Nouveaux tests immunologiques pour le diagnostic de la

tuberculose

Guislaine CarcelainImmunologie Cellulaire, Hôpital Pitié-

Salpêtrière

Primo Infection 5-10%

Réactivation 5-15%

Infection latente > 90%

gouttelettes aérosols dans alvéoles pulmonaires

phagocytose par macrophages alvéolaires, cellules dendritiques

cellules T ganglions drainants

Formes cliniquesbalance entre le pathogène et les réponses immunes de l’hôte

Terrain +++

Guérison spontanée

Éradication?

Adapté de Kaufmann nature reviews 2001

Mise en place d’une boucle de réponse Th1Production de molécules anti microbiales : RNI, ROI

fusion phagosomes/lysosomes

IFN

CD4 CD4-/8-CD8

Lyse

IL12

Cellules T spécifiques Contrôlent mΦ infectés

Adapté de Kaufmann nature reviews 2001

CD4 mémoires effectrices (TEM)Contact récent agfonction effectrice IFNg rapide

CD4 mémoires centrales (TCM)Durée de vie longue>disparition agprolifération rapide à ag

BK interfère Cl II, Cl I, phagocytose

ÉchappementPersistance en Latence

granulone

Hypersensibilité retardée à la tuberculineRéponse Mémoire T aux antigènes mycobactériens

IDR : non spécifique+++, peu reproductible, peu sensible (< 5 ans, ID …)

Présentationd’ag mycobactériens

Mesure inflammation et induration

La Tuberculine : le plus vieux des antigènes mycobactérien

- Koch’s old tuberculine, 1891 concentré de culture inactivé par la chaleur- Tuberculine Purified Protein Derivative (PPD) milieu sans protéines, soniqué, filtré, lots non standardisés > 200 ag partagés entre M tuberculosis, M Bovis, BGC, certaines M atypiques

+ : virage chez non vacciné, >15 mm ou phlycténulaire chez vacciné

Nouveaux tests immunologiques de la tuberculose Alternatives in vitro à l’IDR : mesure de l’IFN secrété par les cellules T

(TEM) en réponse à une stimulation par des antigènes spécifiques

Rationnel : si immunisation fréquence

ELISA ELISpot

IFN pg/ml SFC/106

Sang total ou CMNS

Ag M Tuberculosis ESAT 6, CFP10

Incubation O/N ou 48h

Sécretion IFN

mesure IFN

Adapté de Pai Lancet Infect Dis 2004

IGRAsInterferon Gamma Release Assays

Facteurs contrôlant leur spécificité

Séquence complète du génome de M Tuberculosis: (S. Cole Nature 1998)

- Génome total : 4,4 millions pb- Gènes codants : 3,9 millions pb soit 90,8%- Gènes dont la fonction est connue : 2,4 millions pb

Différences entre M Tuberculosis et BCG : Régions de Différence RD

- 129 ORF présentes dans les isolats cliniques de MTbet absentes dans le génome des souches vaccinales BCG et la

plupart des mycobactéries atypiques

- 3 ag immunodominants spécifiques de Mtb codés par RD et inclus dans tests in vitro : ESAT 6/CFP10 (RD1, virulence), TB 7.7 (RD11)

Nouveaux tests immunologiques de la tuberculose disponibles dans le commerce, approuvés par la FDA, marquage CE

QuantiFERON-TB Gold in-Tube (Cellestis Limited, Canergie, Australia)

T-SPOT.TB (Oxford Immunotech, Oxford, UK)

IGRAs : Avantages par rapport à l’IDR :

- Pas de seconde visite, résultats en 16-24 heures +/-

- Pas de stimulation in vivo des réponses immunes (effet « booster » IDR)

- Reproductibilité test et réactifs

- Résultat objectif

- Spécificité +++ : populations BCG+, infectées par MNT

- Contrôle + : mitogène, met en évidence des faux nég = test in-interprétable

Antigènes (peptides) : ESAT-6, CFP10 (RD1), +/- TB7.7

Interprétation : 3 résultats possibles

Résultat positif : fréquence élevée de cellules TEM (et Teff) spécifiques de MTb

- VP : contage MTb responsable d’une stimulation spécifique de l’immunité mais attention le résultat reste qualitatif :

Tuberculose Infection? / Tuberculose Maladie ?

infection ancienne? / récente? risque d’évolution vers tuberculose Maladie?

- FP : défaut de spécificitéPeu probable sauf :

M kansasii, M Marinum, M Szulgai …

Interprétation : 3 résultats possibles

Résultat négatif : fréquence nulle ou faible de cellules TEM et (TEff) spécifiques MTb

- VN : absence de contage tuberculeux

- FN : pb de sensibilité …. contage tuberculeux ancien? Frces faibles TEM, TE. stimulation trop brève : délais court pour activer TCM. choix des antigènes pb CMH certaines éthnies?

conséquence de ces FN? Risque ou non de réactivation? augmenter nombre ag? Stimulation plus longue?

Résultat indéterminé : production insuffisante d’IFN- en présence de PHA Incapacité du SI à développer une réponse T fonctionnelleComme l’IDR ils peuvent être affectés par l’ID +++ MAIS on le visualise +++QTF > T-SPOT.TB (ajustement nbre lympho)

Spécificité (95% CI) estimée chez le sujet sain Sujets sains, régions faible endémie, ss ATCD ni exposition à MTb

- QTF-G BCG- 8 études : 0.99% (0.98-1.00) - QTF-G BCG+ 8 études : 0.96% (0.94-0.98) - T-SPOT.TB BCG+ 6 études : 0.93% (0.86-1.00) - IDR BCG- 6 études : 0.97% (0.95-0.99) - IDR BCG+ 6 études : 0.59% (0.46-0.73)

Élevée, comparable, > IDR, non modifiée par BCG et peu par MNT (sf M Szulgai, M marimum, M kansasii …)

Sensibilité (95% CI) estimée chez le patient tuberculeux Sujets tuberculose prouvée, la plupart VIH-

- QTF-G 16 études : 0.78% (0.73-0.82) - QTF-G IT 6 études : 0.70% (0.63-0.78) - T-SPOT.TB 13 études : 0.90% (0.86-0.93) - IDR 20 études : 0.77% (0.71-0.82)

Inférieure ou égale à celle de l’IDR, (T Mémoires centrales)?

Pai M, Annals of Internal Medicine 2008

IGRAs: rôle dans le diagnostic TB maladie?

- Pas de détection du pathogène …mis au point pour détecter l’infection par MTb

- Possible cependant en situation particulières paucibacillaires: enfants, formes extrapulmonaires … (IGRAs Liquide Pleural revues en Joshi R 2008, IGRAs sang (Kim 2008))

- Mais problématique chez l’adulte : . un test positif ne fait pas la différence ITL / TBm

vrai problème en situation endémique

. un test négatif : ne peut éliminer le dg de TBm sensibilité non optimale : 80% en situation de TBm

dg ITL Sujets exposition forte Sensibilité variable : QTF-G 44-74% , T-spot.TB 22-100%, IDR 0-90%

(revu en Menzies Ann Intern Med 2007)

Association test positif avec le degré d’exposition Sujets : >20.000 clients supermarché Hollandais, contacts employé TB+ > 17 ans, BGC-, suivi 10 mois, n= 785 IDR et IGRAs, Monovariée : probabilité IGRAs + corrélée frce shopping, expo cumulée Multivariée : probabilité IGRAs + corrélée au degré exposition cumulé alors que pas IDR+++, associée avec âge seulement

(Arend Am J of Resp and Crit care Med 2007)

IGRAs rôle dans le diagnostic d’une ITLDifficulté : pas de gold standard

% de tests IGRAs positifs évoluant vers TBm ? Sujets contacts suivis 2ans, sous groupe de sujets non traités TAT :

Evolution TBm : 5/219 (2.3%) IDR+ versus 6/41 (14.6%) QTF+ p< 0.003

Allemagne (Diel Am J Respir Crit Care Med 2008)

Evolution TBm : 14/843 (1.7%) IDR+ versus 11/649 (1.7%) T-SPOT.TB

Gambie (Hill Plos one 2008)

Forte association risque progression /forte réponse IFN- ESAT-6(Doherty J Clin Microbiol 2002)

Risque progression corrélé à intensité des réponses dans un modèle animal(Weldingh Plos One 2008)

Nécessite plus larges études: confirmer ce concept définir seuil, ou delta d’augmentation

définir si ttt selon ce critère risque TB

ITL : Prédiction risque de TB active?

Adapté de Andersen Trends in Molecular Biology 2007

Seuil maladie

seuil infection

Rationnel : fréquence TEM, T eff corrélée charge antigénique . Taux élevés IFN- prédictifs risque développement TBm . Notion d’ récente du taux IFN- chez patients récemment exposés

Guérison initialeESAT 6-

ITLESAT 6+

Évolution sdaire TBmESAT 6+

Difficile +++

Effet du traitement antituberculeux :

- TBm: diminuent sous traitement dès M3, significatif >M28 - ITL: diminution sous (3-5 mois) ou post traitement (3 mois)

(Carrara 2004, Pathan 2001, Wilkinson 2006, Ewer 2006 …)

TEM , T eff nécessitent contact récent avec l’ag disparition ou seuil de réversion?

Mais: discordances (indiv, publications) (revue Pai, Lancet Inf Dis 2007)

- Variabilités individuelles? - persistance d’une maladie active

microbiobiologiquement? …

Evolution spontanée dans le temps de ces réponses :

- Diminution? disparition? Sous l’effet de la «disparition» de l’ag? - Fluctuations techniques? fluctuations biologiques? attention réponses seuil +++, variations physio <16%? (Veerapathan 2008)

questions : la reproductibilité (réponses faibles ++), % de variation bio, signification réversion? définition des seuils de

conversion, QTF / TSPOT.TB?

A-t-on une Réversion de ces réponses ?

Le patient infecté par le VIH

Sensibilité diminuée, cependant :

- Sensibilité IDR très diminuée et faux négatifs - IGRAs plus sensibles que IDR dans cette population

IDR 47-67% versus IGRAs 63-90% (lagrange 2008, Raby 2008)

T-SPOT.TB moins affecté (Liebeschuetz 2004, Dheda 2005)

- Très modifiée pour QTF par taux CD4/mm3 :<100 : 23%, 100-199 : 70%, 200-349 : 74%, > 350 : 88% (Raby 2008)

Augmentation des Résultats Indéterminés :

- QTF-G 11%, T-SPOT.TB 3%, p< 0.0001 corrélé à la présence d’un facteur de risque d’ID pour les deux tests

(Ferrara 2005, 2006)

- Supérieur pour QTF-G (11-24%), corrélé taux de CD4 QTF-G++(Brock et al. Respir Res 2006)

- T-SPOT.TB plus atteint par déficit fonctionnel que par taux de CD4 (Dheda et al AIDS 2005, Hoffmann AIDS 2007)

Conclusions et perspectivesUn espoir pour avoir mieux que l’IDR ?

– Avoir un test plus spécifique : OUI– Avoir un plus sensible : AUSSI sensible– Avoir un test plus reproductible: OUI mais dans quelle

mesure?– Avoir un test en un seul temps : OUI mais pas plus rapide– Avoir un test plus corrélé à l’exposition ? OUI– Avoir un test prédictif du risque de progression vers la

maladie? OUI probablement mais seuils ou delta de variation à définir

Nécessité de larges études pour

- Mieux définir l’évolution dans le temps de ces réponses (en cours)- Travailler sur l’aspect reproductible/quantitatif des réponses (en cours)- Evaluer sensibilité tests si «immunodépression» enfants, âgés, ID, (en cours) - Evaluer l’apport de ces tests dans les formes cliniques paucibacillaires- Augmenter la sensibilité des tests et capacité diagnostique (antigènes)