augmentation de la métabolisation de la testostérone a été provoquée par le

traitement décrit précédemment (Dai et al., 2001).

7 Présentation et objectifs de la thèse.

Cette thèse s’est inscrite dans le cadre des projets menés par le réseau européen

CASCADE (Chemicals as contaminants in food chain : an NoE for reserach, risk assessment

and education) qui a financé une partie de ce travail. L’un des objectifs du réseau est de

fournir aux consommateurs européens une information fiable sur les risques pour la santé

associés à une exposition à des contaminants alimentaires perturbateurs endocriniens. Trois

molécules connues pour être des PE ont été sélectionnées comme modèles pour l’ensemble

des études menées au sein du réseau : le bisphénol-A, la génistéine et la vinchlozoline. Les

études de leurs propriétés sont réalisées grâce à un certain nombre de modèles in vitro et in

vivo, développés pour explorer leurs mécanismes d’action ou pour faire le screening des

contaminants alimentaires.

60

Afin d’interpréter au mieux les résultats obtenus avec ces modèles, il est important de

connaître le devenir des molécules testées et de caractériser les capacités de ces systèmes

biologiques à métaboliser les composés testés puisque la nature des métabolites formés et

leurs cinétiques de formation influent sur l’activité observée. En effet, si la biotransformation

conduit pour la majorité des xénobiotiques à une détoxication et une élimination de la

molécule, certaines réactions peuvent, au contraire, mener à la production de métabolites plus

actifs que le composé parent. Les réactions biochimiques de phase I et de phase II mises en

jeu dans cette biotransformation augmentent pour la plupart d’entre elles l’hydrophilie de la

molécule et facilitent ainsi son excrétion. Ces modifications de la structure moléculaire sont le

plus souvent responsables d’une perte d’activité du xénobiotique. Cependant, certaines

réactions de phase I telles que l’hydroxylation n’altèrent pas toujours voire augmentent même

l’activité du composé. Ainsi, suivant le devenir de la molécule testée au sein d’un système

biologique, ce dernier pourra provoquer une surestimation de l’activité d’un xénobiotique s’il

est activé, ou au contraire une sous-estimation de son activité si les réactions de

biotransformations mènent à la production de métabolites inactifs.

Le premier objectif du travail présenté dans ce manuscrit a été de compléter les

connaissances des voies de biotransformation de la génistéine et de la vinchlozoline dans le

but de développer une vision intégrée des voies de biotransformation entre l’in vitro et l’in

vivo. Il a été considéré que les données de la littérature étaient suffisantes pour le BPA, ne

justifiant pas d’études complémentaires pour ce contaminant.

La génistéine est une molécule dont les voies de biotransformation in vivo chez le rat

mais aussi chez l’homme sont bien décrites et pour laquelle des données épidémiologiques

existent. Nous avons néanmoins dû compléter les connaissances des voies de

biotransformation in vitro de ce phytoestrogène. Pour ce faire, nous avons utilisé deux

modèles de référence, les microsomes et les hépatocytes cryoconservés et nous avons ainsi

établi les différences et les similitudes entre le rat et l’homme dans les voies de

biotransformation de cette molécule.

Les données publiées sur la biotransformation de la vinchlozoline étant

particulièrement succinctes, nous avons ensuite exploré les voies métaboliques de ce

fongicide chez le rat Wistar in vitro en utilisant les tranches de foie, ce qui nous a permis

d’identifier les principaux métabolites produits et de déterminer leurs cinétiques de formation.

Nous avons complété les observations faites en explorant ces voies de biotransformation in

61

vivo en utilisant l’urine de rats Wistar mâles, mais aussi de rates Wistar en gestation, exposés

par gavage.

Le second objectif de ce travail de thèse a été de caractériser les capacités

métaboliques de différentes lignées cellulaires fréquemment utilisées dans l’étude des

propriété des PE et de leur « screening ». Ces modèles cellulaires sont bien maîtrisés au sein

du réseau Cascade, en particulier les cellules MCF7 (tumeur de glande mammaire humaine) et

les cellules HepG2 (carcinome de foie humain). Nous avons étendu ce travail aux cellules

HC11 (lignée cellulaire non cancéreuse de glande mammaire de souris) pour leurs propriétés

qui en font une lignée d’origine murine intéressante dans l’étude et le screening des PE. Nous

avons poursuivi cet objectif en identifiant les métabolites de la génistéine, du BPA et de la

vinchlozoline et en calculant leurs cinétiques de formation au sein de ces cellules. Afin

d’établir des comparaisons et de disposer d’un modèle de référence en matière de

biotransformation in vitro, nous avons mené parallèlement aux études sur lignées cellulaires

des travaux sur tranches de foie de rat Wistar.

Afin de réaliser ces objectifs, nous avons du adapter les méthodes séparatives en

CLHP pour chacune des molécules. Dans le but de faciliter l’identification des principaux

métabolites de la génistéine et du BPA, nous avons également mis en place des méthodes

principalement biochimiques afin de produire des standards conjugués. Nous avons adapté les

protocoles d’incubation de chacune des molécules dans les différents systèmes in vitro

employés afin de permettre le calcul des cinétiques de production des métabolites majeurs.

Bon nombre d’expérimentations ont été réalisées en collaboration avec les partenaires du

réseau CASCADE, en particuliers Nicolas Olea du Laboratoire de recherche médicale de

l’Université de Grenade (Espagne) pour les cellules MCF7, et Ingemar Pongratz, du

département de Biosciences et de Nutrition de l’Institut Karolinska (Stockholm, Suède), pour

les cellules HepG2 et HC11. L’identification des structures par spectrométrie de masse et/ou

RMN a été possible grace à l’équipement dont dispose mon laboratoire d’accueil et aux

compétences des ingénieurs chargés de ces approches.

62

63

RESULTATS

64

65

Chapitre 1 :

Biotransformation de la génistéine et de la

vinchlozoline

66

67

1 Introduction.

Le but des expérimentations présentées dans ce chapitre est d’une part d’étendre les

connaissances des voies de biotransformation de la génistéine et de la vinchlozoline et d’autre

part d’appréhender les extrapolations animal-homme et in vitro-in vivo en matière de

métabolisme.

1-1 Génistéine.

Un rapport récent a conclu que la génistéine présentait une toxicité négligeable sur les

fonctions de la reproduction et sur le développement au niveau de la population générale

(Rozman et al., 2006) ; néanmoins, l’évaluation du rapport risque/bénéfice de la génistéine

chez l’Homme n’est pas définitivement établi. Un grand nombre de données relatives à sa

biotransformation était déjà disponible, que ce soit in vitro, en particulier à partir de

microsomes (Breinholt et al., 2003, Kulling et al., 2001, Kulling et al., 2000, Kulling et al.,

2002, Roberts-Kirchhoff et al., 1999), ou in vivo chez le rat et l’Homme (Clarke et al., 2002,

Coldham et al., 1999, Coldham and Sauer, 2000, Doerge et al., 2000, Sfakianos et al., 1997,

Shelnutt et al., 2002, Yasuda et al., 1996). En dépit de ces travaux, plusieurs voies

métaboliques et capacités de biotransformations restaient à préciser, notament chez l’Homme.

Afin de disposer de ces informations, nous avons étudié le devenir de la [14C]-génistéine

incubée avec des microsomes de foie et des hépatocytes cryopréservés d’orine humaine. En

complément et afin de pouvoir comparer les données obtenues chez l’Homme et chez le rat,

des expérimentations ont été réalisées à l’aide de tranches de foie de rats mâles Wistar, afin de

vérifier l’identité et les proportions des métabolites de la génistéine produits par ce système.

Chacun de ces modèles biologiques apporte en effet des informations complémentaires en

matière d’enchainement métabolique et de taux de biotransformations.

1-2 Vinchlozoline.

Bien que la vinchlozoline soit un fongicide dont l’usage sera interdit en France à partir

du 31 décembre 2007, elle demeure une molécule modèle du fait de ses propriétés

toxicologiques. En effet, ses deux produits de dégradation, M1 et M2, sont responsables de

ses effets antiandrogéniques en inhibant de façon compétitive la liaison des androgènes à

l’AR et l’expression des gènes normalement induite par les androgènes avec des Ki de 92 et

68

9,7 respectivement (Kelce et al., 1997, Kelce et al., 1994). En outre, il a été récemment

démontré que la vinchlozoline administrée à des rates en gestation entraîne des effets

transgénérationnels tels qu’une diminution de la fertilité, des atteintes de la prostate, des reins,

du système immunitaire, de la spermatogenèse, ou encore le développement de tumeurs des

glandes mammaires (Anway et al., 2005, Anway et al., 2006). L’incidence de ces pathologies

transgénérationnelles est élevée, allant de 10% pour les tumeurs à plus de 50% pour les

lésions prostatiques à chaque génération, depuis la première (F1) jusqu’à la 4ème (F4). Ces

effets transgénérationnels seraient transmis via des altérations épigénétiques impliquant une

méthylation permanente de l’ADN des spermatozoïdes (Chang et al., 2006).

Les données publiées sur la biotransformation de la vinchlozoline sont peu

nombreuses, une seule étude s’attachant à explorer la métabolisation de cette molécule chez le

champignon Cunninghamella elegans (Pothuluri et al., 2000). Si aucune donnée publiée dans

la littérature n’est disponible concernant le devenir de la vinchlozoline in vivo, quelques

informations sur l’identité des métabolites formés chez le rat sont librement accessibles sur

internet (Watson, 1995). Enfin, aucune étude n’a été publiée sur la biotransformation de la

vinchlozoline dans des systèmes in vitro tels que les tranches de foie de rat.

Connaître le devenir de la vinchlozoline et de ses produits d’hydrolyse M1 et M2 chez

le rat représente donc un intérêt certain si l’on veut mieux comprendre les processus

impliqués dans les effets toxiques de cette molécule. Nous avons donc choisi en premier lieu

d’explorer la biotransformation de la vinchlozoline dans les tranches de foie de rats Wistar

mâles et de comparer ce profil métabolique avec celui obtenu in vivo à partir des urines de rats

traités par ce même composé. En effet, la validité d’un modèle in vitro et la valeur prédictive

des données qu’il est capable de produire reposent sur la représentativité de ce modèle par

rapport à l’animal entier. Des expérimentations supplémentaires ont été réalisées en exposant

des femelles en gestation par gavage pendant la détermination sexuelle des embryons afin

d’évaluer à quels métabolites ces embryons étaient susceptibles d’être exposés.

69

Article 1 : COMPARISON OF GENISTEIN METABOLISM IN RATS AND HUMANS

USING LIVER MICROSOMES AND HEPATOCYTES

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71

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73

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80

81

Expérimentation complémentaire : Biotransformation de la génistéine par les tranches de foie de rat Wistar.

Afin de compléter l’étude métabolique de la génistéine sur microsomes et hépatocytes,

nous avons réalisé le même type de travail à partir d’un modèle biologique plus intégré : les

tranches de foie. Ce modèle a d’ailleurs été choisi comme référence dans nos études chez le

rat, en raison de sa facilité d’emploi et de l’excellent niveau d’expression d’enzymes de

biotransformation qu’il permet (Ekins et al., 1996).

Les rats Wistar mâles pesant environ 250 g ont été obtenu auprès d’Iffa Credo

(L’arbresle, France). A leur arrivée à l’animalerie, les animaux ont eu une période d’une

semaine d’acclimatation avant toute expérimentation durant laquelle ils avaient un accès sans

restriction à l’alimentation (UAR 210; Villemoisson sur Orge, France) et à l’eau. A chaque

expérimentation, les animaux étaient tués par dislocation cervicale, immédiatement suivie

d’une exsanguination. Les foies étaient immédiatement récupérés et perfusés avec 40 mL de

tampon Krebs-Henseleit oxygéné glacé (4°C) afin d’en retirer le sang. Les carottes de foie

étaient obtenues à l’aide d’un tube d’acier inoxydable monté sur une foreuse. Une trancheuse

de tissus Krumdieck (Alabama Research and Development Corp., Munford, AL) a été utilisée

pour produire des tranches de foie précisément coupées d’un diamètre de 8 mm et d’une

épaisseur de 0.2 mm (Krumdieck et al., 1980). Une période d’équilibration de 45 min a été

prévue pour permettre de retirer les cellules endommagées et pour retrouver l’homéostasie en

Ca2+ et K+ dans les tranches. Le poids moyen des tranches de foie était de 20 mg, contenant 2

mg de protéines. L’incubation des tranches a été réalisée dans des plaques de 12 puits

(Dogterom, 1993) en utilisant du milieu DMEM. Le volume des incubations était d’1 mL, la

température maintenue à 37°C dans un shaker rotatif réglé à 90 tours par minute,

l’athmosphère étant saturée avec 95% O2/5% CO2. La [14C]-génistéine a été incubée à une

concentration de 10 µM [2420 Bq/mL] pendant 4 hr avec des tranches provenant de trois rats

différents. La stabilité de la génistéine dans les conditions d’incubation a été contrôlée en

l’incubant 4 hr dans un mL de DMEM en l’absence de tranches. La 7-éthoxycoumarine

radiomarquée au 14C a été utilisée pour contrôler l’activité métabolique des enzymes de phase

I et de phase II des tranches en l’incubant pendant 4 hr à une concentration de 25 µM en

présence des tranches de foie de rat. La formation de 7-hydroxycoumarine, 7-

hydroxycoumarine glucuronoconjuguée ou conjuguée à l’acide sulfurique a été contrôlée par

CLHP.

82

La génistéine s’est montrée stable pendant la durée d’incubation, aucun produit de

dégradation n’ayant été détecté au bout de 4 hr à 37°C dans le DMEM seul. Les capacités

métaboliques des tranches étaient conformes à la littérature, puisque plus de 50% de la 7-

éthoxycoumarine a été métabolisée en 7-hydroxycoumarine et en ses conjugués à l’acide

glucuronique et au sulfate, ce qui correspond aux résultats obtenus par (Ekins et al., 1995).

Après incubation de 10 µM de génistéine pendant 4 hr en présence des tranches des

foie, trois métabolites ont été détectées par CLHP avec des temps de rétention (Rt) de 11,8,

13,9 et 19,1 minutes (Fig.1). D’après ces temps de rétention et les hydrolyses enzymatiques

décrits dans l’article 1, ces métabolites ont été identifiés comme étant la génistéine 7-O-

glucuronoconjuguée, 4’-O-sulfate (Rt=11,8 minutes), la génistéine 7-O-glucuronoconjuguée

(Rt=13,.9 minutes et la génistéine 4’-O-sulfate (Rt=19,1 minutes). La génistéine conjuguée à

la fois à l’acide glucuronique et à l’acide sulfurique et la génistéine conjuguée seulement à

l’acide glucuronique en position 7 étaient majoritaires et représentaient en moyenne

respectivement 37,8 % et 36,4 % de la radioactivité totale présente dans les milieu

d’incubation, tandis que la génistéine 4’-O-sulfate représentait 13,4 % en moyenne de la

radioactivité totale.

Ces résultats sont proches de ceux observés précédemment avec les hépatocytes

cryopréservés de rats puisque les 2 métabolites prépondérents sont les mêmes dans les 2

systèmes. En revanche, la génistéine 4’-O-glucuronoconjuguée et la génistéine 7’-O-sulfate,

mises en évidence à partir d’hépatocytes en culture primaire, n’apparaissent pas ici.

Fig.1 : profile radio-CLHP typique obtenu à partir

d’incubations de 10 µM [14C]-génistéine avec des

tranches de foie de rat Wistar pendant 4 hr.

0 5 10 15 20 25 30 35 0

500

1000

1500

2000

2500

dpm

GEN 7-O-G

GEN 4’-O-S 7-O-G

GEN 4’-O-S

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Article 2 : BIOTRANSFORMATION OF VINCLOZOLIN IN RAT PRECISION-CUT

LIVER SLICES: COMPARISON WITH IN VIVO METABOLIC PATTERN

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Expérimentation complémentaire : profiles métaboliques urinaires de la vinchlozoline,

chez la rate en gestation

Les résultats présentés dans la publication 2 montrent que les principaux métabolites

produits in vivo chez le rat Wistar mâle sont identiques à ceux identifiés après incubation de la

vinchlozoline avec les tranches de foie de rat. Ces expérimentations ont montré qu’ils sont

essentiellement issus de la biotransformation de M2, qui demeure un métabolite très

minoritaire à la fois in vitro et in vivo, et dans une moindre mesure de la vinchlozoline. En

outre, la formation rapide de ces métabolites à partir de M2 provoque une diminution

relativement rapide de M1 in vitro.

Comme M1 et M2 sont les deux produits de dégradation qui présentent la plus forte

activité antiandrogénique, il nous est apparu important d’étudier les profiles urinaires de rates

en gestation auxquelles nous avons administré par gavage de la vinchlozoline au moment de

la période de différentiation sexuelle des fœtus, afin de déterminer à quels métabolites les

fœtus étaient les plus exposés.

Les rates Wistar pesant environ 250 g ont été achetées chez Iffa Credo (L’arbresle,

France). A leur arrivée à l’animalerie, les animaux ont subi une semaine d’acclimatation avant

toute expérimentation, avec un accès libre à la nourriture (UAR 210; Villemoisson sur Orge,

France) et à l’eau de boisson. Trois rates ont été mises individuellement dans des cages à

métabolisme. Elles ont été gavées aux 12ème, 14ème, 16ème et 18ème jours de gestation avec

30mg/kg [14C]-vinclozolin dissoute dans du DMSO et ajustée avec de la vinclozolin froide

pour obtenir une activité finale de 0.481 MBq [14C]-VZ/kg p.c. Les urines ont été collectées

toutes les 24 hr pendant 7 jours, et stockées à -20°C jusqu’à analyse. Seules les urines de 24

hr après le premier gavage et celles de 24 hr après le dernier gavage ont été analysées.

Les métabolites sont identiques à ceux de l’expérimentation précédente présents dans

les urines des rates en gestation (fig.2). Les profils radio-CLHP des urines montrent que la

quantité de M2 est inférieure aux limites de détection à chaque prélèvement, tandis que M1,

M5 et ses glucuronoconjugués sont les métabolites majeurs dès 24 hr après le premier gavage.

M4 et M4G voient également leur proportion croitre avec la réitération des gavages.

94

0 10 20 30 40 50 60 0

1000

2000

3000

4000

time [min]

dpm

0 10 20 30 40 50 60 0

2500

5000

7500

time [min]

dpm

M5G1 M5G2

M5G3

M4G

M5b

M4

M1

VZ

M5a

M5G1

M5G2

M5G3 M5

M1

Fig.2 : profil radio-CLHP typique obtenu à partir d’urines de rates en gestation exposées par gavage toutes les 48 hr à 30 mg/kg de [14C]-vinchlozoline dissoute dans du DMSO et ajustée de la vinchlozoline froide (activité finale de 0.481 MBq [14C]-VZ/kg p.c.) : haut : 24 hr après le premier gavage (J1). Bas : 24 hr après le troisième gavage (J7).

95

2 Discussion

L’incubation de la génistéine avec les microsomes des deux espèces a mené à la

formation de trois métabolites hydroxylés, que nous avons identifiés par ESI-MS-MS et RMN

comme étant la 6-hydroxygénistéine, la 8-hydroxygénistéine et la 3’-hydroxygénistéine ou

orobol. Les trois métabolites sont produits par les microsomes de chaque espèce et de chaque

sexe. Quantitativement, l’orobol est le métabolite hydroxylé majoritaire chez le rat, tandis que

chez l’Homme, l’orobol et la 8-hydroxygénistéine sont tous deux majoritaires et produits en

quantités similaires chez l’homme et la femme. Ces deux métabolites sont d’ailleurs produits

à un taux plus important chez l’Homme que chez le rat.

Cinq métabolites conjugués ont été produits par les hépatocytes cryoconservés de foie

de rat et d’Homme : la génistéine 4’-O-sulfate,7-O-glucuronoconjuguée, la génistéine

conjuguée à l’acide glucuronique en position 4’ ou 7, et la génistéine conjuguée au sulfate en

position 4’ ou 7. Que ce soit chez le rat ou chez l’Homme, le métabolite majoritairement

produit est issu de la conjugaison en position 7 de la génistéine à l’acide glucuronique et

représente plus de 50% de la radioactivité totale après 24 hr d’incubation. Sa vitesse de

production est similaire chez l’homme et le rat. Avec les hépatocytes cryoconservés de rat, le

métabolite ayant le second taux de production le plus important est le diconjugué 4’-O-

sulfate, 7-O-glucuronide. Il représente environ 25% de la radioactivité totale en fin

d’incubation alors que chez l’Homme il est inférieur à 10%. Aucun métabolite hydroxylé n’a

été détecté pour les deux espèces.

Ces expérimentations ont montré que la génistéine est métabolisée in vitro autant par

les microsomes de foie de rat que d’Homme et par les hépatocytes cryoconservés des deux

espèces. Pour un même système in vitro, les métabolites formés sont identiques entre les

espèces. Les cinétiques calculées montrent que l’hydroxylation de la génistéine se fait

préférentiellement sur le cycle B en position 3’ chez les deux espèces, mais également sur le

cycle A en position 8 chez l’Homme. D’après la littérature, ces métabolites hydroxylés ne

sont pas toujours tous détectés dans les échantillons d’urines humaines, et lorsqu’ils le sont,

ils sont présents sous formes conjuguées au sulfate ou à l’acide glucuronique et représentent

moins de 10 % de l’ensemble des isoflavones urinaires (Heinonen et al., 2003, Kulling et al.,

2001). Ces observations indiquent que les réactions de phase II sont prédominantes dans les

voies de biotransformation de la génistéine, ce qui a été confirmé par nos résultats obtenus par

l’utilisation des hépatocytes cryoconservés de rat et d’Homme avec lesquels nous n’avons pas

détecté de métabolites hydroxylés, malgré l’expression des enzymes de phase I. Cette absence

96

pourrait être également due aux propriétés inhibitrices de la génistéine envers certaines

enzymes de phase I telles que les CYP1A1, 1A2 et 1B1, décrites par Moon et al. (2006). Chez

les deux espèces, le métabolite produit le plus rapidement est la génistéine 7-O-

glucuronoconjuguée qui a d’ailleurs été décrite comme étant le métabolite majeur présent

dans le sang et dans l’urine humaine (Clarke et al., 2002, Doerge et al., 2000).

Nous avons ainsi montré avec ces expérimentations que les voies de biotransformation

de la génistéine dans les microsomes ou les hépatocytes cryopréservés étaient identiques entre

le rat et l’Homme, les seules différences concernant les cinétiques de production de certains

métabolites.

Les métabolites majeurs de la vinchlozoline, présents dans les milieux d’incubation

des tranches de foie et dans les urines des rats mâles et femelles en gestation exposés à la

vinchlozoline par gavage ont été identifiés par NI-ESI-MS. Ces métabolites sont la 3-(3,5-

dichlorophenyl)-5-methyl-5-(1,2-dihydroxyethyl)-1,3-oxazolidine-2,4-dione (M4, uniquement

dans les urines) et ses glucuronoconjugués (M4G), le 3’,5’-dichloro-2,3,4-trihydroxy-2-

methylbutyranilide (M5) et ses glucuronoconjugués (M5G). Nous avons également identifié

la 3,5-dichloroaniline dans les milieux d’incubation des tranches de foie, d’après son temps de

rétention comparé à celui de la 3,5-dichloroaniline standard. In vitro dans les tranches de foie

de rat comme in vivo dans l’urine de rat mâle ou femelle en gestation, les métabolites

majoritaires sont les M5G, M5, M4G, M4 et M1.

Ces expérimentations ont démontré que la vinchlozoline est métabolisée de façon

efficace chez le rat Wistar. L’hydrolyse spontanée et rapide de la vinchlozoline dans le

DMEM seul, à 37°C, via un clivage non-enzymatique des liaisons carbone-azote en position

2,3- (M2, minoritaire) ou 3,4- (M1 majoritaire) de l’hétérocycle était attendue. Nous avons

déduit des observations faites in vitro comme in vivo que la métabolisation de la vinchlozoline

chez le rat Wistar demandait obligatoirement une étape enzymatique de phase I provoquant la

dihydroxylation du groupement vinyle, probablement via la formation d’un époxyde

intermédiaire, permettant l’obtention des métabolites M4 depuis la vinchlozoline et M5

depuis M2 lesquels peuvent ensuite être conjugués rapidement à l’acide glucuronique sur

l’une ou l’autre des fonctions alcool formées. De la même façon que la vinchlozoline

s’hydrolyse en M2, M4 et son glucuronoconjugué peuvent s’hydrolyser pour donner M5 et

l’un de ses glucuronoconjugués, rendant ces métabolites d’autant plus majoritaires.

Les profiles radio-CLHP des urines de rates en gestation donnent une indication

concernant l’identité des métabolites de la vinchlozoline auxquels les fœtus sont susceptibles

97

d’être exposés. La quantité de M2 présent dans les urines était inférieure aux limites de

détection. Cette observation a été également faite avec les urines de rats mâles Wistar. Les

données cinétiques obtenues à l’aide des tranches de foie de rat indiquent que M2 semble être

un métabolite mineur in vitro comme in vivo, alors qu’il est le produit de dégradation de la

vinchlozoline dont l’activité antiandrogénique est la plus forte (Kelce et al., 1994). Au

contraire, nous avons observé que les quantités de M1 présent in vitro comme in vivo

pouvaient être bien plus importantes. Nos données confirment donc que l’activité

antiandrogénique de la vinchlozoline pourrait dépendre avant tout de la production de M1

comme l’avait suggéré Kelce et al. (1994) qui ont observé que les concentrations sériques de

M1 chez la rate en gestation après un traitement de 100 mg/kg p.c./j pouvaient égaler ou

dépasser la Ki calculé pour l’inhibition du récepteur aux androgènes par M1 in vitro.

Les profils métaboliques de la vinchlozoline après incubation avec les tranches de foie

sont peu différent des profils obtenus avec l’urine de rats mâles ou femelles. Malgré la

quantité moindre de métabolites plus polaires, les métabolites majoritaires sont les même in

vitro et in vivo. L’analyse de milieux d’incubation de la génistéine en présence de tranches de

foie de rats mâles a montré que les métabolites principaux produits n’étaient pas différents de

ceux détectés in vivo chez le rat ou chez l’homme (Coldham et Sauer, 2000, Clarke et al.,

2002, Doerge et al., 2000, Shelnutt et al., 2002). Nous avons donc choisi ce système comme

référence en matière de biotransformation afin de pouvoir lui comparer les cellules HepG2,

MCF7 et HC11.

98

99

Chapitre 2 :

Caractérisation des capacités métaboliques de trois

lignées cellulaires utilisées dans l’étude des

propriétés des PE in vitro.

100

101

1 Introduction

L’étude des propriétés des PE a imposé le développement de différents tests in vitro

dans le but d’étendre et d’accélérer le screening des substances auxquelles l’Homme peut être

exposé. Ces tests utilisant des lignées cellulaires variées incluent en particulier les tests de

prolifération cellulaire et d’expression de gènes rapporteurs. L’un des défauts principaux

reconnu des lignées cellulaires utilisées est qu’elles ont des capacités métaboliques réduites,

ce qui complique l’extrapolation des résultas observés à la situation in vivo. Pourtant, peu

d’études s’intéressent aux capacités métaboliques des cellules dans les conditions de

réalisation des tests et à leur influence sur l’activité des perturbateurs endocriniens testés.

Elles sont pourtant susceptibles de sous-évaluer ou au contraire de surévaluer l’activité réelle

des molécules testées. Afin d’explorer cette problématique, nous avons choisi trois lignées

cellulaires en accord avec deux laboratoires partenaires au sein du réseau CASCADE : le

laboratoire de recherche médicale de l’Université de Grenade, et le Département de

Biosciences et Nutrition du Karolinska Institutet de Stockholm. Ces lignées cellulaires sont

les MCF7 (cellules tumorales de glande mammaire humaine), les HepG2 (carcinome de foie

humain) et les cellules HC11 (cellules épithéliales non transformées de glande mammaire de

souris).

Nous avons utilisé les tranches de foie de rat comme modèle in vitro de référence pour

les études de biotransformation.

102

103

Article 3 : BIOTRANSFORMATION OF GENISTEIN AND BISPHENOL A IN CELL

LINES USED FOR SCREENING ENDOCRINE DISRUPTORS

104

105

BIOTRANSFORMATION OF GENISTEIN AND BISPHENOL A IN CELL LINES USED

FOR SCREENING ENDOCRINE DISRUPTORS

J. Bursztyka3, , E. Perdu3, K. Pettersson1, I. Pongratz1, M. Fernández-Cabrera2, N. Olea2, L.

Debrauwer3, D. Zalko3 and J.P. Cravedi3,*

1Karolinska Institutet, Department for Biosciences and Nutrition, Novum, SE-141 57

Huddinge, Sweden 2University of Granada, Laboratory of Medical Investigation, School of Medicine, Hospital

Clinico, 18071 Granada, Spain 3INRA, UMR 1089 Xénobiotiques, BP3 31931 Toulouse Cedex 9, France

* To whom correspondence should be addressed. Mailing address: INRA, UMR 1089

Xénobiotiques, BP3, 31931 Toulouse CEDEX 9, France. Phone: +33 561 285 002. fax: +33

561 285 244. E-mail: [email protected].

Key words: endocrine disruptors, genistein, bisphenol A, cell lines, HepG2, MCF7, HC11,

metabolism, biotransformation.

______________________________________

Abbreviation used

ATP, adenosine triphosphate, BPA, bisphenol A, CYP, cytochrome P450, DNA, deoxyribonucleic acid, DMEM,

Dulbecco’s modified Eagle’s medium, 7-EC, 7-ethoxycoumarin, 7-HC, 7-hydroxycoumarin, 7HCS, 7-

hydroxycoumarin sulfate, 7-HCG, 7-hydroxycoumarin glucuronide, EDs, endocrine disruptors, EGF, epithelial

growth factor, ER, estrogen receptor, ESI-MS/MS, electrospray ionization-mass spectrometry/mass

spectrometry, FBS, fetal bovine serum, FIDs, free induction decays, HPLC, high performance liquid

chromatography, LC-MS, Liquid chromatography – Mass spectrometry, NADP, β-nicotinamide adenine

dinucleotide phosphate, NMR, nuclear magnetic resonance, RPMI, Roswell Park Memorial Institute medium,

RT, retention time, SPE, solid phase extraction, Tris, hydroxymethylaminomethane, UDP, uridine-5’-

diphosphate.

106

ABSTRACT

In vitro assays provide the opportunity for generating alerts for chemicals which

interact with hormone receptors and are also valuable tools for mechanistic research.

However, the limited capabilities of in vitro models to metabolically activate or inactivate

xenobiotics may lead to misinterpretation of the in vitro data if such information is not taken

into account. The aim of this study was to investigate the metabolic capabilities of human

HepG2, human MCF7 and mouse HC11 cell lines used for testing endocrine disruptor (ED)

toward radiolabelled bisphenol A and genistein, two estrogenic compounds for which

metabolic pathways in vivo as in vitro are well known. Incubations were performed during 12

to 48 h with 250.103 cells in 12 wells plates and 5 to 25 µM of substrates. The kinetics of

formation of the metabolites were studied. Rat liver slices were used as reference for

comparison with the metabolic capabilities of the cell lines. HC11 cells did not show any

biotransformation capability while the major biotransformation pathways in HepG2 and

MCF7 cells were conjugation to sulfate and to a lesser extent to glucuronic acid. No phase I

metabolism occurred, even in rat liver slices. These results suggest that HC11 cells should be

a valuable cellular system to study the intrinsic estrogenic activity of the tested compound,

while HepG2 and MCF7 cells can help to take into account part of the metabolic fate of the

tested compound that occur in vivo. However, since phase I enzymes are poorly or not at all

expressed in these systems, their use in endocrine disruptor testing may result in false

negative for compounds for which bioactivation is a prerequisite.

107

INTRODUCTION:

Scientific evidence is accumulating that humans, domestic animals, and wildlife

species display adverse health consequences due to exposure to environmental chemicals that

interact with the endocrine system. Taking into account the number of natural and man-made

chemical substances, which should be evaluated for their endocrine disrupting potential and

the alarming health and environmental consequences involved, fast and reliable approaches

are needed. In this context, in vitro assays represent an attractive method for testing endocrine

disruptors (EDs) both from a ethical and cost-based point of view. As reviewed by Charles

(2004), Holmes et al. (2001) and Reel et al. (1996), several in vitro models have been used for

screening, among which transactivation (or reporter gene) assays are widely utilized systems.

The general principle is that ligand-bound nuclear hormone receptors alter their conformation,

dimerize and bind specific response element sequences on DNA, and initiate transcription of a

downstream gene which codes for a protein whose activity, usually enzymatic, can be

measured easily and accurately after treatment of the cell culture with different compounds

including xenobiotic agents.

In vitro assays not only provide the opportunity for generating alerts for chemicals

which interact with hormone receptors but are also valuable tools for mechanistic research

and in some instances for establishing experimental designs for animal studies (Gelbke et al.,

2004). However, results obtained from in vitro studies in general are often not directly

applicable to the in vivo situation. The limited capabilities of in vitro models to metabolically

activate or inactivate xenobiotics may lead to misinterpretation of the in vitro data if such

information is not taken into account.

One of the most used cell line to screen EDs is the human breast cancer MCF7 cell

line (Soto and Sonnenschein, 1985, Soto et al., 1995). MCF7 is an immortalized human breast

adenocarcinoma cell line that endogenously expresses predominantly ERα but also some ERβ

(Brooks and Thompson, 2005, Chen et al., 2004, Chen et al., 2003, Constantinou et al.,

1998b, Murata et al., 2004, Nakagawa and Suzuki, 2002, Rivas et al., 2002). The MCF7 cell

proliferation assay of estrogenic activity measures whether and to what extent a substance

induces cell proliferation via ER mediated pathways in MCF7 cells. Another cell line used to

test ED is the human HepG2 hepatoma cell line which are naturally devoid of estrogen

receptors, but subclones stably expressing ERα and ERβ are available (Solakidi et al., 2005).

HepG2 cell line is the most frequently used and best characterized human hepatoma cell line

and it expresses a variety of liver specific metabolic enzymes and transporters with varying

108

activities between different passages and sources of the cells (Brandon et al., 2006, Hewitt

and Hewitt, 2004, Wilkening and Bader, 2003). Mouse HC11 mammary gland cell line

endogenously expresses both ERα and ERβ (Faulds et al., 2004). The involvement of both

nuclear receptors in the proliferation and the differentiation of HC11 cells has been

demonstrated (Helguero et al., 2005) and makes this cell line potentially interesting for testing

estrogenic compounds in an in vitro system of murine origin.

In this study we perform a detailed study of the biotransformation properties of cell-

lines commonly used for in-vitro testing purposes. We used radiolabeled genistein and

bisphenol A (BPA), two EDs exhibiting estrogenic properties, to study the biotransformation

capabilities of these cell lines. Genistein (4’,5,7-trihydroxyisoflavone) an isoflavone mainly

present in soya and soy products binds more strongly to ERβ than ERα (Kuiper et al., 1997).

Properties of this phytoestrogen have been assayed in MCF7 cells (Biau et al., 2007, Breinholt

and Larsen, 1998, Gutendorf and Westendorf, 2001, Leffers et al., 2001, Maggiolini et al.,

2001, Matsumura et al., 2005) and in HepG2 cells (Chodon et al., 2007, Kim et al., 2004,

Loukovaara et al., 1995). Bisphenol A (BPA) [2,2-bis(4-hydroxyphenyl) propane] is used in

industry as a monomer for the synthesis of polycarbonate plastics and epoxy resins that are

employed to manufacture various materials that come in contact with human food, such as

plastic bottles, food containers and coatings of food and beverage cans. BPA is able to interact

with human ERα and ERβ (Hiroi et al., 1999, Kuiper et al., 1998, Kurosawa et al., 2002).

BPA endocrine disrupting properties have been assayed in MCF7 cells (Biau et al., 2007,

Buterin et al., 2006, Gutendorf and Westendorf, 2001, Leffers et al., 2001, Olea et al., 1996,

Vivacqua et al., 2003) and in HepG2 cells (Gould et al., 1998, Safe et al., 2002, Yoon et al.,

2001).

Since the sequential metabolic steps in precision-cut liver slices are similar to those

occurring in vivo (Parrish et al., 1995) and because the retention of heterogeneous cell

population and liver architecture is close to the physiological situation in vivo (Ekins et al.,

1996), precision cut liver slices are considered as the most suitable in vitro metabolism model.

We used this in vitro model to compare the biotransformation capabilities of HepG2, MCF7

and HC11 cell lines toward genistein and BPA. Our study includes kinetic data of metabolite

formation for both molecules in each cell line and in precision-cut rat liver slices.

MATERIALS AND METHODS:

CHEMICALS

109

[4-14C] genistein was purchased from Isotopchim (Ganagobie-Peyruis, France); the

specific activity was 592 MBq/mmol and the radiopurity ≥ 99%, as controlled by radio-

HPLC. [3H]-BPA, with a specific activity of 185 GBq/mmol, was purchased from Moravek

Biochemicals (Mercury Lane, Brea, CA). Its radiopurity was verified by radio-HPLC and was

greater than 99.9%. Unlabeled genistein and BPA were obtained from Sigma-Aldrich (Saint-

Quentin Fallavier, France).

[3-14C]-7-Ethoxycoumarin (7-EC) was purchased from Amersham (Buckinghamshire, UK).

Aryl sulfatase and β-glucuronidase, insulin and EGF were purchased from Sigma-Aldrich

(Saint-Quentin Fallavier, France). Williams' medium E, fetal bovine serum (FBS), L-

glutamine, gentamicine, non-essential amino acids and Na-Pyruvate were obtained from

Invitrogen (Rockville, USA), penicillin/streptomycin solution from Bio-Whittaker

(CAMBREX Company, Walkersville, USA). All chemicals, solvents, and reagents for the

preparation of buffers and HPLC eluents were in the highest grade commercially available

from Merck (Nogent-sur-Marne, France). Ultrapure water from Milli-Q system (Millipore,

Saint Quentin en Yvelines, France) was used for in vitro preparations and HPLC mobile

phases.

CELL INCUBATION

For the three cell lines, HepG2, MCF7 and HC11, 250.103 cells per well were grown at 37°C

in 95% air and 5% CO2 in 12 wells plates and 1 mL of medium per well. For MCF7 cells,

medium was made of DMEM supplemented with 10% FBS and 1% L-Glutamine. For HepG2

cells, medium was made of MEM supplemented with 10% FBS, 1% L-glutamine, 1%

penicillin/streptomycin, 1% non-essential amino acids and 1% Na-pyruvate. For HC11 cells,

medium was RPMI supplemented with 10% FBS, 1% L-glutamine, 0.5% gentamicin, 5 mg/L

insulin and 10 µg/L EGF. After 24hr, the medium was replaced by a medium containing [3H]-

BPA (9250 Bq/incubation) or [14C]-genistein (2420 Bq/incubation).

In a first experiment, three incubation times (12, 24 and 48 h) with one concentration (5 µM)

of each compound were performed in triplicate for each type of cell line. In a second

experiment, 5 concentrations (5, 10, 15, 20 & 25 µM) of each compound were incubated in

triplicate for 24 h with each type of cell line. Blank samples were carried out by incubating 5

µM radiolabeled BPA (9250 Bq/incubation) or 5 µM genistein (2420 Bq/incubation) in the

different media without cells in the conditions described above for 12, 24 and 48 h.

110

At the end of the incubations, the media were removed and stored at -20°C until analysis. The

cells were recovered using for each well 750 µL of 50 mM Tris buffer (pH 7.8) containing 10

mM EDTA and 150 mM NaCl and counted with a Malassez cell.

RAT LIVER SLICES PREPARATION AND INCUBATION

Male Wistar rats weighing about 250 g were purchased from Iffa Credo (L’arbresle,

France). Upon arrival at the animal facility, animals were allowed at least 1 week of

acclimation prior to experimentation. Animals were given free access to lab diet (UAR 210;

Villemoisson sur Orge, France) and tap water. In each experiment, the animals were killed by

cervical dislocation, followed by immediate exsanguination. Rat livers were perfused with 40

mL of ice-cold (4°C) oxygenated Krebs–Henseleit buffer to remove blood. Liver cores were

obtained using a stainless steel tube and drill press. A Krumdieck tissue slicer (Alabama

Research and Development Corp., Munford, AL) was used to produce precision-cut slices of

8 mm diameter and 0.2 mm thickness (Krumdieck et al., 1980). An equilibration period of 45

min allowed for the sloughing of damaged cells and for recovery of Ca2+ and K+ homeostasis

in the slices. The mean wet weight of slices was 20 mg, containing about 2 mg of protein.

Slices were incubated in 12-well plastic tissue culture plates (Dogterom, 1993) using DMEM

medium. The incubation volume was 1 mL. Plates were maintained at 37°C in a rotary shaker,

set at 90 rpm and saturated with a 95% O2/5% CO2 atmosphere. For each experiment,

incubations were performed using liver slices from three rats. In a first experiment, 6

incubation times (1 to 6 hr) with one concentration (100 µM) of each compound were

performed. In a second experiment, 4 concentrations (10, 50, 100 & 200 µM) of each

compound were incubated in triplicate for 4 h.

CELL AND RAT LIVER SLICES VIABILITY

7-EC was used as a probe substrate for oxidative and conjugative metabolism, to

assess the drug-metabolizing capacity of the cell lines and the rat liver slices. Control

incubations were performed in triplicate using 14C-labeled 7-EC 5 µM during 24 h for each

cell line, and 25 µM during 4 h for the rat liver slices. Biotransformation of 7-EC to 7-

hydroxycoumarin (7-HC), 7-hydroxycoumarin sulfate (7-HCS) and 7-hydroxycoumarin

glucuronide (7-HCG) was analyzed by radio-HPLC.

111

MEDIA SAMPLE PROCESSING

Aliquots (100 µL) of media samples were mixed with methanol (1:4, v/v), stirred and

stored at 0°C for 2 hours. They were then centrifuged for 5 min at 8600 g to remove the

proteins. The supernatant was evaporated to dryness under a nitrogen stream before radio-

HPLC analysis and was re-diluted in 100µL of the corresponding HPLC system mobile phase

A.

ANALYTICAL PROCEDURE

The radioactivity of each incubation medium was measured from aliquots (50µL) by

liquid scintillation counting in a Packard Tricarb 4430 counter with Ultima Gold (Packard

Instruments Co., Meriden, CT) as the scintillation cocktail. HPLC coupled to online

radioactivity detection (HP 1100 coupled to Flo-One A500 detector, with Flo-scint II as

scintillation cocktail, Packard Instruments Co., Meriden, CT) was used for metabolite

profiling.

To analyze metabolism products of BPA, the HPLC system consisted in a Zorbax C18

column (250x4 mm, 5µm) coupled to a Kromasil C18 guard precolumn (18x4.6 mm, 5 µm).

Mobile phases consisted of ammonium acetate buffer (20 mM, pH 3.5) and acetonitrile 95:5

v/v in A and 10:90 v/v in B, respectively. Flow rate was 1 mL/min at 35°C. The gradient used

was 0-4 min 100% A; 4-6 min linear gradient from 100% A to A:B 85:15 v/v; 6-16 min A:B

85:15 v/v; 16-18 min linear gradient from 15% B to 25% B; 18-28 min A:B 75:25 v/v; 28-30

min linear gradient from 25% B to 30% B; 30-37 min A:B 70:30 v/v; 37-39 min linear

gradient from 30% B to 70% B; 39-45 min A:B 30:70 v/v.

The HPLC system used to analyze metabolism products of genistein consisted in a

Ultrabase C18 column coupled to a Kromasil C18 guard precolumn (18x4.6 mm, 5 µm).

Mobile phases consisted of ammonium acetate buffer (20 mM, pH 3.5) and acetonitrile 90:10

v/v in A and 10:90 v/v in B, respectively. Flow rate was 1 mL/min at 30°C. The gradient used

was 0-5 min 100% A; 5-30 linear gradient from 100% A to 100% B; 30-35 min linear

gradient from 100% B to 100% A.

Incubations of cells and slices with [14C]-7-EC were studied by radio-HPLC as

previously described (Zalko et al., 1998).

Metabolites were identified by comparison of radio-HPLC RT with those of authentic

standards before and after enzymatic hydrolysis. When necessary, LC-MS/MS was used for

112

structure confirmation. Metabolites were quantified by integrating the area under the

radioactivity detected peaks.

IDENTIFICATION OF METABOLITES

- Enzymatic hydrolysis:

Bacterial aryl-sulfatase (Aerobacter aerogenes, type VI, Sigma) and bovine liver β-

glucuronidase (Type B-1, Sigma) were used to assess the formation of corresponding

conjugates. One UI of β-glucuronidase in 800 µL 0.2 M sodium acetate buffer adjusted to pH

5 was added to 200 µL cell medium. Aryl-sulfatase (0.8 UI in 800 µL of 0.01 M Tris buffer

adjusted to pH 7.1) was added to 200 µL cell medium. After 2 h at 37°C under gentle shaking,

hydrolysis assays were stopped by addition of methanol (1:4, v/v). The supernatant was

evaporated to dryness under a nitrogen stream and recovered in 100µL of the corresponding

HPLC system mobile phase A before analysis.

- Structure characterization:

To isolate the metabolites before identification, the HPLC system was connected to a

Gilson Model 202 fraction collector (Gilson France, Villiers-le-Bel, France).

Identification of the genistein isolated metabolites was achieved by 1H NMR and mass

spectrometry using electrospray (ESI) ionization. ESI-MS/MS experiments were carried out

on a Finnigan LCQ ion trap mass spectrometer (ThermoFisher, Les Ulis, France) equipped

with the Finnigan electrospray ionization source. Negative ionization modes were used. The

sample solutions (typically 5 ng/µl in 50:50 methanol/water) were infused at 3 µl/min into the

electrospray interface. Typical potentials applied to the ESI source were as follows: needle

(5000 V), heated transfer capillary (5-20 V) and tube lens (15-30 V). All spectra were

acquired under automatic gain control conditions. Helium was used for improving the

trapping efficiency, and as the collision gas for MS/MS experiments. 1H NMR spectra were

obtained at 300 K on a Bruker Avance DRX-600 spectrometer (Bruker, Wissembourg,

France) operating at 600.13 MHz and equipped with a 5 mm H, C, N inverse triple resonance

TXI cryoprobe attached to a cryoplatform (the preamplifier cooling unit).

One-dimensional spectra were acquired using a standard pulse sequence for 1H NMR. 16 free

induction decays (FIDs) were collected with a spectral width of 12 ppm into 64 K data points.

An exponential function equivalent to a line-broadening of 0.3 Hz was applied prior to

Fourier transformation.

113

Identification of the BPA isolated metabolites were carried out on a quadrupole ion

trap mass spectrometer (Finnigan LCQ, Thermo Fisher, Les Ulis, France) fitted with an

electrospray ionisation source operating in the negative mode. Samples (typically 1ng/µl in

MeOH-H2O (50-50, v/v)) were introduced into the ionisation source at a flow rate of 8

µl/min. Typical operating parameters used for ion production were as follows : ESI needle (-

5000 V), heated transfer capillary (- 5 V) and tube lens (+15 V). All other parameters for

MS/MS and MSn experiments (isolation width, excitation voltage, excitation time) were

adjusted in order to get maximum structural information for the compound of interest. All

analyses were achieved under automatic gain control conditions using helium as damping as

well as collision gas for MS/MS experiments.

SYNTHESIS OF STANDARD METABOLITES

Glucuronide conjugates

Genistein and BPA glucuronidation were performed by incubating 2 mg rat liver

microsomal protein with [14C] genistein (200 µM, 3.3 KBq) or [H3] BPA (200 µM, 4.5 KBq)

and UDP glucuronic acid (2.5 mM) in 1 mL 0.5 M Tris buffer (pH 7.4) containing 10 mM

MgC12 and 0.05% Triton. After 2hr under agitation at 37°C, incubations were stopped by

addition of 3 volumes of methanol, and centrifuged for 10 min at 8000g. The supernatant was

collected and stored at -20°C until analysis. Identification of genistein conjugates was as

described by Bursztyka et al. (2007). Briefly, two genistein metabolites were produced and

analyzed by mass spectrometry and 1H NMR and identified as genistein 7-O-glucuronide (RT

= 13.9 min) and genistein 4’-O-glucuronide (RT = 15.3 min). One metabolite of BPA was

identified by mass spectrometry. [M–H]– ion was detected at m/z 403. In MS2 experiments,

fragmentation of this quasi-molecular ion led to the pair of complementary fragment ions at

m/z 277 (corresponding to deprotonated BPA) and m/z 175, characteristic of a glucuronide

moiety. This metabolite was identified as BPA-glucuronide (RT = 25.2 min).

Sulfo- conjugates

Rat cytosols (2 mg of liver cytosolic protein) or guinea pig cytosols (1 mg of liver

cytosolic protein) were preincubated under agitation for 30 min at 37°C with 50 mM Tris

buffer (pH 7.5), 5 mM MgC12, 5 mM ATP and 2 mM sodium sulfate in a final volume of 1

mL. Then, [14C]-genistein (200 µM, 6 kBq) or [H3] BPA (200 µM, 4.5 KBq) were added to

114

rat or guinea pig cytosols respectively. Incubations were carried out under agitation for 2h at

37°C. Incubations were stored at -20°C until analysis. The two genistein products obtained

were identified by negative ESI-MS and 1H NMR as genistein 7-O-4’-O-disulfate (RT = 16.6

minutes) and genistein 7-O-sulfate (RT = 18.2 minutes) (Bursztyka et al., 2007). One

metabolite of BPA was identified by mass spectrometry. This metabolite gave a [M–H]–

quasi-molecular ion at m/z 243. Decomposition of this ion (in MS2 experiment) led to a

fragment ion at m/z 227 corresponding to deprotonated BPA, indicating a loss of SO3 from a

sulfate group. This metabolite was identified as a sulfate conjugate of BPA (RT = 33.5 min).

Genistein 4’-O-sulfate 7-O-glucuronide

This metabolite was recently isolated from the bile of rats dosed by gavage with [14C]-

genistein (Bursztyka et al., 2007). It was identified by negative ESI-MS and 1H NMR

spectroscopy. [M-H]- ion of this metabolite was observed at m/z 525, corresponding to a

doubly conjugated form of genistein by both sulfation and glucuronidation. This was

confirmed by the MS/MS spectrum of the m/z 525 precursor ion which displayed

characteristic fragment ions at m/z 349 (corresponding to the loss of the glucuronic acid

moiety) and m/z 269 (i.e. genistein aglycon after consecutive elimination of both glucuronide

and SO3 groups). NMR analysis also confirmed that this product was genistein 4’-O-sulfate 7-

O-β-D-glucuronide.

RESULTS:

VIABILITY OF CELL LINES AND LIVER SLICES:

Assays with 7-ECn confirmed the metabolic capabilities of HepG2 and MCF7 cell

lines. No metabolism occurred when 7-EC was incubated with HC11 cells, whereas 7-EC was

hydrodeethylated into 7-hydroxycoumarin and then conjugated to a sulfate when incubated

with HepG2 or MCF7 cells. However, 7-HC represented less than 3% of the total

radioactivity present in incubation media after 24h, while 7-hydroxycoumarin sulfate

represented about 7%, indicating a weak activity of the phase I enzymes. No 7-HCG has been

detected.

The qualitative and quantitative results obtained with incubations of 7-EC with rat

liver slices were in accordance with those reported previously in rats (Ekins et al., 1995) with

115

more than 50% of 7-EC metabolized in 4h into 7-HC, 7-HCG and 7-HCS indicating a good

metabolic capacity of rat the liver slices used.

METABOLITES OF BPA AND GENISTEIN PRODUCED BY HepG2, MCF7 and HC11

CELL LINES

Radio–HPLC analysis of the media from blank incubations (without cells) did not

reveal any degradation of BPA or genistein which could affect the quantification of the

metabolites (data not shown). A total absence of metabolites was observed when both

compounds were incubated with HC11 cells, whatever the concentration or the duration of the

incubation (fig.1) suggesting that these cell lack the ability to biotransform BPA or Genistein.

After incubation of genistein with HepG2 cells, two metabolites (RT = 13.9 and 18.2

min) were produced, whereas only one metabolite (RT = 18.2 min) was found with MCF7

cells (fig.2). No MS or NMR analysis could be undertaken due to the low amounts of

metabolites produced by the cell lines. However, the peak with a RT of 13.9 min shifted to the

RT of genistein after incubation with β-glucuronidase, whereas aryl-sulfatase also produced

the parent compound when incubated with the metabolite having a RT of 18.2 min. Moreover,

the first metabolite co-eluted with the standard genistein 7-O-glucuronide and the second

metabolite with standard genistein 7-O-sulfate. These results indicate that HepG2 cell lines

are able to produce genistein 7-O-glucuronide and genistein 7-O-sulfate from genistein,

whereas only genistein 7-O-sulfate was found in the case of MCF7 cell lines.

After incubations of BPA with HepG2 or MCF7 cells, two metabolites were produced

(RT = 25.2 and 33.5 min) (fig.2). Incubations of these metabolites with β-glucuronidase and

aryl-sulfatase and subsequent analysis by radio-HPLC suggested that the first eluted peak

corresponded to the glucuronide conjugate of BPA whereas the second peak corresponded to

the sulfoconjugate. The first metabolite co-eluted with the standard BPA-monoglucuronide,

whereas the second one co-eluted with the standard BPA-monosulfate, confirming that the

metabolite with a RT of 25.2 minutes was the BPA-glucuronide and the metabolite with a RT

of 33.5 min was the BPA-sulfate. These results demonstrate marked differences in the ability

of the tested cell-lines to biotransform genistein and BPA. Interestingly while both MCF-7

and HepG2 display a marked ability for biotransformation HC11 cells are totally devoid of

bio-transformation activity.

116

METABOLITES OF BPA AND GENISTEIN PRODUCED BY PRECISION-CUT RAT LIVER

SLICES

The profiles presented above demonstrate marked differences between cells in their ability

to transform compounds. We decided to assess and compare this bio-transformation ability

to a more in-vivo situation using rat-liver slices. We generated rat liver slices as described

and incubated them with BPA or genistein. After incubation of 10µM genistein with rat

liver slices for 4 h, 3 metabolites have been produced with RT of 11.8, 13.9 and 19.1

minutes (fig.3). The second peak shifted to the RT of the parent compound after incubation

with β-glucuronidase and co-eluted with the genistein 7-O-glucuronide standard. The first

peak (RT = 11.8 min) shifted to 19.1 min after incubation with β-glucuronidase, but no

modification of its RT occurred after incubation with aryl-sulfatase. However, it co-eluted

with genistein 4’-O-sulfate 7 -O-glucuronide standard and this structure was confirmed by

LC-MS/MS analysis. The lack of efficiency of aryl-sulfatase could be due to the steric

hindrance of the di-conjugated genistein, precluding the action of the enzyme. The third

peak (RT = 19.1 min) shifted to the RT of genistein after incubation with aryl sulfatase.

Then three metabolites of genistein produced with precision-cut rat liver slices were

identified as genistein 4’-O-sulfate 7-O-glucuronide (RT = 11.8 min), genistein 7-O-

glucuronide (RT = 13.9 min) and genistein 4’-O-sulfate (RT = 19.1 min).

Incubation of BPA with precision-cut rat liver slices resulted in the formation of two

metabolites. The major one had the same RT as BPA-glucuronide and shifted to the RT of

BPA after incubation with β-glucuronidase. Moreover, it co-eluted with BPA glucuronide

standard. The second peak shifted to the RT of BPA-glucuronide (25.2 min) after

incubation with aryl-sulfatase or to the RT of BPA-sulfate (33.5 min) after incubation with

β-glucuronidase. The negative ESI-MS analysis of this metabolite gave a weak peak at m/z

483, corresponding to BPA conjugated to both sulfate and glucuronic acid moieties. The

m/z 483 precursor ion was selected into the ion trap device and submitted to resonant

excitation in an MS/MS experiment. The m/z 483 ion mainly decomposed into a m/z 307

fragment ion, corresponding to the loss of the glucuronic acid moiety (307 = 483 - 176).

By selecting and fragmenting the m/z 307 product ion in a subsequent MS3 experiment, the

m/z 227 fragment ion was obtained as the unique product ion, thus confirming that a SO3

group was eliminated from the m/z 307 ion. Based on these data, this metabolite (RT = 27.2

min) was identified as BPA conjugated to sulfate and glucuronic acid.

117

KINETIC DATA:

The time courses of formation of [3H]-BPA or [14C]-genistein conjugates by cell lines

are shown in fig.4. HepG2 and MCF7 cells were able to metabolize both compounds over 48

h and sulfoconjugates were the major metabolites produced except when BPA was incubated

with MCF7 cells. More than 50% of genistein was conjugated after 12 h and more than 99%

after 48 h of incubation with HepG2 cells, mainly with sulfate and to a lesser extent with

glucuronic acid. Conjugation occurred to a lesser extent in MCF7 cell lines since between 5

and 7% of genistein was conjugated to sulfate after 12 h and less than 48% after 48 h

incubation. With this cell line, the only metabolite produced was genistein 7-O-sulfate, even

after an incubation period of 48 h. After 48 h incubation with HepG2 cells, all BPA was

conjugated, BPA-sulfate representing between 80.5% and 83.8% of the radioactivity present

in the medium and BPA-glucuronide accounting for less than 19 %. By contrast, the major

metabolite of BPA produced by MCF7 cells was BPA-glucuronide, this metabolite amounting

to approximately 17% of the radioactivity present in the medium after 48 h, whereas only

traces of BPA-sulfate was formed.

After incubation with rat liver slices, BPA (100 µM) and genistein (100 µM) were

mostly conjugated to glucuronic acid (fig.5). BPA-glucuronide represented 81 to 84% of the

total radioactivity after 3 h, whereas BPA-glucuronosulfate represented 4 to 10% of the total

radioactivity. Genistein 7-O-glucuronide was the major metabolite produced by rat liver

slices. It represented more than 10% of the total radioactivity after 1 h of incubation, and 32 to

42% after 4 h. Genistein 4’-O-sulfate represented between 3 and 4% of the total radioactivity

while genistein 4’-O-sulfate, 7-O-glucuronide accounted for approximately 2% after 4 h

incubations.

The formation rates of genistein and BPA metabolites in cell lines and in rat liver

slices are shown in fig.6. Conjugation of BPA to sulfate was linear up to 25 µM in both cell

lines. BPA glucuronide formation and BPA sulfoglucuronide formation by rat liver slices

were linear up to 200µM. The production rate of BPA sulfoglucuronide was 0.74 ± 0.39

nmol/mg of protein/hr in rat liver slices at the highest concentration incubated (data not

shown), which is about 33 fold less than BPA glucuronide formation (24.9 ± 1.96 nmol/mg of

protein/hr). BPA conjugation to glucuronic acid in MCF7 and HepG2 cell lines demonstrated

saturation kinetics. Apparent Vmax of BPA conjugation to glucuronic acid was about 5 fold

118

higher in HepG2 than in MCF7 cells (table 1). Genistein conjugation reactions demonstrated

saturation kinetics. In MCF7 cells, apparent Vmax for 7-O-Sulfate genistein production was

reached from the lowest concentration incubated (Apparent Vmax = 0.048±0.007 nmol h-1 per

million of cells). Based on apparent Vmax calculation, conjugates of both compounds to

glucuronic acid and to sulfate were produced at a much higher rate in HepG2 cells than in

MCF7 cells (table 1).

DISCUSSION:

Very limited information is available about the intrinsic metabolising potential of cell

systems traditionally used to detect EDs. OECD has recommended to obtain this information

as quickly as possible since it is of critical importance for the interpretation of in vitro testing

(OECD, 2006). Indeed, depending on the cell-line and on the tested compound, false positive

data results can be due to a lack of detoxification or false negative data can be due to a lack of

bioactivation (Gray et al., 2002).

Biotransformation studies of genistein and BPA using rat liver slices showed that for

both molecules, conjugation with glucuronic acid is the main detoxification pathway.

Although the results obtained with 7-EC as a reference substrate indicate that phase I enzymes

are active in this system, no hydroxylation of genistein or BPA occurred, regardless of the

substrate concentration or of the duration of the incubations. This is in agreement with the

results obtained by Coldham et al. (1999), and Pfeiffer and Metzler (2004) using rat liver

slices. Similarly, neither the hydroxylation of BPA nor that of genistein were observed when

these molecules were incubated with HepG2 or MCF7 despite the fact that these cell lines

were shown to be able to metabolize 7-EC. In fact, CYP1A1 and CYP1B1, the isoforms

predominantly involved in the production of hydroxylated genistein (Roberts-Kirchhoff et al.,

1999), are not expressed in MCF7 cells without prior induction with 2,3,7,8-

tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) (Spink et al., 1998). Likewise, expression and activity of

phase I enzymes are extremely low even in HepG2 cell line (Westerink and Schoonen, 2007a,

Wilkening and Bader, 2003). The use of radiolabelled compounds, which allow a very good

sensibility for minor metabolites detection, confirm that none of the necessary cytochromes

involved in BPA or genistein biotransformation is expressed at a sufficient level to produce

detectable hydroxylated metabolites.

HepG2 and MCF7 cells express the glucuronosyl- and sulfo-transferase activities

involved in the metabolism of both molecules. In contrast, HC11 cells did not show any

119

biotransformation capability. The higher sulfation rate we observed for both compounds using

HepG2 cell line, compared to the glucuronidation rate, is in good agreement with already

published data (Hewitt and Hewitt, 2004, Loukovaara et al., 1995, Westerink and Schoonen,

2007b). In our experimental conditions, the conjugation of genistein to glucuronic acid did not

occur in MCF7 cell lines, genistein 7-O-sulfate being the only metabolite produced. Spink et

al. (2000) also showed that MCF-7 cells were able to conjugate 2-methoxy-estradiol with

sulfuric acid, whereas no glucuro-conjugation of this steroid with glucuronic acid was

observed. However, the expression of some UGT2B (UGT2B15, 2B17 & 2B10) has been

demonstrated in this cell line (Harrington et al., 2006), explaining the formation of BPA

glucuronide. Sulfo- and glucurono-conjugations are generally considered as detoxification

pathways. Kinjo et al. (2004) demonstrated that sulfo- and/or glucurono-conjugates of

genistein loose most of the estrogenic activity of genistein and Snyder et al. (2000) and

Matthews et al. (2001) demonstrated that BPA-glucuronide produces no activation of ERα or

ERβ, while BPA sulfate shows no estrogenicity up to 1 mM (Shimizu et al., 2002).

The absence of metabolism in HC11 cells could give rise to false positive data (due to

lack of detoxification) or negative data (lack of activation when biotransformation is an

absolute prerequisite to endocrine disrupting effects). In the case of BPA and genistein for

which metabolism is mainly considered as a detoxification process, it can be predicted that the

endocrine disrupting activity obtained with HC11 cells would be overestimated compared to

other cell lines able to conduct phase II metabolism. In contrast, the results obtained with

HepG2, and to a lesser extent by MCF7 cell lines could be underestimated, due to the

efficiency of conjugation processes in these systems.

A major point regarding in vitro testing of EDs with respect to the metabolic

competence of these systems is that we need to ascertain that the in vitro system has a

metabolising capacity that is representative for the in vivo situation (OECD, 2006). Our

results indicate that this ideal situation cannot be reached by MCF7 and HepG2 cell lines

since important qualitative and quantitative differences are observed in the metabolic pattern

of genistein and BPA in these systems as compared to in vivo results (Coldham et al., 1999,

Fang et al., 2002, Zalko et al., 2003). In vitro systems capable to mimic in vivo metabolism

are scarce and for some EDs, even efficient models such as precision-cut liver slices produce

only a small number of the metabolites described in vivo. This is the case for BPA and

genistein for which neither the investigated cell lines nor the liver slices were able to form

phase I metabolites.

120

Several authors tried to implement systems used for testing EDs by using S9 fractions

in combination with the assay. For example, the estrogenic activities of methoxychlor and

trans-stilbene can be enhanced using a recombinant reporter-gene assay in stably transfected

MCF7 and HeLa cells in the presence of the rat liver S9 mix (Sumida et al., 2001). There is

also evidence for the activation of some of 13 bisphenol A-related chemicals by S9 in a yeast

hybrid assay (Hashimoto et al., 2001). Yoshihara et al. (2001, 2004) used a yeast hybrid assay

and a mammalian cell system (the MCF-7 cell line) to demonstrate that liver S9 fractions of

several animal species, including human, were able to enhance the estrogenicity of BPA,

through a metabolite identified as 4-methyl-2,4-bis(phydroxyphenyl)pent-1-ene. These

authors showed that the activating effects of S9 were due to CYP activity although neither

cytosol nor microsomes alone were able to activate the chemical. However, analysis of data

obtained with exogenous metabolising systems needs to be done with caution. Some

estrogenic compounds like 4-tert-octylphenol, 4-nonylphenol and 17β-estradiol are

inactivated when metabolising systems are added and the use of S9 fractions in combination

with an assay for endocrine disruption testing may have a number of shortcomings like the

production of active compounds that does not exist or that are produced in lower rates in vivo

(Yoshihara et al., 2001).

To conclude, the interpretation of the results obtained with MCF7 and HepG2 cell

lines in ED testing should take into account the metabolic capabilities of these systems. False

negative results could be avoided for compounds necessitating a bioactivation step, but also

false positive, or at least underestimation of the observed activity, when xenobiotics are

directly conjugated by phase II enzymes without prior phase I reaction, like BPA and

genistein. It may be worthwhile to identify substances that are EDs per se, without any

prerequisite bioactivation. In that case, the use of HC11 cells could be appropriate and will

identify EDs which do not need prerequisite bioactivation. By comparison, the concomitant

use of cell lines expressing metabolizing enzymes such as HepG2 would provide information

on compounds undergoing a detoxification process and, in a limited extent, for bioactivated

EDs.

ACKNOWLEDGMENTS

This study has been partly supported by the European Union network CASCADE (FOOD-

CT-2003-506319). We thank Laurence Gamet-Payrastre for preliminary experiments on

121

MCF7 cells, Cécile Canlet for 1H NMR analysis, and Florence Blas y Estrada and Raymond

Gazel for animal care.

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126

Table 1: Apparent Vmax of genistein and BPA biotransformation by HepG2 and MCF7 cell

lines and by rat liver slices (nmol/106 cells/hr and nmol/mg of protein/hr respectively). * =

linear kinetic up to the highest concentration incubated.

Vmax

MCF7 HepG2 Rat liver slices

7-O-G genistein 0.17±0.01 7.01±1.19

7-O-S genistein 0.048±0.007 1.09±0.22

4’-O-S genistein 0.64±0.08

BPA-G 0.098±0.021 0.48±0.06 * BPA-S * *

127

Fig.1: Typical radio-HPLC metabolic profile obtained from incubation of 5 µM [14C]-genistein and 5µM [3H]-BPA with mouse HC11 cell line (incubation time 48h).

Genistein

0 5 10 15 20 25 30 35 0

1000

2000

3000

4000

time [min]

dpm

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

time [min]

dpm BPA

128

Fig.2: Typical radio-HPLC metabolic profile obtained from incubation of 5µM [3H]-BPA and

5µM [14C]-genistein with human HepG2 hepatoma cell line (incubation time 12h) and human

MCF7 cancer cell line (incubation time 48h).

BPA

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0

1000

2000

3000

4000 dpm

time [min]

HepG2 BPA

BPA-G

BPA-S

MCF7 BPA

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

time [min]

dpm

BPA

BPA-G BPA-S

35 0 5 10 15 20 25 30 0

1000

2000

3000

time [min]

dpm GEN-7-O-S

GEN

GEN-7-O-G

HepG2 genistein

0 5 10 15 20 25 30 35 0

500

1000

1500

2000

time [min]

dpm

GEN-7-O-S

GEN

MCF7 genistein

129

Fig.3: Typical radio-HPLC metabolic profile obtained from incubation of 10 µM [14C]-

genistein and 10 µM [3H]-BPA with rat liver slices (incubation time 4h).

slice BPA

0 5 10 15 20 25 30 35 0

500

1000

1500

2000

2500

time [min]

dpm

0 10 20 30 40 50 0

1000

2000

3000

4000

5000

time [min]

dpm slice genistein

BPA-G

S-BPA-G

BPA

GEN-7-O-G

GEN-4’-O-S 7-O-G

GEN-4’-O-S

GEN

130

Fig.4: Time course of genistein and BPA conjugation in HepG2 and MCF-7 cell lines (5 µM

[14C]-genistein or [3H]-BPA). Data are mean ± SD from three incubations.

HepG2 genistein

12 24 48 0

5

10

15

20

time [h]

nmol

con

juga

te/1

06 c

ells

HepG2 BPA

12 24 48 0

1

2

3

4

5

6

7

sulfate Glucuronide

time [h]

nmol

con

juga

te/1

06 c

ells

MCF7 genistein

12 24 48 0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

time [h]

nmol

con

juga

te/1

06 c

ells

MCF7 BPA

12 24 48 0

0.5

1.0

1.5

time [h]

nmol

con

juga

te/1

06 c

ells

131

Fig.5: Time course of genistein and BPA conjugation in rat liver slices (100 µM [14C]-

genistein or [3H]-BPA). Data are mean ± SD from three incubations.

slice BPA

1 2 3 4 5 6 0

10

20

30

40

50

60

time [h]

nmol

/mg

prot

ein

slice genistein

1 2 3 4 5 6 0

5

10

15

20

25

30

35

(7-O-glucu)

(4'-O-sulfate)

time [h]

nmol

/mg

prot

ein

glucuronide

132

Fig.6: Michaelis-Menten plot of BPA and genistein conjugation to glucuronic acid (squares)

and sulfate (triangles) by HepG2 and MCF-7 cell lines, and rat liver slices. Values are mean ±

SD from three incubations.

0 5 10 15 20 25 0

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

genistein [µM]

HepG2 genistein

5 10 20 25 0 5 10 15 20 25 0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

5 10 20 25 BPA [µM ]

nmol

con

juga

te/1

06 c

ell/h

r

nmol

con

juga

te/1

06 c

ell/h

r

HepG2 BPA

(7-O-glucu)

(7'-O-sulfate)

MCF7 genistein

0 5 10 15 20 25 0

25

50

75

genistein [µM]

pmol

con

juga

te/1

06 c

ells

/hr

(7'-O-sulfate)

BPA [µM]

pmol

con

juga

te/1

06 c

ells

/hr

100

75

50

25

0

slice BPA

0 50 100 150 200 0

5

10

15

20

25

30

BPA [µM]

slice genistein

0 50 100 150 200 0

1

2

3

4

5

6

7

genistein [µM] nmol

con

juga

te/m

g pr

ot./h

r

0 50 100 0

1

2

3

4

5

6

7

(7-O-glucu)

(4'-O-sulfate)

nmol

con

juga

te/m

g pr

ot./h

r

MCF7 BPA

0 5 10 15 20 25

133

Expérimentations complémentaires

Capacités métaboliques des lignées cellulaires vis-à-vis de la vinchlozoline

La biotransformations de la vinchlozoline nécessitait obligatoirement une étape

d’oxydation du groupement vinyl préalable à toute biotransformation de phase II. Sans cette

étape de phase I du métabolisme, les produits de dégradation de la vinchlozoline que sont M1

et M2 ne sont pas inactivés.

Nous avons donc décidé d’étudier le devenir de la vinchlozoline incubée avec les

cellules HepG2, MCF7 et HC11.

Le protocole employé est similaire à celui décrit dans l’article 3. Brièvement, les

cellules ont été mises en culture à raison de 250.103 cellules par puits, dans des plaques de 12

puits, 24 hr avant le début des expérimentations. Après 24 hr, le milieu de culture a été

remplacé par du milieu contenant la [14C]-vinchlozoline (3000 Bq/mL). Toutes les

incubations ont été réalisées en triplicat. Une première expérience a consisté à incuber 5 µM

de vinchlozoline pendant 12, 24 et 48 hr. Une seconde expérience a été réalisée en incubant

pendant 24 hr 5, 10, 15, 20 et 25 µM de vinchlozoline. La 7-éthoxycoumarine a été utilisée

comme substrat de contrôle afin de déterminer les capacités métaboliques des cellules. Des

incubations sans cellules ont été réalisées afin de mesurer l’hydrolyse de la vinchlozoline (5

µM) en M1 et M2 et la stabilité de ces produits de dégradation antiandrogéniques pendant 12,

24 et 48 hr. Les méthodes analytiques sont identiques à celles décrites dans l’article 2.

En l’absence de cellules, la vinchlozoline a été complètement hydrolysée de façon

égale en M1 et M2, dès 12 heures d’incubations, quel que soit le milieu de culture considéré.

Des pics minoritaires, plus polaires, ont été observés avec des temps de rétention de 43,5

minutes, 46 minutes, 51,2 minutes et 53,1 minutes (fig.1). L’identité de ces composés n’a pu

être déterminée. Après incubation en présence de cellules MCF7 ou HC11, les profils radio-

CLHP étaient tout à fait identiques, aucune biotransformation ni de phase I ni de phase II

n’ayant eu lieu. Néanmoins, après incubation de la vinchlozoline en présence des cellules

HepG2, un pic minoritaire supplémentaire a été détecté. Son temps de rétention (56,2

minutes) correspond à celui de la dichloroaniline standard (article 3).

134

Fig.1 : profiles radio-CLHP typiques après 12 hr d’incubation de la vinchlozoline (5µM) dans

les milieux de culture des cellules HepG2, MCF7 et HC11 seuls ou en présence de cellules

MCF7 ou HC11 (A) et après 12 hr en présence de cellules HepG2 (B).

A

0 10 20 30 40 50 60 0

500

1000

1500

2000

temps [min]

dpm

M1 M2

0 10 20 30 40 50 60 0

1000

1500

2000

time [min]

M1

M3

B dpm

500

M2

135

2 Discussion

Les lignées cellulaires HepG2 et MCF7, comme les tranches de foie, se sont montrées

capables de métaboliser la 7-éthoxycoumarine en 7-hydroycoumarine et en ses conjugués à

l’acide sulfurique ou glucuronique indiquant leur aptitude à réaliser certaines étapes de phase

I et de phase II du métabolisme. Néanmoins, que ce soit avec les lignées cellulaires ou les

tranches de foie, aucun métabolite de phase I du BPA ou de la génistéine n’a été décelé en

radio-CLHP, quelle que soit la concentration en substrat ou la durée d’incubation. Les

incubations du BPA ou de la génistéine en présence de tranches de foie de rat ont donné des

conjugués à l’acide glucuronique majoritaires tandis que les incubations réalisées en présence

des cellules HepG2 ou MCF7 ont donné des métabolites majoritairement conjugués à l’acide

sulfurique. Au contraire, les cellules HC11 n’ont montré aucune capacité de

biotransformation.

Cette absence complète de biotransformation dans les cellules HC11 peut être la

source de résultats faussement positifs si la molécule testée est intrinsèquement active, ou au

contraire source de résultats faussement négatifs si la molécule testée doit être bioactivée

lorsque cette étape est un prérequis indispensable à toute activité perturbatrice endocrinienne.

Ainsi pour le BPA et la génistéine, molécules dont le métabolisme est essentiellement

considéré comme un processus de détoxification (Kinjo et al., 2004, Matthews et al., 2001,

Shimizu et al., 2002, Snyder et al., 2000), il peut être prédit que l’activité perturbatrice

endocrinienne observée avec les cellules HC11 serait surestimée comparée à celle observée

avec d’autres lignées cellulaires disposant d’un équipement enzymatique permettant la

conjugaison de ces substrats. Au contraire, les résultats obtenus avec les cellules HepG2 ou

MCF7 peuvent sous-estimer l’activité intrinsèque des molécules testées si celles-ci peuvent

être directement prises en charge par les enzymes de phase II exprimées par ces cellules (à

l’instar du BPA et la génistéine). Si le composé testé est actif et ne peut être pris en charge par

les enzymes de phase II exprimés par les cellules MCF7 et HepG2, l’activité mesurée sera

similaire à celle obtenue avec les cellules HC11, et probablement surestimée par rapport à ce

qui est observé in vivo. Enfin, si la molécule testée doit être activée via une étape de phase I

du métabolisme, les cellules HepG2 et MCF7 donneront un résultat faussement négatif,

comme les cellules HC11.

136

137

CONCLUSION

138

139

Un des objectifs de ce travail était de parfaire les connaissances en matière de

métabolisme des trois substances retenues dans ce projet. Les données de la littérature, tant in

vivo qu’in vitro, ayant été jugées suffisantes pour le bisphénol A, nos efforts ont

principalement porté sur la génistéine et la vinchlozoline. Dans tous les cas, nous avons

disposé de molécules radio-marquées.

Concernant la génistéine, nous nous sommes attachés à déterminer les voies de

biotransformation de ce phytoestrogène chez l’homme en privilégiant l’utilisation

d’hépatocytes et de microsomes de foie. Parallèlement, afin de disposer d’éléments de

comparaison avec les rongeurs, le même type d’étude a été effectué chez le rat. Si les résultats

obtenus chez l’Homme confirment les voies métaboliques précédemment décrites chez les

rongeurs, les analyses quantitatives indiquent que les voies de bio-activation, c’est à dire

celles qui conduisent à des métabolites susceptibles d’endommager les macromolécules

endogènes en formant des adduits, ou encore capables de réagir avec les récepteurs aux

estrogènes, sont davantage exprimés chez l’Homme. Ces données qui ressortent

principalement des travaux menés à partir de microsomes hépatiques posent le problème de

l’extrapolation de l’animal à l’Homme. Elles indiquent que le risque associé à la

consommation de génistéine chez l’Homme pourrait être plus important que celui que laissent

supposer ces expérimentations menées chez le rat.

Pour la vinchlozoline, les résultats originaux qui ont été obtenus à la fois in vivo et in vitro

mettent en évidence plusieurs voies métaboliques de ce fongicide. Ils confirment la formation

de deux produits d’hydrolyse, M1 et M2, dont les propriétés anti-androgéniques ont été

décrites à de nombreuses reprises. Ils démontrent également que le composé majoritairement

formé est un dérivé dihydroxylé (M5) dont l’activité biologique reste à déterminer,

notamment en matière d’interaction avec les récepteurs nucléaires. En effet, s’il semble que ce

métabolite soit peu ou pas impliqué dans le caractère anti-androgénique de la vinchlozoline,

son activité vis-à-vis d’autres récepteurs nucléaires pourrait être non négligeable, comme cela

a été récemment montré pour M1 et M2 (Molina-Molina et al., 2006). En revanche, M2,

connu pour être le plus actif en matière d’anti-androgénicité avec un Ki de 9,7 µM (Kelce et

al., 1997), est en fait un métabolite très minoritaire. Il est peu probable qu’il atteigne des

concentrations proches de son Ki in vivo, du moins chez le rat. M1, bien que moins

antiandrogénique avec un Ki de 92 µM, risque davantage d’atteindre des concentrations

proches de son Ki et d’entrainer une perturbation endocrinienne.

140

Enfin, les profils métaboliques réalisés à partir de tranches de foie de rat montrent la

formation de dichloroaniline. Ce composé génotoxique est cependant produit en quantité très

limitée par rapport aux autres métabolites.

Les études réalisées ont également permis d’étabolir des comparaisons in vivo-in vitro. Parmi

les modèles in vitro utilisés figurent les microsomes hépatiques, les hépatocyte en culture

primaire et les tranches de foie de rat. Ce dernier modèle a été privilégié en raison de sa

facilité d’utilisation et de sa représentativité de l’animal entier en matière de métabolisme.

S’agissant de la vinchlozoline, les principaux métabolites observés in vivo chez le rat dans nos

expérimentations ou d’après la littérature, ont été retrouvés in vitro après incubation avec des

tranches de foie de rat. Les métabolites majoritaires formés sont issus de l’oxydation de la

fonction vinyle de la vinchlozoline ou de son produit de dégradation M2, puis d’une

conjugaison à l’acide glucuronique sur les fonctions alcool formées. Dans nos conditions

expérimentales, l’ensemble des métabolites ainsi obtenus représente près de 61 % de la

radioactivité totale incubée avec les tranches de foie, tandis qu’M1 représente environ 12 %

de la radioactivité totale en moyenne. Une situation tout à fait similaire a été observée pour les

profils urinaires de rats ayant reçu par gavage une dose unique de 14C-vinchlozoline.

De même, les principaux métabolites obtenus après incubation du BPA ou de la génistéine en

présence des tranches de foie étaient les mêmes que ceux rapportés par la littérature in vivo

chez le rat ou chez l’Homme. Il s’agit du BPA conjugué à l’acide glucuronique et de la

génistéine conjuguée à l’acide glucuronique en position 7 ainsi que la génistéine conjuguée à

la fois à l’acide glucuronique en position 7 et à l’acide sulfurique en position 4’. Les

métabolites majoritaires de la génistéine étaient également produits par les hépatocytes

cryopréservés de rat et ceux d’Homme.

Néanmoins, par rapport aux observations faites in vivo, les métabolites issus des étapes de

phase I étaient soit absents (BPA ou génistéine) soit moins variés (vinchlozoline), malgré

l’expression des enzymes de phase I dont l’activité a été contrôlée par la biotransformation de

la 7-éthoxycoumarine en 7-hydroxycoumarine.

Le second objectif de ce travail a été la caractérisation des capacités de

biotransformation des lignées cellulaires utilisées dans l’étude des perturbateurs endocriniens.

Les lignées cellulaires MCF-7 et HepG2 ont montré une activité des enzymes de phase I bien

plus faible encore que celle des tranches de foie, insuffisante pour nous permettre de détecter

la production d’éventuels métabolites hydroxylés du BPA ou de la génistéine. Néanmoins, ces

141

deux lignées cellulaires expriment les enzymes de phase II impliquées dans la conjugaison du

BPA et de la génistéine à l’acide sulfurique et dans une moindre mesure à l’acide

glucuronique. La vinchlozoline est entièrement dégradée en M1 et M2 dès 12 hr. Ces deux

produits antiandrogéniques ne subissent aucune biotransformation ni par les cellules MCF-7,

ni par les cellules HepG2, du fait de leur incapacité à procéder à l’étape d’oxydation du

groupement vinyl préalable à toute conjugaison ultérieure. Enfin, l’activité enzymatique de

phase I ou de phase II des cellules HC11 était nulle quelque soit le substrat employé.

L’absence pratiquement complète de biotransformation par les enzymes de phase I quelque

soit la lignée cellulaire utilisée peut entraîner dans certains cas soit une sous estimation, soit

au contraire une surestimation de l’activité perturbatrice endocrinienne de la molécule testée.

En effet, si la molécule testée doit être bioactivée par une étape de phase I, les lignées

cellulaires ne permettront le plus souvent pas de détecter cette activité. Au contraire, si une

molécule donnée est active avant toute biotransformation et qu’une étape de phase I est

nécessaire avant que toute étape de phase II puisse avoir lieu, l’activité observée ne prendra

pas en compte sa potentielle inactivation et sera ainsi surestimée.

Tout métabolisme n’est pas absent des lignées cellulaires telles que les lignées HepG2 et

MCF7, où les sulfotransférases et dans une moindre mesure les glucuronotransférases

impliquées dans la conjugaison de la génistéine et du BPA étaient exprimées. Ces

biotransformations mènent habituellement à des métabolites moins actifs, sinon inactifs, et

risquent donc d’induire une sous évaluation de l’activité de la molécule testée si l’étendue de

cette inactivation n’est pas prise en compte dans l’analyse des résultats.

Certains tests sont réalisés à l’aide d’un système constitué d’une lignée cellulaire, telles les

cellules HepG2, cotransfectée avec les plasmides contenant le gène d’un récepteur nucléaire

et un gène rapporteur (Maness et al, 1998, Gaido et al. 2000, Simon et al., 2006, Zhang et al.,

2007). Ces cellules HepG2 peuvent ainsi être cotransfectées transitoirement avec l’hAR et les

gènes de la luciférase ou de la β-galactosidase, et constituer un système permettant d’évaluer

l’activité (anti)androgénique des molécules testées. Le test andiandrogénique consiste à

mesurer l’activités luciférase et β-galactosidase en présence de dihydroxytestostérone

(molécule androgénique de référence) associée ou non à la molécule testée. Or si les

cinétiques de biotransformation de la molécule de référence sont toujours identiques pour une

lignée cellulaire et des conditions de culture données, les molécules testées peuvent être

différemment métabolisées en fonction de leur structure chimique sans que ces différences

d’activation ou d’inactivation soient représentatives de ce qui est observé in vivo. En

142

l’absence de données sur le devenir des molécules testées, les résultats observés sont donc

difficilement interprétables, puisqu’ils peuvent aussi bien sous estimer que surestimer

l’activité que pourra avoir la molécule in vivo en fonction des capacités de la lignée cellulaire

à la métaboliser.

Néanmoins, certaines cellules n’expriment pas les enzymes impliquées dans la

biotransformation des xénobiotiques. C’est le cas par exemple des cellules HC11. Ces cellules

semblent idéales pour tester l’activité intrinsèque des molécules. Le risque principal lors de

l’emploi de ces cellules est d’obtenir un résultat faussement négatif et de ne pas détecter

l’activité potentielle d’une molécule qui doit être activée lors de sa biotransformation. Pour

résoudre l’insuffisance métabolique des modèles cellulaires couramment utilisés, en

particulier concernant les enzymes de phase I, principalement impliquées dans les

phénomènes de bioactivation, plusieurs auteurs ont proposé d’inclure à ces tests un système

métabolique exogène tel que des fractions S9 de foie de rat (Sumida et al., 2001, Hashimoto et

al., 2001), ou encore de singe et d’homme (Yoshihara et al., 2001, 2004). Cependant, ce

système présente quelques inconvénients, tels que la production en excès de métabolites

normalement minoritaires ou même absents in vivo, ou encore l’inactivation de perturbateurs

endocriniens reconnus, voire d’hormones endogènes comme le 17β-estradiol (Yoshihara et

al., 2001). Le risque de lisaison non spécifique des molécules testées aux protéines de la

fraction enzymatique ainsi que la cytotoxicité de ces fractions vis-à-vis des cellules sont

également à prendre en compte. Enfin, les résultats obtenus en associant les cellules à

l’emploi de fractions S9 sont trop peu reproductibles (OECD, 2006).

D’autres solutions peuvent être envisagées, comme le développement de lignées cellulaires

génétiquement modifiées pour exprimer les enzymes impliquées dans les voies de

biotransformation des xénobiotiques. Là encore, certains problèmes techniques peuvent

apparaitre. En particulier, le nombre de CYP pouvant être incorporé dans une lignée cellulaire

est limité (OECD, 2006). Il peut également être envisagé d’induire l’expression d’enzymes du

métabolisme de façon spécifique avant de réaliser les tests choisis, mais toutes les enzymes ne

sont pas inductibles au sein d’une lignée cellulaire comme les HepG2 (Westerink et

Schoonen, 2007).

Des systèmes dits in silico sont également en cours de développement. Ces systèmes sont des

logiciels utilisant les ressources informatiques afin de calculer et prédire, pour une molécule

donnée, les métabolites susceptibles d’être formés, les enzymes impliquées dans ces voies

métaboliques, et la toxicité liée à ces métabolites ou à leur production (Cronin, 2001). Par

exemple, MetabolExpert, développé et commercialisés par CompuDrug Chemistry Ltd

143

(USA), permet de faire des prédictions qualitatives sur l’identité des métabolites formés et des

enzymes impliquées dans ces réactions de biotransformation. Un logiciel complémentaire,

HazardExpert, permet de prédire un certain nombre d’effets toxiques, en prenant en compte

des facteurs comme l’espèce, la dose, la voie et la durée d’exposition. En associant

HazardExpert et MetabolExpert, il est possible d’obtenir des prédictions de la toxicité du

composé parent et de ses métabolites potentiels. Dans l’immédiat, l’inconvénient principal de

ces systèmes in silico est dû à l’absence de prédiction de la toxicité liée à la perturbation

endocrinienne. En outre, ces systèmes de prédiction des voies de biotransformation n’ont pour

objectif que d’indiquer les métabolites principaux susceptibles d’être observés in vivo.

En termes de prolongement et de perspectives de ce travail, plusieurs points méritent d’être

mentionnés :

- Les principales voies de biotransformation de la vinchlozolines ont été établies in vivo à

partir l’urine de rat et in vitro à l’aide de tranches de foie de rat, mais certains métabolites

minoritaires restent à identifier. Par ailleurs, la pertinence de ces voies pour l’Homme

mériterait d’être étudiée en utilisant des systèmes biologiques tels que les microsomes ou les

hépatocytes d’origine humaine.

- De manière plus générale, les biotransformations des composés testés pour leur activité de

perturbation endocrinienne méritent d’être davantage prises en compte. C’est une étape

décisive au développement de méthodes alternatives aux approches Iin vivoI mais également

une nécessité en matière d’interprétations des données obtenues. Cette prise en compte peut

éventuellement se faire à l’aide de systèmes de biotransformation exogènes, tels que S9 ou

microsomes, voire la modification génétique des cellules utilisées pour les tests afin de leur

permettre d’exprimer les enzymes impliquées dans les voies de biotransformation des

perturbateurs endocriniens. Dans tous les cas, ces alternatives nécessitent davantage de mises

au point méthodologique et de données expérimentales.

- Les cellules HC11 se révèlent un modèle potentiellement intéressant pour l’étude des

molécules estrogéniques. En effet, elles permettent d’évaluer l’activité estrogénique

intrinsèque des xénobiotiques, voire de leurs métabolites isolés, ceux-ci ne subissant aucune

biotransformation pendant la durée de leur incubation. Leur emploi associé à des études

parallèles avec des cellules exprimant certaines enzymes de phase II, telles les cellules MCF7

ou HepG2, permettrait de mesurer l’influence des biotransformation de phase II. Afin de

diminuer les risques de fausses interprétations, il demeure essentiel de caractériser l’activité

144

enzymatique des cellules employées, une même lignée pouvant montrer une variation

d’activité marquée entre les souches (Hewitt et Hewitt, 2004).

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Métabolisme du bisphénol A, de la vinchlozoline et de la ... · J’ai également été accueilli chaleureusement à Stockholm, dans l’équipe de Ingemar Pongratz et Katarina