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Muriel PerronBât. 445
Cours Master 2Octobre 2006
Les cellules souchesneurales
http://www.umr8080.u-psud.fr/coursBD.html
Les cellules souches: généralités
Les cellules souches neurales
Les cellules souches de la rétine
La signalisation moléculaire
Plan du cours
Qu’est-ce qu’une cellule souche?
Une cellule souche a la capacité unique de:
s’auto-renouveler indéfiniment ou de manière prolongée
produire différentes cellules spécialisées (différenciées)
La division d’une cellule souche est asymétrique - les cellules filles ne sont pas identiques, et seule une des deux est identique à la cellule mère
Divisions asymétriques
Qu’entend-on par auto-renouvellement?
Où trouve-t-on des cellules souches?
Les cellules souches embryonnaires
• dérivent de la masse interne du blatocyste (embryon de 4-5 jours)
Les cellules souches adultes
• dérivent de tissues adultes
Les cellules souches embryonnaires ou cellules ES
Pluripotentespotentiel de
produire tous les types cellulaires
(plus de 200 différents types de cellules)
Multipotentes
Les cellules souches adultes
Les cellules souches EMBRYONNAIRESEMBRYONNAIRES produisent des progéniteurs qui, à leur tour, se différentient en cellules spécialisées créant tissus et organes
Les cellules souches ADULTESADULTES participent au renouvellement et à la réparation des tissus adultes
Rôle des cellules souches?
Plasticité innatendue des cellules souches adultes
Le dogme voulait que chaque organe héberge les cellules souches spécialisées qui lui sont propres.
Or selon les conditions de culture, ou dans des expériences de transplantations cellulaires, des cellules souches adultes peuvent se différencier en cellules d’un tissu dont elles ne proviennent pas
• rescue lethally irradiated mice.
Les cellules souches de la moelle osseuse peuvent se différencier en cellules nerveuses, du foie, du muscle cardiaque, du muscle squeletique…
Plasticité innatendue des cellules souches adultes
Remise en question de la plasticité des cellules souches adultes
• Dans certains cas des chercheurs ont suspecté des phénomènes de fusion cellulaire qui pourraient être responsables d’une partie de ces observations de plasticité des cellules souches.
• Mais la fusion cellulaire est un évênement rare qui ne permet sans doute pas d’expliquer toutes les observations de “transdifférenciation”.
Environnement stable pour les cellules
souches
Les niches sont des ensembles de tissus et de matrices extracellulaires qui peuvent indéfiniment héberger des cellules souches et contrôler leur auto-renouvellement et leur production cellulaire in vivo.
Concept de niches
Potentiel médical des cellules souches
• Les cellules souches pourraient un jour remplacer les cellules endommagées dans le corps.
Médecine régénérative
Specific Tissues can be grown from Stem
cells under special conditions
• Aujourd’hui : lymphome, leucémie.
• Demain? Parkinson, maladies cardiaques, diabète…
Potentiel médical des cellules souches
Sources de cellules souches embryonnaires
• Embryons excédentaires provenant de cliniques de fécondation in vitro (FIV)
• Embryons créés à des fins de recherche par FIV• Lignées de cellules souches embryonnaires
existantes• Transfert de noyau d’une cellule somatique
Il est possible de produire des cellules souches embryonnaires à partir d’une cellule somatique adulte par transfert de noyau; le noyau d’une cellule adulte est ainsi fusionné avec un ovule dont on a retiré le noyau.
Transfert de noyau d’une cellule somatique
• Le clonage thérapeutique a pour but de récolter des cellules souches embryonnaires en vue de mener des recherches sur d’éventuels traitements
l’embryon sert à fabriquer des cellules souches embryonnaires.
• Le clonage reproductif a pour but de créer un nouvel organisme, identique à la cellule adulte donneuse
le blastocyste est implanté dans l’utérus.
Les clonages thérapeutiques et reproductifs commencent tous deux par un transfert de noyau d’une cellule somatique, mais le clonage reproductif permet au blastocyste de se transformer en un fœtus.
Les premières expériences de transplantation nucléaires
Le clonage de têtards a montré que les noyaux de cellules animales différenciées gardaient tout leur potentiel génétique.
Tadpole (frog larva)
Intestinal cell
Frog egg cell
Nucleus
Nucleus
UV
Nucleusdestroyed
Transplantationof nucleus
Eight-cellembryo
Tadpole
Gurdon, 1962
1962
Le 1er mammifère cloné s’appelle Dolly et a été produit en 1997
La première expérience de transplantation nucléaire chez un
mammifère
Débat éthique
• Les cellules souches embryonnaires pourraient sauver de nombreuses vies.
Il faut effectuer des recherches sur les cellules souches embryonnaires.
Débat éthique (suite)
• Récolter des cellules souches embryonnaires à partir d’un embryon précoce le détruit.
« Le clonage thérapeutique mènera au clonage reproductif».
Débat éthique (suite)
La recherche sur les embryons humains fait l'objet d'une législation, qui varie suivant les pays. En France, la loi du 29 juillet 1994 permet
uniquement les recherches sur les cellules de foetus obtenus à la suite d'une interruption volontaire de grossesse.
le clonage est interdit quel qu'il soit, reproductif ou thérapeutique
Le projet de loi relatif à la bioéthique du 20 juin 2001 a notamment pour objet d'autoriser les recherches sur l'embryon et les cellules souches embryonnaires sous certaines conditions :
• Les recherches ont une finalité médicale qui ne peut pas être atteinte avec la même efficacité par une autre méthode
• Les deux membres du couple à l'origine de l'embryon en ont fait explicitement don à la recherche
• Les protocoles expérimentaux ont été dûment autorisés par les ministres concernés après avis de l'agence de la procréation, de l'embryologie et de la génétique humaine.
Les recherches sur les embryons humains et les cellules souches humaines sont-elles autorisées en France ?
Législation relative aux cellules souches embryonnaires
Législation relative aux cellules souches embryonnaires
Pays Clonage thérapeutique
Création d’embryons à
des fins de recherche
Utilisation d’embryons
excédentaires provenant de cliniques de
FIV
Utilisation de lignées de cellules SE existantes
R.-U. 3 3 3 3
É.-U. ? 3 3 3
Canada 7 7 3 3
Allemagne 7 7 7 3
France 7 7 7 ?
- -- --
--
Adultes
Différenciation limitée : multipotent + plasticité
Rares dans les tissus matures
Difficiles à cultiver en culture
Plus “éthiques” que les cellules souches embryonnaires
Embryonnaires
Différenciation illimitée: pluripotent
Présentes en grand nombre
Faciles à cultiver en culture
Différences entre cellules souches adultes et cellules souches embryonnaires
Les cellules souches: généralités
Les cellules souches neurales
Les cellules souches de la rétine
La signalisation moléculaire
Plan du cours
Neurogenèse adulte?
• Dans certains tissus, la perte de cellules, naturelle ou après une blessure, est compensée par la prolifération et la différenciation de cellules souches.
• Un dogme en neurobiologie disait qu’étant donné que la perte de neurones dans le CNS, dus à des processus dégénératifs, ne sont pas remplacés, le CNS des mamifères ne possède pas de
population de cellules souches.
“We are born with a certain number of brain cells which decrease with age.
Everything must die in the brain or spinal cord - nothing can regenerate.”
Ramon y Cajal 1902
Le premier indice suggérant l’existence de neurogenèse dans certaines régions du cerveau de mammifère date de 1965 (marquage en thymidine tritiée).
C’est seulement en 1993, grâce à de nouvelles techniques de marquage des cellules en prolifération (retrovirus, BrdU), que ceci a clairement été montré.
La première évidence de cellules capable de s’auto-renouveler et multipotentes dans le cerveau date de 1996.
Neurogenèse adulte?
Une cellule souche neurale a la capacité de s’auto-renouveler et de donner les trois types majeurs du CNS des mammifères: les neurones, les astrocytes et les oligodendrocytes
Qu’est ce qu’une cellule souche neurale?
Galli et al., 2003
Où trouve-t-on des cellules souches neurales?
Régions principales où de la neurogenèse a lieu pendant toute la vie adulte (en gris):
• Bulbe olfactif• Hippocampe
Régions qui contiennent les cellules souches (en noir):
• Zone subventriculaire
• Gyrus denté
De la neurogenèse est à présent également trouvée dans le cervelet, le cortex…
Taupin et Gage, 2002; Galli et al, 2003
Environ 30 000 nouveaux neuroblastes sont produits chaque jour qui migrent vers le bulbe
olfactif
Les cellules souches de la zone subventriculaire
Quelle est l’origine des cellules souches neurales?
“Reste” de cellules souches embryonnaires?
Ependymal cells?
Glie radiale?
Astrocytes?
2003
Comportement ex vivo des cellules souches neurales
Okano, 2002
Plasticité des cellules souches neurales en dehors du SNC
innatendu
Après injections intraveineuses, des cellules souches neurales adultes sont capables de donner des cellules hématopoïétiques.
Science 1999
Potentiel de différenciation innatendu
Après co-culture avec des myoblastes ou injection dans le muscle squeletique, des cellules souches neurales adultes sont capables de donner des cellules musculaires.
Régénération de neurones à partir des cellules souches endogènes après une attaque cérébrale
Potentiel de régénération à partir des cellules souches neurales endogènes
Mais 80% des nouveaux neurones meurent.
Seuls environ 0,2% des neurones détruits sont remplacés.
Stimuler la formation ou la survie des nouveaux neurones (FGF-2, EGF, brain-derived neurotrophic factor, cascase inhibitors)
Taupin, C. R. Biologies, 2006
Modulation of neurogenesis in the adult brain
Thousands of new neurons are continuously produced in the dentate gyrus.Function of these newborn?
Exposure of animals to an enriched environment leads to improvement of performance in several learning tasks and enhances neurogenesis specifically in the hippocampus.
QuickTime™ et undécompresseur codec YUV420
sont requis pour visionner cette image.
Do these new neurons participate in memory improvement induced by enrichment?
S. Laroche
Experiment: Neurogenesis was reduced throughout the environmental enrichment period using the antimitotic agent methylazoxymethanol acetate (MAM).
Result: MAM treatment completely prevented the enrichment-induced long-term memory improvement.
Adult-generated neurons participate in modulating memory function
Bruel-Jungerman et al., 2006
Les cellules souches: généralités
Les cellules souches neurales
Les cellules souches de la rétine
La signalisation moléculaire
Plan du cours
Les cellules rétiniennes
• Photoreceptors, rods and cones, are found in the outer layer of the retina. Their outer segments are membranous structures that capture light and carry out phototransduction.
• They form synapses with bipolar and horizontal cells, found in the inner nuclear layer.
• Also in the inner nuclear layer are amacrine cells, which synapse with bipolar cells and the output cell type, ganglion cells.
• Ganglion cells then send the result of all of this processing to the brain via the optic nerve.
La rétine: Introduction
Analyse clonale:
Les rétinoblastes sont multipotents
La rétine des amphibiens et des poissons
Prolifération Sortie du cycle cellulaire Rétine mature
La rétine des amphibiens et des poissons
Cellules souchesCellules souches
NeuroblastesNeuroblastes
Précurseurs enPrécurseurs endifférenciationdifférenciation
ZMCZMC
EpithéliumEpithéliumpigmentépigmenté
Rétine neuraleRétine neurale
NerfNerfoptiqueoptique
CristallinCristallin
Les cellules souches rétiniennes des amphibiens
ZMC = zone marginale ciliaire
Harris et Perron, 1998
2000
En culture, les cellules de l’épithélium ciliaire sont capables de former des neurosphères …
Les cellules souches rétiniennes des mammifères
Tropepee et al. 2000, Ahmad 2001
Les cellules souches rétiniennes des mammifères
Colonie de cellules dérivées de corps cilaire
de rétine
Exemple d’une cellule neurale dérivée d’une
telle colonie
Tsonis 2004
… et de se différencier en divers types de neurones rétiniens
Les cellules souches rétiniennes des mammifères
Le corps ciliaire a deux fonctions :
o la sécrétion de l'humeur aqueuse
o l’accommodation (le muscle ciliaire permet l'accomodation par les changements de forme du cristallin)
Le corps ciliaire est situé entre l’iris et la rétine neurale
Origine embryonnaire commune avec la rétine neurale
Stem cells ‘could restore vision’………
En France, environ 40 000 personnes sont concernées par les maladies dégénératives oculaires héréditaires et plus de 1,5 million par les dégénérescences maculaires liées à l'âge.
Les formes les plus fréquentes de dégénérescences rétiniennes sont:
• la rétinite pigmentaire (35 000 personnes en France)
• le syndrome de Usher (1 naissance sur 25 000)
• les dégénérescences de la macula (10 % de la population de plus de 50 ans)
Les maladies dégénératives oculaires
Traitements de maladies dégénératives oculaires
2001
Transplantation into the mouse eye
The EGFP human RSCs and progeny are able to survive and integrate into the neural retina and the RPE.
Coles et al., PNAS 2005
Limitations
• Disponibilité des cellules souches rétiniennes limitée
• Manque de connaissances de la reproductibilité des expériences de transplantation
• Etablissement des connections avec les autres neurones
• Potentiel oncogénique
Tsonis 2004
• Réponse des cellules gliales de Müller à une dégénération rétinienne induite au N-methyl-D-aspartate (NMDA)
Les cellules gliales de Müller: des cellules souches rétiniennes ?
BrdU+
Müller
BrdU+
Neuron
Les cellules souches: généralités
Les cellules souches neurales
Les cellules souches de la rétine
La signalisation moléculaire
Plan du cours
Auto-renouvellement?Auto-renouvellement?
Multipotence?
Multipotence?
Fonction chez
l’adulte?
Fonction chez
l’adulte?
Stem cell niches in zebrafish retina
Raymond et al., BMC Developmental Biology, 2006
Development 2005
Ptc Smo
Hh
Ptc
Hh
Smo
Gli Gli
Gli Gli
QuickTime™ et undécompresseur Photo - JPEG
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QuickTime™ et undécompresseur Photo - JPEG
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QuickTime™ et undécompresseur Photo - JPEGsont requis pour visionner cette image.
R épressionActivation
(transcription)
Voie inactive Voie active
La cascade de signalisation Hedgehog
Objective
• Investigate the possible involvement of the Hh pathway in the control of stem cell lineages in the postnatal and adult forebrain SVZ
Gene expression in single SVZ cells
single cell multiplex RT-PCR from single randomly collected SVZ cells with a patch-clamp pipette
• 17% of the cells co-expressed both genes, confirming that one population of GFAP+ cells, known to be stem cells, express Gli1
• Not all GFAP+ cells expressed Gli1
• Many Gli1+ cells did not express GFAP, suggesting that more abundant precursors also respond, or may have recently responded, to Shh signaling
Cyclopamine inhibits SVZ cell proliferation in vivo
- cyclopamine injection- BrdU injection- harvest tissus after 2 hours
Reduced number of newborn interneurons in the adultolfactory bulb after cyclopamine treatment.
- cyclopamine injection- BrdU injection- harvest tissus after 30 days
Shh signaling regulates SVZ proliferation and neurogenesis.
Shh treatment increases the number of neurospheres
-culture with or withour Hh for 4 days- dissociated-Culture in EGF for neurosphere formation for 1 week
Bilan
Auto-renouvellement?Auto-renouvellement?
Multipotence?
Multipotence?
Fonction chez
l’adulte?
Fonction chez
l’adulte?
HedgehogWntNotchRetinoic acidBMI-1
CroissanceRéparationMémoire
Cellules souches et cancer
2001
Première évidence de cellules issues de tumeurs du cerveau ayant des caractéristiques de cellules souches: 2002
Brain tumour stem cells
Reviewed in Vescovi et al., Nature reviews 2006
- autorenouvellement (neurospheres)- autorenouvellement in vivo (capacité d’initier une tumeur)- multipotence (astrocytes + neurones)- expression de marqueurs de cellules souches neurales
Brain tumour stem cells
Origine des cellules souches cancéreuses?
• Hypothèse traditionnelle: dédifférenciation d’une cellule neurale en réponse à des altérations génétiques
• Concept du “cancer stem cell”: similitudes entre auto-renouvellement des cellules souches neurales et des cellules cancéreuses Les cancers pourraient dériver d’une cellule souche dont les
mécanismes d’auto-renouvellement seraient dérégulés
Cellules souches et cancer
Figure 1. Les traitements anti-cancéreux traditionnels (en haut) tuent rapidement les cellules tumorales en division (rouge) mais leurs effets sont souvent transitoires, suggérant la persistance de cellules souches cancéreuses (bleu), à l’origine de la récurrence tumorale. L’enjeu actuel (en bas) consiste à développer des outils thérapeutiques capables de cibler directement les cellules souches cancéreuses, afin d’obtenir des rémissions à plus long terme.
Cellules souches et cancer
Risques de tératomes dans les greffes de cellules
souches
L’implantation de cellules ES de souris dans le cerveau de souris conduit à la formation de tératomes dans 20% des cas.
Le risque est réduit si les cellules ont été préalablement différenciées in vitro.
Mais encore…• Combien de différents types de cellules
souches existe-t-il chez l’adulte?• Quelle est la source des cellules souches
adultes? • Pourquoi les cellules souches restent-elles
indifférenciées quand toutes les cellules autours d’elles se sont différenciées?
• Est-ce que les cellules souches adultent présentent normalement une certaine plasticité ou bien est ce qu’elles se trans-différencient uniquement quand les scientifiques les manipulent expérimentalement?
• Quels sont les signaux qui régulent la prolifération, la différenciation, la plasticité des cellules souches?
http://stemcells.nih.gov/info/scireport/
